FR3030049A1

FR3030049A1 - CELL ANALYSIS AND CULTURE SYSTEM, METHOD OF ANALYSIS AND CELL CULTURE THEREFOR AND METHOD OF MANUFACTURING THE ASSOCIATED CHIP

Info

Publication number: FR3030049A1
Application number: FR1462259A
Authority: FR
Inventors: Andrew David Griffiths
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2016-06-17
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: FR3030049B1

Abstract

L'invention concerne un système d'analyse et de culture cellulaire (40) comprenant : - une source d'un premier fluide comprenant un premier réactif, - une puce (44) comprenant un conduit d'entrée comportant une première entrée (18) reliée à la source et une sortie, au moins un conduit de passage (12) du premier fluide, dans lequel débouche la sortie du conduit d'entrée. La puce (44) comprend en outre, pour chaque conduit de passage (12) un réservoir (14), débouchant dans le conduit de passage (12). Le réservoir (14) contient une solution pré-chargée, comprenant un deuxième réactif apte à réagir avec le premier réactif dans le conduit de passage (12).The invention relates to a cell culture and analysis system (40) comprising: - a source of a first fluid comprising a first reagent, - a chip (44) comprising an input conduit comprising a first input (18) connected to the source and an outlet, at least one passage conduit (12) of the first fluid, into which the outlet of the inlet conduit. The chip (44) further comprises, for each passage duct (12) a reservoir (14), opening into the passage duct (12). The reservoir (14) contains a pre-charged solution, comprising a second reagent capable of reacting with the first reagent in the passage conduit (12).

Description

1 Système d'analyse et de culture cellulaire, procédé d'analyse et de culture cellulaire associé et méthode de fabrication de la puce associée La présente invention concerne un système d'analyse et de culture cellulaire. Dans le domaine de la culture cellulaire, il est connu de faire croître des colonies cellulaires sur la surface de plaques comprenant un milieu de croissance gélifié par un agent gélifiant notamment de l'agar agar. Un système couramment utilisé comporte des plaques d'agar agar disposées dans des boîtes de Petri. Les cellules individuelles sont étalées sur la surface des plaques et se multiplient jusqu'à former une colonie cellulaire. Une colonie est un amas de cellules. Les cellules sont, par exemple, des micro-organismes comme des bactéries, des levures ou des fungi. Les systèmes sur plaques permettent de quantifier et d'identifier les microorganismes.The present invention relates to a system for analysis and cell culture. In the field of cell culture, it is known to grow cell colonies on the surface of plates comprising a growth medium gelled by a gelling agent, in particular agar agar. A commonly used system comprises agar agar plates disposed in Petri dishes. The individual cells are spread on the surface of the plates and multiply to form a cell colony. A colony is a cluster of cells. The cells are, for example, micro-organisms such as bacteria, yeasts or fungi. Plate systems can quantify and identify microorganisms.

Les micro-organismes peuvent être identifiés à partir de nombreuses méthodes : par exemple, une analyse de la morphologie des colonies, une vérification de la capacité de croissance d'une colonie sur un milieu sélectif, un marquage sélectif, une mesure de spectroscopie de masse ou autre. La croissance de colonies bactériennes sur un milieu sélectif contenant un antibiotique est utilisée, par exemple, pour déterminer la résistance d'une bactérie à l'antibiotique. Cependant, la formation de colonies visibles à l'oeil nu c'est-à-dire de macro- colonies nécessite une incubation de plus de dix heures selon le temps de réplication du micro-organisme. En effet, la croissance radiale des macro-colonies est sensiblement linéaire puisqu'elle est limitée par la diffusion des nutriments. Par exemple, le temps de réplication de Escherichia coli est de dix-sept minutes et le taux de croissance radial linéaire de la colonie a été mesuré à 0,013 micro mètres (pm) par seconde. Des temps d'incubation plus courts peuvent être souhaités ou même essentiels, par exemple, pour identifier rapidement des micro-organismes pathogènes. Par exemple, l'identification rapide de résistance à un antibiotique d'une bactérie permet au patient d'être traité rapidement avec des antibiotiques plus adaptés. Pour réduire les temps d'incubation, il est connu de chercher à détecter des micro- colonies, c'est-à-dire de plus petites colonies non visibles à l'oeil nu. L'extension radiale de micro-colonies est supposée exponentielle puisque la croissance n'est pas limitée par la diffusion de nutriments.Microorganisms can be identified from many methods: for example, colony morphology analysis, colony growth capacity check on selective media, selective labeling, mass spectroscopy measurement. Or other. The growth of bacterial colonies on a selective medium containing an antibiotic is used, for example, to determine the resistance of a bacterium to the antibiotic. However, the formation of colonies visible to the naked eye that is to say macro-colonies requires an incubation of more than ten hours depending on the replication time of the microorganism. Indeed, the radial growth of macro-colonies is substantially linear since it is limited by the diffusion of nutrients. For example, the Escherichia coli replication time is 17 minutes and the linear radial growth rate of the colony was measured at 0.013 micro meters (μm) per second. Shorter incubation times may be desired or even essential, for example, to rapidly identify pathogenic microorganisms. For example, the rapid identification of antibiotic resistance of a bacterium allows the patient to be treated quickly with more suitable antibiotics. To reduce the incubation times, it is known to seek to detect micro-colonies, that is to say smaller colonies not visible to the naked eye. The radial extension of micro-colonies is assumed to be exponential since growth is not limited by nutrient diffusion.

3030049 2 Les micro-colonies peuvent être détectées à partir de diverses méthodes incluant des étapes de coloration, des marquages vitaux de fluorescence ou des mesures de bioluminescence permettant de détecter l'adénosine-triphosphate (ATP). Des colonies immergées c'est-à-dire les colonies qui croissent à l'intérieur du gel 5 et non sur leur surface peuvent également être analysées. La publication « the effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria » parue dans Journal of Applied Microbiology, 83(1), 76-84 décrit une étude de colonies immergées. Il existe un besoin pour une détection rapide, une quantification et une 10 caractérisation de colonies de micro-organismes immergées. En outre, il existe un besoin de quantifier simultanément la croissance de micro-colonies immergées pour un ensemble de milieux sélectifs. A cet effet, l'invention a pour objet un système d'analyse et de culture cellulaire comprenant : 15 - une source d'un premier fluide comprenant un premier réactif, - une puce comprenant : - un conduit d'entrée comportant une première entrée reliée à la source et une sortie, - au moins un conduit de passage du premier fluide, dans lequel débouche 20 la sortie du conduit d'entrée, caractérisé en ce que la puce comprend en outre, pour chaque conduit de passage : - un réservoir, le réservoir débouchant dans le conduit de passage, le réservoir contenant une solution pré-chargée, la solution pré-chargée comprenant un deuxième réactif apte à réagir avec le premier réactif dans le conduit de passage.Micro-colonies can be detected from a variety of methods including staining steps, vital fluorescence markings, or bioluminescence measurements to detect adenosine triphosphate (ATP). Submerged colonies, i.e., colonies that grow inside the gel and not on their surface can also be analyzed. The publication "the effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria" published in Journal of Applied Microbiology, 83 (1), 76-84 describes a study of submerged colonies. There is a need for rapid detection, quantification and characterization of colonies of submerged microorganisms. In addition, there is a need to simultaneously quantify the growth of submerged micro-colonies for a set of selective media. For this purpose, the subject of the invention is an analysis and cell culture system comprising: a source of a first fluid comprising a first reagent, a chip comprising: an input conduit comprising a first input connected to the source and an outlet, - at least one conduit for the passage of the first fluid, into which the outlet of the inlet conduit opens, characterized in that the chip further comprises, for each passage duct: a reservoir , the reservoir opening into the passage duct, the tank containing a preloaded solution, the preloaded solution comprising a second reagent capable of reacting with the first reagent in the passage duct.

25 Le système d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prise(s) isolément ou suivant toute combinaison techniquement possible : - le premier réactif et le deuxième réactif sont aptes à former un gel dans le conduit de passage, de préférence, un gel adapté à la culture de cellules, notamment un 30 gel d'alginate ; - le premier fluide comprend, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée du réservoir comprenant un milieu sélectif de croissance des cellules ; - le système comprend un outil d'imagerie propre à former une image d'une partie 35 du conduit de passage et avantageusement propre à détecter des micro-colonies dans le conduit de passage ; 3030049 3 - le conduit de passage du premier fluide est étendu selon une direction longitudinale et les dimensions transverses du conduit de passage du premier fluide au voisinage du réservoir sont inférieures à 1 mm ; - le système comprend un module d'injection configuré pour injecter le premier 5 fluide dans le conduit d'entrée en aval de la source et pour entrainer le premier fluide dans le conduit de passage ; - la puce comprend une pluralité de conduits de passage parallèles, dans lesquels débouche la sortie du conduit d'entrée, la puce comprenant pour chaque conduit de passage, un réservoir propre débouchant dans le conduit de passage, le premier fluide 10 comprenant avantageusement, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée de chaque réservoir comprenant un deuxième réactif sélectif dans chaque réservoir, notamment un milieu sélectif de croissance des cellules distinct ; - l'outil d'analyse est propre à permettre l'analyse de la croissance de micro-colonies ; 15 - pour le ou chaque conduit de passage, le réservoir est disposé au-dessus du conduit de passage, le réservoir débouchant dans le conduit de passage par une ouverture inférieure d'aire horizontale avantageusement inférieure à l'aire horizontale du conduit de passage. L'invention a également pour objet un procédé d'analyse et de culture cellulaire 20 comprenant les étapes suivantes : - fourniture d'un système d'analyse et de culture cellulaire, tel que précédemment décrit ; - injection du premier fluide dans le conduit d'entrée à partir de la source de premier fluide ; 25 - passage du premier fluide dans le conduit de passage jusqu'au réservoir ; - réaction du premier réactif du premier fluide et du deuxième réactif de la solution pré-chargée dans le conduit de passage, de préférence la réaction permettant la formation d'un gel dans le conduit de passage. Le procédé selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des 30 caractéristiques suivantes : - le premier fluide comprend une pluralité de cellules en suspension, et le procédé comprend les étapes suivantes : - formation d'une image d'une partie du conduit de passage, et - détection de micro-colonies dans le conduit de passage ; 35 - le premier fluide comprend une pluralité de cellules en suspension, la solution du réservoir comprenant un milieu sélectif de croissance des cellules et le procédé comprend 3030049 4 une étape de détermination d'un paramètre représentatif de l'effet du milieu sélectif sur au moins une cellule ; - les cellules sont marquées par des marquages vitaux de fluorescence ; - le procédé comprend une détection des micro-colonies comprenant 5 avantageusement des étapes de coloration, des marquages vitaux de fluorescence ou des mesures de bioluminescence permettant de détecter l'adénosine-triphosphate (ATP) ; et - la puce comprend une pluralité de conduits de passage parallèles, dans lesquels débouche la sortie du conduit d'entrée, la puce comprenant pour chaque conduit de 10 passage, un réservoir propre débouchant dans le conduit de passage, le premier fluide comprenant avantageusement, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée de chaque réservoir comprenant un deuxième réactif sélectif dans chaque réservoir, notamment un milieu sélectif de croissance des cellules distinct, le procédé comprenant le passage du premier fluide dans le conduit de passage en regard 15 de chaque réservoir, et la réaction du premier réactif sélectivement avec le deuxième réactif de chaque solution pré-chargée dans le conduit de passage. L'invention a également pour objet une méthode de fabrication d'une destinée à être intégrée dans le système d'analyse et de culture cellulaire, tel que précédemment décrit : 20 - fourniture d'une demi-puce supérieure comprenant un réservoir ; - chargement du réservoir avec une solution comprenant un deuxième réactif ; - fermeture de la demi-puce supérieure par une demi-puce inférieure, de façon à former une puce comprenant un conduit d'entrée comportant une première entrée apte à être reliée à une source d'un premier fluide comprenant un premier réactif, et une sortie, 25 au moins un conduit de passage dans lequel débouche la sortie du conduit d'entrée, et dans laquelle le réservoir débouche dans le conduit de passage. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple, et faite en se référant aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 est une représentation schématique d'un système d'analyse et de 30 culture cellulaire selon l'invention ; - la figure 2 est une vue en coupe suivant un plan vertical II de la puce du système de la figure 1 ; - la figure 3 est une vue prise en coupe suivant un plan axial inférieur horizontal III de la puce de la figure 2 ; 35 - la figure 4 est une vue en coupe selon un plan axial médian horizontal IV de la puce de la figure 2 ; 3030049 5 - la figure 5 est une vue en coupe suivant un plan axial supérieur horizontal V de la puce de la figure 2, - la figure 6 est une vue en coupe suivant un plan frontal de la demi-puce supérieure de la figure 2, 5 - la figure 7 est une vue en coupe suivant un plan transversal de la demi-puce supérieure de la figure 2, - la figure 8 est une vue analogue à la figure 6 d'une demi-puce supérieure suivant un troisième mode de réalisation, - la figure 9 est une vue analogue à la figure 7 de réalisation de la demi-puce 10 supérieure de la figure 8. Dans la description qui va suivre, les termes « amont » et « aval » et les termes « entrée » et « sortie » sont utilisés en référence aux sens normaux de circulation des fluides dans le système. Le terme « longitudinal » est défini par rapport à la direction du conduit de 15 passage de la puce. La direction d'élévation Z est définie par rapport à l'épaisseur de la puce. La direction longitudinale X est sensiblement perpendiculaire à la direction d'élévation Z. La direction transversale Y, est sensiblement perpendiculaire aux directions longitudinales X et d'élévation Z, de sorte que ces trois directions forment un repère orthonormé.The cell culture and analysis system according to the invention may comprise one or more of the following characteristics, taken alone or in any technically possible combination: the first reagent and the second reagent are capable of forming a gel in the passageway, preferably a gel adapted for culturing cells, in particular an alginate gel; the first fluid further comprises a plurality of cells in suspension, the pre-charged solution of the reservoir comprising a selective cell growth medium; the system comprises an imaging tool capable of forming an image of a portion of the passage duct and advantageously capable of detecting micro-colonies in the passage duct; - the conduit for the passage of the first fluid is extended in a longitudinal direction and the transverse dimensions of the conduit for passing the first fluid in the vicinity of the reservoir are less than 1 mm; the system comprises an injection module configured for injecting the first fluid into the inlet duct downstream of the source and for driving the first fluid in the passage duct; the chip comprises a plurality of parallel passage ducts, into which the outlet of the inlet duct opens out, the chip comprising for each passage duct, a clean reservoir opening into the passage duct, the first fluid advantageously comprising, in further, a plurality of cells in suspension, the pre-loaded solution of each reservoir comprising a second selective reagent in each reservoir, including a separate cell growth selective medium; the analysis tool is suitable for allowing the analysis of the growth of micro-colonies; For the or each passage duct, the reservoir is disposed above the passage duct, the reservoir opening into the passage duct through a lower horizontal area opening advantageously less than the horizontal area of the passage duct. The invention also relates to a method of analysis and cell culture comprising the following steps: - providing an analysis system and cell culture, as previously described; injecting the first fluid into the inlet duct from the source of the first fluid; - passage of the first fluid in the passage conduit to the reservoir; reaction of the first reagent of the first fluid and of the second reagent of the pre-charged solution in the passage duct, preferably the reaction allowing the formation of a gel in the passage duct. The method according to the invention may comprise one or more of the following features: the first fluid comprises a plurality of cells in suspension, and the method comprises the following steps: forming an image of a part of the duct passage, and - detection of micro-colonies in the passage duct; The first fluid comprises a plurality of cells in suspension, the reservoir solution comprising a selective cell growth medium and the method comprises a step of determining a parameter representative of the effect of the selective medium on at least one a cell ; the cells are marked by vital fluorescence markings; the method comprises a micro-colony detection advantageously comprising staining steps, fluorescence vital markings or bioluminescence measurements for detecting adenosine triphosphate (ATP); and the chip comprises a plurality of parallel passage ducts into which the outlet of the inlet duct opens out, the chip comprising, for each passage duct, a clean reservoir opening into the passage duct, the first fluid advantageously comprising in addition, a plurality of cells in suspension, the pre-loaded solution of each reservoir comprising a second selective reagent in each reservoir, in particular a separate selective cell growth medium, the process comprising the passage of the first fluid in the passageway next to each reservoir, and the reaction of the first reagent selectively with the second reagent of each pre-charged solution in the passage conduit. The invention also relates to a method of manufacturing a device for integration into the analysis and cell culture system, as previously described: - providing an upper half-chip comprising a reservoir; loading the reservoir with a solution comprising a second reagent; closing the upper half-chip by a lower half-chip, so as to form a chip comprising an input conduit having a first input adapted to be connected to a source of a first fluid comprising a first reagent, and a outlet, at least one passage conduit in which opens the outlet of the inlet duct, and wherein the tank opens into the passage duct. The invention will be better understood on reading the following description given solely by way of example, and with reference to the appended drawings, in which: FIG. 1 is a diagrammatic representation of a system of analysis and cell culture according to the invention; - Figure 2 is a sectional view along a vertical plane II of the chip of the system of Figure 1; - Figure 3 is a view taken in section along a horizontal lower axial plane III of the chip of Figure 2; FIG. 4 is a sectional view along a horizontal median axial plane IV of the chip of FIG. 2; FIG. 5 is a sectional view along a horizontal upper axial plane V of the FIG. 2 chip; FIG. 6 is a sectional view along a front plane of the upper half-chip of FIG. 2; FIG. 7 is a sectional view along a transverse plane of the upper half-chip of FIG. 2; FIG. 8 is a view similar to FIG. 6 of an upper half-chip according to a third embodiment; FIG. 9 is a view similar to FIG. 7 of the embodiment of the upper half-chip of FIG. 8. In the description which follows, the terms "upstream" and "downstream" and the terms "input" and "Output" are used in reference to the normal flow directions of the fluids in the system. The term "longitudinal" is defined with respect to the direction of the flue passageway. The elevation direction Z is defined with respect to the thickness of the chip. The longitudinal direction X is substantially perpendicular to the elevation direction Z. The transverse direction Y, is substantially perpendicular to the longitudinal directions X and elevation Z, so that these three directions form an orthonormal frame.

20 Les termes « inférieurs » et « supérieurs » sont définis par rapport à la direction d'élévation Z. On appelle plan « axial » les plans qui s'étendent selon la direction longitudinale X et la direction transversale Y. On appelle plan « frontal», les plans qui s'étendent selon la direction d'élévation Z 25 et la direction longitudinale X On appelle plan « transversal », les plans perpendiculaires à la direction longitudinal c'est-à-dire les plans qui s'étendent selon la direction Y et la direction d'élévation Z. Par exemple la direction transversale Y et la direction longitudinale X définissent 30 dans un plan axial horizontal et la direction d'élévation Z s'étend verticalement. Par ailleurs, on entend par le terme « diamètre », l'étendue maximale du conduit considéré dans un plan transversal, par exemple le diamètre d'un cercle dans le cas où la section transversale du canal est circulaire ou la diagonale d'un rectangle dans le cas où la section transversale du canal est rectangulaire.The terms "lower" and "higher" are defined with respect to the direction of elevation Z. The term "axial" plane refers to the planes which extend in the longitudinal direction X and the transverse direction Y. ", The planes which extend in the direction of elevation Z 25 and the longitudinal direction X is called" transverse plane ", the planes perpendicular to the longitudinal direction that is to say the plans that extend according to the Y direction and the Z direction of elevation. For example the transverse direction Y and the longitudinal direction X define in a horizontal axial plane and the elevation direction Z extends vertically. Moreover, by the term "diameter" is meant the maximum extent of the duct considered in a transverse plane, for example the diameter of a circle in the case where the cross section of the channel is circular or the diagonal of a rectangle in the case where the cross section of the channel is rectangular.

35 La figure 1 illustre un premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 3030049 6 Le premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 est par exemple prévu pour évaluer la croissance de colonies de cellules dans un milieu. Par exemple, il permet d'étudier l'action d'un antibiotique sur la croissance de colonies de bactéries. Les cellules sont par exemple des micro-organismes, comme des bactéries, des 5 levures ou des fungi. Le système d'analyse et de culture cellulaire 1 comprend une puce 2 et une source 4 d'un premier fluide. En outre, le système d'analyse et de culture cellulaire 1 comprend un module d'injection 6 et un outil de mesure 8. En complément, le système d'analyse et de culture cellulaire 1 comprend un incubateur.FIG. 1 illustrates a first analysis and cell culture system. The first analysis and cell culture system 1 is for example designed to evaluate the growth of cell colonies in a medium. For example, it allows to study the action of an antibiotic on the growth of colonies of bacteria. The cells are for example microorganisms, such as bacteria, yeasts or fungi. The cell culture and analysis system 1 comprises a chip 2 and a source 4 of a first fluid. In addition, the analysis and cell culture system 1 comprises an injection module 6 and a measurement tool 8. In addition, the analysis and cell culture system 1 comprises an incubator.

10 La puce 2 comprend un conduit d'entrée 10, un conduit de passage 12, un réservoir 14 et un conduit de sortie 16. La puce est par exemple réalisée dans un matériau perméable à l'eau et à l'air, par exemple du polydiméthylsiloxane (PDMS). En variante, la puce est réalisée en un matériau non perméable à l'eau et à l'air, comme un matériau plastique dur ou du verre.The chip 2 comprises an inlet duct 10, a passage duct 12, a reservoir 14 and an outlet duct 16. The chip is for example made of a material permeable to water and air, for example polydimethylsiloxane (PDMS). Alternatively, the chip is made of a non-permeable material with water and air, such as a hard plastic material or glass.

15 Le conduit d'entrée 10 comporte une première entrée 18, une portion longitudinale 20 et une sortie 22. La première entrée 18 est reliée à la source 4. Le conduit de passage 12 comporte une entrée 24 reliée à la sortie 22 du conduit d'entrée et une sortie 26. La sortie 22 du conduit d'entrée 10 débouche dans l'entrée 24 du conduit de passage 12.The inlet duct 10 has a first inlet 18, a longitudinal portion 20 and an outlet 22. The first inlet 18 is connected to the source 4. The passage duct 12 has an inlet 24 connected to the outlet 22 of the duct. The inlet 22 and the outlet 26. The outlet 22 of the inlet duct 10 opens into the inlet 24 of the passage duct 12.

20 Le conduit de sortie 16 comporte une entrée 28 et une sortie principale 30. La sortie 26 du conduit de passage 12 débouche dans l'entrée 28 du conduit de sortie 16. Le réservoir 14 débouche dans le conduit de passage 12. Le réservoir 14 contient une solution pré-chargée. La source 4 comprend, par exemple, un récipient comprenant un premier fluide.The outlet duct 16 has an inlet 28 and a main outlet 30. The outlet 26 of the passage duct 12 opens into the inlet 28 of the outlet duct 16. The tank 14 opens into the passage duct 12. The reservoir 14 contains a preloaded solution. The source 4 comprises, for example, a container comprising a first fluid.

25 Dans la figure 1, la source 4 est externe à la puce 2. Le premier fluide contient un premier réactif. Le premier réactif est, par exemple, un agent de gélification comme de l'alginate. La solution pré-chargée comprend un deuxième réactif apte à réagir avec le premier réactif dans le conduit de passage 12.In Figure 1, the source 4 is external to the chip 2. The first fluid contains a first reagent. The first reagent is, for example, a gelling agent such as alginate. The preloaded solution comprises a second reagent capable of reacting with the first reagent in the passage duct 12.

30 Le premier réactif et le deuxième réactif sont par exemple aptes à former un gel dans le conduit de passage 12. Ce gel est par exemple propice à la croissance de micro-colonies. Par exemple, le premier réactif est de l'alginate de sodium et le deuxième réactif est du chlorure de calcium ; ces réactifs sont aptes à former un gel d'alginate de calcium. Le module d'injection 6 est configuré pour injecter le premier fluide dans le conduit 35 d'entrée 10 en aval de la source 4 et pour entrainer le premier fluide dans le conduit de passage 12.The first reagent and the second reagent are, for example, capable of forming a gel in the passage duct 12. This gel is, for example, conducive to the growth of micro-colonies. For example, the first reagent is sodium alginate and the second reagent is calcium chloride; these reagents are capable of forming a calcium alginate gel. The injection module 6 is configured to inject the first fluid into the inlet conduit 10 downstream of the source 4 and to drive the first fluid in the passage duct 12.

3030049 7 Le module d'injection 6 comprend, par exemple, un pousse-seringue ou un contrôleur de flux basé sur la pression. Par exemple, le module d'injection 6 est propre à appliquer une différence de pression entre la première entrée 18 du conduit d'entrée 10 et la sortie principale 30.The injection module 6 comprises, for example, a syringe driver or a pressure controller based on the pressure. For example, the injection module 6 is adapted to apply a pressure difference between the first inlet 18 of the inlet duct 10 and the main outlet 30.

5 L'outil de mesure 8 est, par exemple, un outil d'imagerie propre à former une image d'une partie du conduit de passage. En particulier, l'outil d'imagerie permet de visualiser la partie du conduit de passage 21 au niveau où le premier réactif réagit avec le deuxième réactif. Le fonctionnement du système 1 d'analyse va maintenant être décrit.The measuring tool 8 is, for example, an imaging tool capable of forming an image of a part of the passage duct. In particular, the imaging tool makes it possible to visualize the portion of the passage duct 21 at the level where the first reagent reacts with the second reagent. The operation of the analysis system 1 will now be described.

10 La source 4 est fournie. La puce 2 est fournie avec le réservoir 14 pré-rempli avec la solution pré-chargée comprenant le deuxième réactif. Le premier fluide est injecté dans le conduit d'entrée 10 à partir de la source 4 de premier fluide au moyen du module d'injection 6. Le premier fluide est mis en circulation dans le conduit de passage 12 jusqu'au 15 réservoir 14 par le module d'injection 6. Le premier fluide arrive au niveau du réservoir 14. Le premier fluide est mis en circulation dans le conduit d'entrée 10 puis dans le conduit de passage 12 par application d'une différence de pression imposée entre la première entrée 18 et la sortie principale 30 par le module d'injection 8.Source 4 is provided. The chip 2 is supplied with the tank 14 pre-filled with the pre-charged solution comprising the second reagent. The first fluid is injected into the inlet duct 10 from the source 4 of the first fluid by means of the injection module 6. The first fluid is circulated in the passage duct 12 to the reservoir 14 by the injection module 6. The first fluid arrives at the reservoir 14. The first fluid is circulated in the inlet duct 10 and then in the passage duct 12 by applying a pressure difference imposed between the first input 18 and the main output 30 by the injection module 8.

20 Quand le conduit de passage 12 est rempli, la circulation du premier fluide est stoppée par le module d'injection 8. La solution pré-chargée diffuse depuis le réservoir 14 jusque dans le conduit de passage 12. Le premier réactif réagit avec le deuxième réactif dans le conduit de passage 21.When the passage duct 12 is filled, the circulation of the first fluid is stopped by the injection module 8. The pre-charged solution diffuses from the reservoir 14 into the passage duct 12. The first reagent reacts with the second reagent in the passageway 21.

25 La réaction entre le premier réactif et le deuxième réactif forme un gel dans le conduit de passage 12. La zone du conduit de passage 12 où s'effectue la réaction entre le premier réactif et le deuxième réactif est par exemple observée par au moyen de l'outil de mesure 8. Dans une première application du premier système d'analyse et de culture 30 cellulaire 1, le premier fluide comprend un échantillon contenant une pluralité de cellules en suspension. La pluralité de cellules en suspension est constituée, par exemple, de micro-organismes à étudier. En variante ou en complément, le premier fluide contient également un milieu de culture. Les différents constituants du premier fluide sont par exemple mélangés dans le 35 récipient de la source 4 avant leur injection dans la puce 2.The reaction between the first reagent and the second reagent forms a gel in the passage duct 12. The zone of the passage duct 12 where the reaction between the first reagent and the second reagent takes place is for example observed by means of In a first application of the first analysis and cell culture system 1, the first fluid comprises a sample containing a plurality of cells in suspension. The plurality of cells in suspension consists, for example, of microorganisms to be studied. Alternatively or additionally, the first fluid also contains a culture medium. The various constituents of the first fluid are, for example, mixed in the container of the source 4 before they are injected into the chip 2.

3030049 8 Au cours de la réaction entre le premier et le deuxième réactif, des cellules sont immergées dans le gel en formation. La puce 2 est avantageusement placée dans un incubateur après le remplissage du conduit de passage 12. L'incubateur maintient par exemple la puce 2 à une 5 température constante adaptée à la croissance des colonies. En variante ou en complément, notamment lorsque la puce est en matériau perméable comme le PDMS, l'incubateur maintient la puce 2 à une hydrométrie constante adaptée à la croissance des colonies. Les cellules se multiplient dans le gel et forment des micro-colonies.During the reaction between the first and the second reagent, cells are immersed in the forming gel. The chip 2 is advantageously placed in an incubator after the filling of the passage conduit 12. The incubator maintains for example the chip 2 at a constant temperature adapted to the growth of the colonies. As a variant or in addition, especially when the chip is made of a permeable material such as PDMS, the incubator keeps the chip 2 at a constant hydrometry adapted to the growth of the colonies. The cells multiply in the gel and form micro-colonies.

10 Les micro-colonies peuvent être visualisées par imagerie microscopique à travers la puce 4 par exemple par l'outil de mesure 8. Avantageusement les micro-colonies sont révélées par des agents de marquage. Le cas échéant, le milieu de culture comprend les agents de marquage et l'outil de mesure est adapté au marquage utilisé.The micro-colonies can be visualized by microscopic imaging through the chip 4, for example by the measuring tool 8. Advantageously, the micro-colonies are revealed by labeling agents. Where appropriate, the culture medium comprises the marking agents and the measuring tool is adapted to the marking used.

15 Les agents de marquages sont, par exemple, des colorants ou des marqueurs vitaux fluorescents ou de bioluminescence. Dans un exemple, le premier fluide contient de la luciférase « firefly » ou son substrat la D-luciférine permettant de détecter l'ATP. Par exemple, l'outil de mesure est apte à mesurer l'intensité de fluorescence dans la longueur d'onde correspondant aux marquages utilisés.The labeling agents are, for example, dyes or fluorescent or bioluminescent vital markers. In one example, the first fluid contains firefly luciferase or its substrate D-luciferin for detecting ATP. For example, the measurement tool is able to measure the fluorescence intensity in the wavelength corresponding to the markings used.

20 Dans une deuxième application, le premier fluide comprend un échantillon contenant une pluralité de cellules en suspension, et la solution pré-chargée du réservoir 14 comprend un milieu sélectif de croissance des cellules. Le procédé d'analyse comprend une étape de détermination d'un paramètre représentatif de l'effet du milieu sélectif sur au moins une cellule. Par exemple, si le milieu 25 sélectif comprend un antibiotique, le compte du nombre de colonies en croissance permet de déterminer un paramètre représentatif de l'effet de l'antibiotique sur la cellule. En outre, une étude de la dispersion de taille des colonies permet d'obtenir des informations complémentaires sur l'effet du milieu sélectif. Un deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 va à présent être décrit 30 en référence aux figures 2 à 7. Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 diffère du premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 en ce que le système 40 comprend deux sources distinctes dont une source 4 pour le premier fluide et une source pour l'échantillon contenant une pluralité de cellules en suspension. En outre, le conduit d'entrée 10 comporte une deuxième entrée 42 reliée à la source d'échantillon.In a second application, the first fluid comprises a sample containing a plurality of cells in suspension, and the pre-loaded solution of the reservoir 14 comprises a selective cell growth medium. The analysis method comprises a step of determining a parameter representative of the effect of the selective medium on at least one cell. For example, if the selective medium comprises an antibiotic, counting the number of growing colonies makes it possible to determine a parameter representative of the effect of the antibiotic on the cell. In addition, a study of the colony size dispersion provides additional information on the effect of the selective medium. A second cell culture and analysis system 40 will now be described with reference to FIGS. 2-7. The second analysis and cell culture system 40 differs from the first cell culture and analysis system 1 in that the system 40 comprises two separate sources including a source 4 for the first fluid and a source for the sample containing a plurality of cells in suspension. In addition, the inlet duct 10 has a second inlet 42 connected to the sample source.

35 Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 diffère également en ce que la puce 44 comprend une pluralité de conduits de passage 12 parallèles et pour 3030049 9 chaque conduit de passage 12, un réservoir 14 distinct, comprenant une solution pré-chargée associée au conduit de passage 12. La sortie du conduit d'entrée 10 débouche dans chacun des conduits de passage 12. La structure de la puce 44 va être détaillée en référence aux figures 2 à 5.The second cell culture and analysis system 40 also differs in that the chip 44 comprises a plurality of parallel passageways 12 and for each passageway 12 a separate reservoir 14 comprising a preloaded solution associated with the passage duct 12. The output of the inlet duct 10 opens into each of the passage ducts 12. The structure of the chip 44 will be detailed with reference to Figures 2 to 5.

5 La puce 44 présente une forme de bloc rectangulaire allongé selon l'axe longitudinal X et aplati selon la direction d'élévation Z. La puce 44 présente une paroi inférieure 46 et une paroi supérieure 48. La première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 30 débouchent par la paroi supérieure 48 comme représenté sur la figure 5.The chip 44 has a rectangular block shape elongate along the longitudinal axis X and flattened in the elevation direction Z. The chip 44 has a bottom wall 46 and an upper wall 48. The first inlet 18, the second inlet 42 and the main outlet 30 open through the upper wall 48 as shown in FIG. 5.

10 La paroi inférieure 46 de la puce 44 est optiquement transparente au moins au niveau des conduits de passage 12 et au moins dans la plage de longueur d'onde utile pour l'outil de mesure 8. En référence à la figure 2, la première entrée 18 présente dans le sens amont vers aval, un premier canal droit de connexion 50 et une chambre 52.The lower wall 46 of the chip 44 is optically transparent at least at the passage ducts 12 and at least in the useful wavelength range for the measuring tool 8. Referring to FIG. input 18 has in the upstream to downstream direction a first connection straight channel 50 and a chamber 52.

15 Le premier canal droit 50 est étendu selon la direction d'élévation Z. La chambre 52 définit un logement présentant un premier volume. Le fond inférieur de la chambre 52 débouche dans la portion longitudinale 20 du conduit d'entrée 10. La chambre 52 permet l'alimentation en fluide pour remplir les conduits de passage 12.The first right channel 50 is extended in the elevation direction Z. The chamber 52 defines a housing having a first volume. The lower bottom of the chamber 52 opens into the longitudinal portion 20 of the inlet duct 10. The chamber 52 allows the supply of fluid to fill the passage ducts 12.

20 La deuxième entrée 42 présente, dans le sens amont vers aval, une ouverture évasée 54 et un deuxième canal droit 56. L'ouverture évasée 54 présente la forme d'un entonnoir de section axiale horizontale carrée. Cette forme est avantageuse car elle permet l'insertion rapide de l'échantillon dans la puce 44 et son guidage vers le conduit 12.The second inlet 42 has, in the upstream to downstream direction, a flared opening 54 and a second right channel 56. The flared opening 54 has the shape of a funnel of square horizontal axial section. This form is advantageous because it allows the rapid insertion of the sample into the chip 44 and its guidance towards the conduit 12.

25 Le deuxième canal droit 56 est étendu selon la direction d'élévation Z. Le deuxième canal droit 56 débouche dans la portion longitudinale 20 du conduit d'entrée 10. La deuxième entrée 42 débouche ainsi perpendiculairement dans la portion longitudinale 20 du conduit d'entrée 10. La jonction entre la deuxième entrée 42 et la portion longitudinale 20 est située en 30 aval de la jonction entre la première entrée 18 et la portion longitudinale 20. En outre le diamètre de la portion longitudinale 20 augmente en aval de la jonction entre la deuxième entrée 42 et la portion longitudinale 20. En aval de la jonction entre la deuxième entrée 42 et la portion longitudinale 20, la portion longitudinale du conduit d'entrée 10 présente avantageusement des dimensions 35 adaptées pour obtenir dans les conditions d'opération prévues un flux laminaire et un nombre de Reynolds peu élevé, par exemple, strictement inférieur à 10.The second right channel 56 is extended in the elevation direction Z. The second right channel 56 opens into the longitudinal portion 20 of the inlet duct 10. The second inlet 42 thus opens perpendicularly into the longitudinal portion 20 of the duct. The junction between the second inlet 42 and the longitudinal portion 20 is situated downstream of the junction between the first inlet 18 and the longitudinal portion 20. In addition, the diameter of the longitudinal portion 20 increases downstream of the junction between the second inlet 42 and the longitudinal portion 20. Downstream of the junction between the second inlet 42 and the longitudinal portion 20, the longitudinal portion of the inlet duct 10 advantageously has dimensions 35 adapted to obtain under the operating conditions provided for a laminar flow and a low Reynolds number, for example, strictly less than 10.

3030049 10 La sortie 22 du conduit d'entrée 10 est avantageusement en forme de pointe divergente vers l'aval, de sorte à distribuer le premier fluide et l'échantillon dans les différents conduits de passage 12 et à le répartir entre les conduits 12. La sortie 22 du conduit d'entrée 10 débouche dans chaque entrée 24 d'un conduit 5 de passage 12. Sur la figure 3, on observe plusieurs conduits de passage 12 parallèles, notamment un nombre compris entre 1 et 10. Les conduits de passage 12 sont délimités par des parois latérales 60. Les parois latérales 60 sont étanches de façon à isoler chaque conduit de passage 10 12 du conduit de passage 12 adjacent. Chaque conduit de passage 12 s'étend sensiblement selon une direction longitudinale X. La section de chaque conduit de passage 12 dans un plan transversal est par exemple carrée. Le diamètre de cette section est avantageusement inférieur à 1 mm.The outlet 22 of the inlet duct 10 is advantageously in the shape of a divergent tip downstream, so as to distribute the first fluid and the sample in the various passage ducts 12 and to distribute it between the ducts 12. The outlet 22 of the inlet duct 10 opens into each inlet 24 of a passage duct 12. In FIG. 3, several parallel passage ducts 12 are observed, in particular a number between 1 and 10. The ducts passing through 12 are delimited by side walls 60. The side walls 60 are sealed so as to isolate each passage duct 12 12 from the adjacent duct 12. Each passage duct 12 extends substantially in a longitudinal direction X. The section of each passage duct 12 in a transverse plane is for example square. The diameter of this section is advantageously less than 1 mm.

15 Dans une variante, la section est circulaire. La longueur de chaque conduit de passage 12 est avantageusement supérieure à 1 cm. En outre la distance entre les conduits de passage 12 les plus éloignés est avantageusement inférieure au champ de l'outil d'imagerie 8 de sorte que tous les 20 conduits de passages 12 sont observables simultanément. En variante, si la distance entre les conduits de passage 12 les plus éloignés est plus large, l'outil d'imagerie prend une série d'images permettant de couvrir l'ensemble des conduits de passage 12. Chaque conduit de passage 12 est associé à un réservoir 14 propre.In a variant, the section is circular. The length of each passage duct 12 is advantageously greater than 1 cm. In addition, the distance between the most distant passage ducts 12 is advantageously less than the field of the imaging tool 8 so that all the passage ducts 12 are observable simultaneously. Alternatively, if the distance between the most distant passage ducts 12 is wider, the imaging tool takes a series of images to cover all the passage ducts 12. Each passage duct 12 is associated to a tank 14 clean.

25 Avantageusement, chaque réservoir 14 est pré-rempli avec un milieu sélectif différent. Les milieux sélectifs peuvent, par exemple, comprendre du milieu contenant différents antibiotiques à différentes concentrations. Chaque réservoir 14 comprend une entrée a et une sortie [3 telle que représentée sur les figures 6 et 7. Les entrées a et sorties [3 de réservoirs 14 sont scellées et non 30 représentées sur les figures 2 à 5. Chaque réservoir 14 s'étend selon une direction longitudinale au-dessus du conduit de passage 12 associé. Le réservoir 14 débouche dans le conduit de passage 12 par une ouverture inférieure d'aire horizontale avantageusement inférieure ou égale à l'aire horizontale du 35 conduit de passage 12. Avantageusement, les dimensions et le positionnement de l'ouverture inférieure du réservoir 14 sont adaptés pour limiter la diffusion du contenu des 3030049 11 réservoirs 14 d'un conduit de passage 12 à un autre. Par exemple, l'ouverture inférieure du réservoir 14 est centrée entre l'entrée 24 et la sortie 26 du conduit de passage 12 associé. Dans la puce du deuxième système 40, les réservoirs 14 sont fermés par une 5 membrane 62 destinée à séparer les réservoirs 14 des conduits de passage 12. La membrane 62 permet de délimiter le volume du réservoir 14. L'ouverture inférieure du réservoir 14 est ainsi fermée par la membrane 62, comme illustré sur les figures 2, 6 et 7. La membrane 62 sépare chaque réservoir 14 du conduit de passage 12 associé. Avantageusement, la membrane 62 est imperméable tant que le conduit de passage est 10 sec. Puis la membrane 62 est perméable si le conduit de passage 12 comporte un fluide : elle est propre à laisser diffuser une partie de la solution pré chargée, par exemple le deuxième réactif. Chaque sortie 26 du conduit de passage 12 débouche dans l'entrée 28 du conduit de sortie 16.Advantageously, each reservoir 14 is pre-filled with a different selective medium. The selective media may, for example, comprise medium containing different antibiotics at different concentrations. Each reservoir 14 comprises an inlet a and an outlet [3 as shown in FIGS. 6 and 7. The inlet and outlet inlets [3 of reservoirs 14 are sealed and not shown in FIGS. 2 to 5. Each reservoir 14 is extends in a longitudinal direction above the associated passage duct 12. The tank 14 opens into the passage duct 12 through a lower horizontal area opening advantageously less than or equal to the horizontal area of the passage duct 12. Advantageously, the dimensions and the positioning of the lower opening of the tank 14 are adapted to limit the diffusion of the contents of the reservoirs 14 of a passage conduit 12 to another. For example, the lower opening of the reservoir 14 is centered between the inlet 24 and the outlet 26 of the associated passage duct 12. In the chip of the second system 40, the reservoirs 14 are closed by a membrane 62 intended to separate the reservoirs 14 from the passage ducts 12. The membrane 62 makes it possible to define the volume of the reservoir 14. The lower opening of the reservoir 14 is thus closed by the membrane 62, as shown in Figures 2, 6 and 7. The membrane 62 separates each reservoir 14 of the associated passage conduit 12. Advantageously, the membrane 62 is impervious as long as the passage duct is dry. Then the membrane 62 is permeable if the passage duct 12 comprises a fluid: it is able to let some of the pre-filled solution, for example the second reagent, diffuse. Each outlet 26 of the passage duct 12 opens into the inlet 28 of the outlet duct 16.

15 L'entrée 28 du conduit de sortie 16 présente une forme de pointe convergente de sorte à recevoir les fluides des différents conduits de passage 12. Le conduit de sortie 16 comporte, en outre, une chambre 64 entre l'entrée 28 du conduit de sortie 16 et la sortie principale 30. La sortie principale 30 présente un canal s'étendant selon la direction d'élévation.The inlet 28 of the outlet duct 16 has a convergent tip shape so as to receive the fluids from the different passage ducts 12. The outlet duct 16 further comprises a chamber 64 between the inlet 28 of the duct output 16 and the main output 30. The main output 30 has a channel extending in the direction of elevation.

20 L'entrée 28 du conduit de sortie 16 débouche dans le fond de la chambre 64 du conduit de sortie 16. La chambre 64 du conduit de sortie présente avantageusement un volume similaire à la chambre 52 de la première entrée 18. La chambre 64 du conduit de sortie permet la récupération de l'excès de fluide introduit pour remplir les conduits de passage 12.The inlet 28 of the outlet duct 16 opens into the bottom of the chamber 64 of the outlet duct 16. The chamber 64 of the outlet duct advantageously has a volume similar to the chamber 52 of the first inlet 18. The chamber 64 of the outlet duct allows the recovery of excess fluid introduced to fill the passage ducts 12.

25 En outre, la solution pré-chargée comprend un milieu de culture sélectif. Par exemple, le réservoir 14 comprend un antibiotique à une concentration choisie. Le réservoir 14 est avantageusement pré-chargé avant le chargement de l'échantillon. Un exemple de méthode fabrication de la puce 44 va maintenant être décrit en référence aux figures 6 et 7.In addition, the preloaded solution comprises a selective culture medium. For example, reservoir 14 includes an antibiotic at a selected concentration. The reservoir 14 is advantageously pre-loaded before the sample is loaded. An example of a method for manufacturing chip 44 will now be described with reference to FIGS. 6 and 7.

30 La puce 44 telle que représentée sur la figure 2 est avantageusement formée d'une demi-puce inférieure 70 et une demi-puce supérieure 72. Une partie de la demi-puce supérieure 72 est représentée sur les figures 6 et 7. Les deux demi-puces 70, 72 lorsqu'elles sont assemblées forment la puce 44 représentée sur les figures 2 à 5.The chip 44 as shown in FIG. 2 is advantageously formed of a lower half-chip 70 and an upper half-chip 72. A portion of the upper half-chip 72 is shown in FIGS. half-chips 70, 72 when assembled form the chip 44 shown in Figures 2 to 5.

35 Chaque demi-puce 70, 72 comporte une paroi inférieure et une paroi supérieure.Each half-chip 70, 72 has a bottom wall and a top wall.

3030049 12 La paroi inférieure de la demi-puce inférieure 70 est la paroi inférieure 46 de la puce 44. La paroi supérieure de la demi-puce supérieure 72 est la paroi supérieure 48 de la puce 44. La paroi inférieure de la demi-puce supérieure est destinée à être en contact avec 5 la paroi supérieure de la demi-puce inférieure. Chaque demi-puce 70, 72 présente des formes complémentaires de sorte à définir les conduits 10, 12, 16 lorsque les demi-puces 70, 72 sont assemblées pour former la puce 44 entière. La première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 30 débouchent 10 dans la paroi supérieure 48 de la demi-puce supérieure 72. La demi-puce supérieure 72 comporte en outre les réservoirs 14. Les deux demi-puces 70, 72 sont, par exemple, réalisées dans le même matériau, par exemple, un élastomère, notamment du polydiméthylsiloxane (PDMS). Les deux demi-puces 70, 72 sont par exemple collées, par exemple, avec un 15 traitement plasma. Dans un premier temps, une demi-puce supérieure 72 est fournie. La demi-puce supérieure 72 est assemblée à la demi-puce inférieure 70, de façon à former une puce 44 dans laquelle chaque réservoir 14 débouche dans un conduit de passage 12.The lower wall of the lower half-chip 70 is the lower wall 46 of the chip 44. The upper wall of the upper half-chip 72 is the upper wall 48 of the chip 44. The lower wall of the half-chip upper is intended to be in contact with the upper wall of the lower half-chip. Each half-chip 70, 72 has complementary shapes so as to define the ducts 10, 12, 16 when the half-chips 70, 72 are assembled to form the entire chip 44. The first inlet 18, the second inlet 42 and the main outlet 30 open into the upper wall 48 of the upper half-chip 72. The upper half-chip 72 further comprises the reservoirs 14. The two half-chips 70, 72 are, for example, made of the same material, for example, an elastomer, especially polydimethylsiloxane (PDMS). The two half-chips 70, 72 are for example glued, for example, with a plasma treatment. At first, an upper half-chip 72 is provided. The upper half-chip 72 is connected to the lower half-chip 70, so as to form a chip 44 in which each reservoir 14 opens into a passage duct 12.

20 Chaque réservoir 14 est chargé avec une solution comprenant un deuxième réactif. Chaque solution est injectée dans le réservoir 14 par son entrée a, par exemple au moyen du module d'injection 8. Avantageusement, l'étape de remplissage de chaque réservoir 14 est effectuée après le collage de la demi-puce inférieure 70 sur la demi-puce supérieure 72.Each reservoir 14 is charged with a solution comprising a second reagent. Each solution is injected into the reservoir 14 via its inlet a, for example by means of the injection module 8. Advantageously, the step of filling each reservoir 14 is performed after the bonding of the lower half-chip 70 to the half upper chip 72.

25 En variante, la demi-puce inférieure 70 est collée à la demi-puce supérieure 72 après le remplissage. En attendant l'utilisation de la puce 44 avec les réservoirs 14 pré-remplis, les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14, la première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 44 sont scellées de façon à limiter l'évaporation ou les fuites lors de 30 déplacements de la puce 44 ou pendant le stockage de la puce 44. Lorsque le conduit de passage 12 situé sous la membrane 62 est rempli de fluide, la membrane 62 laisse diffuser la solution pré-chargée du réservoir 14 associé jusque dans le conduit de passage 12. Le fonctionnement du deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 va 35 maintenant être décrit. Le fonctionnement diffère du fonctionnement précédemment décrit 3030049 13 en ce que chaque réservoir 14 est pré-rempli avec une solution pré-chargée comprenant le deuxième réactif. Les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14, la première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 30 sont par exemple scellées lors de la conservation de la 5 puce. Le cas échéants, la première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 40 sont descellées. Les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14 restent avantageusement scellées. L'échantillon de cellules est chargé par la deuxième entrée 42. Le premier fluide est chargé depuis la source 4 par la première entrée 18. Le premier fluide et l'échantillon 10 sont mis en circulation par le module d'injection 6. En particulier, la chambre 52 de la première entrée 18 est remplie de premier fluide. Le premier fluide et l'échantillon sont transportés dans le conduit d'entrée 10 après la zone de jonction.Alternatively, the lower half-chip 70 is glued to the upper half-chip 72 after filling. While waiting for the use of the chip 44 with the pre-filled tanks 14, the inputs and outputs [3 of the tanks 14, the first inlet 18, the second inlet 42 and the main outlet 44 are sealed so as to limit the evaporation or leakage during the displacement of the chip 44 or during the storage of the chip 44. When the passage duct 12 located under the membrane 62 is filled with fluid, the membrane 62 allows the pre-charged solution of the reservoir 14 to diffuse. associated with the passageway 12. The operation of the second analysis and cell culture system 40 will now be described. The operation differs from the previously described operation in that each reservoir 14 is pre-filled with a preloaded solution comprising the second reagent. The inlets and outlets [3 of the tanks 14, the first inlet 18, the second inlet 42 and the main outlet 30 are for example sealed during the conservation of the chip. In the case, the first input 18, the second input 42 and the main output 40 are unsealed. The inlets and outlets [3 of the tanks 14 remain advantageously sealed. The sample of cells is loaded by the second inlet 42. The first fluid is charged from the source 4 by the first inlet 18. The first fluid and the sample 10 are circulated by the injection module 6. In particular the chamber 52 of the first inlet 18 is filled with first fluid. The first fluid and the sample are transported into the inlet duct 10 after the junction zone.

15 Le premier fluide arrive dans chaque conduit de passage 12 jusqu'au niveau des réservoirs 14. La circulation est stoppée quand le conduit de passage 14 est rempli de fluide. La puce 44 est par exemple placée dans un incubateur. Chaque solution pré-chargée diffuse depuis les réservoirs 14 jusque dans le 20 conduit de passage 12. Dans l'exemple où chaque réservoir 14 contient un milieu sélectif différent, l'observation des colonies dans chaque conduit de passage 12 permet de comparer l'effet de chaque milieu sélectif. La puce permet d'obtenir des données multiples dans des conditions similaires.The first fluid arrives in each passage duct 12 to the level of the tanks 14. The circulation is stopped when the passage duct 14 is filled with fluid. The chip 44 is for example placed in an incubator. Each pre-charged solution diffuses from the tanks 14 into the passageway 12. In the example where each reservoir 14 contains a different selective medium, the observation of the colonies in each passageway 12 makes it possible to compare the effect of each selective medium. The chip makes it possible to obtain multiple data under similar conditions.

25 Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 44 permet d'analyser plusieurs milieux sélectifs en même temps à partir du même échantillon et dans les mêmes conditions de culture. Ceci est très avantageux pour limiter les variations expérimentales et avoir des données plus représentatives. Un troisième système d'analyse et de culture cellulaire va à présent être décrit. La 30 puce de ce troisième système diffère de la puce 44 du deuxième système en ce que le réservoir 14 n'est pas délimité par une membrane 62. La puce de ce troisième système d'analyse est avantageusement formée d'une demi-puce inférieure 70 et une demi-puce supérieure 84. La demi-puce supérieure 84 de ce troisième système d'analyse est illustrée sur les figures 8 et 9.The second cell culture and analysis system 44 allows several selective media to be analyzed at the same time from the same sample and under the same culture conditions. This is very advantageous for limiting experimental variations and having more representative data. A third system of analysis and cell culture will now be described. The chip of this third system differs from the chip 44 of the second system in that the reservoir 14 is not delimited by a membrane 62. The chip of this third analysis system is advantageously formed of a lower half-chip. 70 and an upper half-chip 84. The upper half-chip 84 of this third analysis system is illustrated in FIGS. 8 and 9.

35 En outre, tel que représentée sur la figure 9, chaque réservoir 14 présente dans un plan transversal, une section transversale en forme de T. Les branches 82 horizontales 3030049 14 du T s'étendent selon la direction Y. Ces branches 82 facilitent la retenue de la solution pré-chargée dans le réservoir 14. Le tronc vertical du T permet la jonction avec le conduit de passage 12. En variante, les réservoirs 14 présentent une section transversale en forme de rectangle ou autre.Furthermore, as shown in FIG. 9, each reservoir 14 has a T-shaped cross-section in a transverse plane. The T horizontal branches 82 extend in the Y direction. retention of the pre-loaded solution in the reservoir 14. The vertical trunk of the T allows the junction with the passage conduit 12. Alternatively, the tanks 14 have a cross section in the form of a rectangle or the like.

5 Une méthode de fabrication de la puce du troisième système d'analyse et de culture cellulaire 80 va maintenant être décrite, en regard des figures 8 et 9. Dans un premier temps, une demi-puce supérieure 84 est fournie. La demi-puce supérieure 84 diffère de la demi-puce supérieure 72 précédemment décrite en ce qu'elle ne comporte pas de membrane 62. En outre, les réservoirs 14 de la demi-puce présentent 10 une section transversale en forme de T. La méthode diffère en ce que le remplissage des réservoirs 14 est effectué avant la fermeture de la demi-puce supérieure 84 par la demi-puce inférieure 70. La demi-puce supérieure 84 est fermée temporairement par une paroi de barrage 86.A method of manufacturing the chip of the third analysis and cell culture system 80 will now be described, with reference to FIGS. 8 and 9. In a first step, an upper half-chip 84 is provided. The upper half-chip 84 differs from the upper half-chip 72 previously described in that it has no membrane 62. In addition, the reservoirs 14 of the half-chip have a T-shaped cross-section. method differs in that the filling of the tanks 14 is performed before the closure of the upper half-chip 84 by the lower half-chip 70. The upper half-chip 84 is temporarily closed by a barrier wall 86.

15 Dans un exemple, quand la demi-puce supérieure 84 est fabriquée dans un matériau dur, la paroi de barrage 86 est avantageusement en matériau élastomérique, de façon à voir une étanchéité entre la demi-puce supérieure 84 et la paroi de barrage 86 par simple application de pression. Inversement, si la demi-puce supérieure 84 est en matériau élastomérique, la paroi de barrage 86 est en matériau dur.In one example, when the upper half-chip 84 is made of a hard material, the barrier wall 86 is preferably made of elastomeric material, so as to see a seal between the upper half-chip 84 and the barrier wall 86. simple pressure application. Conversely, if the upper half-chip 84 is of elastomeric material, the barrier wall 86 is made of hard material.

20 Une pression est appliquée pour sceller la paroi de barrage 86 contre la demi-puce supérieure 84. La méthode diffère en ce que chaque réservoir 14 est chargé avec une solution comprenant en outre des précurseurs d'un gel de maintien. Le gel de maintien est propre à maintenir la solution pré-chargée dans le réservoir 25 14 tant que le conduit de passage 12 est sec. Puis le gel de maintien est propre à relarguer une partie de la solution pré-chargée, si le conduit de passage 12 comporte un fluide. Après le remplissage, les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14 sont scellées. Un gel de maintien est formé dans les réservoirs 14 à partir des précurseurs de gel 30 de maintien. Le reste de la solution pré-chargée, notamment le deuxième réactif reste maintenu dans le gel de maintien. Dans un exemple, le gel de maintien est un gel de gélatine. Le réservoir 14 est chargé avec une solution comprenant de la gélatine. Le réservoir 14 est chargé à une température où le précurseur de gel de maintien est fluide. Puis la température est 35 diminuée en dessous de la température de gélification du gel de maintien de sorte que le 3030049 15 gel de maintien se forme dans le réservoir. En variante, le gel de maintien est un gel d'agar agar formé à partir d'un refroidissement d'une solution d'agar agar. Dans un autre exemple, le gel de maintien est un gel de polyacrylamide. Après le remplissage du réservoir 14 avec une solution comprenant des agents de réticulations. Le 5 gel de maintien est formé après un temps d'attente permettant la diffusion des agents de réticulation. Dans un autre exemple, le gel est un hydrogel de Poly(éthylène-glycol)-diacrylate (PEGDA). Après le remplissage des réservoirs 14, une irradiation aux rayons UV est appliquée sur la demi-puce 84 pour permettre la formation et la réticulation des hydrogels 10 de PEG-DA dans les réservoirs 14. La paroi de barrage 86 est ensuite retirée. Puis la demi-puce inférieure 70 est assemblée à la demi-puce supérieure 84 pour fermer la puce. Lorsque le conduit de passage 12 situé sous le réservoir 14 est rempli de fluide, le 15 gel de maintien laisse diffuser la solution pré-chargée du réservoir 14 associé jusque dans le conduit de passage 12. Les systèmes d'analyse et de culture cellulaire 1, 40, 80 selon l'invention permettent donc de réaliser une observation de culture de cellules immergées en micro-colonie. De plus, le système 40, 80 permet de tester différentes conditions de culture 20 simultanément. Dans un exemple particulier, chaque réservoir 14 est pré-rempli avec une solution d'antibiotique avec une concentration différente. Ceci permet d'effectuer une gamme afin de connaitre la concentration efficace pour limiter la croissance d'une colonie bactérienne particulière et de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l'antibiotique.Pressure is applied to seal the barrier wall 86 against the upper half-chip 84. The method differs in that each reservoir 14 is loaded with a solution further comprising precursors of a holding gel. The holding gel is able to maintain the pre-charged solution in the reservoir 14 as long as the passage conduit 12 is dry. Then the holding gel is able to salve a part of the pre-charged solution, if the passage conduit 12 comprises a fluid. After filling, the inlets and outlets [3 of the tanks 14 are sealed. A holding gel is formed in the reservoirs 14 from the holding gel precursors. The remainder of the pre-loaded solution, especially the second reagent, remains in the holding gel. In one example, the holding gel is a gelatin gel. The reservoir 14 is loaded with a solution comprising gelatin. The reservoir 14 is charged to a temperature where the holding gel precursor is fluid. Then, the temperature is lowered below the gelation temperature of the holding gel so that the holding gel is formed in the reservoir. Alternatively, the holding gel is an agar gel formed from cooling an agar agar solution. In another example, the holding gel is a polyacrylamide gel. After filling the reservoir 14 with a solution comprising crosslinking agents. The holding gel is formed after a waiting time permitting diffusion of the crosslinking agents. In another example, the gel is a poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogel. After filling the reservoirs 14, UV irradiation is applied to the half-chip 84 to allow formation and crosslinking of the PEG-DA hydrogels in the reservoirs 14. The barrier wall 86 is then removed. Then the lower half-chip 70 is connected to the upper half-chip 84 to close the chip. When the passage duct 12 located under the reservoir 14 is filled with fluid, the holding gel allows the pre-charged solution of the associated reservoir 14 to diffuse into the passage duct 12. The analysis and cell culture systems 1 , 40, 80 according to the invention therefore make it possible to perform a culture observation of cells immersed in micro-colony. In addition, the system 40, 80 makes it possible to test different culture conditions simultaneously. In a particular example, each reservoir 14 is pre-filled with an antibiotic solution with a different concentration. This makes it possible to perform a range in order to know the effective concentration to limit the growth of a particular bacterial colony and to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotic.

25 Le système et le procédé selon l'invention sont très avantageux pour déterminer rapidement et détecter rapidement l'efficacité et les gammes d'efficacités de milieu sélectif à l'encontre de la croissance de micro-organismes. A l'inverse, le système permet également de connaitre les conditions améliorant la croissance de micro-organismes.The system and method according to the invention are very advantageous for rapidly determining and rapidly detecting the efficacy and range of efficiencies of selective medium against the growth of microorganisms. Conversely, the system also allows to know the conditions improving the growth of microorganisms.

30 En outre, d'autres facteurs peuvent également être testés en modifiant la composition de la solution préchargée ou du premier fluide. En variante ou en complément, avant le remplissage des conduits de passage 12, chaque réservoir 14 maintient la solution pré-chargée par des forces capillaires. Par exemple, le réservoir 14 contient un support poreux pour le maintien de la solution 35 préchargée. Dans ce cas la forme du réservoir 14 est adaptée pour renforcer l'effet de capillarité.In addition, other factors may also be tested by changing the composition of the preloaded solution or the first fluid. Alternatively or additionally, before the filling of the passage ducts 12, each reservoir 14 maintains the preloaded solution by capillary forces. For example, the reservoir 14 contains a porous support for holding the preloaded solution. In this case the shape of the reservoir 14 is adapted to enhance the capillary effect.

3030049 16 En variante, les cellules sont des cellules de culture primaires issues d'une biopsie d'un organisme. En variante, les cellules sont des cellules cancéreuses ou des cellules de lignées cellulaires. En variante, le nombre et la disposition des conduits de passage 12 sont 5 différents. En variante chaque réservoir 14 s'étend selon une direction longitudinale au-dessous du conduit de passage 12 associé. En variante d'autres compositions de polymères sont utilisés pour fabriquer des gels compatibles avec l'invention, soit le gel dans le conduit de passage 12, soit le gel de 10 maintien. Les gels sont des gels en polymères naturels, des gels en polymères synthétiques ou des combinaisons de gels de polymères synthétiques et naturels. Une liste non exhaustive de polymères permettant la formation de gels compatible avec des applications biomédicales est décrite dans l'article « hydrogels for biomedical 15 applications » de Hoffman AS paru en 2002 dans Advanced Drug Delivery Reviews. Le gel de maintien et le gel produit par la réaction du premier réactif et du deuxième réactif est par exemple un gel physique, c'est-à-dire un gel dont la structure en réseau est maintenue par des enchevêtrements moléculaires et/ou par des forces secondaires incluant des forces hydrophobiques, des forces ioniques ou 20 des forces de liaison hydrogène. Les gels de maintien et les gels formés par la réaction du premier réactif et du deuxième réactif sont en variante des gels chimiques c'est-à-dire des gels contenant des réseaux réticulés par des liaisons covalentes. Ces gels peuvent être synthétisés de différentes façons.Alternatively, the cells are primary culture cells derived from a biopsy of an organism. Alternatively, the cells are cancer cells or cells of cell lines. Alternatively, the number and arrangement of the passage ducts 12 are different. As a variant, each tank 14 extends in a longitudinal direction below the associated passage duct 12. Alternatively other polymer compositions are used to make gels compatible with the invention, either the gel in the passage conduit 12 or the holding gel. The gels are natural polymer gels, synthetic polymer gels or combinations of synthetic and natural polymer gels. A non-exhaustive list of polymers allowing the formation of gels compatible with biomedical applications is described in the article "hydrogels for biomedical 15 applications" of Hoffman AS published in 2002 in Advanced Drug Delivery Reviews. The maintenance gel and the gel produced by the reaction of the first reagent and the second reagent is, for example, a physical gel, that is to say a gel whose network structure is maintained by molecular entanglements and / or by secondary forces including hydrophobic forces, ionic forces or hydrogen bonding forces. The maintenance gels and the gels formed by the reaction of the first reagent and the second reagent are alternatively chemical gels, that is to say gels containing networks crosslinked by covalent bonds. These gels can be synthesized in different ways.

25 Les gels physiques sont, par exemple, former par chauffage d'une solution de polymère. En variante, le gel physique est formé par refroidissement d'une solution de polymères comme pour un gel d'agarose ou de gélatine dans l'eau. En variante, le gel physique est formé par réticulation d'un polymère dans 30 une solution aqueuse par application de cycles de congélation/décongélation aboutissant à la formation de microcristaux de polymères, comme pour un gel de PVA dans une solution aqueuse. En variante, le gel physique est formé par diminution du pH, notamment pour former un gel maintenu par liaison hydrogène entre deux polymères différents dans 35 une solution aqueuse.The physical gels are, for example, formed by heating a polymer solution. Alternatively, the physical gel is formed by cooling a solution of polymers such as for an agarose or gelatin gel in water. Alternatively, the physical gel is formed by crosslinking a polymer in an aqueous solution by applying freeze / thaw cycles resulting in the formation of polymer microcrystals, such as for a PVA gel in an aqueous solution. Alternatively, the physical gel is formed by lowering the pH, especially to form a gel maintained by hydrogen bonding between two different polymers in an aqueous solution.

3030049 17 En variante, le gel physique est un coacervat formé par mélange d'une solution de polyanion et d'une solution de polycation, comme de l'alginate de sodium avec de la polylysine). En variante, le gel physique est formé par addition d'une solution de 5 polyélectrolite à un ion multivalent de charge opposée, comme par exemple la solution du polyélectrolite de d'alginate de sodium à laquelle est ajoutée l'ion multivalent Ca2+ avec du chlorure. Les gels chimiques sont par exemple formés par réticulation de polymères à l'état solide ou en solution.Alternatively, the physical gel is a coacervate formed by mixing a solution of polyanion and a polycation solution, such as sodium alginate with polylysine). Alternatively, the physical gel is formed by adding a polyelectrolite solution to a multivalent ion of opposite charge, such as, for example, the sodium alginate polyelectrolite solution to which the multivalent Ca 2+ ion is added with chloride. . The chemical gels are, for example, formed by crosslinking polymers in the solid state or in solution.

10 Par exemple, les gels chimiques sont formés par radiation en lumière visible ou aux ultraviolets.En variante, le gel chimique est formé par réticulation chimique, comme, par exemple le collagène qui est traité avec du glutaraldéhyde ou un biépoxyde. Le gel chimique est par exemple formé en utilisant des réactifs à plusieurs 15 fonctions. Le gel chimique est par exemple formé en polymérisant un monomère avec un réticulant en solution. En variante, le gel chimique est formé en copolymérisant un monomère avec un macromère multifonctionnel. En variante le gel chimique est formé par polymérisation d'un monomère 20 avec un polymère solide différent pour former un gel IPN. En variante le gel chimique est formé par conversion chimique d'un polymère hydrophobe en hydrogel. Le gel de maintien dans les réservoirs 14 est par exemple formé par l'une quelconque des méthodes précédentes.For example, the chemical gels are formed by visible light or ultraviolet radiation. Alternatively, the chemical gel is formed by chemical crosslinking, such as, for example, collagen which is treated with glutaraldehyde or biepoxide. The chemical gel is for example formed using multi-functional reagents. The chemical gel is for example formed by polymerizing a monomer with a crosslinking agent in solution. Alternatively, the chemical gel is formed by copolymerizing a monomer with a multifunctional macromer. Alternatively, the chemical gel is formed by polymerizing a monomer with a different solid polymer to form an IPN gel. Alternatively the chemical gel is formed by chemical conversion of a hydrophobic polymer to a hydrogel. The holding gel in the reservoirs 14 is for example formed by any of the preceding methods.

25 En revanche, le gel formé dans le conduit de passage 12 est formé par des méthodes de gélification compatible avec la présence de cellules. Les méthodes de gélification qui risquent d'endommager les types cellulaires comme les méthodes basées sur un chauffage au-dessus de 37°, ou sur des cycles de congélation/décongélation ne sont pas appliquées pour la création des gels dans 30 les conduits de passage 12. Avantageusement, le gel formé dans les conduits de passage 12 est soit un gel d'alginate de calcium formé en mélangeant une solution aqueuse de chlorure de calcium avec une solution d'alginate de sodium soit un hydrogel de PEG DA formé en mélangeant du PEG DA avec un photo initiateur par exemple le 2,2 diméthoxy 2- 35 phényl acétophénone. Le gel PEG DA est ensuite avantageusement exposé à la lumière visible pour réticuler. En variante, le gel est exposé aux UVs.In contrast, the gel formed in the passageway 12 is formed by gelation methods compatible with the presence of cells. Gelling methods that may damage cell types such as heating above 37 °, or freeze / thaw cycles are not applied to the creation of gels in passageways. Advantageously, the gel formed in the passage ducts 12 is either a calcium alginate gel formed by mixing an aqueous solution of calcium chloride with a sodium alginate solution or a PEG DA hydrogel formed by mixing PEG. DA with an initiator photo for example 2,2 dimethoxy-2-phenyl acetophenone. The PEG DA gel is then advantageously exposed to visible light to crosslink. Alternatively, the gel is exposed to UVs.

3030049 18 Avantageusement, le premier réactif est le polymère et le deuxième réactif est un agent de réticulation ou un initiateur. Le polymère est conduit depuis la source 4 jusqu'au conduit de passage 12 et l'agent de réticulation ou l'initiateur diffuse depuis le gel préformé dans les réservoirs 14.Advantageously, the first reagent is the polymer and the second reagent is a crosslinking agent or an initiator. The polymer is conducted from the source 4 to the passageway 12 and the crosslinking agent or the initiator diffuses from the preformed gel into the tanks 14.

5 En variante, le polymère est le premier réactif et l'agent de réticulation ou le photo-initiateur est le deuxième réactif.Alternatively, the polymer is the first reagent and the crosslinking agent or photoinitiator is the second reagent.

Claims

CLAIMS 1. A cell culture and analysis system (1, 40) comprising: - a source (4) of a first fluid comprising a first reagent, - a chip (2, 44) comprising: - an inlet conduit (10) having a first inlet (18) connected to the source and an outlet (20), - at least one passage duct (12) of the first fluid, into which the outlet (20) of the inlet duct (10) opens. ), characterized in that the chip (2, 44) further comprises, for each passage duct (12): - a reservoir (14), the reservoir (14) opening into the passage duct (12), the reservoir (14) containing a preloaded solution, the preloaded solution comprising a second reagent capable of reacting with the first reagent in the passageway (12). 15

2. System (1, 40) according to claim 1, wherein the first reagent and the second reagent are capable of forming a gel in the passage duct (12), preferably a gel adapted to cell culture, especially an alginate gel. 20

The system (1, 40) according to any one of claims 1 or 2, wherein the first fluid further comprises a plurality of cells in suspension, the pre-charged solution of the reservoir (14) comprising a medium selective cell growth.

4. System (1, 40) according to any one of the preceding claims, 25 comprising an imaging tool (8) capable of forming an image of a portion of the passage duct (12) and advantageously capable of detecting micro-colonies in the passageway 12.

5. System (1, 40) according to any one of the preceding claims, in which the passage duct (12) of the first fluid is extended in a longitudinal direction (X) and the transverse dimensions of the passage duct (12). of the first fluid in the vicinity of the tank (14) are less than 1 mm.

The system (1, 40) according to any of the preceding claims, comprising an injection module (6) configured to inject the first fluid into the inlet conduit (10) downstream of the source. (4) and for driving the first fluid in the passage duct (12).

7. System (1, 40) according to any one of the preceding claims, in which the chip (2, 44) comprises a plurality of parallel passage ducts (12) into which the outlet (20) of the duct opens out. inlet (10), the chip (2, 44) comprising for each passage duct (12), a reservoir (14) clean opening into the passage duct (12), the first fluid further advantageously comprising, in addition, a plurality of cells in suspension, the preloaded solution of each reservoir (14) comprising a second selective reagent in each reservoir, including a separate cell growth selective medium.

8. A method of analysis and cell culture comprising the following steps: - providing a cell culture and analysis system (1, 40) according to any one of the preceding claims; injecting the first fluid into the inlet duct (10) from the source (4) of the first fluid; - Passage of the first fluid (4) in the passage duct (12) to the reservoir (14); reaction of the first reagent of the first fluid and the second reagent of the pre-charged solution in the passage duct (2), preferably the reaction allowing the formation of a gel in the passage duct (12).

9. A method of analysis and cell culture according to claim 8, wherein the first fluid comprises a plurality of cells in suspension, and the method comprises the following steps: forming an image of a portion of the conduit of passage (12), and - detection of micro-colonies in the passageway (12).

10. A method of manufacturing a chip intended to be integrated in the analysis and cell culture system (1, 40) according to any one of claims 1 to 7: - supply of a top half-chip (72, 84) comprising a reservoir (14); loading the reservoir (14) with a solution comprising a second reagent; closing the upper half-chip (72, 84) by a lower half-chip (70) so as to form a chip comprising an input conduit (10) comprising a first input (18) adapted to be connected to a source of a first fluid comprising a first reagent, and an outlet (20), at least one passage duct (12) into which the outlet (20) of the inlet duct (10) opens, and in which the tank (14) opens into the passage duct (12). 5