FR3025437B1

FR3025437B1 - CONDUCTIVE MEMBRANE CAPSULES

Info

Publication number: FR3025437B1
Application number: FR1458295A
Authority: FR
Inventors: Leopold Mottet; Jerome Bibette; Nicolas Bremond; Philippe Poulin
Original assignee: Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris; ESPCI Innov SAS
Current assignee: Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Priority date: 2014-09-04
Filing date: 2014-09-04
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2034-09-04
Also published as: WO2016034714A1; FR3025437A1

Abstract

La présente invention concerne une capsule étant formée d'un cœur liquide et d'au moins une enveloppe gélifiée encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, ladite enveloppe gélifiée comprenant un matériau conducteur électrique ; l'utilisation d'une telle capsule pour la production de bioréacteurs, le criblage de micro-organismes ou la réalisation d'une anode et/ou cathode de piles à bactéries ainsi qu'une méthode de criblage de bactéries électro-actives utilisant ladite capsule et un dispositif comprenant une telle capsule.The present invention relates to a capsule being formed of a liquid core and at least one gelled envelope completely encapsulating the liquid core at its periphery, said gelled envelope comprising an electrically conductive material; the use of such a capsule for the production of bioreactors, the screening of microorganisms or the production of an anode and / or cathode of bacterial cells and a method for screening electroactive bacteria using said capsule and a device comprising such a capsule.

Description

Capsules à membrane conductriceConductive membrane capsules

La présente invention concerne une capsule formée d’un cœur liquide et d’au moins une enveloppe gélifiée encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, ladite enveloppe gélifiée comprenant un matériau conducteur électrique ; l’utilisation d’une telle capsule pour la production de bioréacteurs, le criblage de micro-organismes ou la réalisation d’une anode et/ou cathode de pile à bactéries ainsi qu’une méthode de criblage de bactéries électro-actives utilisant ladite capsule et un dispositif comprenant une telle capsule.The present invention relates to a capsule formed by a liquid heart and at least one gelled envelope completely encapsulating the liquid heart at its periphery, said gelled envelope comprising an electrically conductive material; the use of such a capsule for the production of bioreactors, the screening of microorganisms or the production of an anode and / or cathode of a bacteria cell as well as a method of screening for electroactive bacteria using said capsule and a device comprising such a capsule.

La limitation de la production de déchets ainsi que la question de leur valorisation, et plus particulièrement celle de la valorisation de leur énergie, est aujourd’hui une préoccupation majeure. A l’heure actuelle, l’Union Européenne investit beaucoup dans le traitement des déchets.The limitation of the production of waste as well as the question of its recovery, and more particularly that of the recovery of their energy, is today a major concern. The European Union is currently investing a lot in waste treatment.

Par ailleurs, le traitement des eaux usées aux États-Unis permet de générer 15 GW d’énergie (25 milliards de dollars) ce qui représente 3% de la puissance électrique des États-Unis.In addition, the treatment of wastewater in the United States generates 15 GW of energy ($ 25 billion), which represents 3% of the electric power of the United States.

Les déchets domestiques, industriels, ou d'origine animale représentent ainsi une puissance énergétique potentielle de 17 GW et une énergie de 1,5.1011 kWh.Household, industrial or animal waste represents a potential energy power of 17 GW and an energy of 1.5.1011 kWh.

Les piles microbiennes encore appelées piles à bactéries sont des dispositifs d'énergie verte remarquables qui exploitent les microorganismes afin de produire de l'électricité à partir de composés organiques comme les déchets. La bactérie se nourrit de déchets et en même temps, relargue des électrons.Microbial cells, also called bacteria cells, are remarkable green energy devices that use microorganisms to generate electricity from organic compounds such as waste. The bacteria feed on waste and at the same time release electrons.

Cependant, les piles à bactéries actuelles présentent certains inconvénients, et il existe un besoin d’amélioration de la production d’énergie par les piles bactériennes existantes, notamment par la recherche de micro-organismes plus électrochimiquement actifs.However, current bacteria cells have certain drawbacks, and there is a need to improve the production of energy by existing bacterial cells, in particular by researching more electrochemically active microorganisms.

La sélection d’organismes électro-actifs se fait actuellement en parallélisant des cultures dans des micro-puits muni d’une électrode (Hou, Han, & al PlosOne August 2009). Dans un domaine proche, la sélection à haut débit d’enzymes est faite grâce à des plaques de 96 puits (Song, O’Donohue Bioresource Technology 2010).The selection of electro-active organisms is currently done by paralleling cultures in micro-wells equipped with an electrode (Hou, Han, & al PlosOne August 2009). In a nearby field, high-throughput selection of enzymes is done using 96-well plates (Song, O’Donohue Bioresource Technology 2010).

Les inventeurs de la présente invention ont mis au point une capsule pouvant encapsuler un objet électro-actif qui présente de nombreux avantages par rapport aux techniques de l’art antérieur de sélection de micro-organismes électro-actifs.The inventors of the present invention have developed a capsule capable of encapsulating an electro-active object which has numerous advantages over the techniques of the prior art for selecting electro-active microorganisms.

La capsule selon l’invention permet de compartimenter la culture donc de décorréler le bioréacteur du système de lecture de l’activité électrochimique des microorganismes. Elle permet également une culture sur un temps plus long car la membrane de la capsule protège la culture des contaminations. De plus, et contrairement à ce qu’il est observé avec les cultures en micro-puit, la culture en capsule permet le renouvellement du milieu sans manipulations complexes telles que des centrifugations ou des pipetages multiples. Le renouvellement facilité du milieu élimine les problèmes liés à l’évaporation.The capsule according to the invention makes it possible to compartmentalize the culture and therefore to decorrelate the bioreactor from the system for reading the electrochemical activity of microorganisms. It also allows a culture over a longer time because the membrane of the capsule protects the culture from contamination. In addition, and contrary to what is observed with micro-well cultures, capsule culture allows renewal of the medium without complex manipulations such as centrifugations or multiple pipetting. The easy renewal of the medium eliminates the problems associated with evaporation.

Par ailleurs, la capsule selon l’invention permet de connecter la culture à un système de lecture pour connaître les performances électrochimiques de l’organisme encapsulé.Furthermore, the capsule according to the invention makes it possible to connect the culture to a reading system in order to know the electrochemical performance of the encapsulated organism.

Ainsi, la capsule selon l’invention apporte un outil nouveau à la culture de microorganismes dans des capsules à cœur liquide en permettant d’agir de manière électrique sur l’organisme encapsulé.Thus, the capsule according to the invention provides a new tool for the cultivation of microorganisms in capsules with a liquid heart by making it possible to act electrically on the encapsulated organism.

La présente invention a donc pour objet une capsule comprenant un cœur liquide, une enveloppe gélifiée encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, l’enveloppe gélifiée étant propre à retenir le cœur liquide lorsque la capsule est plongée dans un gaz, une solution aqueuse ou une huile, l’enveloppe gélifiée comprenant au moins un polyélectrolyte gélifié et au moins un agent tensioactif, caractérisée en ce que l’enveloppe gélifiée comprend en outre un matériau conducteur électrique.The present invention therefore relates to a capsule comprising a liquid heart, a gelled envelope completely encapsulating the liquid heart at its periphery, the gelled envelope being capable of retaining the liquid heart when the capsule is immersed in a gas, an aqueous solution or an oil, the gelled envelope comprising at least one gelled polyelectrolyte and at least one surfactant, characterized in that the gelled envelope further comprises an electrically conductive material.

Par « matériau conducteur électrique >>, on entend un matériau capable de laisser passer un courant électrique, c’est-à-dire des électrons, et de véhiculer le courant, donc des électrons, d'un point à un autre.By "electrically conductive material" is meant a material capable of passing an electric current, that is to say electrons, and of conveying the current, therefore electrons, from one point to another.

En particulier, le matériau conducteur électrique consiste en des particules solides électriquement conductrices, plus particulièrement en des nanotubes de carbone, du noir de carbone ou du graphène.In particular, the electrically conductive material consists of electrically conductive solid particles, more particularly carbon nanotubes, carbon black or graphene.

Encore plus particulièrement, ledit matériau conducteur électrique est biocompatible.Even more particularly, said electrically conductive material is biocompatible.

Par « matériau biocompatible >>, on entend un matériau qui n’interfère pas, ni ne dégrade, le milieu biologique dans lequel il est utilisé.By "biocompatible material" is meant a material which does not interfere with or degrade the biological environment in which it is used.

Le cœur liquide de la capsule selon l’invention est constitué d’un liquide aqueux ou huileux pouvant contenir des molécules, microorganismes, ou autres objets de taille supérieure à la taille maximale des pores de la membrane (environ 20 nm).The liquid core of the capsule according to the invention consists of an aqueous or oily liquid which may contain molecules, microorganisms, or other objects larger than the maximum size of the pores of the membrane (about 20 nm).

Selon un aspect de la présente invention, le cœur liquide comprend au moins un objet électro-actif.According to one aspect of the present invention, the liquid heart comprises at least one electro-active object.

Par « objet électro-actif », on entend un objet électriquement actif ou réactif, capable d’échanger, de générer ou de capter des électrons ou encore de générer ou de capter un autre objet électro-actif.By "electroactive object" is meant an electrically active or reactive object capable of exchanging, generating or capturing electrons or even generating or capturing another electroactive object.

En particulier, l’objet électro-actif est choisi parmi les micro-organismes, les cellules, les macromolécules et les molécules. Encore plus particulièrement, l’objet électro-actif est choisi parmi les bactéries du genre Escherichia Coli, Geobacter, Shewanella, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum, Enterobacter.In particular, the electroactive object is chosen from microorganisms, cells, macromolecules and molecules. Even more particularly, the electroactive object is chosen from bacteria of the genus Escherichia Coli, Geobacter, Shewanella, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum, Enterobacter.

Dans le cadre de la présente invention, le cœur liquide de la capsule peut comprendre au moment de l'encapsulation des quantités variables de molécules, microorganismes, macromolécules et cellules qui seront adaptées en fonction de type d’objet encapsulé.In the context of the present invention, the liquid core of the capsule can comprise, at the time of encapsulation, variable quantities of molecules, microorganisms, macromolecules and cells which will be adapted according to the type of object encapsulated.

Par exemple, le cœur liquide de la capsule peut comprendre au moment de l'encapsulation une quantité de cellules supérieure ou égale à 1 cellule/capsule.For example, the liquid core of the capsule may comprise at the time of encapsulation an amount of cells greater than or equal to 1 cell / capsule.

Il peut également comprendre au moment de l'encapsulation une quantité de microorganismes supérieure ou égale à 1 microorganismes/capsule, de préférence supérieure à l’inoculum minimal. Pour chaque bactérie, il existe en effet un inoculum minimal qui correspond à la concentration minimale en bactérie qui permet à la culture de croître.It can also include at the time of encapsulation an amount of microorganisms greater than or equal to 1 microorganisms / capsule, preferably greater than the minimum inoculum. For each bacteria, there is indeed a minimum inoculum which corresponds to the minimum concentration of bacteria which allows the culture to grow.

De préférence, le liquide contenu dans le cœur liquide est physiologiquement acceptable. Il peut notamment comprendre une solution saline, des macromolécules ou molécules, un viscosifiant physiologiquement acceptable et/ou un milieu de culture destiné à la croissance et/ou à la culture des micro-organismes ou des cellules.Preferably, the liquid contained in the liquid heart is physiologically acceptable. It can in particular comprise a saline solution, macromolecules or molecules, a physiologically acceptable viscosifier and / or a culture medium intended for the growth and / or the culture of microorganisms or cells.

Par « milieu de culture >>, on entend tout milieu, en particulier tout milieu liquide, susceptible de soutenir la croissance des cellules ou microorganismes. Pour l’encapsulation de bactéries, on utilise par exemple un cœur composé de 15% de PEG3500 et de 0.45% de NaCI, cette solution saline permettant de maintenir une osmolarité acceptable pour le microorganisme durant l’encapsulation, cette osmolarité étant similaire à celle du milieu de culture de la bactérie.By “culture medium” is meant any medium, in particular any liquid medium, capable of supporting the growth of cells or microorganisms. For the encapsulation of bacteria, a core composed of 15% PEG3500 and 0.45% NaCl is used for example, this saline solution making it possible to maintain an osmolarity acceptable for the microorganism during encapsulation, this osmolarity being similar to that of culture medium of the bacteria.

Le cœur liquide peut aussi comprendre des excipients physiologiquement acceptables, tels que des épaississants, ou des modificateurs de rhéologie. Ces épaississants sont par exemple des polymères, des cross-polymères, des microgels, des gommes ou des protéines, dont des polysaccharides, des celluloses, des polyosides, des polymères et co-polymères à base de silicone, des particules colloïdales (silice, argiles, latex, nanotubes de carbones biocompatibles...). L'enveloppe gélifiée des capsules selon l'invention comprend un gel contenant de l'eau, au moins un polyélectrolyte réactif aux ions multivalents et le matériau conducteur électrique. Selon l'invention, l'enveloppe contient en outre un agent tensioactif résultant de son procédé de fabrication, comme décrit par la suite.The liquid core can also include physiologically acceptable excipients, such as thickeners, or rheology modifiers. These thickeners are for example polymers, cross-polymers, microgels, gums or proteins, including polysaccharides, celluloses, polysaccharides, polymers and co-polymers based on silicone, colloidal particles (silica, clays , latex, biocompatible carbon nanotubes ...). The gelled envelope of the capsules according to the invention comprises a gel containing water, at least one polyelectrolyte reactive with multivalent ions and the electrically conductive material. According to the invention, the envelope also contains a surfactant resulting from its manufacturing process, as described below.

Tout particulièrement, la capsule selon l’invention est obtenue à partir d’un procédé comprenant les étapes suivantes de : a) convoyage séparé dans une double enveloppe d’une première solution liquide aqueuse ou huileuse et d’une deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier et le matériau conducteur électrique; b) formation, à la sortie de la double enveloppe, d’une série de gouttes, chaque goutte comprenant un noyau central formé de ladite première solution et une pellicule périphérique formée de ladite deuxième solution et recouvrant totalement le noyau central; c) immersion de chaque goutte dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à réagir avec le polyélectrolyte de la pellicule pour le faire passer d’un état liquide à un état gélifié et former l’enveloppe gélifiée comprenant le matériau conducteur électrique, le noyau central formant le cœur liquide; d) récupération des capsules formées; la deuxième solution contenant au moins un agent tensioactif avant son contact avec la première solution et donc avant son contact avec la solution gélifiante.Very particularly, the capsule according to the invention is obtained from a process comprising the following steps of: a) separate conveying in a double envelope of a first aqueous or oily liquid solution and of a second liquid solution containing a polyelectrolyte liquid suitable for gelation and electrically conductive material; b) formation, at the exit of the double envelope, of a series of drops, each drop comprising a central core formed of said first solution and a peripheral film formed of said second solution and completely covering the central core; c) immersion of each drop in a gelling solution containing a reagent capable of reacting with the polyelectrolyte of the film to bring it from a liquid state to a gelled state and to form the gelled envelope comprising the electrically conductive material, the central core forming the liquid heart; d) recovery of the capsules formed; the second solution containing at least one surfactant before it comes into contact with the first solution and therefore before it comes into contact with the gelling solution.

Plus particulièrement, ladite deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier et le matériau conducteur mentionnée à l’étape a) du procédé est formée par la mise en contact du matériau conducteur électrique sous forme dispersée et du polyélectrolyte propre à gélifier.More particularly, said second liquid solution containing a liquid polyelectrolyte capable of gelling and the conductive material mentioned in step a) of the process is formed by bringing the electrically conductive material in dispersed form into contact with the polyelectrolyte capable of gelling.

Encore plus particulièrement, l’enveloppe gélifiée est formée par un hydrogel de polysaccharide gélifié par ions divalents comprenant des particules solides électriquement conductrices sous forme dispersées et connectées formant ainsi un réseau électriquement conducteur.Even more particularly, the gelled envelope is formed by a hydrogel of polysaccharide gelled by divalent ions comprising electrically conductive solid particles in dispersed and connected form thus forming an electrically conductive network.

Selon un des aspects de ce procédé, le rapport du débit de la première solution au débit de la deuxième solution à la sortie de la double enveloppe est compris entre 0.1 et 20, avantageusement entre 1 et 5, l’enveloppe gélifiée présentant une épaisseur comprise entre 1.6% et 55%, avantageusement entre 6% et 20% du diamètre de la capsule, après récupération des capsules formées.According to one aspect of this process, the ratio of the flow rate of the first solution to the flow rate of the second solution at the outlet of the double envelope is between 0.1 and 20, advantageously between 1 and 5, the gelled envelope having a thickness comprised between 1.6% and 55%, advantageously between 6% and 20% of the diameter of the capsule, after recovery of the capsules formed.

Selon un autre aspect du procédé, les gouttes formées par coextrusion dans la double enveloppe tombent par gravité à travers un volume d’air dans la solution gélifiante.According to another aspect of the process, the drops formed by coextrusion in the double jacket fall by gravity through a volume of air in the gelling solution.

Dans le cadre de la présente description, on entend par « tensioactif » une molécule amphiphile présentant deux parties de polarité différente, l'une lipophile et apolaire, l'autre hydrophile et polaire. Un tensioactif peut être de type ionique (cationique ou anionique), zwitterionique ou non ionique. L'agent tensioactif est avantageusement un tensioactif anionique, un tensioactif non ionique, un tensioactif cationique ou un mélange de ceux-ci. La masse moléculaire de l'agent tensioactif est comprise entre 150 g/mol et 10000 g/mol, avantageusement entre 250 g/mol et 1500 g/mol.In the context of the present description, the term "surfactant" means an amphiphilic molecule having two parts of different polarity, one lipophilic and nonpolar, the other hydrophilic and polar. A surfactant can be of the ionic (cationic or anionic), zwitterionic or nonionic type. The surfactant is advantageously an anionic surfactant, a nonionic surfactant, a cationic surfactant or a mixture of these. The molecular weight of the surfactant is between 150 g / mol and 10,000 g / mol, advantageously between 250 g / mol and 1,500 g / mol.

Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif anionique, il est par exemple choisi parmi un alkylsulfate, un alkyle sulfonate, un alkylarylsulfonate, un alkylphosphate alcalin, un dialkylsulfosuccinate, un sel d'alcalino-terreux d'acides gras saturés ou non. Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre de carbones supérieur à 5, voire 10 et au moins un groupement anionique hydrophile, tel qu'un sulfate, un sulfonate ou un carboxylate lié à une extrémité de la chaîne hydrophobe.In the case where the surfactant is an anionic surfactant, it is for example chosen from an alkyl sulphate, an alkyl sulphonate, an alkylarylsulphonate, an alkaline alkylphosphate, a dialkylsulphosuccinate, an alkaline earth salt of saturated or unsaturated fatty acids. These surfactants advantageously have at least one hydrophobic hydrocarbon chain having a number of carbons greater than 5 or even 10 and at least one hydrophilic anionic group, such as a sulfate, a sulfonate or a carboxylate linked to one end of the hydrophobic chain.

Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif cationique, il est par exemple choisi parmi un sel d'halogénure d'alkylpyridium ou d'alkylammonium comme le chlorure ou le bromure de n-éthyldodecylammonium, le chlorure ou le bromure de cétylammonium (CTAB). Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre de carbones supérieur à 5, voire 10 et au moins un groupement cationique hydrophile, tel qu'un cation d'ammonium quaternaire.In the case where the surfactant is a cationic surfactant, it is for example chosen from an alkylpyridium or alkylammonium halide salt such as n-ethyldodecylammonium chloride or bromide, cetylammonium chloride or bromide (CTAB) . These surfactants advantageously have at least one hydrophobic hydrocarbon chain having a number of carbons greater than 5, or even 10 and at least one hydrophilic cationic group, such as a quaternary ammonium cation.

Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif non ionique, il est par exemple choisi parmi des dérivés polyoxyéthylénés et/ou polyoxypropylénés des alcools gras, des acides gras, ou des alkylphénols, des arylphénols, ou parmi des alkyls glucosides, des polysorbates, des cocamides.In the case where the surfactant is a nonionic surfactant, it is for example chosen from polyoxyethylenated and / or polyoxypropylenated derivatives of fatty alcohols, fatty acids, or alkylphenols, arylphenols, or from alkyl glucosides, polysorbates, cocamides.

En particulier, l’agent tensioactif sera choisi dans la liste suivante : un alkylsulfate, un alkyle sulfonate, un alkylarylsulfonate, un alkylphosphate alcalin, un dialkylsulfosuccinate, un sel d’alcalino-terreux d’acides gras saturés ou non, un sel d’halogénure d’alkylpyridium ou d’alkylammonium comme le chlorure ou le bromure de n-éthyldodecylammonium, le chlorure ou le bromure de cétylamonium, des dérivés polyoxyéthylénés et/ou polyoxypropylénés des alcools gras, des acides gras ou des alkylphénols, ou parmi des arylphénols, des alkyls glucosides, des polysorbates, des cocamides ou leurs mélanges.In particular, the surfactant will be chosen from the following list: an alkylsulfate, an alkylsulfonate, an alkylarylsulfonate, an alkaline alkylphosphate, a dialkylsulfosuccinate, an alkaline earth salt of saturated or unsaturated fatty acids, a salt of alkylpyridium or alkylammonium halide such as n-ethyldodecylammonium chloride or bromide, cetylamonium chloride or bromide, polyoxyethylenated and / or polyoxypropylenated derivatives of fatty alcohols, fatty acids or alkylphenols, or among arylphenols, alkyl glucosides, polysorbates, cocamides or mixtures thereof.

Plus particulièrement, le pourcentage massique total en agent tensioactif dans la deuxième solution sera supérieur à 0,01% et est avantageusement compris entre 0,01% et 0,5% en masse.More particularly, the total mass percentage of surfactant in the second solution will be greater than 0.01% and is advantageously between 0.01% and 0.5% by mass.

Par « polyélectrolyte réactif aux ions polyvalents », on entend, au sens de la présente invention, un polyélectrolyte susceptible de passer d'un état liquide dans une solution aqueuse à un état gélifié sous l'effet d'un contact avec une solution gélifiante contenant des ions multivalents tels que des ions d'un métal alcalino-terreux choisis par exemple parmi les ions calcium, les ions baryum, les ions magnésium.By "polyelectrolyte reactive with polyvalent ions" is meant, within the meaning of the present invention, a polyelectrolyte capable of passing from a liquid state in an aqueous solution to a gelled state under the effect of contact with a gelling solution containing multivalent ions such as ions of an alkaline earth metal chosen for example from calcium ions, barium ions, magnesium ions.

Dans l'état liquide, les chaînes individuelles de polyélectrolyte sont sensiblement libres de s'écouler les unes par rapport aux autres. Une solution aqueuse de 2% en masse de polyélectrolyte présente alors un comportement purement visqueux aux gradients de cisaillement caractéristiques du procédé de mise en forme. La viscosité de cette solution à cisaillement nul est entre 50 mPa.s et 10000 mPa.s, avantageusement entre 1000 mPa.s et 7000 mPa.s.In the liquid state, the individual polyelectrolyte chains are substantially free to flow relative to one another. An aqueous solution of 2% by mass of polyelectrolyte then exhibits a purely viscous behavior at the shear gradients characteristic of the shaping process. The viscosity of this zero shear solution is between 50 mPa.s and 10000 mPa.s, advantageously between 1000 mPa.s and 7000 mPa.s.

Les chaînes individuelles de polyélectrolyte dans l'état liquide présentent avantageusement une masse molaire supérieure à 65000 g/mole.The individual polyelectrolyte chains in the liquid state advantageously have a molar mass greater than 65,000 g / mole.

Dans l'état gélifié, les chaînes individuelles de polyélectrolyte forment, avec les ions multivalents, un réseau tridimensionnel cohésif qui retient le cœur liquide et empêche son écoulement. Les chaînes individuelles sont retenues les unes par rapport aux autres et ne peuvent pas s'écouler librement les unes par rapport aux autres. Dans cet état, la viscosité du gel formé est infinie. De plus, le gel a un seuil de contrainte à l'écoulement. Ce seuil de contrainte est supérieur à 0,05 Pa. Le gel possède également un module d'élasticité non nul et supérieur à 35 kPa.In the gelled state, the individual polyelectrolyte chains form, with the multivalent ions, a cohesive three-dimensional network which retains the liquid core and prevents its flow. The individual chains are retained with respect to each other and cannot flow freely with respect to each other. In this state, the viscosity of the gel formed is infinite. In addition, the gel has a flow stress threshold. This stress threshold is greater than 0.05 Pa. The gel also has a non-zero elastic modulus greater than 35 kPa.

Le gel tridimensionnel de polyélectrolyte contenu dans l'enveloppe emprisonne de l'eau et l'agent tensioactif.The three-dimensional polyelectrolyte gel contained in the envelope traps water and the surfactant.

Le polyélectrolyte est de préférence un polymère biocompatible inoffensif pour le corps humain. Il est par exemple produit biologiquement.The polyelectrolyte is preferably a biocompatible polymer harmless to the human body. It is for example biologically produced.

Avantageusement, il est choisi parmi les polysaccharides, polyélectrolytes de synthèse à base d'acrylates (polyacrylate de sodium, de lithium, de potassium ou d'ammonium, ou polyacrylamide), de polyélectrolytes de synthèse à base de sulfonates (polystyrène sulfonate) de sodium, par exemple). Plus particulièrement, le polyélectrolyte est choisi parmi un alginate d'alcalino-terreux, tel qu'un alginate de sodium ou un alginate de potassium, une gellane ou une pectine.Advantageously, it is chosen from polysaccharides, synthetic polyelectrolytes based on acrylates (sodium, lithium, potassium or ammonium polyacrylate, or polyacrylamide), synthetic polyelectrolytes based on sodium sulfonates (polystyrene sulfonate) , for example). More particularly, the polyelectrolyte is chosen from an alkaline earth alginate, such as a sodium alginate or a potassium alginate, a gellan or a pectin.

Les alginates sont produits à partir d'algues brunes appelées «laminaires», désignées par le terme anglais « sea weed ».Alginates are produced from brown algae called "laminaria", designated by the English term "sea weed".

De tels alginates présentent avantageusement une teneur en a-L-guluronate supérieure à environ 50%, de préférence supérieure à 55%, voire supérieure à 60%.Such alginates advantageously have an α-L-guluronate content greater than about 50%, preferably greater than 55%, or even greater than 60%.

En particulier, le ou chaque poyélectrolyte sera un polyélectrolyte réactif aux ions multivalents, notamment un polysaccharide réactif aux ions multivalents tel qu’un alginate d’alcalin, une géllane ou une pectine, de préférence un alginate d’alcalin ayant avantageusement une teneur en bloc α-L-guluronate supérieure à 50%, notamment supérieure à 55%.In particular, the or each poyelectrolyte will be a polyelectrolyte reactive with multivalent ions, in particular a polysaccharide reactive with multivalent ions such as an alkali alginate, a gelan or a pectin, preferably an alkali alginate advantageously having a block content. α-L-guluronate greater than 50%, in particular greater than 55%.

Plus particulièrement, la teneur massique en polyélectrolyte dans la deuxième solution peut être inférieure à 5% en masse et est avantageusement comprise entre 0,5 et 3% en masse.More particularly, the mass content of polyelectrolyte in the second solution can be less than 5% by mass and is advantageously between 0.5 and 3% by mass.

Selon un aspect de la présente invention, la capsule pourra comprendre en outre une enveloppe intermédiaire encapsulant totalement à sa périphérie le cœur liquide, ladite enveloppe intermédiaire étant elle-même encapsulée totalement à sa périphérie par l’enveloppe gélifiée.According to one aspect of the present invention, the capsule may further comprise an intermediate envelope totally encapsulating the liquid core at its periphery, said intermediate envelope being itself totally encapsulated at its periphery by the gelled envelope.

Cette enveloppe intermédiaire liquide sera formée d’une composition intermédiaire comprenant un tampon ou un milieu de culture, et/ou un viscosifiant. En particulier, le viscosifiant sera un polymère hydrosoluble, tel que du Polyéthylène glycol (PEG), du dextran, de l'alginate en solution plus dilué que dans l'enveloppe extérieure ou encore de l’alginate plus dilué que dans l’enveloppe extérieure mélangé à un matériau conducteur électrique. L’enveloppe intermédiaire est au contact du cœur et de l’enveloppe externe et maintient le cœur hors de contact de l’enveloppe externe.This liquid intermediate envelope will be formed of an intermediate composition comprising a buffer or a culture medium, and / or a viscosifier. In particular, the viscosifier will be a water-soluble polymer, such as Polyethylene glycol (PEG), dextran, alginate in solution more diluted than in the outer envelope or else alginate more diluted than in the outer envelope. mixed with an electrically conductive material. The intermediate envelope is in contact with the heart and the outer envelope and keeps the heart out of contact with the outer envelope.

La phase intermédiaire est utile pour stabiliser la capsule lors de sa formation, par exemple dans le cas où le cœur liquide contient du calcium susceptible d’induire trop tôt la gélification de la phase externe. En effet, selon leur composition, les milieux de culture peuvent interférer avec la polymérisation. Elle permet ainsi de séparer le cœur liquide de la phase externe à gélifier. Elle permet aussi de protéger le cœur liquide pendant la formation des gouttes, de l’alginate de la couche externe qui n’est pas encore polymérisé.The intermediate phase is useful for stabilizing the capsule during its formation, for example in the case where the liquid core contains calcium capable of inducing gelling of the external phase too early. According to their composition, the culture media can interfere with the polymerization. It thus makes it possible to separate the liquid core from the external phase to be gelled. It also helps protect the liquid core during the formation of drops, of the alginate of the outer layer which has not yet polymerized.

En particulier, le cœur liquide et la phase intermédiaire étant toutes deux liquides, celles-ci se mélangent à terme pour former le cœur liquide de la capsule.In particular, since the liquid core and the intermediate phase are both liquid, these eventually mix together to form the liquid core of the capsule.

La présence d’une telle enveloppe intermédiaire est notamment décrite dans l’article scientifique « Formation of liquid-core capsules having a thin hydrogel membrane : liquid pearls », Bremond et al, Soft Matter, 2010, 2484-2488.The presence of such an intermediate envelope is notably described in the scientific article “Formation of liquid-core capsules having a thin hydrogel membrane: liquid pearls”, Bremond et al, Soft Matter, 2010, 2484-2488.

Production des gouttesDrops production

La production des gouttes selon le procédé selon l’invention mentionné précédemment est effectuée par convoyage séparé dans une double enveloppe d’une première solution liquide contenant la solution aqueuse ou huileuse dans laquelle est préférentiellement comprise un ou plusieurs micro-organismes, cellules, macromolécules ou molécules et d’une deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier, le matériau conducteur électrique et au moins un agent tensioactif, le convoyage étant tel que décrit dans WO2010/063937.The production of the drops according to the method according to the invention mentioned above is carried out by separate conveying in a double envelope of a first liquid solution containing the aqueous or oily solution in which is preferably included one or more microorganisms, cells, macromolecules or molecules and a second liquid solution containing a liquid polyelectrolyte capable of gelling, the electrically conductive material and at least one surfactant, the conveying being as described in WO2010 / 063937.

Dans le cas de la présence supplémentaire d’une enveloppe intermédiaire, le convoyage séparé s’effectue dans une triple enveloppe, avec une troisième solution comprenant la solution intermédiaire. A la sortie de la double (ou triple) enveloppe, les différents flux entrent en contact et se forme alors une goutte multi-composante, selon un mode hydrodynamique dit de « dripping >> (goutte-à-goutte, décrit notamment dans WO 2010/063937) ou un mode dit de « jetting >> (avec une instabilité de jet, décrit notamment dans FR 2012/2964017), selon la taille des capsules souhaitées.In the case of the additional presence of an intermediate envelope, the separate conveying takes place in a triple envelope, with a third solution comprising the intermediate solution. At the exit of the double (or triple) envelope, the different flows come into contact and a multi-component drop is formed, according to a hydrodynamic mode called "dripping" (drip described in particular in WO 2010 / 063937) or a so-called “jetting” mode (with jet instability, described in particular in FR 2012/2964017), depending on the size of the capsules desired.

Le premier flux constitue le cœur liquide et le deuxième flux constitue l’enveloppe externe liquide. Dans le cas de la présence de l’enveloppe intermédiaire, le deuxième flux constitue l’enveloppe intermédiaire liquide et le troisième flux l’enveloppe externe liquide.The first flow constitutes the liquid core and the second flow constitutes the liquid outer envelope. In the case of the presence of the intermediate envelope, the second flow constitutes the liquid intermediate envelope and the third flow the liquid external envelope.

Selon le mode de production, chaque goutte multi-composante se détache de la double (ou triple) enveloppe et chute dans un volume d’air, avant d’être immergée dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à gélifier le polyélectrolyte de l’enveloppe externe liquide, pour former l’enveloppe externe gélifiée des capsules selon l’invention.Depending on the production method, each multi-component drop is detached from the double (or triple) envelope and falls into a volume of air, before being immersed in a gelling solution containing a reagent capable of gelling the polyelectrolyte of the liquid outer shell, to form the gelled outer shell of the capsules according to the invention.

Selon certaines variantes, les gouttes multi-composantes peuvent comprendre des couches supplémentaires entre l’enveloppe externe et le cœur liquide, autre que l’enveloppe intermédiaire. Ce type de goutte peut être préparé par convoyage séparé de multiples compositions dans des dispositifs à multiples enveloppes.According to certain variants, the multi-component drops may comprise additional layers between the external envelope and the liquid core, other than the intermediate envelope. This type of drop can be prepared by separate conveying of multiple compositions in multiple envelope devices.

Etape de gélificationGelation stage

Lorsque la goutte multi-composante entre en contact de la solution gélifiante, le réactif propre à gélifier le polyélectrolyte présent dans la solution gélifiante forme alors des liaisons entre les différentes chaînes de polyélectrolyte présentes dans l’enveloppe externe liquide, passant alors à l’état gélifié, provoquant ainsi la gélification de l’enveloppe externe liquide.When the multi-component drop comes into contact with the gelling solution, the reagent capable of gelling the polyelectrolyte present in the gelling solution then forms bonds between the various polyelectrolyte chains present in the liquid outer envelope, then passing to the state gelled, thereby causing the liquid outer shell to gel.

Sans vouloir être lié à une théorie particulière, lors du passage à l’état gélifié du polyélectrolyte, les chaînes individuelles de polyélectrolyte présentes dans l’enveloppe externe liquide se raccordent les unes aux autres pour former un réseau réticulé, aussi appelé hydrogel.Without wishing to be bound to a particular theory, when the polyelectrolyte changes to a gelled state, the individual polyelectrolyte chains present in the liquid outer envelope are connected to each other to form a crosslinked network, also called a hydrogel.

Dans le cadre de la présente description, le polyélectrolyte présent dans l’enveloppe externe gélifiée est à l’état gélifié et est également appelé polyélectrolyte à l’état gélifié ou encore polyélectrolyte gélifié.In the context of the present description, the polyelectrolyte present in the gelled external envelope is in the gelled state and is also called polyelectrolyte in the gelled state or also gelled polyelectrolyte.

Une enveloppe externe gélifiée, propre à retenir l’ensemble constitué par le cœur ou le cœur et l’enveloppe intermédiaire, est ainsi formée. Cette enveloppe externe gélifiée présente une tenue mécanique propre, c’est-à-dire qu’elle est capable retenir le cœur liquide et, en cas de présence d’une enveloppe intermédiaire, d’entourer totalement l’enveloppe intermédiaire. Ceci a pour effet de maintenir la structure interne du cœur liquide et le cas échéant, de l’enveloppe intermédiaire.An outer gelled envelope, suitable for retaining the assembly constituted by the heart or the heart and the intermediate envelope, is thus formed. This gelled outer shell has its own mechanical strength, that is to say that it is capable of retaining the liquid core and, in the presence of an intermediate shell, completely surrounding the intermediate shell. This has the effect of maintaining the internal structure of the liquid core and, where appropriate, of the intermediate envelope.

Les capsules selon l’invention séjournent dans la solution gélifiante le temps que l’enveloppe externe soit complètement gélifiée, de préférence sans excéder 60 minutes, encore plus préférentiellement sans excéder 10 minutes.The capsules according to the invention remain in the gelling solution while the outer envelope is completely gelled, preferably without exceeding 60 minutes, even more preferably without exceeding 10 minutes.

On peut ensuite éventuellement éliminer la solution gélifiante et les capsules gélifiées peuvent ensuite éventuellement être collectées et plongées dans une solution aqueuse de rinçage, généralement essentiellement constituée d’eau, en particulier de l’eau physiologique, afin de rincer les capsules gélifiées formées. Cette étape de rinçage permet d’extraire de l’enveloppe externe gélifiée un éventuel excès du réactif propre à gélifier de la solution gélifiante, et tout ou partie du tensioactif (ou d’autres espèces) contenu initialement dans la deuxième solution liquide.The gelling solution can then optionally be eliminated and the gelled capsules can then optionally be collected and immersed in an aqueous rinsing solution, generally essentially consisting of water, in particular physiological water, in order to rinse the gelled capsules formed. This rinsing step makes it possible to extract from the gelled outer envelope any excess of the reagent capable of gelling of the gelling solution, and all or part of the surfactant (or other species) initially contained in the second liquid solution.

La présence d’un tensioactif dans la deuxième solution liquide permet d’améliorer la formation et la gélification des gouttes multi-composantes selon le procédé tel que décrit précédemment.The presence of a surfactant in the second liquid solution makes it possible to improve the formation and gelling of the multi-component drops according to the method as described above.

Caractéristiques des capsules gélifiéesCharacteristics of gelled capsules

Avantageusement, la capsule est de forme sphérique et présente un diamètre extérieur inférieur à 5 mm et compris notamment entre 0.3 mm et 4 mm.Advantageously, the capsule is spherical in shape and has an outside diameter of less than 5 mm and in particular between 0.3 mm and 4 mm.

De préférence, l’enveloppe externe gélifiée des capsules selon l’invention possède une épaisseur comprise de 32 pm à 1000 pm, de préférence de 120 pm à 400 pm, et avantageusement de 100 pm à 350 pm.Preferably, the gelled outer shell of the capsules according to the invention has a thickness of from 32 μm to 1000 μm, preferably from 120 μm to 400 μm, and advantageously from 100 μm to 350 μm.

Les capsules selon l’invention présentent généralement un rapport volumique entre le cœur et l’ensemble des enveloppes intermédiaire et externe supérieur à 1, et de préférence inférieur à 5.The capsules according to the invention generally have a volume ratio between the heart and all of the intermediate and external envelopes greater than 1, and preferably less than 5.

Selon un mode de réalisation particulier, les capsules selon l’invention présentent généralement un rapport volumique entre le cœur et l’ensemble des enveloppes intermédiaire et externe compris entre 1 et 5.According to a particular embodiment, the capsules according to the invention generally have a volume ratio between the heart and all of the intermediate and external envelopes of between 1 and 5.

Ainsi, les capsules selon la présente invention sont utiles dans de nombreux secteurs d’activités comme par exemple celui des bioénergies, des piles bactériennes, enzymatiques ou encore dans celui de la fabrication d’électrodes.Thus, the capsules according to the present invention are useful in numerous sectors of activity such as, for example, that of bioenergies, bacterial or enzymatic cells or even that of the manufacture of electrodes.

Elles trouvent de nombreuses applications telles que la sélection de microorganismes électro-actifs ou la création d’énergie électrique à partir de déchets.They find many applications such as the selection of electroactive microorganisms or the creation of electrical energy from waste.

Ainsi, une capsule selon l’invention permet: - la production à grande cadence de bio-réacteurs (1 bio-réacteur/seconde) ; - le criblage de micro-organismes en permettant l'encapsulation d'une seule cellule qui donnera une colonie mono-clonale, les réservoirs et donc les cellules d'intérêts pouvant être ensuite choisis selon l'électro-activité ; - la digitalisation, parallélisation et miniaturisation de la culture ; - la récupération d'électrons et donc de l’énergie produite par une population de micro-organismes ; - l'encapsulation d'espèces électrochimiques et le déclenchement de réactions internes à la capsule via le contact d'une électrode avec la membrane. - la polarisation du réacteur pour permettre la croissance de micro-organismes sous un potentiel donné et ajustableThus, a capsule according to the invention allows: - high-speed production of bio-reactors (1 bio-reactor / second); - the screening of microorganisms by allowing the encapsulation of a single cell which will give a mono-clonal colony, the reservoirs and therefore the cells of interest which can then be chosen according to electro-activity; - digitalization, parallelization and miniaturization of culture; - the recovery of electrons and therefore of the energy produced by a population of microorganisms; - the encapsulation of electrochemical species and the triggering of reactions internal to the capsule via the contact of an electrode with the membrane. - the polarization of the reactor to allow the growth of micro-organisms under a given and adjustable potential

Selon un de ces aspects, la présente invention concerne donc également l’utilisation d’au moins une capsule selon l’invention, pour la production de bioréacteurs.According to one of these aspects, the present invention therefore also relates to the use of at least one capsule according to the invention, for the production of bioreactors.

Elle concerne également l’utilisation d’au moins une capsule selon l’invention, pour le criblage de micro-organismes, en particulier de microorganismes électro-actifs, encore plus particulièrement de ceux choisi parmi : Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum et Enterobacter.It also relates to the use of at least one capsule according to the invention, for the screening of microorganisms, in particular of electroactive microorganisms, even more particularly of those chosen from: Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum and Enterobacter.

La capsule selon l’invention peut donc constituer un outil de sélection d’organismes électro-actifs via l’encapsulation d’une cellule unique.The capsule according to the invention can therefore constitute a tool for selecting electro-active organisms via the encapsulation of a single cell.

Par ailleurs, la conductivité de sa membrane permet le passage d’une électrode de l’intérieur vers l’extérieur de la capsule et inversement. La membrane permet donc la récupération d’électrons relargués dans le milieu extérieur par les organismes en culture.In addition, the conductivity of its membrane allows the passage of an electrode from the inside to the outside of the capsule and vice versa. The membrane therefore allows the recovery of electrons released into the external environment by cultured organisms.

Ainsi, la présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une capsule selon l’invention, pour la récupération d’électrons produits par des microorganismes, en particulier ceux choisi parmi : Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum et Enterobacter.Thus, the present invention also relates to the use of at least one capsule according to the invention, for the recovery of electrons produced by microorganisms, in particular those chosen from: Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum and Enterobacter.

La présente invention concerne également l’utilisation d’une capsule selon l’invention, pour la réalisation d’une anode et/ou d’une cathode de pile à bactéries.The present invention also relates to the use of a capsule according to the invention, for producing an anode and / or a bacteria cell cathode.

Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également une méthode de criblage de bactéries électro-actives comprenant la culture de bactéries contenues dans au moins une capsule selon l’invention telle que définie précédemment.According to one of these aspects, the present invention also relates to a method of screening for electroactive bacteria comprising the culture of bacteria contained in at least one capsule according to the invention as defined above.

Les conditions de culture sont déterminées par l’homme du métier en fonction de chaque bactérie sur la base de ses connaissances générales.The culture conditions are determined by the skilled person according to each bacteria on the basis of his general knowledge.

Dans le cadre de la présente invention, les bactéries sont cultivées dans un milieu de culture comprenant un milieu de culture de base, celui-ci ayant pour caractéristique d’être capable de soutenir la croissance et le développement desdites bactéries, en particulier pour l’obtention d’une lignée monoclonale. Ce type de milieu de culture de base est bien connu de l’homme du métier. On peut citer par exemple le milieu LB Broth ou le milieu 826 de DMSZ.In the context of the present invention, the bacteria are cultivated in a culture medium comprising a basic culture medium, the latter having the characteristic of being capable of supporting the growth and development of said bacteria, in particular for obtaining a monoclonal line. This type of basic culture medium is well known to those skilled in the art. Mention may be made, for example, of LB Broth medium or medium 826 of DMSZ.

Dans le cadre de la présente invention, lorsque la capsule doit comprendre une population monoclonale de bactéries, l’homme du métier pourra utiliser la loi de Poisson pour déterminer la concentration de bactéries à encapsuler pour obtenir une bactérie par capsule:In the context of the present invention, when the capsule must comprise a monoclonal population of bacteria, a person skilled in the art can use Poisson's law to determine the concentration of bacteria to be encapsulated in order to obtain one bacterium per capsule:

, dans laquelle : - λ est le nombre moyen de bactérie par volume de capsule ; et P(k) est la probabilité qu’il y ait k bactéries dans une capsule connaissant la valeur de λ., in which: - λ is the average number of bacteria per volume of capsule; and P (k) is the probability that there are k bacteria in a capsule knowing the value of λ.

La valeur de λ dépend de la concentration C de cellules de la première solution exprimée en nombre de cellules par unité de volume, du diamètre D de la capsule et du rapport rq des débits de la façon suivante :The value of λ depends on the concentration C of cells of the first solution expressed in number of cells per unit volume, the diameter D of the capsule and the ratio rq of the flow rates as follows:

Selon un autre de ces aspects, la présente invention concerne également un dispositif comprenant au moins une capsule selon l’invention et au moins une électrode, ladite au moins une électrode étant en contact avec l’enveloppe gélifiée de ladite au moins une capsule.According to another of these aspects, the present invention also relates to a device comprising at least one capsule according to the invention and at least one electrode, said at least one electrode being in contact with the gelled envelope of said at least one capsule.

La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci-dessous qui n'en limitent pas la portée.The present invention will be illustrated in more detail by the figures and examples below which do not limit the scope thereof.

FIGURESFIGURES

Figure 1 : Gauche : Montage de formation de la bi-goutte composée de A au cœur et de B autour. Droite : Extrémité de l’injecteur permettant la formation de la bi-goutte. (A) Sortie pour le mélange A constituant le cœur de la capsule, (B) sortie pour le mélange B constituant la membrane de la future capsule.Figure 1: Left: Two-drop formation assembly composed of A at the heart and B around. Right: End of the injector allowing the formation of the twin drop. (A) Outlet for mixture A constituting the core of the capsule, (B) outlet for mixture B constituting the membrane of the future capsule.

Figure 2 : Schéma du montage de fabrication des capsules à cœur liquide et à membrane conductrice (D=3mm, h=350pm, R=1,7mm, H=5cm)Figure 2: Diagram of the manufacturing assembly of capsules with liquid core and conductive membrane (D = 3mm, h = 350pm, R = 1.7mm, H = 5cm)

Figure 3 : Capsules à cœur liquide et à membrane conductriceFigure 3: Liquid core and conductive membrane capsules

Figure 4 : Evolution de la conductivité d’une capsule selon l’invention en fonction du pourcentage massique en nanotubesFigure 4: Evolution of the conductivity of a capsule according to the invention as a function of the mass percentage of nanotubes

Figure 5 : Schéma du montage d’encapsulation de bactéries avec une concentration de la solution de cœur réglée pour avoir une bactérie par capsule (D=3mm, h=350pm, R=1,7mm, H=5cm)Figure 5: Diagram of the encapsulation arrangement of bacteria with a concentration of the heart solution adjusted to have one bacterium per capsule (D = 3mm, h = 350pm, R = 1.7mm, H = 5cm)

EXEMPLESEXAMPLES

Protocole de fabrication des capsules à cœur liquide et à membrane conductrice semi-perméableProtocol for manufacturing capsules with a liquid core and a semipermeable conductive membrane

Création du mélange qélifiable :Creation of the mixable mixture:

Le mélange : 10 mL d’eau milliQ, 150 mg de nanotubes de carbone et 200 mg de SDS est dispersé sous ultrasons pendant 1h15 avec un sonicateur Vibracell 75042 Bioblock Scientific selon les paramètres suivant : Puissance = 35%Pmax ; Puise : 3s on,1s off. La poudre d’alginate LF200FTS, 1% en masse, est ensuite ajoutée à la dispersion puis le tout est mis sous agitation magnétique pendant 12h afin d’obtenir la solution gélifiable.The mixture: 10 mL of milliQ water, 150 mg of carbon nanotubes and 200 mg of SDS is dispersed under ultrasound for 1 hour 15 minutes with a Vibracell 75042 Bioblock Scientific sonicator according to the following parameters: Power = 35% Pmax; Power: 3s on, 1s off. The LF200FTS alginate powder, 1% by mass, is then added to the dispersion and the whole is then stirred magnetically for 12 hours in order to obtain the gelable solution.

Création du mélange à encapsuler :Creation of the mixture to be encapsulated:

Le mélange : 25 mL d’eau milliQ, 5,1g de polyéthylène glycol de masse molaire moyenne 3350 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) et 135mg de NaCI sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h.The mixture: 25 ml of milliQ water, 5.1 g of polyethylene glycol of average molar mass 3350 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) and 135 mg of NaCl are mixed with magnetic stirring for 3 h.

Création du bain de gélification : 1L d’eau milliQ, 10g de CaCI2, 50pL de tween20 à 10% en masse sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h.Creation of the gelation bath: 1 liter of milliQ water, 10 g of CaCl 2, 50 μl of tween20 at 10% by mass are mixed with magnetic stirring for 3 h.

Création de la capsule :Creation of the capsule:

Une bi-goutte est créée avec le dispositif présenté en figures 1 et 2 selon la méthode décrite dans WO2010/063937.A two-drop is created with the device presented in Figures 1 and 2 according to the method described in WO2010 / 063937.

Le mélange à encapsuler est placé dans la seringue A, il sortira du centre de l’injecteur (A) pour constituer le cœur de la future capsule.The mixture to be encapsulated is placed in syringe A, it will leave the center of the injector (A) to constitute the heart of the future capsule.

Le mélange gélifiable est placé dans la seringue B, il sortira du bord de l’injecteur (B) pour constituer la membrane de la future capsule.The gelable mixture is placed in syringe B, it will come out of the edge of the injector (B) to form the membrane of the future capsule.

La création de la bi-goutte et ses paramètres sont contrôlés en contrôlant les débits des deux solutions (cœur et extérieur) via des pousses-seringues. Le débit de la seringue A est de 5mL/h, le débit de la seringue B est 5mL/h.The creation of the bi-drop and its parameters are controlled by controlling the flow rates of the two solutions (core and exterior) via syringe pumps. The flow rate of syringe A is 5 ml / h, the flow rate of syringe B is 5 ml / h.

La bi-goutte est ensuite gélifiée en la faisant tomber dans le bain de gélification. La solution extérieure gélifie (l’alginate gélifie) et enferme le cœur liquide de la bi-goutte. La capsule est créée telle qu’illustrée en figure 3. La capsule est laissée dans le bain de gélification pendant 1h.The twin drop is then gelled by dropping it in the gelling bath. The outer solution gels (alginate gels) and encloses the liquid core of the dropper. The capsule is created as illustrated in FIG. 3. The capsule is left in the gelation bath for 1 hour.

Description de la capsule :Description of the capsule:

Les débits pour la formation de la capsule sont de 5mL/h pour la solution extérieure (membrane) et de 5mL/h pour la solution intérieure (cœur). L’injecteur a un diamètre de 3mm (D), il est placé à 5cm au-dessus du bain de gélification (H).The flow rates for the formation of the capsule are 5mL / h for the external solution (membrane) and 5mL / h for the internal solution (heart). The injector has a diameter of 3mm (D), it is placed 5cm above the gelling bath (H).

Pour ces débits, la capsule finale à un diamètre de 1,7mm (R), avec une membrane de 350pm d’épaisseur moyenne (h). Le cœur de la capsule a un volume de 11 pL.For these flows, the final capsule has a diameter of 1.7mm (R), with a membrane of 350pm of average thickness (h). The heart of the capsule has a volume of 11 pL.

Caractérisation de la conductivité du mélange gélifiable L’évolution de la conductivité du mélange gélifiable est mesurée à l’aide d’un impédancemètre (Materials Mate 7260) sur des billes de gels pleines à 10kHz, en fonction du pourcentage massique en nanotubes.Characterization of the conductivity of the gelable mixture The evolution of the conductivity of the gelable mixture is measured using an impedance meter (Materials Mate 7260) on solid gel beads at 10 kHz, as a function of the mass percentage of nanotubes.

Création des mélanges gélifiable :Creation of gelable mixtures:

Le protocole de création des mélanges à différents pourcentages massique en nanotubes de carbone est le même que celui du protocole de création du mélange gélifiable de la création des capsules. Seule la masse de nanotubes change. 5 mélanges différents sont réalisés avec les masses de nanotubes suivantes: 0; 50; 100; 150; 200 mg correspondant respectivement aux pourcentages suivants : 0 ; 0,5 ;1 ; 1,5 ; 2% en masse.The protocol for creating mixtures with different mass percentages of carbon nanotubes is the same as that of the protocol for creating the gelable mixture for the creation of capsules. Only the mass of nanotubes changes. 5 different mixtures are made with the following nanotube masses: 0; 50; 100; 150; 200 mg corresponding respectively to the following percentages: 0; 0.5; 1; 1.5; 2% by mass.

Création des billes de gels : A l’aide d’une pipette pasteur plastique VWR de 7mL, les mélanges gélifiables sont faits goutter d’une hauteur de 5 cm dans le bain de gélification (identique à celui décrit précédemment). Les billes sont laissées à gélifier pendant 24h dans le bain. Les billes sont ensuite équilibrées dans une solution de CaCI2 à 1mM pendant 48h pour dialyser le SDS présent dans le mélange gélifiable.Creation of the gel beads: Using a VWR plastic pasteur pipette of 7mL, the gelling mixtures are made to drop from a height of 5 cm into the gelling bath (identical to that described above). The beads are left to gel for 24 hours in the bath. The beads are then equilibrated in a CaCl 2 solution at 1 mM for 48 h to dialyze the SDS present in the gelable mixture.

Des billes pleines de 3 mm de diamètre composées de 1% en masse d’alginate et de pourcentages massique de nanotubes de carbones variables sont ainsi obtenues.Solid beads 3 mm in diameter composed of 1% by mass of alginate and mass percentages of variable carbon nanotubes are thus obtained.

Protocole de mesure :Measurement protocol:

Pour mesurer la conductivité, une bille est placée entre deux vis de 3mm de diamètres distantes de 2,7mm, connectée à l’impédancemètre. La conductivité à 10 kHz est mesurée.To measure the conductivity, a ball is placed between two 3mm screws with diameters of 2.7mm apart, connected to the impedance meter. The conductivity at 10 kHz is measured.

Les résultats sont présentés en figure 4.The results are presented in Figure 4.

Les résultats montrent une augmentation de la conductivité du gel avec l’ajout des nanotubes. L’ajout de nanotubes de carbones permet d’augmenter jusqu’à 100 fois la conductivité de l’hydrogel.The results show an increase in the conductivity of the gel with the addition of nanotubes. The addition of carbon nanotubes increases the conductivity of the hydrogel up to 100 times.

Protocole de fabrication de capsules comprenant des bactéries pour cultures monoclonales.Protocol for the manufacture of capsules comprising bacteria for monoclonal cultures.

Pour l’encapsulation des bactéries, l’ensemble des solutions utilisées sont stérilisés par filtration à 0,2pm. Le dispositif d’encapsulation est stérilisé thermiquement à 121 °C pendant 20 minutes par une autoclave (JSM table top sterilizer).For the encapsulation of bacteria, all of the solutions used are sterilized by filtration at 0.2 pm. The encapsulation device is thermally sterilized at 121 ° C for 20 minutes by an autoclave (JSM table top sterilizer).

Création du mélange gélifiable : 1.7% en masse d’alginate LF200FTS et 5mM de SDS sont dissous dans 10 mL d’eau milliQ puis mis sous agitation magnétique pendant 12h pour obtenir le mélange gélifiable.Creation of the gelable mixture: 1.7% by mass of LF200FTS alginate and 5 mM of SDS are dissolved in 10 ml of milliQ water and then stirred for 12 hours to obtain the gelable mixture.

Encapsulation monoclonale : Détermination de la concentration monoclonale permettant d’avoir une (ou moins) bactérie par capsule.Monoclonal encapsulation: Determination of the monoclonal concentration allowing to have one (or less) bacteria per capsule.

Pour préparer la solution de bactéries à la concentration monoclonale, la loi de Poisson est utilisée:To prepare the bacteria solution at monoclonal concentration, Poisson's law is used:

, dans laquelle : - λ est le nombre moyen de bactérie par volume de capsule ; P(k) est la probabilité qu’il y ait k bactéries dans une capsule connaissant la valeur de λ ; et - le volume du cœur d’une capsule est de 11 pL., in which: - λ is the average number of bacteria per volume of capsule; P (k) is the probability that there are k bacteria in a capsule knowing the value of λ; and - the volume of the heart of a capsule is 11 pL.

Ainsi, en appliquant cette loi avec 0,1 bactérie par capsule (9 bactéries/mL), 90% des capsules sont sans bactérie (p(0)), 9% des capsules obtenues sont monoclonales, c’est à dire avec une bactérie (p(1)), moins de 0.5% des capsules obtenues sont avec deux bactéries (p(2)) et moins 0.02% des capsules obtenues sont avec 3 bactéries, etc.Thus, by applying this law with 0.1 bacteria per capsule (9 bacteria / mL), 90% of the capsules are without bacteria (p (0)), 9% of the capsules obtained are monoclonal, that is to say with a bacterium (p (1)), less than 0.5% of the capsules obtained are with two bacteria (p (2)) and less than 0.02% of the capsules obtained are with 3 bacteria, etc.

Ce protocole permet ainsi d’obtenir des capsules monoclonales avec un risque faible d’avoir des capsules contenant des bactéries issues d’une encapsulation non monoclonale (5% des capsules contenant des bactéries).This protocol thus makes it possible to obtain monoclonal capsules with a low risk of having capsules containing bacteria resulting from a non-monoclonal encapsulation (5% of the capsules containing bacteria).

Création du mélange bactérien à encapsuler :Creation of the bacterial mixture to be encapsulated:

Le mélange : 8,3mL d’eau milliQ, 1,7g de polyéthylène glycol de masse molaire moyenne 3500 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldricti) et 45mg de NaCI sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h. On y ajoute ensuite 1mL de solution bactérienne composée de la bactérie à la concentration de 84 bactéries par millilitre dans son milieu de culture (voir ci-dessous).The mixture: 8.3 ml of milliQ water, 1.7 g of polyethylene glycol with an average molar mass of 3500 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldricti) and 45 mg of NaCl are mixed with magnetic stirring for 3 h. Then added 1 ml of bacterial solution composed of the bacteria at the concentration of 84 bacteria per milliliter in its culture medium (see below).

Ainsi, une solution bactérienne comprenant des bactéries E.coli est préparée de la façon suivante : 2pL d’une souche de bactéries E.coli MC4100 YFP conservé à -80°C est ajouté à 10mL de LB Broth (Sigma). Le mélange est mis en culture sous agitation circulaire pendant 12h à 37°C. A 12h, la concentration en bacérie est évaluée par une mesureThus, a bacterial solution comprising E.coli bacteria is prepared in the following manner: 2 μL of a strain of E.coli bacteria MC4100 YFP stored at -80 ° C. is added to 10 ml of LB Broth (Sigma). The mixture is cultured with circular stirring for 12 h at 37 ° C. At 12 noon, the concentration of bacteria is evaluated by a measurement

d’absorbance à 600nm. La différence de densité optique observée à 600nm entre le milieu LB Broth et la culture bactérienne (Delta.D.O en unité de densité optique) permet d’obtenir la concentration en bactérie par millilitre via la formule : Concentration= Delta.D.O * 4.108 bactéries/mL. Cette culture est ensuite diluée par dilutions successives dans du LB Broth pour atteindre la concentration de 84 bactéries/mL.absorbance at 600nm. The difference in optical density observed at 600 nm between the LB Broth medium and the bacterial culture (Delta.DO in optical density unit) makes it possible to obtain the concentration of bacteria per milliliter via the formula: Concentration = Delta.DO * 4.108 bacteria / mL. This culture is then diluted by successive dilutions in LB Broth to reach the concentration of 84 bacteria / ml.

Ainsi, une solution bactérienne comprenant des bactéries Geobacter est préparée de la façon suivante : 1mL d’une souche de bactéries Geobacter Sulfurreducens fournie par DMSZ est ajouté à 9mL de son milieu spécifique (milieu 826 DMSZ) dans un tube hungate de 12 mL sous anaérobie à 30°C pendant 4 jours. A 4 jours, la concentration en bactérie est évaluée par une mesure d’absorbance à 600nm. La différence de densité optique observée à 600nm entre le milieu de culture 826 et la culture bactérienne (Delta.D.O en unité de densité optique) permet d’obtenir la concentration en bactérie par millilitre via la formule : Concentration = Delta.D.O * 4.108 bactéries/mL. Cette culture est ensuite diluée par dilutions successives dans du milieu 826 pour atteindre la concentration de 84 bactéries/mL.Thus, a bacterial solution comprising Geobacter bacteria is prepared as follows: 1 ml of a strain of Geobacter Sulfurreducens bacteria supplied by DMSZ is added to 9 ml of its specific medium (medium 826 DMSZ) in a 12 ml hungate tube under anaerobic conditions at 30 ° C for 4 days. At 4 days, the bacteria concentration is evaluated by an absorbance measurement at 600nm. The difference in optical density observed at 600 nm between the culture medium 826 and the bacterial culture (Delta.DO in optical density unit) makes it possible to obtain the concentration of bacteria per milliliter via the formula: Concentration = Delta.DO * 4.108 bacteria / mL. This culture is then diluted by successive dilutions in medium 826 to reach the concentration of 84 bacteria / ml.

Création de la capsule de culture monoclonale :Creation of the monoclonal culture capsule:

Une bi-goutte est créée avec le dispositif présenté dans les figures 1 et 5 selon la méthode décrite dans WO2010/063937.A two-drop is created with the device presented in Figures 1 and 5 according to the method described in WO2010 / 063937.

Le mélange bactérien à encapsuler (préparé au choix avec des bactéries E.Coli ou Geobacter comme indiqué dans le paragraphe précédent) est placé dans la seringue A, il sortira du centre de l’injecteur (A) pour constituer le cœur de la future capsule.The bacterial mixture to be encapsulated (prepared as desired with E.Coli or Geobacter bacteria as indicated in the previous paragraph) is placed in syringe A, it will leave the center of the injector (A) to constitute the heart of the future capsule .

La bi-goutte est ensuite gélifiée en la faisant tomber dans le bain de gélification. La solution extérieure gélifie (l’alginate gélifie) et enferme le cœur liquide de la bi-goutte. La capsule est créée. La capsule est laissée dans le bain de gélification pendant 15min.The twin drop is then gelled by dropping it in the gelling bath. The outer solution gels (alginate gels) and encloses the liquid core of the dropper. The capsule is created. The capsule is left in the gelation bath for 15 min.

Les capsules sont ensuite mises en culture dans le milieu de culture de la bactérie encapsulée (cf paragraphe précédent) additionné de 5mM de Cacl2, et dans les conditions de culture applicables à la bactérie encapsulée. Après l’incubation, on obtient des capsules remplies de bactéries.The capsules are then cultured in the culture medium of the encapsulated bacterium (cf. previous paragraph) supplemented with 5 mM of Cacl2, and under the culture conditions applicable to the encapsulated bacterium. After incubation, capsules filled with bacteria are obtained.

Les résultats de l’encapsulation monoclonale sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.The results of the monoclonal encapsulation are presented in Table 1 below.

Tableau 1 :Table 1:

Ainsi, la capsule selon l’invention présente de nombreux avantages :Thus, the capsule according to the invention has many advantages:

Parallélisation possible et non limitée ; - Croissance au temps long ; Récupération simplifiée de la totalité de la population cultivée (pas de centrifugation) ;Parallelization possible and not limited; - Long-term growth; Simplified recovery of the entire cultivated population (no centrifugation);

Encapsulation possible d’un seul micro-organisme ;Possible encapsulation of a single microorganism;

Possibilité d’actions de type électrique sur l’organisme encapsulé ; - Manipulation simplifiée de la culture ; et - bioréacteur dissocié du système de mesure courant.Possibility of electrical type actions on the encapsulated organism; - Simplified handling of culture; and - bioreactor dissociated from the current measurement system.

Claims

1. Capsule comprising a liquid heart, a gelled envelope completely encapsulating the liquid heart at its periphery, the gelled envelope being able to retain the liquid heart when the capsule is immersed in a gas, an aqueous solution or an oil, the envelope gelled comprising at least one gelled polyelectrolyte and at least one surfactant, characterized in that the gelled envelope further comprises an electrically conductive material.

2. Capsule according to claim 1, characterized in that it is obtained by the implementation of a method comprising the following steps of: a) separate conveying in a double envelope of a first aqueous or oily liquid solution and d a second liquid solution containing a liquid polyelectrolyte capable of gelling and the electrically conductive material; b) formation, at the exit of the double envelope, of a series of drops, each drop comprising a central core formed of said first solution and a peripheral film formed of said second solution and completely covering the central core; c) immersion of each drop in a gelling solution containing a reagent capable of reacting with the polyelectrolyte of the film to bring it from a liquid state to a gelled state and to form the gelled envelope comprising the electrically conductive material, the central core forming the liquid heart; d) recovery of the capsules formed; the second solution containing at least one surfactant before it comes into contact with the first solution and therefore before it comes into contact with the gelling solution.

3. Capsule according to claim 2, wherein said second liquid solution containing a liquid polyelectrolyte capable of gelling and the conductive material mentioned in step a) of the process is formed by bringing the electrically conductive material in dispersed form into contact with the polyelectrolyte suitable for gelling.

4. Capsule according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it further comprises an intermediate envelope totally encapsulating at its periphery the liquid core, said intermediate envelope itself being totally encapsulated at its periphery by the gelled envelope.

5. Capsule according to any one of claims 1 to 4, in which the liquid heart comprises at least one electro-active object.

6. Capsule according to any one of the preceding claims, in which the electrically conductive material consists of electrically conductive solid particles.

7. A capsule according to claim 6, in which said electrically conductive solid particles are chosen from carbon nanotubes, carbon black and graphene.

8. Capsule according to any one of claims 6 or 7, wherein the gelled envelope is formed by a hydrogel of polysaccharide gelled by divalent ions comprising said electrically conductive solid particles in dispersed and connected form thus forming an electrically conductive network.

9. Capsule according to any one of the preceding claims, in which said electrically conductive material is biocompatible.

10. Capsule according to claim 5, in which said electroactive object is chosen from microorganisms, cells, macromolecules and molecules.

11. Capsule according to claim 10, in which said microorganism is chosen from bacteria of the genus Escherichia Coli, Geobacter, Shewanella, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum, Enterobacter.

12. Use of at least one capsule according to any one of claims 1 to 11, for the production of bioreactors.

13. Use of at least one capsule according to any one of claims 10 to 11, for the screening of microorganisms, in particular electroactive microorganisms.

14. Use of at least one capsule according to any one of claims 10 to 11, for the recovery of electrons produced by microorganisms.

15. Use of at least one capsule according to any one of claims 10 to 11, for the production of an anode and / or of a bacteria cell cathode.

16. Device comprising at least one capsule according to any one of claims 1 to 11 and at least one electrode, said at least one electrode being in contact with the gelled envelope of said at least one capsule.