FR3010612A1 - Utilisation de pectinases dans l'alimentation des animaux monogastriques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'amélioration des performances zootechniques des animaux d'élevage monogastriques par ajout de pectinases polygalacturonases dans l'alimentation.

Description

Utilisation de pectinases dans l'alimentation des animaux monogastriques La présente invention concerne l'amélioration des performances zootechniques des animaux d'élevage monogastriques par ajout d'additifs alimentaires dans l'alimentation. Dans les aliments pour animaux d'élevage, les protéines et les acides aminés sont les principaux facteurs limitants de la croissance des animaux de rente. Le tourteau de soja est la source de protéines la plus utilisée au niveau mondial, tandis que, le maïs est la céréale la plus utilisée car il constitue une excellente source d'énergie pour les monogastriques. Néanmoins, la valeur nutritionnelle de ces matières premières est limitée par la présence de facteurs antinutritionnels, notamment les polysaccharides non amylacés. Il existe donc un besoin important de solutions permettant de mieux valoriser les sources de protéines disponibles, en particulier le tourteau de soja, afin d'optimiser les performances zootechniques et de limiter les rejets animaux dans l'environnement. Or le tourteau de soja contient une proportion importante de fibres (12% environ de fibres insolubles au détergent neutre (NDF)), dont la présence limite l'accès des enzymes digestives endogènes de l'animal aux nutriments essentiels (protéines, acides aminés, énergie) en exerçant un effet cage. La teneur et la composition de ces fibres est variable notamment selon la variété et la maturité de la graine de soja utilisée pour produire du tourteau et selon le procédé de trituration. Il existe donc un besoin important de supplémentation de l'alimentation des animaux afin de mieux la valoriser en rendant plus accessibles les nutriments essentiels présents dans cet aliment. Il a été proposé d'ajouter à l'alimentation des ruminants des complexes enzymatiques incluant des activités cellulases, xylanases, 6-glucanases, pectinases, mannanases, et a-galactosidases afin d'augmenter la digestibilité des fourrages ingérés (WO 2009/0006362). Toutefois, ces additifs agissant sur les fourrages (foin, paille, ensilage, ...) lors de la digestion, ils ne sont pas applicables aux animaux d'élevage monogastriques, dont l'alimentation, généralement constituée de matières premières beaucoup moins fibreuses (maïs grain par exemple) et très riche en tourteaux de soja, ne nécessite pas de supplémentation enzymatique pour dégrader les fibres. La présente invention résulte de la découverte inattendue, par les inventeurs, que l'introduction d'une polygalacturonase dans l'alimentation, riche en tourteaux de soja, des animaux monogastriques permettait d'améliorer les performances zootechniques des animaux, en particulier permettait d'améliorer de manière significative le gain de poids chez l'animal et de réduire de manière significative l'indice de consommation de l'animal. Les inventeurs ont ainsi montré qu'une pectinase polygalacturonase dont l'activité est compatible avec les conditions physico-chimiques du tube digestif d'un animal monogastrique était capable d'améliorer le taux d'hydrolyse des protéines du tourteau de soja et d'aliments contenant du tourteau de soja, ce qui se traduit zootechniquement par plus d'acides aminés disponibles pour la croissance et donc un gain de poids amélioré. Elle permet également d'améliorer les sucres libérés à partir des mêmes substrats et in fine permet d'améliorer la digestibilité in vitro de la matière sèche, des protéines et des parois végétales. De plus, les inventeurs ont pu constater de manière très surprenante que cet effet de la pectinase polygalacturonase était obtenu sans ajout d'enzymes exogènes habituellement utilisées en alimentation animale, telles que xylanases et [3- glucanases. Il n'est pas nécessaire d'incorporer d'autres activités enzymatiques pour obtenir l'effet zootechnique de la pectinase polygalacturonase sur des animaux monogastriques dont la ration alimentaire comprend du tourteau de soja et/ou du maïs. La présente invention concerne donc un additif pour l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques qui comprend une composition enzymatique comprenant une pectinase polygalacturonase, ladite composition enzymatique présentant une activité polygalacturonase supérieure à 12000 PGU par gramme de composition. La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'additif selon l'invention comme ingrédient de compositions alimentaires ou de prémix pour animaux d'élevage monogastriques. La présente invention concerne par ailleurs un prémix pour l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques comprenant l'additif selon l'invention, dans lequel le ratio entre les activités pectine-méthyl-estérase (PE) et polygalacturonase (PG) est compris entre 0.005 et 0.250 et le ratio entre les activités xylanase (AXC) et polygalacturonase (PG) est compris entre 0 et 0.5. La présente invention a également pour objet une composition alimentaire supplémentée pour animaux d'élevage monogastriques comprenant une quantité efficace de l'additif selon l'invention ou du prémix selon l'invention, en association avec des aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques. Un autre objet de l'invention a trait à un procédé de fabrication d'une composition alimentaire supplémentée pour animaux d'élevage monogastriques comprenant le mélange de l'additif selon l'invention ou d'un prémix selon l'invention avec des aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques.

La présente invention concerne également l'utilisation de l'additif selon l'invention, du prémix selon l'invention ou de la composition alimentaire selon l'invention, pour augmenter les performances zootechniques d'un animal d'élevage monogastrique. La présente invention a également trait à un procédé pour augmenter les performances zootechniques des animaux d'élevage monogastriques caractérisé en ce que l'on fait ingérer à cet animal, dans la ration alimentaire, une quantité efficace de l'additif selon l'invention, du prémix selon l'invention ou de la composition alimentaire selon l'invention.

Description détaillée de l'invention Animaux d'élevage monogastriques Dans le contexte de l'invention, le terme "animal d'élevage monogastrique" désigne tout animal non-humain dont l'estomac n'est constitué que d'une seule poche entière, par opposition aux ruminants. Du fait de la présence de cette poche unique, les animaux monogastriques ont une physiologie digestive considérablement différente de celles des ruminants car elle attribue un rôle majeur dans l'utilisation des aliments aux capacités propres à l'animal et un rôle secondaire à la flore. De tels animaux sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple la volaille, le Porc, l'Equidé, le Chien, le Chat et le Lapin.

Ainsi, de préférence, dans le contexte de l'invention l'animal d'élevage monogastrique est un porc, un lapin, un équidé, un chat, un chien ou une volaille. De manière davantage préférée, l'animal d'élevage monogastrique est un porc ou une volaille. Par "volaille", on entend ici tout oiseau domestique, appartenant généralement aux gallinacés, aux palmipèdes ou aux Struthionidae, élevé pour sa chair, ses oeufs ou ses plumes, soit en basse-cour traditionnelle, soit en élevage industriel. Les volailles incluent en particulier l'oie, le jars, l'oison, la dinde, le dindon, le dindonneau, la poule, en particulier la poule pondeuse, la poulette, le coq, le poulet, le coquelet, le canard, la cane, le caneton, la pintade, le pintadeau, le chapon, la poularde, la caille, le faisan, la perdrix, l'autruche et le pigeon. De préférence, quand l'animal d'élevage monogastrique utilisé dans le cadre de l'invention est une volaille, il est choisi parmi la dinde, le dindonneau, la poule pondeuse, le poulet, la poulette, le canard, la pintade et le chapon. Par "porc", on entend ici un mammifère domestique omnivore de la famille des porcins, ou suidés, qui est une sous-espèce du sanglier sauvage (Sus scrofa). Le terme "porc" englobe ici le cochon, la truie, la cochette, le verrat, le porcelet, le cochonnet, le goret, le nourrain (ou nourrin) et le porc à l'engrais.

Par "lapin", on entend ici un mammifère domestique à grandes oreilles de la famille des léporidés, réparties dans neuf genres biologiques : Brachylagus, Bunolagus, Caprolagus, Nesolagus, Oryctolagus (lapin commun), Pentalagus, Poelagus, Pronolagus, Romerolagus ou Sylvilagus. De préférence, le lapin utilisé dans le cadre de l'invention est le lapin commun ou lapin de garenne (Oryctolagus cuniculus). Par « équidé », on entend un grand mammifère herbivore et ongulé à sabot unique, appartenant au genre Equus. Le terme « équidé » englobe ici le poulain, la pouliche, la jument, la poulinière, l'étalon, l'entier, le hongre, le yearling, le foal, l'âne, l'ânesse, l'ânon, le mulet et le zèbre.

Par « chien », on entend un mammifère de la famille des canidés (Canis lupus familiaris). Le terme « chien » englobe ici le chien, le chiot, la chienne. Par « chat », on entend un mammifère carnivore de la famille des félidés (Felis silvestris catus). Le terme « chat » englobe ici le chat, la chatte et le chaton.

Composition enzymatique La composition enzymatique utilisée dans le cadre de l'invention comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en une pectinase polygalacturonase, et présente une activité polygalacturonase supérieure à 12000 PGU par gramme de composition. Par "pectinase polygalacturonase", "endopolygalacturonase", "pectine polygalacturonase", "poly(1,4-a-D-galacturon ide) g lycanohydrolase", "poly-(1 ,4)-a- D- galactosiduronate glycanohydrolase" ou "PG", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.2.1.15 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB), qui clive les liaisons glucosidiques a(14) des chaînes linéaires d'acide galacturonique dans les pectines de manière à produire des oligogalacturonates. Les PG sont largement distribuées chez les champignons, les bactéries et de nombreuses levures. Elles existent également chez les végétaux supérieurs. La PG utilisée dans le cadre de l'invention peut ainsi être produite par des microorganismes, en particulier des champignons, bactéries ou levures, non-génétiquement modifiés ou génétiquement modifiés. La PG utilisée dans le cadre de l'invention peut ainsi être produite par Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Burkholderia cepacia, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, Thermotoga maritima, Aspergillus aculeatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus neo niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus tubigensis, Bacillus subtilis, Botryotinia fuckeliana, Chondrostereum purpureum, Claviceps purpurea, Cochliobolus carbonum, Colletotrichum lindemuthianum, Cryptonectria parasitica, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, Geotrichum klebahnii, Kluyveromyces marxianus, Ophiostoma novoulmi, Penicillium expansum, Penicillium griseoroseum, Penicillium janthinellum, Penicillium olsonii, Saccharomyces cerevisiae, Sclerotinia sclerotiorum, Actinidia deliciosa, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Cucumis melo, Glycine max, Lycopersicon esculentum, Malus domestica, Medicago sativa, Persea americana, Prunus persica, Rubus idaeus, Cryptomeria japonica, Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Nicotiana tabacum, Salix gilgiana, Oenothera organensis ou Phaedon cochleariae, en particulier des souches non-génétiquement modifiées ou des souches génétiquement modifiées de ces microorganismes. De préférence, la PG utilisée dans le cadre de l'invention est produite par un champignon du groupe Aspergillus niger, tel que Aspergillus niger Van Tieghem (aussi appelé Aspergillus niger) ou Aspergillus tubingensis, en particulier des souches non-génétiquement modifiées ou des souches génétiquement modifiées de ces microorganismes. De préférence, la PG utilisée dans le cadre de l'invention est produite par Aspergillus tubingensis, en particulier des souches non-génétiquement modifiées ou des souches génétiquement modifiées de ce microorganisme. De manière préférée entre toutes, la PG utilisée dans la cadre de l'invention est la polygalacturonase SF (Stone Fruits) de concentration 7000 PGU/g commercialisée sous forme liquide par la société Lyven pour une application dans les jus de fruits. La pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention peut être produite par n'importe quelle technique de production d'enzyme conventionnelle bien connue de l'homme du métier. En particulier, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention peut être produite par fermentation. De telles techniques incluent par exemple la fermentation submergée (ou fermentation en milieu liquide), la fermentation en milieu solide et la fermentation en milieu solide/liquide.

Dans le contexte de l'invention, la "fermentation en milieu solide" est définie comme la culture de microorganismes sur des supports solides humides, sur des supports inertes ou sur des substrats insolubles qui peuvent être utilisés comme source de carbone et d'énergie. Le processus de fermentation a lieu en absence ou quasi-absence d'eau libre dans l'espace entre les particules de substrat. Au contraire, la "fermentation submergée" fait ici référence à une culture de microorganismes dans laquelle, à la fois les nutriments et les microorganismes sont submergés dans un milieu aqueux. Dans un mode de réalisation particulier, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention est obtenue par fermentation en milieu solide ou liquide, plus particulièrement par fermentation en milieu solide. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention est obtenue par fermentation, en particulier par fermentation en milieu solide ou liquide, plus particulièrement par fermentation en milieu solide, avec un champignon du groupe Aspergillus piger, en particulier Aspergillus figer Van Tieghem. Tout substrat approprié comme source de carbone et d'énergie peut être utilisé pour mettre en oeuvre cette fermentation. De préférence, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention est obtenue par fermentation, en particulier par fermentation en milieu solide ou liquide, plus particulièrement par fermentation en milieu solide, sur un substrat riche en pectines. En effet, sans être lié par la théorie, la présence importante de pectines dans le substrat permet d'induire plus efficacement la production de pectinases par le microorganisme. De tels substrats riches en pectines sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple la pulpe de betterave, la peau d'orange, la peau de pomme, la pulpe de poire, la peau de mangue, la pulpe de raisin, la pulpe de chicorée, la pulpe de pomme de terre, la coque et la cabosse de cacao, le tourteau de cacao, le tourteau de soja, le tourteau de colza, la graine et la pulpe de caroube. De préférence, le substrat utilisé est la pulpe de betterave. De manière particulièrement préférée, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention est obtenue par fermentation, en particulier par fermentation en milieu solide ou liquide, plus particulièrement par fermentation en milieu solide, de pulpe de betterave par un champignon du groupe Aspergillus piger, en particulier Aspergillus figer Van Tieghem. La pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention peut être sous toute forme appropriée pour son utilisation dans un additif. Elle peut en particulier être sous forme extraite, sous forme de poudre stabilisée, ou sous forme brute.

Par "forme extraite", on entend ici l'enzyme sous forme liquide, de préférence concentrée, extraite du milieu de fermentation. L'extraction de l'enzyme peut être mise en oeuvre par toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par extraction en solution aqueuse, extraction en solution alcoolique, extraction par solvants, homogénéisation haute pression, extraction supercritique, extraction par lits fluidisés, broyage, broyage cryogénique, décompression, cavitation, bullage, extraction par ultrasons, adsorption sur résines ou zéolites. L'enzyme sous forme liquide peut être ensuite purifiée par toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par centrifugation, filtration, ultrafiltration, chromatographie, utilisation de membranes ou précipitation.

Par "poudre stabilisée", on entend ici l'enzyme extraite, mise sur support de manière à obtenir une poudre, avant d'être stabilisée. Le support utilisé peut en particulier être une céréale broyée ou un coproduit de céréale broyé, des polyols tels que le sorbitol, des polysaccharides tels que les maltodextrines ou les dextrines, de la gomme arabique, de la cellulose, des matières grasses telles que des acides gras ou des esters d'acides gras, des minéraux tels que du phosphate ou du carbonate, ou des protéines telles que de la gélatine. Le broyage, mis en oeuvre sur le support, peut être effectué par toute technique appropriée bien connue de l'homme du métier, telle que la micronisation, le broyage par cisaillement, le broyage par impact, le cryobroyage ou l'émiettage. La poudre peut ensuite être stabilisée par toute technique de stabilisation bien connue de l'homme du métier, en particulier par ajout de sel(s).

Par "forme brute", on entend ici le milieu de fermentation contenant l'enzyme. Le milieu de fermentation après fermentation du substrat par un microorganisme peut en particulier être déshydraté et/ou broyé avant d'être utilisé directement dans la composition enzymatique selon l'invention. Ce broyage peut également être effectué par toute technique appropriée bien connue de l'homme du métier, telle que la micronisation, le broyage par cisaillement, le broyage par impact, le cryobroyage ou l'émiettage. De préférence, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention peut être sous forme extraite ou sous forme de poudre stabilisée. La pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention agissant au niveau du tractus digestif de l'animal d'élevage monogastrique, en particulier aux niveaux de l'estomac et de son intestin, il est particulièrement avantageux que cette pectinase polygalacturonase soit résistante aux conditions physico-chimiques du tractus digestif d'un animal d'élevage monogastrique, en particulier aux conditions physico-chimiques de l'estomac d'un animal d'élevage monogastrique. Ainsi, de préférence, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention est résistante à un pH acide, typiquement un pH compris entre 1,5 et 5. De préférence, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention est également résistante à la présence des enzymes du tractus digestif d'un animal d'élevage monogastrique, en particulier à la présence des enzymes de l'estomac d'un animal d'élevage monogastrique. Ainsi, de préférence, la pectinase polygalacturonase de la composition enzymatique selon l'invention est résistante à la présence de pepsine et/ou de pancréatine. Par l'expression "est résistante à X", on entend ici que la pectinase polygalacturonase a une activité qui n'est pas sensiblement diminuée ou abolie en présence de X par rapport à son activité dans des conditions physico-chimiques normales, typiquement à pH 4,65, en absence d'enzymes protéolytiques, et/ou à une température de 31°C. Les techniques de mesure de l'activité polygalacturonase sont bien connues de l'homme du métier. Typiquement, pour mettre en évidence cette activité, on peut faire agir la solution enzymatique sur une solution d'acide polygalacturonique d'orange et mesurer les sucres réducteurs libérés par la méthode à l'aide du 2 cyano-acétamide. Le milieu réactionnel est typiquement composé de 750 !IL de tampon succinate à pH 4,65, de 750 !IL d'une solution d'acide polygalacturonique à 5 g/L et de 15 !IL de solution enzymatique. Des prélèvements sont de préférence effectués régulièrement, par exemple toutes les 10 minutes pendant 40 minutes, mélangés à une solution de 2 cyano-acétamide à 20 g/L et une solution de tampon borate de sodium 0,2 M pH 10,1 et incubés par exemple à 103°C pendant 12 minutes puis refroidis à 4°C. L'absorbance des échantillons peut ensuite être dosée à 280 nm. Une unité d'activité enzymatique polygalacturonase (PGU) est alors définie comme la quantité d'enzyme permettant de libérer 1 umol/min d'acide galacturonique à 31 °C et pH 4,65 à partir d'une solution de polygalacturonate de sodium à 5 g/L. De préférence, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité polygalacturonase supérieure ou égale à 12000 PGU par gramme de composition, de manière davantage préférée une activité PG supérieure ou égale à 15000 PGU par gramme de composition, de matière davantage préférée une activité PG supérieure ou égale à 20000 PGU par gramme de composition, de matière davantage préférée une activité PG supérieure ou égale à 30000 PGU par gramme de composition. La composition enzymatique selon l'invention peut comprendre des activités enzymatiques autres que l'activité polygalacturonase telle que définie ci-dessus, mais à des niveaux très faibles. En particulier, la composition enzymatique selon l'invention peut comprendre d'autres activités pectinases, telles que des activités pectine-méthyl-estérase et/ou des activités pectine-lyase. Toutefois, de préférence les activités pectine-méthylestérase et/ou les activités pectine-lyase sont présentes à des niveaux faibles.

Dans le contexte de l'invention, les termes "pectine-méthyl-estérase", 'pectinestérase", "pectine pectylhydrolase", "pectine méthoxylase", "pectine déméthoxylase", "pectolipase" et "PE" sont utilisés indifféremment, et font référence à une enzyme de la classe EC 3.1.1.11 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB), qui catalyse la déestérification des liaisons méthyl-ester du squelette galacturonane des substances pectiques pour libérer des pectines acides et du méthanol. Les PE sont produites à partir de plantes, de bactéries pathogènes des végétaux et de champignons. Les PE peuvent ainsi être obtenues à partir de Rhodotorula sp., Phytophthora infestans, Erwinia chrysanthemic, Saccharomyces cerevisiae, Lachnospira pectinoschiza, Pseudomonas solanacearum, Aspergillus piger, Aspergillus neo piger, Aspergillus tubingensis, Bacilus subtilis, Lactobacillus lactis, Penicillium frequentans, E. chrysanthemi, Penicillium occitanis, Carica papaya, Lycopersicum esculentum, Prunus malus, Vitis vinifera, Citrus sp., Pouteria sapota ou Malpighia glabra. Les techniques de mesure de la PE sont bien connues de l'homme du métier, et incluent par exemple le test de diffusion sur gel tel que décrit dans Downie et al. (1998) Anal. Biochem. 264:149-157, qui est basé sur une liaison accrue du rouge de ruthénium à la pectine, du fait de la diminution du nombre d'esters de méthyle attachés à la pectine ou un test de suivi du pH du milieu réactionnel lors de l'hydrolyse des pectines par la solution enzymatique. L'action de l'enzyme libère du méthanol et des groupements acides carboxyliques. L'effet acidifiant de ces derniers est dosé en suivant la chute du pH du milieu réactionnel à l'aide d'un indicateur coloré. La cinétique de dégradation de la pectine par la PE est une sigmoïde dont la partie centrale est linéaire, ce qui permet de retrouver l'activité d'un échantillon à partir de la pente de cette droite. La détermination de cette pente constitue une mesure de l'activité pectine méthyle estérase. De préférence, l'activité PE est mesurée en suivant la cinétique d'évolution du pH du milieu réactionnel lors de l'hydrolyse d'une solution de pectines (E440) à 10 g/L par la solution enzymatique à l'aide de vert de bromocrésol à 0,01%. Une unité d'activité pectine méthyl-estérase (PEU) est alors définie comme la quantité d'enzyme qui libère une micromole d'acide pendant une minute à 30°C et pour un pH compris entre 5.0 et 5.8. De préférence, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité pectine-méthyl-estérase comprise entre 0 et 300 PEU par gramme de composition. De manière préférée entre toutes, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité pectine méthyl-estérase inférieure à 250 PEU par gramme de composition. De manière préférée entre toutes, la composition enzymatique selon l'invention est dépourvue d'activité PLE.

Dans le contexte de l'invention, les termes "pectine-lyase", "transeliminase" et "PL" sont utilisés indifféremment et font référence à une enzyme de la classe EC 4.2.2.2 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB), qui clive de manière non-hydrolytique les pectates ou pectinates, en cassant les liaisons glycosidiques en C-4 et éliminant de manière simultanée l'hydrogène du C-5, produisant des produits non-saturés D 4:5. Les PL sont produites par de nombreuses bactéries et certains champignons pathogènes. Les PL peuvent ainsi être obtenues à partir de Aspergillus piger, Aspergillus neo piger, Aspergillus tubingensis, Bacilus subtilis, Colletotrichum lindemuthionum, Bacteroides thetaiotaomicron, Erwinia carotovora, Amucala sp., Pseudomonas syringae, Colletotrichum magna, E; chrysanthemi, Bacillus sp., C. gloeosporioides.

Les techniques de mesure de l'activité PL sont bien connues de l'homme du métier, et incluent par exemple la mesure de l'augmentation de l'absorbance à 235 nm due à la formation de doubles liaisons par [3-élimination. Le milieu réactionnel est typiquement composé de 250 pL de pectines (SIGMA P9135) à 4,24 g/L dans un tampon succinate 5,904 g/L et pH 5,2 et de 50 pL de solution enzymatique (échantillon inconnu extrait dans un tampon 0.1 M pH 5.2). L'absorbance du milieu réactionnel à 235 nm à 30°C est de préférence suivi en cinétique pendant 7 minutes. Une unité d'activité pectine-lyase (PLU) est alors définie comme la quantité d'enzyme permettant de libérer 1 pmole de doubles liaisons en 1 min à 30°C à partir de pectine.

De préférence, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité PL comprise entre 0 et 200 PLU par gramme de composition, de préférence comprise entre 0 et 150 PLU par gramme de composition. De manière préférée entre toutes, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité PL inférieure à 100 PLU par gramme de composition. De manière particulièrement préférée, la composition enzymatique selon l'invention est dépourvue d'activité PL. Dans certains modes de réalisation, la composition enzymatique selon l'invention peut comprendre d'autres activités enzymatiques telles que des activités xylanasiques, [3- glucanasiques et/ou protéasiques. Toutefois, de préférence les activités xylanasiques, R- glucanasiques et/ou protéasiques sont présentes à des niveaux très bas. Par "xylanase", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.2.1.8 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB), qui dégrade le polysaccharide linéaire [3-1,4-xylane en xylose, cassant ainsi en particulier l'hémicellulose.

Les techniques de mesure de l'activité xylanasique sont bien connues de l'homme du métier. Typiquement, pour mettre en évidence cette activité, on peut faire agir la solution enzymatique sur une solution de xylane d'avoine soluble lié à un chromophore, le Rémazol Brillant Blue R, et mesurer les oligomères libérés par l'action de la solution enzymatique. Ceux-ci sont retrouvés dans la fraction soluble après précipitation à l'éthanol. Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 130 pL de solution d'azo-xylane d'avoine (MEGAZYME) 10 g/L, 50 pL de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate 0,4 M, pH 4,70. On effectue de préférence la réaction à 31 °C pendant 20 minutes. La réaction est typiquement arrêtée par ajout de 500 pl_ d'éthanol à 96%. La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation (10 minutes à 300 tour/minute à 20°C) est lue à 590 nm.

Une unité d'activité xylanase (AXC) peut alors être définie comme la quantité d'enzyme qui, diluée à raison de 1 unité/mL, à pH 4,70 et à 30°C, libère, à partir d'une solution de Rémazol Brillant Blue R xylane, des oligomères non précipitables dans l'éthanol tels que la densité optique du surnageant soit de 0,93 à 590 nm. De préférence, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité xylanasique comprise entre 0 et 1000 AXC par gramme de composition, de préférence comprise entre 0 et 500 AXC par gramme de composition, de préférence comprise entre 0 et 250 AXC par gramme de composition. De manière préférée entre toutes, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité xylanasique inférieure à 150 AXC par gramme de composition. De manière particulièrement préférée, la composition enzymatique selon l'invention est dépourvue d'activité xylanasique. Par "p-glucanase", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.2.1.6 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB), qui clive le glucane. Les p-glucanases incluent en particulier la R1,3-glucanase qui clive les p-1,3-glucanes, tels que le callose ou le curdlan, la [3-1,6- glucanase qui clive les 3-1,6-glucanes, la cellulase, l'endo-p-1,4-glucanase spécifique du xyloglucane ou l'exo-p-1,4-glucanase spécifique du xyloglucane. Les techniques de mesure de l'activité 3-glucanase sont bien connues de l'homme du métier. Typiquement, pour mettre en évidence cette activité, on peut faire agir la solution enzymatique sur une solution de 3-glucane d'orge lié à un chromophore, le Rémazol Brillant Blue R. L'hydrolyse, à pH 4,8 de ce substrat par les activités [3- glucanases libère des oligomères liés au chromophore et non précipitables par de l'éthanol dont la concentration est évaluée par mesure de l'absorbance à 590 nm. Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 130 pl_ de solution d'azo-barley glucan (MEGAZYME) dilué au 4/5ème dans un tampon de dilution acétate phosphate 0,1 M et ajusté à pH 4,75, 50 pl_ de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate phosphate 0,1 M, pH 4,60. On effectue de préférence la réaction à 31 °C pendant 20 minutes. La réaction est typiquement arrêtée par ajout de 620 pl_ de solution de précipitation (30 g d'acétate de sodium trihydraté et 3 g d'acétate de zinc dans 1 litre d'éthanol à 96%). La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation (10 minutes à 3000 tours/minute à 20°C) est lue à 590 nm.

Une unité d'activité [3-glucanase (BGU) peut être alors définie comme la quantité d'enzyme qui, diluée à une concentration de 1 unité par mL dans les conditions de dosage (30°C et pH 4,8), libère des oligomères du 6-glucane d'orge lié au Rémazol Brillant Blue R non précipitables dans l'éthanol, de telle façon que l'absorbance du surnageant est de 0,9 à 590 nm. De préférence, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité 6-glucanase comprise entre 0 et 2000 BGU par gramme de matière sèche, de préférence comprise entre 0 et 1000 BGU par gramme de matière sèche, de préférence comprise entre 0 et 500 BGU par gramme de matière sèche. De manière préférée entre toutes, la composition enzymatique selon l'invention est dépourvue d'activité 6-glucanase. Par "protéase", "peptidase" ou "enzyme protéolytique", on entend ici toute enzyme clivant les liaisons peptidiques des protéines. Les techniques de mesure de l'activité protéasique sont bien connues de l'homme du métier. Typiquement, on peut doser l'activité protéasique sur de l'azocaséine selon la méthode de Béinon, décrite dans l'ouvrage "Proteins Purification Methods - a practical approach", Harris E.L.V. et Angal, S (éditeurs), IRL-Press, Oxford University Press, 1-66 (1989). La dégradation de ce substrat par des protéases entraîne la libération de groupements azo qui absorbent dans l'UV à 340 nm. L'évolution de l'absorbance pendant la cinétique d'hydrolyse de cette protéine indique l'importance de la réaction.

Typiquement, le milieu réactionnel contient 1000 pl de solution d'azocaséine à 1%, pH 5,0 et 200 pl de solution enzymatique. On peut par exemple utiliser une solution d'azocaséine obtenue par dissolution dans un tampon acétate 0,1 M à pH 5,0, et réaliser la réaction enzymatique à 60°C. Des prélèvements peuvent être réalisés toutes les 5 min pendant 20 min et être mélangés avec de l'acide tricholoroacétique (TCA) à 5% pour stopper la réaction. Une unité d'activité protéase (PU) peut alors être définie comme la quantité d'enzyme nécessaire à l'augmentation de 0,01 unité A340nm par minute, générée par la libération de groupes azo dans les conditions citées précedemment. De préférence, la composition enzymatique selon l'invention présente une activité protéase comprise entre 0 et 100 PU par gramme de composition, de préférence comprise entre 0 et 50 PU par gramme de composition, de préférence comprise entre 0 et 25 PU par gramme de composition. De manière préférée entre toutes, la composition enzymatique selon l'invention est dépourvue d'activité protéase. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition enzymatique selon l'invention est essentiellement dépourvue ou est dépourvue d'activités enzymatiques autres que l'activité polygalacturonase, en particulier est essentiellement dépourvue ou est dépourvue d'activités xylanase, 6-glucanase ou protéase. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition enzymatique selon l'invention consiste essentiellement ou consiste en une activité polygalacturonase.

Additif pour l'alimentation des animaux La présente invention concerne un additif, de préférence non-médicamenteux, pour l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques, qui comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en une composition enzymatique telle que définie dans la section "Composition enzymatique" ci-dessus.

Par "additif", on entend ici un composant ou mélange de composants qui peut être ajouté à un aliment ou à un régime alimentaire d'un animal. L'additif selon l'invention peut en outre comprendre des ingrédients additionnels tels que des supports physiologiquement acceptables, des stabilisants, antioxydants, conservateurs L'additif selon l'invention peut être sous toute forme adaptée pour son usage ultérieur, en particulier sous formes liquide, poudre ou granulé. L'additif selon l'invention peut être utilisé comme ingrédient, en particulier comme ingrédient non-médicamenteux, de compositions alimentaires ou de prémix pour animaux d'élevage monogastriques.

Prémix Par "prémix", on entend ici un concentré d'enzymes et éventuellement d'oligo-éléments, de vitamines et de minéraux, associés en faible pourcentage aux différentes matières premières pour constituer l'aliment complet à destination des animaux d'élevage.

La présente invention concerne ainsi un prémix pour l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques comprenant un additif tel que défini à la section "Additif' ci-dessus, dans lequel le ratio entre les activités PE et PG, telles que définies à la section "Composition enzymatique" ci-dessus, est compris entre 0,005 et 0,250 et/ou le ratio entre les activités AXC et PG, telles que définies à la section "Composition enzymatique" ci-dessus, est compris entre 0 et 0.5. De préférence, dans le prémix selon l'invention, le ratio entre les activités PE et PG est compris entre 0,001 et 0,250, de préférence entre 0,002 et 0,100, de préférence entre 0,005 et 0,050, de préférence entre 0,006 et 0,010, de préférence entre 0,007 et 0,009. De manière particulièrement préférée, le ratio entre les activités PE et PG est de 0,008.

De préférence, dans le prémix selon l'invention, le ratio entre les activités AXC et PG est compris entre 0,0 et 0,5, de préférence entre 0,10 et 0,45, de préférence entre 0,2 et 0,425, de préférence entre 0,3 et 0,5. De manière particulièrement préférée, le ratio entre les activités AXC et PG est de 0,4.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le ratio entre les activités PE et PG dans le prémix est compris entre 0,007 et 0,009, en particulier de 0,008, et le ratio entre les activités AXC et PG dans le prémix est compris entre 0,3 et 0,5, en particulier de 0,4. Les activités PE et AXC présentes dans le prémix peuvent être introduites par l'ajout d'additifs différents de l'additif selon l'invention. En effet, le prémix selon l'invention peut comprendre d'autres additifs conventionnellement utilisés dans l'alimentation des animaux d'élevage, en particulier des animaux d'élevage monogastriques. De tels additifs sont bien connus de l'homme du métier et incluent les additifs technologiques tels que les conservateurs, les antioxydants, les émulsifiants, les stabilisants, les épaississants, les gélifiants, les liants, les substances pour le contrôle de contamination de radionucléides, les anti-agglomérants, les correcteurs d'acidité, les additifs pour l'ensilage, les dénaturants ; les additifs sensoriels tels que les colorants (dopant ou modifiant la couleur d'aliments pour animaux ; des substances qui, incluses dans l'alimentation des animaux donneront une couleur aux denrées alimentaires produites à partir de ces animaux), des substances aromatiques ; les additifs nutritionnels, tels que les vitamines, provitamines et "substances à effet analogue chimiquement bien définies", les composés d'oligo-éléments, les acides aminés, l'urée ; et les additifs zootechniques tels que les améliorateurs de digestibilité comme des enzymes, des stabilisateurs de la flore intestinale, ou des substances ayant un "effet positif sur l'environnement". Le prémix selon l'invention peut être sous toute forme adaptée pour son usage ultérieur, en particulier sous formes liquide, poudre ou granulé.. Composition alimentaire La présente invention concerne également une composition alimentaire supplémentée pour animaux d'élevage monogastriques comprenant une quantité efficace d'un additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus ou d'un prémix tel que défini dans la section "Prémix" ci-dessus, en association avec des aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques.

Les aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple les tourteaux d'oléagineux, tels que le tourteau d'arachide, le tourteau de cacao, le tourteau de colza, le tourteau de coprah, le tourteau de coton, le tourteau de lin, le tourteau de palmiste, le tourteau de pépins de raisin, le tourteau de sésame, le tourteau de soja et le tourteau de tournesol; les céréales, telles que l'avoine, le blé dur, le blé tendre, le maïs, l'orge, le riz cargo, le seigle, le sorgho, le triticale, ou leurs co-produits; les graines protéagineuses ou oléagineuses telles que la graine de colza, la graine de coton, la féverole à fleurs blanches, la féverole à fleurs colorées, la graine de lin, le lupin blanc, le lupin bleu, le pois, le pois chiche, la graine de soja extrudée, la graine de soja toastée, la graine de tournesol; d'autres coproduits d'origine végétale tels que le concentré protéique de luzerne, le concentré protéique de pomme de terre, les coques de cacao, les coques de soja, les cosses de sarrasin, la farine de gousse de caroube, la levure de brasserie déshydratée, le marc de raisin, la mélasse de betterave, la mélasse de canne, les pépins de raisin, la pulpe d'agrumes déshydratée, la pulpe de betterave déshydratée, la pulpe de betterave déshydratée mélassée, la pulpe de betterave surpressée, la pulpe de pomme de terre déshydratée, la purée-pelures de pomme de terre, la vinasse d'acide glutamique, la vinasse de levurerie, la vinasse déminéralisée; les matières grasses animales telles que le saindoux ou le suif, les protéines animales telles que les farines de viande ou farines d'os et les farines de poisson. De préférence les aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques utilisés dans le cadre de l'invention comprennent du tourteau de soja, de colza, de tournesol, de coton, ou des mélanges de ceux-ci et/ou du maïs. Dans un mode de réalisation préféré, les aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques utilisés dans le cadre de l'invention comprennent du tourteau de soja et/ou du maïs. De préférence, l'additif tel que défini dans la section "Additif' ou le prémix tel que défini à la section "Prémix" est présent dans la composition alimentaire à une quantité telle que la pectinase polygalacturonase est présente dans la composition alimentaire selon l'invention à une concentration comprise entre 10 et 1000 PGU/kg de composition alimentaire, de manière davantage préférée à une concentration comprise entre 50 et 750 PGU/kg de composition alimentaire, de préférence à une concentration comprise entre 100 et 500 PGU/kg de composition alimentaire, de manière préférée entre toutes à une concentration de 250 PGU/kg de composition alimentaire. La composition alimentaire selon l'invention peut être sous toute forme adaptée pour l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques. Elle peut en particulier être sous forme de granulé, de miette ou de farine.35 La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'une composition alimentaire supplémentée pour animaux d'élevage monogastriques telle que définie ci-dessus comprenant une étape de mélange d'un additif tel que défini à la section "Additif' ci-desuss ou d'un prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus avec des aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques, tels que définis ci- dessus. L'étape de mélange de l'additif ou du prémix avec l'aliment peut être mise en oeuvre par toute technique bien connue de l'homme du métier. Le procédé de fabrication de la composition alimentaire selon l'invention peut en outre comprendre une étape de formulation de la composition alimentaire ainsi qu'une étape de conditionnement. Ces étapes peuvent être mises en oeuvre par toute technique conventionnelle bien connue de l'homme du métier. Ainsi, l'additif ou le prémix, quand ils sont sous forme de farine, peuvent être ajoutés à l'aliment au moment de l'étape de formulation (ou mélange), ou lorsqu'ils sont sous forme liquide, peuvent être pulvérisés après granulation. Utilisations pour augmenter les performances zootechniques Les inventeurs ont montré que la présence de pectinase polygalacturonase seule dans l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques permettait de manière surprenante d'accroître leurs performances zootechniques. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'un additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus, d'un prémix tel que défini dans la section "Prémix" ci-dessus ou d'une composition alimentaire telle que définie dans la section "Composition alimentaire", pour augmenter les performances zootechniques d'un animal d'élevage monogastrique tel que défini dans la section "Animal d'élevage monogastrique" ci-dessus. Par "performance zootechnique", on entend ici un indicateur permettant de juger de la qualité d'un animal, en particulier de son aptitude biologique pour différentes fonctions (croissance, travail, reproduction...). Les performances zootechniques incluent en particulier le gain de poids de l'animal, en particulier le gain de poids moyen quotidien, son indice de consommation, le poids à âge-type, le rendement à l'abattage, la prise alimentaire, la production d'ceufs, la production de lait, la taille de portée, la mortalité, la morbidité, la production de poils ou la production de plumes. De préférence, l'additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus, le prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus ou la composition alimentaire telle que définie à la section "Composition alimentaire" ci-dessus permet de favoriser le gain de poids et/ou d'améliorer l'indice de consommation et/ou de favoriser la prise alimentaire et/ou d'améliorer le rendement à l'abattage, la production d'ceufs, la production de lait, la taille de portée, la production de poils ou la production de plumes et/ou de réduire la mortalité et/ou la morbidité chez un animal d'élevage monogastrique tel que défini à la section "Animal d'élevage monogastrique". De manière particulièrement préférée, l'additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus, le prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus ou la composition alimentaire telle que définie à la section "Composition alimentaire" ci-dessus permet de favoriser le gain de poids et/ou d'améliorer l'indice de consommation et/ou de favoriser la prise alimentaire chez un animal d'élevage monogastrique tel que défini à la section "Animal d'élevage monogastrique". Par "gain de poids" ou "gain moyen quotidien", on entend ici l'évolution de la croissance pondérale de l'animal, exprimée en g/jour. Par "indice de consommation", on entend ici l'efficacité de la conversion alimentaire. Cet indice est déterminé par le rapport entre la quantité d'aliments consommés et le gain de poids vif. Par "poids à âge-type", on entend ici le poids de l'animal à un âge de référence (1 an ou 18 mois par exemple), ce qui permet de faciliter les comparaisons. Par "rendement à l'abattage", on entend ici le rapport entre le poids de la carcasse et le poids vif de l'animal, ce qui permet d'estimer le "rendement vrai".

Par "prise alimentaire", on entend la quantité d'aliments ingérés par l'animal. Par « production d'ceufs », on entend la quantité d'ceuf produite par jour, exprimée en nombre ou en poids. Par « production de lait », on entend la quantité de lait produite par jour, exprimée en unité de volume ou en unité de poids.

Par « taille de portée », on entend l'effectif et le poids à la naissance des jeunes ou des petits. Par « morbidité », on entend le nombre d'animaux malades. Par « mortalité », on entend le nombre d'animaux morts. Par « production de poils », on entend la quantité de poils produite par un mammifère élevé pour ses poils (lapin angora, chèvre cachemire par exemple). Par « production de plumes », on entend la quantité de plumes produite par un oiseau élevé pour ses plumes (autruche ou oie par exemple). De préférence, l'additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus, le prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus ou la composition alimentaire telle que définie à la section "Composition alimentaire" ci-dessus permet de favoriser le gain de poids et/ou d'améliorer l'indice de consommation et/ou de favoriser la prise alimentaire de manière significative chez un animal d'élevage monogastrique tel que défini à la section "Animal d'élevage monogastrique". En particulier, l'additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus, le prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus ou la composition alimentaire telle que définie à la section "Composition alimentaire" ci-dessus permet d'améliorer l'indice de consommation de 1 à 5%, de préférence de 2%, chez un animal d'élevage monogastrique, en particulier chez de la volaille, de préférence chez un dindonneau, nourri de préférence avec un aliment comprenant du tourteau de soja, de préférence un aliment comprenant un mélange de tourteau de soja et de maïs, la pectinase polygalacturonase étant de préférence présente dans l'aliment à une concentration de 250 PGU par kg d'aliment. En particulier, l'additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus, le prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus ou la composition alimentaire telle que définie à la section "Composition alimentaire" ci-dessus permet également d'améliorer le gain de poids de 1 à 5%, de préférence de 2%, chez un animal d'élevage monogastrique, en particulier chez un porc, de préférence chez un porcelet, nourri de préférence avec un aliment comprenant du tourteau de soja, de préférence un aliment comprenant un mélange de tourteau de soja et de maïs, la pectinase polygalacturonase étant de préférence présente dans l'aliment à une concentration de 250 PGU par kg d'aliment.

En particulier, l'additif tel que défini dans la section "Additif' ci-dessus, le prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus ou la composition alimentaire telle que définie à la section "Composition alimentaire" ci-dessus permet également d'augmenter la prise alimentaire de 1 à 10%, de préférence de 5%, chez un animal d'élevage monogastrique, en particulier chez un porc, de préférence chez un porcelet, nourri de préférence avec un aliment comprenant du tourteau de soja, de préférence un aliment comprenant un mélange de tourteau de soja et de maïs, la pectinase polygalacturonase étant de préférence présente dans l'aliment à une concentration de 250 PGU par kg d'aliment. La présente invention concerne également un procédé pour augmenter les performances zootechniques des animaux d'élevage monogastriques caractérisé en ce que l'on fait ingérer à cet animal, dans la ration alimentaire, une quantité efficace de l'additif tel que défini à la section "Additif' ci-dessus, du prémix tel que défini à la section "Prémix" ci-dessus ou de la composition alimentaire telle que définie à la section "Composition alimentaire" ci-dessus.

Par "quantité efficace", on entend ici la quantité de pectinase polygalacturonase présente dans l'additif, le prémix ou la composition alimentaire, permettant d'accroître les performances zootechniques telles que définies ci-dessus. Comme il sera clairement apparent pour l'homme du métier, cette quantité dépendra de l'animal d'élevage monogastrique considéré, de son âge, de son sexe, de son stade physiologique, de son poids et de sa ration alimentaire.

Typiquement, dans le cas de la volaille, la quantité ingérée efficace est comprise entre 2 PGU/jour pour un poussin de 1 jour et 200 PGU/jour pour un dindon de 7 semaines. Typiquement, dans le cas du porc, la quantité ingérée efficace est comprise entre 5 PGU/jour chez le porcelet au sevrage et 2500 PGU/jour chez la truie en lactation.

La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- dessous. Brève description des figures La Figure 1 présente des histogrammes montrant les résultats de FAN de l'exemple 1 obtenus sur différents ratios maïs/tourteau de soja (M/TS), après digestion pepsine/pancréatine, et en l'absence (Ct + enz) ou avec chacune des trois pectinases PG, PL et PE. La Figure 2 présente des histogrammes montrant les valeurs d'acides aminés libres dans le surnageant de l'exemple 1 obtenu sur différents ratios maïs/tourteau de soja (M/TS), après digestion pepsine/pancréatine, et en l'absence (Ct + enz) ou avec chacune des trois pectinases PG, PL et PE. 25 La Figure 3 présente des histogrammes montrant les teneurs en lysine libre dans le surnageant de l'exemple 1 obtenu sur différents ratios maïs/tourteau de soja (M/TS), après digestion pepsine/pancréatine, et en l'absence (Ct + enz) ou avec chacune des trois pectinases PG, PL et PE. 30 La Figure 4 présente des histogrammes montrant les résultats de FAN obtenus sur l'aliment complet de volaille de chair de l'exemple 2, après digestion pepsine/pancréatine, en l'absence (Ct + enz) ou en présence de chacune des trois pectinases PG, PL et PE. 20 La Figure 5 présente des histogrammes montrant les valeurs de digestibilité de la matière sèche (Dig.MS), des protéines (Dig.Prot) et des parois végétales (Dig.P.Veg.) de l'aliment complet de volaille de chair de l'exemple 2 en l'absence (Ct+) ou en présence de PG.

La Figure 6 présente des histogrammes montrant les valeurs de FAN dans le surnageant de l'aliment complet de volaille de chair de l'exemple 2 en l'absence (Ct+) ou en présence de la PG après digestion pepsine/pancréatine. La Figure 7 présente des histogrammes montrant les valeurs de sucres réducteurs dans le surnageant de l'aliment complet de volaille de chair de l'exemple 2 en l'absence (Ct+) ou en présence de la PG après digestion pepsine/pancréatine. EXEMPLES Exemple 1 : Evaluation de l'effet de différentes pectinases sur la digestibilité in vitro de matières premières pour aliments des animaux Matériel et méthodes Sélection de pectinases actives dans les conditions physico-chimiques du tube digestif des animaux monogastriques Les inventeurs ont simulé les premières étapes de la digestion chez les animaux monogastriques suivant la méthode décrite par Boisen et Fernandez (1997) (Boisen, S., Fernandez, J.A., 1997. Prediction of total tract digestibility of energy in feedstuffs and pig diets by in vitro analyses. Anim. Feed Sci. Technol. 68, 277-286.) constituée par une double attaque enzymatique : une heure en présence de pepsine (pH 2,5 ; 39°C) suivie d'une heure en présence de pancréatine (pH 4,5 ; 39°C). Protocole de digestibilité pepsine+pancréatine Le substrat à tester a été préalablement broyé (broyeur centrifuge Retsch, grille 0,85 mm). 25 g de l'échantillon broyé ont été mis en solution dans 475 g d'eau. Le pH a été ajusté à 2,5 à l'aide d'une solution d'acide sulfurique (H2SO4 9,5%). Cette solution a été répartie à raison de 15 ml par tube et placée à température constante de 39°C. Au temps T=0, 1 ml de solution de pepsine porcine (4,875 g/1) a été ajoutée et les tubes ont été placés sous agitation continue (1100 rpm). A ce stade, les solutions aqueuses de pectinases ont été ajoutées dans les tubes expérimentaux (1 ml/tube). Au temps 10+60 min, le pH du milieu réactionnel a été ajusté à 6,5 à l'aide de NaOH 2 M et 1 ml de solution de pancréatine porcine (1,875 g/1) a été ajoutée. Les tubes ont été maintenus sous agitation continue (1100 rpm) et à 39°C pendant 60 min. Au temps 10+120 min, les tubes ont été placés 15 min au bain marie à 95°C afin de stopper l'action des enzymes. Pour chaque condition, différents dosages ont été effectués sur le surnageant : Les extrémités amines libres par la méthode FAN (Free Amino Nitrogen) afin de mesurer le taux d'hydrolyse des protéines. Ce dosage est basé sur une réaction de la ninhydrine avec la fonction amine terminale des acides aminés, peptides ou protéines qui provoque une coloration pourpre caractéristique. Les résultats sont exprimés en mg d'acides aminés libres/ml. Le profil et la quantité en acides aminés libres présents dans le surnageant après digestion mesurés par chromatographie liquide haute performance ; Les extrémités réductrices par la méthode au DNS afin d'estimer la libération de sucres solubles. Les résultats sont exprimés en g d'équivalent glucose par litre. Les inventeurs ont également récupéré le substrat insoluble après digestion afin d'en faire le dosage de composition et ainsi calculer des digestibilités de la matière sèche, des protéines et des parois végétales. Résultats Comparaison de l'effet de pectinases sur un mélange maïs/tourteau de soja Le maïs et le tourteau de soja sont les principales matières premières utilisées au niveau mondial dans l'alimentation des animaux monogastriques. Dans une première expérience, les inventeurs ont comparé l'effet de trois types de pectinases (PG, PE et PL) sur le taux d'hydrolyse des protéines (FAN) mesuré sur des mélanges maïs (M)/tourteau de soja (TS) à différents ratios. Les proportions testées sont les suivantes : 100%M ; 75%M/25%TS ; 50%M/50%TS ; 25%M/75%TS et 100°ATS.

La pectinase PG est issu de la fermentation en milieu solide d'un milieu pulpe de betterave par un champignon filamenteux de type Aspergillus niger. Il s'agit du rétentat de filtration (RF PG, extraction aqueuse des activités enzymatiques puis concentration par centrifugation) du milieu de production préparé par la société Lyven. La pectinase PE est issu de la fermentation en milieu solide d'un milieu pulpe de betterave par un champignon filamenteux de type Aspergillus niger. Il s'agit du rétentat de filtration (RF PE, extraction aqueuse des activités enzymatiques puis concentration par centrifugation) du milieu de production préparé. La pectinase PL est issu de la fermentation en milieu solide d'un milieu pulpe de betterave par un champignon filamenteux de type Aspergillus piger. Il s'agit du rétentat de filtration (RF PL, extraction aqueuse des activités enzymatiques puis concentration par centrifugation) du milieu de production préparé. Les trois pectinases ont été ajoutées sous forme d'extrait aqueux à raison de 0.02% chacune.

La Figure 1 présente les résultats de FAN obtenus sur les différents ratios M/TS et avec chacune des trois pectinases. Le témoin+enzymes représente le substrat seul ayant subi les deux hydrolyses (pepsine+pancréatine). Les valeurs RF PE, RF PL et RF PG représentent les valeurs obtenues après hydrolyse du substrat en présence de pepsine et pancréatine et avec l'ajout de pectinases PE, PL et PG respectivement au temps T=0. Les inventeurs ont constaté que plus la proportion de TS était importante, plus la libération de FAN était importante. Sans être lié par la théorie, ceci est lié au taux de protéines plus élevé dans TS que dans M. Quel que soit le ratio M/TS, l'ajout de pectinase PG permet d'améliorer significativement le taux de FAN. En présence de RF PG, le taux d'hydrolyse des protéines est plus élevé libérant un potentiel intéressant pour la croissance des animaux. Ce test permet aussi de conclure que si les inventeurs ont pu mesurer un effet sur le taux de FAN, c'est que l'enzyme ajoutée a résisté aux conditions physico-chimiques du milieu. En particulier, l'enzyme ajoutée a résisté au pH acide (pH 1,5) et à la présence de pepsine et de pancréatine. Cet effet est confirmé par le dosage des acides aminés libres présents dans le surnageant (Figure 2). L'ajout de pectinase PG permet d'améliorer significativement la quantité d'acides aminés libres, donc solubles et donc disponibles pour l'animal et ses besoins en croissance. En particulier, l'effet positif de pectinase PG est particulièrement visible sur la libération de lysine à partir des substrats (Figure 3), la lysine étant le premier acide aminé limitant pour la croissance des animaux.

Cet exemple démontre donc que la pectinase polygalacturonase, contrairement aux autres pectinases, est capable, quand elle est utilisée seule, d'accroître la digestibilité, in vitro, des aliments pour animaux d'élevage monogastriques.

Exemple 2 : Comparaison de l'effet de différentes pectinases sur la digestibilité in vitro d'un aliment complet pour volailles de chair Après avoir observé l'effet des pectinases sur les matières premières (maïs et tourteau de soja), les inventeurs ont évalué l'effet sur un aliment complet pour volailles de chair formulé à base de maïs et tourteau de soja. L'intérêt est de voir si l'effet mesuré sur les matières premières n'est pas inhibé par la présence des autres constituants de l'aliment (minéraux, acides aminés, matières grasses, ...). Les inventeurs ont réalisé le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1 en remplaçant les matières premières M/TS par un aliment complet granulé formulé pour volailles de chair. La composition de l'aliment utilisé est définie dans le tableau 1. Matière première Incorporation (%) Maïs 63,28 Tourteau soja 48 31,13 Son fin 1,88 Phosphate bicalcique 1,95 Prémix oligo-vitamines 1,00 Carbonate calcium 0,41 Bicarbonate de sodium 0,08 DL- Méthionine 0,14 Sel 0,12 L-Lysine 0,01 Tableau 1 : composition de l'aliment utilisé La Figure 4 présente les résultats de FAN obtenus sur l'aliment ci-dessus avec chacune des trois pectinases. Les inventeurs ont observé sur aliment le même effet positif de la pectinase PG beaucoup plus important qu'avec les autres pectinases. L'ajout de pectinase PG permet d'améliorer le taux d'hydrolyse des protéines de l'aliment et donc laisse penser qu'un animal monogastrique pourrait tirer plus de nutriments azotés de ce même aliment.

Exemple 3 : Mesure de l'effet de l'ajout de pectinase PG sur la digestibilité in vitro de la matière sèche, des protéines et des parois végétales d'un aliment complet pour volailles de chair Après avoir observé l'effet de la pectinase PG sur le taux d'hydrolyse des protéines, les inventeurs ont étudié son effet sur la digestibilité in vitro de la matière sèche, des protéines et des parois végétales. Pour cela, ils ont réalisé le même protocole de digestibilité que celui décrit dans l'exemple 2 et, en complément, ils ont récupéré la partie insoluble (culot). La partie insoluble représente l'indigestible. Par différence avec la quantité introduite dans le tube au début du protocole, ils en ont déduit une valeur de digestibilité. Les valeurs de digestibilités sont exprimées en pourcentage. Plus elles sont élevées, plus le nutriment est soluble donc disponible pour l'animal.

Dans la Figure 5 sont présentées les valeurs de digestibilité de la matière sèche, des protéines et des parois végétales de l'aliment complet utilisé dans l'exemple 2. L'ajout de pectinase PG permet une amélioration de la digestibilité de la matière sèche (+0,5 point), de la digestibilité des protéines (+2,0 points) et de la digestibilité des parois végétales (+6,49 points). Sans être lié par la théorie, l'amélioration de la digestibilité des parois végétales s'explique par l'effet direct de la pectinase PG sur les fibres des matières premières, et du tourteau de soja en particulier. L'amélioration de la digestibilité des protéines est une conséquence de cet effet : les fibres exerçant un effet cage moins important. De même que pour les exemples précédents, les inventeurs ont réalisé le dosage des FAN et des sucres réducteurs dans le surnageant (Figures 6 et 7). La pectinase PG permet d'améliorer significativement la libération d'extrémités amines libres (FAN) et de sucres réducteurs. Elle permet donc une meilleure solubilisation des acides aminés et des sucres, et suggère donc qu'un animal monogastrique pourrait tirer plus de nutriments azotés (acides aminés) et plus d'énergie (sucres) de ce même aliment.30 Exemple 4 : Effet de l'ajout de la pectinase PG dans l'alimentation de jeunes volailles de chair (dindon) nourries avec un régime de type maïs-tourteau de soja sur les performances de croissance Les dindonneaux sont des volailles de chair habituellement nourries avec un régime contenant du maïs et du tourteau de soja. Compte-tenu de son fort besoin en protéines au démarrage, le dindonneau consomme un aliment riche en tourteau de soja (jusqu'à 50%). C'est pourquoi, les inventeurs ont choisi ce modèle animal pour tester l'intérêt de l'ajout de pectinase sur la valorisation zootechnique de l'aliment.

Matériel et méthodes Le dispositif de l'essai est un dispositif en blocs : 4 traitements x 12 répétitions. Chaque aliment a été testé sur 12 cages de 1 dindon. 100 dindonneaux mâles de souche Grade Marker (provenant du couvoir GRELIER), ont été mis en cages dès leur arrivée sur la station (jour de l'éclosion = JO). Afin de faciliter l'adaptation, les dindonneaux ont été élevés en cage par groupe de 2 ou 3. Ils ont reçu pendant cette période un aliment unique de démarrage sans enzyme et sans anticoccidien (MAT [Matières azotées Totales] = 27,2 %, EMAn [Energie Métabolisable Apparente à bilan azoté nul] = 2625 kcal/kg) jusqu'à J8.

A J8, les dindonneaux ont été pesés individuellement, puis une mise en lot a été effectuée sur le critère du poids corporel (12 blocs de 4 cages de 1 animal). Les dindonneaux retenus sont ceux dont le poids est au centre de la distribution de la population initiale. Des blocs homogènes ont alors été constitués. Une analyse de variance a été effectuée pour vérifier l'absence d'effet traitement. Les 48 animaux retenus ont été placés dans leurs cages et ont reçu leurs aliments expérimentaux. Les performances de croissance de J8 à J28 ont été enregistrées (consommation, gain de poids, indice de consommation). Les consommations individuelles ont été mesurées à J9 (24h), J12, puis tous les quatre jours : J16, J20, J24 et J28. En fin d'essai, à J28, les dindonneaux ont été pesés.

La composition de l'aliment est présentée dans le tableau 2. Aliment Démarrage T soja 48 N°11-19439 44,04 Maïs N °12-19643 33,76 Blé Apache N °12-19574 10,00 Gluten 60 Maïs 5,00 Phosphate bicalcique 4,01 Huile de soja 1,18 PX3211 1,00 L- Lysine HCL 0,40 DL- Méthionine 0,26 Bicarbonate de Na 0,17 CaCO3 0,15 Sel de mer 0,02 L- Tryptophane 0,01 Caractéristiques Démarrage Matière sèche 87,94 EMAn poulet 2625 MAT 27,20 Matières grasses 3,94 Cellulose brute 3,46 Calcium 1,40 Chlore 0,26 Sodium 0,18 Potassium 1,08 Lysine Digestible 1,54 Méthionine Digestible 0,65 Mét+Cys Digestibles 1,03 Thréonine Digestible 0,90 Tryptophane Digestible 0,27 Tableau 2 : Composition de l'aliment La pectinase PG a été ajoutée à l'aliment démarrage à raison de 0,0015% pour apporter 250 PGU/kg d'aliment.

Celle-ci correspond au traitement "BIOC#2". Résultats Les performances des dindonneaux de J8 à J28 sont présentées dans les tableaux 3 et 4.

Moyenne Ecart-type Coef. Var. Min Max Poids J28, Témoin 1248,7 134,7 0,11 1066,1 1435,0 Poids J28, BIOC#2 1246,4 108,6 0,09 965,6 1361,9 Valeur de p=0.977 Tableau 3 : Performances des dindonneaux (poids) Moyenne Ecart-type Coef. Var. Min Max IC, Témoin 1,44 0,04 0,03 1,38 1,48 IC, BIOC#2 1,42 0,04 0,03 1,36 1,49 Valeur de p=0.090 Tableau 4 : Performances des dindonneaux (indice de consommation) Une tendance à la diminution de l'indice de consommation en présence de PG se dégage (p=0,09). L'indice de consommation (quantité d'aliment consommé / gain de poids) est ainsi amélioré de 1,4 % avec la pectinase PG.

Exemple 5 : Effet de l'ajout de pectinases PG dans l'alimentation de porcelets sevrés sur les performances de croissance Les porcelets sevrés sont alimentés eux aussi avec des aliments à base de tourteau de soja. Or leur système digestif n'est pas encore mature et vient de subir le stress du changement de mode d'alimentation : d'une alimentation liquide lactée à une alimentation solide. Les inventeurs ont donc testé l'intérêt des pectinases PG sur les performances de croissance des porcelets sevrés.

Matériel et méthodes Un total de 48 porcelets mâles castrés et femelles Piétrain x (Large White x Landrace) ont été répartis en fonction de leur poids vif et de leur origine entre quatre traitements expérimentaux. Tous les porcelets étaient issus de la même bande sevrée le 4 avril 2013 à environ 28 jours d'âge. Dans ce but, des groupes (blocs) de 6 porcelets comparables (même sexe, poids vifs proches et frères ou soeurs de portée (ou demi-frères ou demi-soeurs)) ont été constitués la veille du sevrage. Ces 6 porcelets ont été répartis sur 6 loges contiguës à raison d'une loge par traitement. Les animaux ont été logés dans deux salles de 12 cages et dans deux salles de 24 cages, avec la moitié de chaque sexe pour chaque salle. L'aliment 1 er âge (standard) a été distribué seul pendant 9 jours. Le passage à l'aliment 2ème âge (expérimental) s'est fait sur une période de transition de 3 jours en distribuant un aliment composé de 50% d'aliment 1 er âge et 50% de l'aliment 2ème âge expérimental. Les animaux sont restés sur le même traitement expérimental pendant toute la période 2ème âge. L'aliment 2ème âge a été distribué seul de J13 à J36. Cette période expérimentale a été divisée en 3 sous-périodes (P2a de J13 à J19, P2b de J20 à J26, P2c de J27 à J36). En définitive, chaque lot d'un traitement expérimental est constitué de 12 porcelets, avec autant de mâles castrés et de femelles, alimentés en individuel, avec de l'aliment 1 er puis 2ème âge, répartis de la manière décrite dans le tableau 5.35 Lot TP TN C3 Témoin + Témoin - PG Type d'aliment 1 er âge Standard Standard Standard Supplémentation 1er âge Non Non Oui Aliment 2ème âge Témoin Expérimental Expérimental Supplémentation 2ème âge Non Non Oui Tableau 5 : Protocole expérimental Dans cet essai, les inventeurs ont utilisé un témoin positif TP (valeurs nutritionnelles normales), un témoin négatif TN (valeurs nutritionnelles abaissées de 12%) et le traitement expérimental constitué du témoin négatif additionné de la pectinase PG. Les données de composition centésimale et chimique des aliments sont présentées dans les tableaux 6 et 7. Les différents régimes ont été mélangés et granulés au moulin expérimental de l'INRA, 35590 Saint Gilles. Les températures de granulation n'ont pas excédé 48,4°C pour les aliments 1er âge et 55,8°C pour les aliments 2ème âge. L'aliment de transition était composé à 50% de l'aliment 1 er âge et à 50% de l'aliment 2ème âge du lot correspondant. 1 : Valeurs estimées d'après Tables INRA&AFZ, 2004. Composition centésimale, % Orge 45,562 Tourteau de soja 50 17,500 Concentré de protéine de soja 2,500 Huile végétale 2,300 Lactosérum doux 20,000 Poudre de lait 40 Mg 8,000 Carbonate Calcium 1,470 Phosphate monocalcique 0,679 Premix 0,500 Valeurs nutritionnelles' Protéines brutes, % 18,8 Matières grasses, % 6,7 Cellulose brute, % 2,9 Amidon, % 24,3 Energie Digestible Porcs, MJ 14,56 Energie Nette Porcs, MJ 10,61 Lysine, g 13,7 Thréonine, g 8,8 Méthionine, g 5,2 Tableau 6 :composition et valeurs nutritionnelles de l'aliment 1er âge TP TN C3 Aliments 2ème âge Orge, % 22,700 24,700 24,70015 Tourteau de soja, % 21,150 16,930 16,930 Blé tendre, % 23,200 17,360 17,360 Maïs, % 23,708 11,435 11,435 Coques de soja, % 1,680 7,520 7,520 Pulpe de betterave, % 0,840 3,760 3,760 Son de blé, % 1,680 7,520 7,520 Son de maïs, % 1,680 7,520 7,520 Lysine HCI, % 0,240 0,180 0,180 DL Méthionine 99, % 0,030 0,009 0,009 L-Thréonine 98.5, % 0,077 0,059 0,059 L-Tryptophane, % 0,009 0,001 0,001 Phosphate bicalcique , % 0,968 0,968 0,968 Carbonate de calcium, % 1,128 1,128 1,128 N aC I , % 0,400 0,400 0,400 Phytase,% 0,010 0,010 0,010 Prémix oligo-vitaminique 0,500 0,500 0,500 2ème âge, (3/0 Pectinase PG, % 0,05 Energie Nette, MJ/kg 9,23 8,28 8,28 Protéines Brutes, % 17,91 16,83 16,83 Cellulose Brute, % 4,42 7,66 7,66 Matières Grasses, % 2,19 2,16 2,16 Lysine, % 1,039 0,944 0,944 Lysine Digestible, % 0,952 0,838 0,838 Thréonine, % 0,671 0,607 0,607 Thréonine Digestible, % 0,579 0,502 0,502 Tryptophane, % 0,275 0,261 0,261 Tryptophane Digestible, % 0,236 0,218 0,218 Lysine Dig / EN, g/MJ 1,02 1,01 1,01 1 : Valeurs estimées d'après Tables INRA&AFZ, 2004. Tableau 7 :composition et valeurs nutritionnelles' des aliments 2ème âge L'essai a été mené dans les installations de l'INRA à Saint Gilles (35590), dans 4 salles de 12 et 24 loges individuelles, sur caillebotis plastique. Chaque loge mesurait 0,48 m2 (0,80 x 0,60 m). L'éclairage était dépendant de la température dans la salle. La température ambiante relevée était de 27±1 °C pendant la première semaine, puis elle a diminué de un peu moins de 1 °C par semaine pour atteindre 24±1 °C et ce jusqu'à la fin de l'expérience. Les aliments ont été alloués à volonté à raison de plusieurs distributions par jour (pour éviter les gaspillages). L'eau était également ad libitum. Les porcelets ont été pesés individuellement l'avant-veille du sevrage pour la mise en lots puis le jour du sevrage lors de l'installation des animaux dans leur loge. Les porcelets ont ensuite été pesés à jeun (après 10 heures environ sans aliment) à J13, J27 et J37.

Par période et par loge, les quantités d'aliment offertes et un cumul des refus réalisés le matin, selon leur état de souillure, ont été notés. La teneur en matière sèche de l'aliment proposé et des refus (s'ils étaient souillés) a été mesurée à l'issue de chaque période. Les consommations d'aliment de chaque loge ont ainsi été mesurées par différence entre les quantités proposées et les refus réalisés. Les quantités d'aliment consommé ont ensuite été standardisées pour une teneur en matière sèche de 88%. Les performances (gain de poids vif, aliment ingéré, indice de consommation) ont été calculées pour chaque loge et pour chacune des périodes suivantes : J1 à J11 (P1), J12 à J26 (P2ab), J27 à J36 (P2c) et J12 à J36 (P2).

La consistance des fèces était observée quotidiennement pour chaque porc avec une note de 1 (normale) à 3 (diarrhée liquide). Les températures mini et maxi de chaque salle étaient notées chaque jour. Les données ont été traitées par analyse de variance selon un dispositif factoriel (procédure GLM de SAS) prenant en compte les effets du bloc intra-sexe (n=2x6), du sexe (n=2) et du régime expérimental (n=6). Deux animaux ont été écartés de l'analyse (1 mâle du lot TP et 1 mâle du lot C1) du fait de sous-consommations consécutives au sevrage, entrainant une perte de poids. Des analyses de covariance complémentaires ont été réalisées selon le même modèle et en prenant en compte les différences de poids vif au début de la période 2ème âge (J12). Les effets des covariables n'étaient pas significatifs, ils ont donc été ignorés dans les résultats présentés. Résultats L'état sanitaire des animaux a été très satisfaisant pendant la phase expérimentale. Deux porcelets ont refusé de manger suite au sevrage et ont donc été écartés de l'expérience. L'analyse des résultats zootechniques (Tableau 8) n'a pas mis en évidence de différence significative entre les lots pour les quantités d'aliment ingérées, les poids vifs mesurés et les indices de consommation calculés durant les différentes phases de la période expérimentale. La prise en compte du développement du tractus digestif via l'ajustement du poids vif en fin d'expérimentation a permis de mettre en évidence une différence significative entre l'indice de consommation du lot témoin positif et les lots traitement sur la période deuxième âge. Les inventeurs ont noté par ailleurs une tendance à une consommation d'aliment plus importante dans le lot avec PG (+5,3%). Ceci se traduit aussi par un GMQ amélioré de 2% par rapport au témoin négatif. Le poids vif des animaux à J37 est ainsi amélioré de 1%. Du fait d'une meilleure consommation, l'indice de consommation du lot PG est légèrement dégradé. Lot Traitement Sexe ETR4 Effets4 TP TN C3 MC F Nombre de Porcelets Poids vifs, kg 11 12 12 34 36 0.61 0.87 1.45 1.80 1.78 J1 9.15 12.14 17.53 22.77 22.77 9.17 11.74 16.99 21.76 21.49 9.19 11.77 16.92 21.98 21.71 9.20 11.77 16.78 21.70 21.47 9.18 11.92 17.18 22.40 22.17 J13 J27 J37 J37aj5 Aliment ingéré, g/j6 J1-J11' 349 316 327 316 346 65 S* J13-J26 664 633 661 638 670 90 J27-J36 977 979 1037 996 1036 99 St J13-J36 794 777 818 787 823 88 St Gain de poids vif, g/j/porcelet 214 215 214 228 59 J1-J12 249 J13-J27 385 375 368 358 375 67 J27-J37 524 477 506 492 522 70 St J13-J37 443 417 426 414 437 54 St J13-J37aj 443 406 414 404 427 54 St Indice de Consommation, g/ g6 J1-J12 1.46 1.60 1.64 1.57 1.60 0.34 J13-J27 1.77 1.70 1.83 1.81 1.82 0.22 J27-J37 1.89 2.08 2.08 2.05 2.00 0.24 J13-J37 1.81 1.86 1.94 1.91 1.89 0.15 J13-J37aj 1.81a 1.91 ab 1.99b 1.96 1.94 0.15 L* 4 : ETR: écart type résiduel; niveaux de signification : **: P<0.01, *: P<0.05, t: 0.05<P<0.10. Effet: L : Lot, S : sexe. 5 : J37aj (poids moyen ajusté à J37 en utilisant un coefficient correcteur de 0.9879 pour tenir compte du développement accru du tube digestif lors d'une alimentation riche en fibres) 6 : Les quantités d'aliment sont standardisées pour une teneur en MS de 88%, : l'aliment support utilisé pour cette période est le même pour chaque lot.

Tableau 8 : Performances de croissance des porcelets en post-sevrage selon leur régime L'ajout de pectinases PG dans l'alimentation des porcelets a donc permis de stimuler leur consommation d'aliment pendant la période post-sevrage et d'améliorer le gain de poids des animaux.15 Exemple 6 : Effet de l'ajout de pectinases PG dans l'alimentation de jeunes volailles de chair (dindon) nourries avec un régime de type maïs-tourteau de soja sur les performances des animaux.

Dans cet exemple, les inventeurs ont mesuré les performances de croissance des animaux et réalisé deux bilans digestifs des nutriments : le premier pendant la période de démarrage et le second pendant la période de croissance. Matériel et méthodes Le dispositif de l'essai est un dispositif en blocs : 6 traitements x 12 répétitions. Chaque aliment a été testé sur 12 cages de 1 dindon. 150 dindonneaux mâles de souche GRADE MAKER (provenant du couvoir GRELIER), ont été mis en cages dès leur arrivée sur la station (jour de l'éclosion = JO). Afin de faciliter l'adaptation, les dindonneaux ont été élevés en cage par groupe de 2 ou 3. Ils ont reçu jusqu'à J8 un aliment démarrage Demi sans TiO2. Les aliments démarrage (MAT = 27,2 %, EMAn = 2625 kcal/kg) et croissance (MAT = 25 %, EMAn = 2725 kcal/kg) sont sans enzyme et sans additif anticoccidien. A J8, les dindonneaux ont été pesés individuellement, puis mis en lots sur le critère du poids corporel (12 blocs de 6 cages de 1 animal). Les dindonneaux retenus sont ceux dont le poids est au centre de la distribution de la population initiale. Des blocs homogènes ont alors été constitués. Une analyse de variance a été effectuée pour vérifier l'absence d'effet traitement. Les 72 animaux retenus ont été placés dans leurs cages et ont reçu leurs aliments expérimentaux (aliment démarrage de J8 à J28 et aliment croissance de J28 à J49).

Les performances de croissance de J8 à J49 ont été enregistrées (consommation, gain de poids, indice de consommation). Les consommations individuelles ont été mesurées à J28 et à J49, c'est-à-dire à chaque fin de phase d'alimentation. Aux mêmes dates, les animaux ont également été pesés. A la fin de la phase de démarrage (J19 à J21) et à la fin de la phase de croissance (J41 à J43), des bilans digestifs avec marqueur (par collecte partielle) ont été effectués sur les 12 dindons des 6 traitements. Les traitements testés sont les suivants : témoin BIOC#2 : pectinase PG d'Aspergillus piger extraite en milieu aqueux (247 PGU/kg d'aliment, <1 AXC/kg d'aliment, 7 BGU/kg d'aliment, 1 PU/kg d'aliment) BIOC#3 : pectinase PG d'Aspergillus piger non extraite (250 PGU/kg d'aliment, <1 AXC/kg d'aliment, <7 BGU/kg d'aliment, 1 PU/kg d'aliment) BIOC#4 : pectinase PE d'Aspergillus piger extraite en milieu aqueux (50 PEU/kg d'aliment, <1 AXC/kg d'aliment, 7 BGU/kg d'aliment, 1 PU/kg d'aliment) BIOC#5 : pectinase PG d'Aspergillus piger extraite en milieu aqueux (247 PGU/kg d'aliment, 100 AXC/kg d'aliment soit un rapport AXC/PGU de 0,4, 97 BGU/kg d'aliment, 1 PU/kg d'aliment) La composition des aliments est présentée dans le tableau 9. Matière première (%) DEMARRAGE CROISSANCE Tourteau soja 48 44,21 42,39 Maïs 12-19643 32,80 36,01 Blé Apache 10,00 10,00 Gluten 60 maïs 5,00 2,50 Phosphate bicalcique 4,01 3,78 Huile soja 1,48 2,95 PX 3211 1,00 1,00 Lysine HCI 0,39 0,30 DL-Méthionine 0,26 0,25 Bicarbonate de soude 0,15 0,10 CaCO3 0,15 0,12 Sel 0,04 0,08 L-tryptophane 0,01 0,02 TiO2 0,50 0,50 Caractéristiques (%) DEMARRAGE CROISSANCE Matière sèche 88,0 88,1 EMAn poulet 2625 2725 MAT 27,2 25,0 Matières grasses 4,2 5,7 Cellulose brute 3,4 3,4 Calcium 1,4 1,33 Chlore 0,27 0,27 Sodium 0,18 0,18 Potassium 1,08 1,05 Lysine Digestible 1,54 1,40 Méthionine Digestible 0,65 0,60 Mét+Cys Digestible 1,03 0,95 Thréonine Digestible 0,90 0,84 Tryptophane Digestible 0,27 0,25 Tableau 9: Composition de l'aliment Résultats Les performances de croissance des animaux de J8 à J49 sont présentées dans le tableau 10.15 Témoin BIOC#2 BIOC#3 BIOC#4 BIOC#5 Valeur de p Consommation d'aliment (g/animal) Gain moyen quotidien (g/jour/animal) Indice de consommation (g/g) 5515 5474 5510 5450 5633 0,924 84,1 83,6 85,0 83,4 87,1 0,175 1,50 1,49 1,47 1,48 1,45 0,658 Tableau 10: Performances de croissance des dindons de J8 à J49 L'ajout de pectinases, PG ou PE, est sans effet sur la consommation alimentaire des animaux. En revanche, on constate une amélioration de 3,6% du gain moyen quotidien et une amélioration de 3,3% de l'indice de consommation avec la pectinase BIOC#5. L'ajout de pectinases PG dans l'alimentation des dindons alimentés en régime maïs-tourteau de soja a donc permis d'améliorer le gain de poids des animaux et leur efficacité alimentaire. L'efficacité de pectinases PG est meilleure lorsque le ratio AXC/PG est de 0,4. Exemple 7 : Effet de l'ajout de pectinases en association avec des xylanases dans l'alimentation de jeunes volailles de chair (poulet de chair) nourries avec un régime de type maïs-tourteau de soja sur les performances de croissance Dans cet exemple, les inventeurs ont mesuré les performances de croissance de poulets de chair et réalisé un bilan digestif des nutriments à 21 jours.

Matériels et méthodes Trois cent quatre-vingt quatre poussins de souche Ross 308 ont été répartis dans 96 cages, à raison de quatre poussins par cage. Chaque cage de digestibilité possédait une mangeoire, un abreuvoir et un plateau en plastique pour la collecte des excreta. Les aliments et l'eau ont été fournis à volonté. Le programme alimentaire consistait en un aliment unique de croissance sous forme de farine de 0 à 23 jours. La composition de cet aliment est décrite dans le tableau 11. Les niveaux nutritionnels correspondaient aux recommandations NRC (NRC (1994). Nutrient Requirements of Poultry. 9th rev. ed. National Academy Press, Washington, DC.). Le régime expérimental contenait également 5 g/kg de dioxyde de titane comme marqueur indigestible pour la collecte des excreta. L'aliment a été préparé à IRTA (Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries), Mas de Bover (Espagne). Ingrédients E127STA (%) Maïs 64,32 Tourteau de soja 48% 29,95 Matière grasse animale (lard) 1,93 Phosphate bicalcique 1,91 Carbonate de calcium 0,75 Sel 0,35 DL-méthionine 0,22 L-Lysine HCI 0,23 L-Thréonine 0,03 Antioxydant (Etoxiquin 66%) 0,02 Prémix Vitamine-oligo 0,30 Tableau 11: Composition du régime de base Chaque traitement a été répété 12 fois et réparti au hasard en bloc dans les cages de digestibilité. Chaque répétition consistait en une cage de 4 poulets. Les différents traitements sont résumés dans le Tableau 12 : Traitements Produit Dosage dans Activité Activité Activité expérimental l'aliment (%) PGU / kg AXC / kg PEU / kg aliment aliment aliment T-1 Control: maïs-soja (1) T-2 PE50 0.01% 50 T-5 PG250 0.01% 250 T-6 PG250+AXC100 0.01% 250 100 (1) : Régime de base sans additif Tableau 12: Régimes et traitements expérimentaux Les données brutes ont été analysées en analyse de variance randomisée par blocs, en utilisant la procédure GLM de SAS. Les moyennes des traitements ont été comparées avec le test de Duncan. Les contrastes linéaires entre traitements ont aussi analysés. Les données ont été réputées statistiquement différentes lorsque P < 0.05. Résultats Les données de croissance des animaux de 0 à 21 jours sont résumées dans le tableau 13.

Trt Régime Dose Poids vif GMQ CMJ IC (g/g) Mortalité (%) (g) (g/j) (g/j) (%) T1 Control (maïs-soja) 863 ab 38,9 ab 55,9 1,44 2,78 T2 PE50 0,01 867 ab 39,1 ab 55,8 1,43 0 T5 PG250 0,01 846 b 38,1 b 54,5 1,43 2,78 T6 PG250+AXC100 0,01 900 a 40,7 a 57,1 1,39 5,56 St. Err. 15,3 0,73 1,02 0,015 2,14 Pr>F 0,056 0,056 0,45 0,12 0,49 Linear contrast "T1 vs T2" 0,86 0,86 0,92 0,57 0,36 Linear contrast "T1 vs T5" 0,45 0,45 0,40 0,91 Linear contrast "T1 vs T6" 0,10 0,10 0,40 0,02 0,36 GMQ : Gain Moyen Quotidien ; CMJ : Consommation Moyenne Journalière ; IC : Indice de Consommation Deux chiffres dans une même colonne suivis de la même lettre (a ou b) ne sont pas significativement différents au seuil de 5%. Tableau 13: Résultats de croissance de 0 à 21 jours L'ajout de pectinase PE à raison de 50 PEU/kg d'aliment ne permet pas d'améliorer les performances de croissance des animaux. En revanche, l'ajout de pectinases PG à raison de 250 PGU/kg d'aliment et avec un ratio AXC/PGU de 0,4 permet d'améliorer en tendance le poids vif à 21 jours de +4%, d'améliorer en tendance le GMQ de 4,6% et ainsi de réduire significativement l'indice de consommation de 3,4% par rapport au traitement « control ». L'ajout de pectinase PG permet d'améliorer l'efficacité alimentaire de 3,4% chez des poulets de chair nourris avec un régime de type maïs + tourteau de soja.

Exemple 8 : Protocole de production de pectinases PG par fermentation en milieu solide Dans cet exemple, les inventeurs décrivent la fermentation en milieu solide de coproduits agricoles en présence d'Aspergillus piger en vue de produire des pectinases PG. Plusieurs substrats ont été comparés : la pulpe de betterave, le tourteau de colza, le son de blé et le tourteau de soja. Chacun des substrats a été autoclave à 121°C pendant 20 minutes. Après refroidissement, les substrats ont été humidifiés par ajout d'eau osmosée pour obtenir un milieu de culture à 40% de matière sèche ou 35% pour la pulpe de betterave. Les milieux de culture ainsi obtenus ont été répartis dans des fioles d'erlenmeyer à raison de 10 grammes de matières sèches par fiole. Le milieu de culture a ensuite été inoculé avec une solution de spores de la souche d'Aspergillus piger. Le mélange a ensuite été incubé à 33°C en conditions aérobies à l'obscurité pendant 45 heures sans agitation.

Le mélange obtenu en fin de fermentation peut être séché et utilisé tel quel dans l'alimentation des animaux ou être extrait dans l'eau pour être ajouté sous forme liquide.

Exemple 9 : Protocole de production de pectinases PG par fermentation en milieu liquide Dans cet exemple, les inventeurs décrivent la fermentation en milieu liquide de pulpe de betterave en présence d'Aspergillus piger en vue de produire des pectinases PG. Un milieu de culture nutritif est constitué de 50 g/L de pulpe de betterave broyée et tamisée à 200 de 6 g/L de protéine de soja Rushipro, de 1,7 g/L d'urée et de 1,35 g/L de KH2PO4. Le pH du milieu nutritif a été ajusté à 5,2. Le milieu ainsi constitué a été autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Après refroidissement, le milieu a été inoculé par une solution de spores d'Aspergillus piger pour obtenir une concentration de spores initiale de 1 x106 spores/mL. Le milieu inoculé a été mis en culture dans un incubateur agité à 33°C, en conditions aérobies et avec une agitation réglée à 150 tours par minute.

Après 6 jours de fermentation, le milieu de fermentation a été centrifugé à 6000 tours par minutes à 4°C puis filtré sur un filtre en acétate de cellulose de 0,22pm. Le filtrat ainsi obtenu et contenant de la pectinase PG peut être utilisé dans l'alimentation des animaux.

Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Additif pour l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques qui comprend une composition enzymatique comprenant une pectinase polygalacturonase, ladite composition enzymatique présentant une activité polygalacturonase supérieure à 12000 PGU par gramme de composition:
2. 2. Additif selon la revendication 1, dans lequel la pectinase polygalacturonase est produite par fermentation avec un champignon du groupe Aspergillus niger. 10
3. 3. Utilisation de l'additif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 comme ingrédient non médicamenteux de compositions alimentaires ou de prémix pour animaux d'élevage monogastriques. 15
4. 4. Prémix pour l'alimentation des animaux d'élevage monogastriques comprenant un additif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le ratio entre les activités PE et PG est compris entre 0.005 et 0.250 et le ratio entre les activités AXC et PG est compris entre 0 et 0.5. 20
5. 5. Composition alimentaire supplémentée pour animaux d'élevage monogastriques comprenant une quantité efficace d'un additif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou d'un prémix selon la revendication 4, en association avec des aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques. 25
6. 6. Composition alimentaire selon la revendication 5, dans laquelle lesdits aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques comprennent du tourteau de soja et/ou du maïs.
7. 7. Procédé de fabrication d'une composition alimentaire supplémentée pour animaux 30 d'élevage monogastriques comprenant le mélange d'un additif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou d'un prémix selon la revendication 4 avec des aliments appropriés pour les animaux d'élevage monogastriques. S. Utilisation d'un additif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, d'un prémix 35 selon la revendication 4 ou d'une composition alimentaire selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, pour favoriser le gain de poids, et/ou améliorer l'indice deconsommation et/ou favoriser la prise alimentaire et/ou améliorer le rendement a l'abattage, la production d'oeufs, la production de lait, la taille de portée, la production de poils ou la production de plumes chez un animal d'élevage monogastrique. 9. Procédé, pour favoriser le gain de poids et/ou améliorer l'indice de consommation et/ou favoriser la prise alimentaire et/ou améliorer le rendement à l'abattage, la production d'ceufs, la production de lait, la taille de portée, la production de poils ou la production de plumes des animaux d'élevage monogastriques caractérisé en ce que l'on fait ingérer à cet animal, dans la ration alimentaire, une quantité efficace de l'additif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, du prémix selon la revendication 4 ou de la composition alimentaire selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6.