FR3010187A1 - Utilisation de l'urotensine ii et/ou l'urp comme marqueurs pour le diagnostic du vasospasme post hsa - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne notamment une méthode de diagnostic in vitro du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) chez un sujet humain ainsi qu'une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne .

Description

UTILISATION DE L'UROTENSINE II ET/OU L'URP COMME MARQUEURS POUR LE DIAGNOSTIC DU VASOSPASME POST HSA L'invention se rapporte au domaine du diagnostic in vitro du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) chez l'homme. En particulier, l'invention concerne l'utilisation de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et/ou de leurs précurseurs pour le diagnostic in vitro du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez un sujet humain. Le vasospasme est une vasoconstriction majeure des artères cérébrales principales, plus 10 précisément des artères cérébrales proximales. Le vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne a été décrit dès 1951 (Ecker et al., 1951). L'hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA), résulte de l'épanchement de sang artériel dans les espaces sous-arachnoïdiens, où circule le liquide céphalo-rachidien. La cause la plus fréquente (environ 80%) en est la rupture d'anévrisme. 15 Le vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne survient dans 50 à 70% des cas, 4 à 21 jours après la rupture anévrismale, le plus souvent à proximité de celle-ci, et peut persister jusqu'à 4 semaines (Rabinstein et al., 2004). Ce vasospasme serait secondaire à la présence d'oxyhémoglobine dans les espaces sous-arachnoïdiens. L'oxyhémoglobine provoque localement i) une diminution de la production endothéliale et neuronale de facteurs 20 vasodilatateurs tels que le monoxyde d'azote (NO) ainsi qu'une inhibition de sa biodisponibilité par complexation, ii) une augmentation de la sécrétion endothéliale du peptide vasoconstricteur endothéline-1 (ET-1), iii) l'induction de l'apoptose des cellules endothéliales et vasculaires lisses, iv) un stress oxydatif responsable de la synthèse de lipides vasoactifs (dérivés de l'acide arachidonique) et v) une modification de la réponse des canaux ioniques calciques et 25 potassiques voltage-dépendants, responsable d'une entrée massive de calcium (Kolias et al., 2009). Le vasospasme correspond à une vasoconstriction par contraction des cellules musculaires lisses ainsi qu'à une prolifération cellulaire pariétale, associées à une réaction inflammatoire (Borel et al., 2003). D'autre part, l'ischémie cérébrale retardée ou DCI fait partie des lésions cérébrales consécutives 30 à l'hémorragie sous-arachnoïdienne, et se traduit par une dégradation neurologique secondaire (confusion, nouveau déficit neurologique, troubles de conscience) définissant le déficit neurologique ischémique retardé (DNI). Pendant de nombreuses années, la DCI a été attribuée au vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. On estime désormais que le vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne participe probablement à la DCI mais n'est pas le seul mécanisme en cause. Néanmoins, la plupart des méthodes de diagnostic du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne ne permettent pas de distinguer ces deux états pathologiques de manière suffisamment fiable, et ne permettent pas au praticien d'établir un diagnostic très fiable. En outre, à ce jour, les méthodes de diagnostic du vasospasme, en particulier du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne, reposent uniquement sur l'utilisation de techniques de radiologie. Parmi les méthodes existantes, l'examen de référence reste l'angiographie. L'angioscanner en 10 est une alternative. Il est moins invasif, mais aussi moins sensible pour la détection d'un vasospasme modéré ou situé en distalité. Le diagnostic du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne peut être réalisé par un Doppler transcrânien, qui permet d'enregistrer la vélocimétrie des artères. Le caractère à la fois non invasif et reproductible de cette méthode en fait un examen interressant pour la surveillance 15 du calibre des gros vaisseaux de la base du crâne. Néanmoins, sa sensibilité, comparée à celle de l'artériographie, reste faible. Ainsi, seul le vasospasme de l'artère cérébrale moyenne peut être prédit avec une sensibilité et une spécificité suffisante par cette méthode. Cependant, l'accès à ces techniques de référence nécessite un déplacement du patient vers un site de radiologie spécialisée, transport compliqué par l'état clinique du patient qui est souvent 20 altéré. En effet, des patients les plus graves sont habituellement sous sédation (Vergouwen et al., 2010). Il existe donc un besoin de méthodes diagnostiques améliorées, qui ne nécessitent pas le déplacement du patient, telles que des méthodes permettant l'utilisation d'échantillons biologiques. Cependant, jusqu'à présent, aucun marqueur biologique n'avait été identifié qui 25 permette de diagnostiquer facilement le vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne à partir d'un simple échantillon du patient, pouvant être prélevé au lit du malade. Pourtant, le rôle de certaines substances régulant le tonus vasomoteur a été étudié afin de tenter de mettre en évidence des marqueurs utilisables pour un tel diagnostic. Par exemple, l'utilisation de l' endothéline-1 et de la protéine S10013 comme marqueur du 30 vasospasme a été envisagée. Les taux d'endothéline-1, molécule vasoconstrictrice, sont en effet élevés dans le plasma et dans le liquide céphalorachidien de sujet atteints d'hémorragie sous-arachnoïdienne en cas de persistance d'un vasospasme cérébral, tandis que ces mêmes taux déclinent en l'absence de vasospasme (Seifert et al., 1995 ; Juvela, 2000). Ces taux d'endothéline-1 restent élevés 4 à 7 jours après l'hémorragie en cas de vasospasme, et cette persistance pourrait servir de marqueur prédictif.

Cependant l'augmentation du taux de ce marqueur demeure trop tardive pour permettre le diagnostic précoce. Quant à la protéine S100f3, celle-ci est présente dans le cytoplasme des cellules et possède une forte affinité pour le calcium, ce qui pourrait permettre d'évaluer la gravité des lésions cérébrales (Puybasset et al., 2006). Néanmoins, l'utilisation de ce marqueur nécessite un dosage 10 pluriquotidien, ce qui s'avère trop contraignant et limite son utilisation. Ainsi, jusqu'à présent, pour des raisons de manque de sensibilité, spécificité ou de lien causal, aucune de ces molécules n'a été utilisée comme marqueur biologique pour diagnostiquer le vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne, et ainsi évaluer le devenir du patient ou guider sa prise en charge. 15 Il subsiste donc un besoin pour des méthodes de diagnostic du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne présentant des caractéristiques et conditions d'application améliorées, notamment en termes de simplicité, de mise en oeuvre et de fiabilité. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le niveau d'expression de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et/ou de leurs 20 précurseurs dans un échantillon biologique d'un sujet humain corrèle avec la survenue d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. Les inventeurs ont ainsi découvert qu'il est possible d'utiliser le niveau d'expression de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et/ou de leurs précurseurs, mesuré dans un échantillon biologique du sujet, comme marqueur biologique pour 25 le diagnostic in vitro du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez ledit sujet. L'Urotensine II (UII) et son analogue, l'Urotensin-II Related Peptide (URP) (Sugo et al., 2003), sont des facteurs endogènes vasoactifs parmi les plus puissants connus à l'heure actuelle. Ces deux peptides sont les ligands endogènes d'un récepteur à 7 domaines transmembranaires couplé aux protéines G, le récepteur GPR14 (G protein-coupled receptor-14), aussi appelé UTR. 30 Le récepteur à l'Urotensine II ou UTR est codé par le gène UTS2R (référence NCBI : Gene ID 2837). L'activation de ce récepteur entraîne classiquement une augmentation de la concentration cytosolique de calcium suite au recrutement d'une protéine Gq et à l'activation d'une phospholipase C (PLC) (Proulx et al., 2008). Cependant, l'effet vasoconstricteur de l'UII varie considérablement d'une espèce à l'autre, il existe au sein d'une même espèce une hétérogénéité régionale marquée. L'UII a une action vasoconstrictrice sur les artères pulmonaires et l'aorte thoracique de Rat, par contre elle est sans effet sur l'aorte abdominale, les artères fémorales et rénales (Ames, Sarau et al., 1999). Les études in vitro portant sur les vaisseaux de Chat et de Porc montrent que l'UII provoque une vasoconstriction au niveau de l'aorte, des artères pulmonaires, mésentériques et fémorales. En revanche, chez le Lapin et le Chien, l'effet vasoconstricteur du neuropeptide est restreint aux artères coronaires (Douglas and Ohlstein 2000; Saetrum Opgaard, Nothacker et al., 2000). Chez les primates, les effets de l'UII sont aussi très variables. Alors que l'UII exerce une action vasoconstrictrice intense sur les artères de macaque, elle n'a quasiment aucun effet sur les vaisseaux de marmouset (Douglas and Ohlstein 2000; Douglas, Sulpizio et al., 2000). Chez l'Homme, l'effet vasoconstricteur de l'UII sur les artères coronaires et pulmonaires est 12 fois moins important que chez le macaque (Douglas and Ohlstein 2000; Douglas, Sulpizio et al., 2000; Camarda, Guerrini et al., 2002). Parallèlement, les résultats sur les effets de l'administration d'UII chez l'Homme sont pour l'instant contradictoires : tandis que certaines études ont montré que l'injection d'UII dans l'artère brachiale de volontaires sains produit un effet vasoconstricteur puissant (Bohm and Pernow 2002), d'autres auteurs ne confirment pas ces résultats (Wilkinson, Affolter et al., 2002). Ainsi, l'utilisation du niveau d'expression de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et/ou de leurs précurseurs comme marqueur biologique de prédiction du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne était difficilement prévisible. Cette 25 nouvelle utilisation est donc particulièrement surprenante Aussi, l'invention a pour premier objet l'utilisation de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et/ou de leurs précurseurs dans un échantillon biologique d'un sujet humain comme marqueur biologique pour le diagnostic in vitro du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez ledit sujet. 30 L'invention a pour deuxième objet une méthode de diagnostic in vitro du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez un sujet humain comprenant la détermination du niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine et leurs précurseurs dans un échantillon biologique dudit sujet, la séquence desdits analogues comprenant la séquence SEQ ID NO: 1, où la séquence SEQ ID NO: 1 est Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys. L'invention présente l'avantage de pouvoir être mise en oeuvre de façon simple et rapide, à partir d'un simple échantillon du sujet, et ne nécessite donc pas le déplacement de celui-ci. L'invention peut par exemple être mise en oeuvre à partir d'un échantillon de sang, de sérum ou de plasma du sujet, et peut par conséquent être utilisée y compris dans le cas où le sujet est sous sédation. En outre, l'invention permet de diagnostiquer le vasospasme après hémorragie sous-10 arachnoïdienne avec une grande sensibilité et une grande spécificité. De façon générale, la sensibilité d'une méthode mesure la capacité de celle-ci à donner un résultat positif lorsqu'une hypothèse est vraie, tandis que la spécificité mesure la capacité d'un test à donner un résultat négatif lorsque l'hypothèse est fausse. Ainsi, la sensibilité d'une méthode de diagnostic est estimée par la proportion de sujets déterminés comme positifs 15 (malades) par la méthode chez les sujets effectivement malades, tandis que la spécificité d'une méthode de diagnostic est estimée par la proportion de sujets déterminés comme négatifs (non malades) par la méthode chez les sujets effectivement non-malades. La courbe ROC (pour « Receiver Operating Characteristic Curve ») représente l'évolution de la sensibilité (taux de vrais positifs) en fonction du taux de faux positifs. L'aire sous la courbe 20 ROC (AUC) est couramment utilisée pour estimer la performance de prédiction d'un test diagnostique. Plus précisément, un AUC de 1 correspond à une prédiction idéale, tandis qu'une AUC de 0.5 correspond à une prédiction due au hasard. On estime que pour qu'une méthode ait une bonne performance de prédiction, l'AUC obtenue avec cette méthode doit être supérieure à 0,85 (Ray P. et al.. Anesthesiology; 112: 1023-40, 2010). 25 Or, les inventeurs ont pu montrer que l'AUC de la méthode de l'invention est de 0,94. Ceci indique que la méthode est particulièrement sensible, et constitue donc un test discrimant permettant le diagnostic du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. Les inventeurs ont en outre montré que le niveau d'expression de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et/ou de leurs précurseurs corrèle avec le vasospasme 30 mais pas avec l'ischémie cérébrale retardée. La méthode de l'invention permet donc de limiter les diagnostics différentiels.

En effet, l'étude de la corrélation des niveaux d'expression des marqueurs de l'invention la survenue d'une DCI fait apparaitre une AUC de 0,56, c'est-à-dire très proche d'une estimation au hasard. En outre, les inventeurs ont observé des niveaux d'expression des marqueurs de l'invention 5 élevés chez les sujets ayant développé une ischémie cérébrale retardée associée à un vasospasme, alors que les mêmes niveaux d'expression restent faibles chez les sujets ayant présentés une ischémie cérébrale retardée sans vasospasme. L'ensemble de ces résultats montre que l'invention permet un diagnostic très spécifique du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. 10 Afin de permettre une meilleure compréhension de la présente invention, certaines définitions sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent être interprétés selon leur sens habituel. Par « vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne », on entend au sens de la présente invention une vasoconstriction majeure des artères cérébrales principales consécutive à une 15 hémorragie sous-arachnoïdienne. Par « marqueur biologique », on entend au sens de la présente invention une caractéristique qui est objectivement mesurée et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux, de processus pathogéniques, ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique. Un marqueur désigne donc toute une gamme de substances et de paramètre divers. Par exemple, 20 un marqueur peut être une substance dont la détection indique un état pathologique particulier (par exemple la présence de la protéine C activée en tant que marqueur d'une infection). Selon certains modes de réalisation de la présente invention un marqueur est un polypeptide dont les changements d'expression, en particulier de niveau d'expression, ou d'état, corrèlent avec le risque ou la progression d'une maladie. 25 L'Urotensine II (UII), c'est-à-dire la forme mature de la protéine Urotensine II, est un peptide cyclique vasoactif dont la région biologiquement active est conservée chez le Rat, la Souris et l'Homme. Chez l'Homme, le gène de l'Urotensine II (référence NCBI : Gene ID: 10911) code pour plusieurs transcrits primaires, à savoir le transcrit a (références NCBI : NM_021995.2) et le transcrit b (références NCBI : NM 006786.3), traduits réciproquement en la prépro-protéine a 30 de l'Urotensine II humaine (références NCBI : NP 068835.1) et la prépro-protéine b de l'Urotensine II humaine (références NCBI : NP 006777.1). En particulier, dans la présente demande, la séquence de la prépro-protéine a de l'Urotensine II humaine (références NCBI : NP_068835.1) est représentée par la séquence SEQ ID NO: 3 et la séquence de la préproprotéine b de l'Urotensine II humaine (références NCBI : NP_ NP_006777.1) est représentée par la séquence SEQ ID NO: 4. Ces deux prépro-protéines, aussi appelées précurseurs de l'UII, subissent ensuite des modifications post-traductionnelles conduisant à une seule forme mature de la protéine Urotensine II humaine. En particulier, dans le cadre de la présente demande, la séquence de l'Urotensine II humaine est représentée par la séquence SEQ ID NO: 2. Par « Urotensine II humaine », on entend selon l'invention un peptide dont la séquence est la séquence peptidique de l'Urotensine II humaine. En particulier, dans le cadre de la présente demande, la séquence de la protéine Urotensine II humaine est la séquence SEQ ID NO: 2.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'Urotensine II est un peptide dont la séquence est la séquence peptidique SEQ ID NO: 2, où la séquence SEQ ID NO: 2 est Glu-Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val. Par « précurseur de l'Urotensine II humaine », on entend au sens de la présente invention un peptide capable d'être modifié de façon post-traductionnelle en Urotensine II humaine.

Cette définition comprend donc les précurseurs de l'Urotensine II humaine déjà connus, tels que par exemple la prépro-protéine a de l'Urotensine II humaine (références NCBI : NP_068835.1) et la prépro-protéine b de l'Urotensine II humaine (références NCBI : NP_006777.1), ainsi que les précurseurs qui n'ont pas encore été caractérisés. Préférentiellement, au sens de l'invention, on entend par « précurseur de l'Urotensine II humaine » un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence ayant au moins 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95% d'identité avec la séquence de la prépro-protéine a de l'Urotensine II humaine, en particulier de séquence SEQ ID NO: 3 (références NCBI: NP 068835.1), ou avec la séquence de la prépro-protéine b de l'Urotensine II humaine, en particulier de séquence SEQ ID NO: 4 (références NCBI : NP_006777.1), sur toute la longueur de ladite séquence. Préférentiellement, le précurseur de l'Urotensine II humaine selon l'invention est un peptide dont la séquence est la séquence peptidique de la prépro-protéine a de l'Urotensine II humaine, en particulier de séquence SEQ ID NO: 3 (références NCBI : NP_068835.1), ou de la préproprotéine b de l'Urotensine II humaine, en particulier de séquence SEQ ID NO: 4 (références NCBI: NP 006777.1).Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit précurseur de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 3 ou la séquence SEQ ID NO: 4, où la séquence SEQ ID NO: 3 est MYKLASCCLLFIGFLNPLLSLPLLDSREISFQLSAPHEDARLTPEELERASLLQILPEMLG AERGDILRKADS STNIFNPRGNLRKFQDFSGQDPNILLSHLLARIWKPYKKRETPDCFW KYCV et la séquence SEQ ID NO: 4 est METNVFHLMLCVTSARTHKSTSLCFGHFNSYPSLPLIHDLLLEISFQLSAPHEDARLTPE ELERASLLQILPEMLGAERGDILRKADSSTNIFNPRGNLRKFQDFSGQDPNILLSHLLARI WKPYKKRETPDCFWKYCV Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit précurseur de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID NO: 3 ou la séquence SEQ ID NO: 4.

Par « analogue de l'Urotensine II humaine », on entend selon l'invention un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence ayant au moins 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95% d'identité avec la séquence peptidique de la protéine Urotensine II humaine, en particulier de séquence SEQ ID NO: 2, sur toute la longueur de ladite séquence, et qui conserve la capacité à se lier et à activer le récepteur à l'Urotensine II.

Au sens de la présente invention, le récepteur à l'Urotensine II est le récepteur GPR14 (G protein-coupled receptor-14), aussi appelé UTR (urotensin II receptor). Au sens de la présente invention, un peptide conserve la capacité à se lier et à activer le récepteur à l'Urotensine II s'il se lie au récepteur considéré, ici le GPR14, et mime les effets produits par le ligand naturel, c'est-à-dire l'Urotensine II.

Pour déterminer si un peptide répond à ces critères, l'homme du métier dispose des connaissances générales techniques nécessaires à la mise en oeuvre d'un test approprié. L'homme du métier pourra par exemple déterminer si un peptide conserve la capacité à se lier et à activer le récepteur à l'Urotensine II par des méthodes classiques d'étude de relations ligand récepteur in vitro, telles que des tests de déplacement.

De préférence, l'homme du métier utilisera des tests de déplacement reposant sur l'utilisation de cellules exprimant le récepteur à l'Urotensine II, préférentiellement des cellules CHO exprimant le récepteur à l'Urotensine II, dites « CHO-hUT ». La détermination du caractère analogue du peptide est alors effectuée sur les cellules CHO-hUT par des tests de déplacement de la liaison de l'Urotensine II humaine marquée à l'Iode radioactive (Iode 125) en présence de quantités croissantes (par exemple 10-12 -10-g M) de peptide à tester.

Ce test est avantageusement complété par un test fonctionnel évaluant l'effet de la liaison dudit peptide sur l'activation du récepteur, notamment par la mesure du niveau de messagers secondaires produits au cours de l'expérience en fonction des quantités de peptides utilisées. Plus particulièrement, dans le cadre de l'invention l'homme du métier pourra mesurer les variations de calcium intracellulaire en présence de concentrations croissantes de peptide. Pour plus de détails sur la mise en oeuvre de ces tests, l'homme du métier pourra se référer à la publication Leprince et al., Peptide, 29, (2008), 658-673. L'Urotensine II-related-peptide (URP), c'est-à-dire la forme mature de la protéine URP, parfois aussi appelé Urotensine IIB, est un analogue de l'Urotensine II identifié dans un premier temps chez le rat. Chez l'homme, le gène UTS2B (référence NCBI : Gene ID: 257313) code pour un transcrit primaire (références NCBI : NM_198152.3), traduit en la préprotéine de l'URP (références NCBI : NP 937795.2). En particulier, dans la présente demande, la séquence de la préprotéine de l'URP humaine (références NCBI : NP_937795.2) est représentée par la séquence SEQ ID NO: 6. Cette préprotéine, aussi appelée précurseur de l'URP, subit ensuite des modifications post-traductionnelles conduisant à la forme mature de la protéine URP. En particulier, dans le cadre de la présente demande, la séquence de la protéine URP humaine est la séquence SEQ ID NO: 5. Les inventeurs ont montré qu'il existe un motif commun entre la séquence de l'Urotensine II et la séquence de certains analogues connus de l'Urotensine II, en particulier l'URP. Ce motif 20 commun, c'est-à-dire cette séquence peptidique commune, est représentée dans la présente demande par la séquence SEQ ID NO: 1. Selon un mode particulier de l'invention, la séquence desdits analogues de l'Urotensine II humaine comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 1, où la séquence SEQ ID NO: 1 est 25 Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys. L'homme du métier comprendra aisément que, selon cette définition, l'URP humaine en particulier fait partie des analogues de l'Urotensine II humaine. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit analogue de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 5, où la séquence 5 est 30 Ala-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val En outre, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit analogue de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID NO: 5. Par « le peptide conserve la capacité à se lier au récepteur à l'Urotensine II », on entend dans la présente demande que le peptide a une affinité pour le récepteur comparable à celle de l'Urotensine II.

Plus particulièrement, au sens de l'invention, un peptide conserve la capacité de se lier au récepteur à l'Urotensine II si son affinité pour ledit récepteur est entre 25% et 175% de l'affinité de l'Urotensine II pour ledit récepteur. L'affinité d'un ligand pour un récepteur est communément exprimée par la constante d'association (Ka), peut être mesurée en utilisant une variété de méthodes connues de l'homme du métier y compris la dialyse à l'équilibre, les immunoblots, le BIACORE, les analyses d'immunoprécipitation, les tests radioimmunologiques, les tests immunoenzymatiques (par exemple, ELISA), des titrages d'anticorps par immunofluorescence et la microscopie. Dans le contexte de la présente invention, l'affinité est préférentiellement mesurée par exemple par dialyse à l'équilibre, ou par une trempe de fluorescence, ces technologies étant couramment utilisées dans l'art. La constante d'association (Ka), est aussi l'inverse de la constante de dissociation (Kd), c'est-à-dire que Ka =1/Kd, où : si un composé de formule Ax By se dissocie selon la réaction Ax By H xA + yB alors la constante de dissociation Kd est [A] g [AxBy] Par « le peptide conserve la capacité à activer le récepteur à l'Urotensine II », on entend dans la présente demande que le peptide induit les mêmes messagers secondaires que l'Urotensine II, en particulier l'augmentation la concentration cytosolique de calcium. Plus particulièrement, au sens de l'invention, un peptide conserve la capacité d'activer le récepteur à l'Urotensine II si l'augmentation la concentration cytosolique de calcium est comprise entre 25% et 175% de l'augmentation de la concentration cytosolique de calcium obtenue avec l'Urotensine II et mesurée dans les mêmes conditions. La concentration cytosolique de calcium peut être mesurée par toute méthode connue de l'homme du métier telle que par exemple la spectrofluorimétrie.

Par précurseur d'analogue de l'Urotensine II humaine, on entend au sens de la présente invention un peptide capable d'être modifié de façon post-traductionnelle en analogue de l'Urotensine II humaine.

Cette définition comprend donc les précurseurs d'analogues de l'Urotensine II humaine déjà connus, tels que par exemple les précurseurs de l'URP, dont en particulier la préprotéine de l'URP (références NCBI : NP 937795.2), en particulier de séquence SEQ ID NO: 6, ainsi que les précurseurs qui n'ont pas encore été caractérisés de l'URP, et les précurseurs des analogues de l'Urotensine II qui n'ont pas encore été décrits. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit précurseur de l'analogue de l'Urotensine II humaine est un peptide dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 6, où la séquence SEQ ID NO: 6 est MNKILS STVCFGLLTLL SVL SFLQ SVHGRPYLTQGNEIFPDKKYTNREELLLALLNKNFD 10 FQ RPFNTDLALPNKLEELNQ LEKLKEQLVEEKD S ETSYAVDGLF S SHP S KRA CFWKYC V Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit précurseur de l'analogue de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID NO: 6 Les pourcentages d'identité auquel il est fait référence dans le cadre de l'exposé de la présente 15 invention sont déterminés sur la base d'un alignement global des séquences à comparer, c'est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité sur toute la longueur en utilisant par exemple l'algorithme de Needlemena et Wunsch (J.Mol. Biol. 48,443-453, 1970). Cette comparaison de séquences peut être effectuée par exemple à l'aide du logiciel needle en utilisant le paramètre « Gap open » égal à 10.0, le paramètre « Gap extend » égal à 0.5 et une 20 matrice « Blosum 62 ». Le logiciel needle est par exemple disponible sur le site internet ebi.ac.uk world wide sous la dénomination « Align ». Par niveau d'expression d'un composé, on entend au sens de la présente invention la quantité dudit composé préférentiellement sous sa forme peptidique. Ainsi, par niveau d'expression de l'Urotensine II humaine, on entend au sens de la présente invention la quantité d'Urotensine II 25 humaine sous sa forme peptidique. De plus, par niveau d'expression d'un analogue de l'Urotensine II humaine, on entend au sens de la présente invention la quantité dudit analogue sous sa forme peptidique. Le niveau d'expression du composé, en particulier de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou de leurs précurseurs pourra être déterminé selon 30 toute méthode de détection et/ou de quantification d'un peptide dans un échantillon biologique connue de l'homme du métier, par exemple toute méthode basée sur des techniques classiques d'analyse de biochimie, notamment celles décrites ci-après et dans les exemples. De telles techniques sont expliquées en détail dans la littérature (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les méthodes décrites ci-après sont présentées à titre indicatif et ne constituent en aucune manière une liste exhaustive des approches techniques pouvant être utilisées pour la mise en oeuvre de l'invention. L'homme du métier saura identifier selon l'état d'évolution et d'optimisation des techniques, à tout moment, quelles sont les méthodes les mieux adaptées pour mettre en oeuvre l'invention. Les techniques pour déterminer le niveau d'expression d'un polypeptide sont connues de l'homme du métier. Par exemple, il est possible d'employer des anticorps dirigés contre ledit polypeptide, en particulier dans des technologies bien connues telles que l'immunoprécipitation, l'immunohistologie, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie. Parmi les autres techniques qui peuvent être utilisées sont comprises les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltammétrie et d'ampérometrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non-confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, ou « surface plasmon resonance » en anglais, par ellipsometry, par méthode de miroir résonnant, tec.), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDSPAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier et il n'est pas nécessaire de les détailler ici. La détermination du niveau d'expression d'un polypeptide peut comprendre en outre une étape préalable de séparation des polypeptides totaux compris dans l'échantillon du sujet, par exemple par électrophorèse ou chromatographie. Les tests immunologiques reposent sur l'utilisation de molécules capables de reconnaitre un 30 antigène avec une grande spécificité et une grande sensibilité. Le plus couramment, on utilise à cette fin des anticorps dirigés contre l'antigène. Selon un mode de réalisation de l'invention, la détermination du niveau d'expression de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou de leurs précurseurs comprend au moins un test immunologique. Préférentiellement, ledit test immunologique comprend au moins un anticorps dirigé contre l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou de leurs précurseurs. Par « anticorps dirigé contre un antigène», on entend au sens de l'invention toute molécule 5 protéique, préférentiellement toute molécule d'immunoglobine, qui se lie sélectivement et de manière réversible à un antigène avec la sélectivité requise. Les termes « anticorps dirigés contre un antigène » désignent à la fois les molécules d'immunoglobuline intactes telles que les anticorps monoclonaux et polyclonaux, et aussi les bi-anticorps dirigés contre ledit antigène , les anticorps humanisés, les anticorps chimériques, les anticorps simple chaîne, les fragments Fab, 10 les fragments F (ab'), les protéines de fusion, dès lors qu'ils se lient sélectivement et de manière réversible audit antigène, préférentiellement à l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou de leurs précurseurs. Par « se lie sélectivement », on entend au sens de l'invention la capacité des anticorps à se lier préférentiellement à un antigène. Le caractère sélectif d'une telle liaison est classiquement 15 appelé l'affinité de liaison, communément exprimé par la constante de dissociation. L'affinité de liaison peut être mesurée en utilisant une variété de méthodes connues de l'homme du métier, y compris les immunoblots, les analyses d'immunoprécipitation, les tests radioimmunologiques, les tests immunoenzymatiques (par exemple, ELISA), des titrages d'anticorps par immunofluorescence et la microscopie. 20 Les techniques pour produire des anticorps, ainsi que les tests immunologiques classiques mentionnés, ci-avant sont en particulier décrits dans Harlow, E. et Lane, D, « Antibodies: A Laboratory Manual », (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier et ne nécessitent pas d'être décrites en détail ici. En effet, l'homme du métier sait obtenir des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un 25 peptide donné à partir dudit peptide. Pour produire des anticorps dirigés contre l'Urotensine II humaine, et/ou les analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou leurs précurseurs, on pourra produire des peptides correspondant à l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou de leurs précurseurs par génie génétique, en utilisant un système de production de peptides 30 recombinants procaryote ou eucaryote, notamment en i) cultivant un microorganisme ou des cellules eucaryotes transformé(es) à l'aide d'une séquence nucléotidique codant ces différents peptides, ii) isolant les peptides produits par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Les milieux et conditions de culture associées à chaque type cellulaire utilisé pour la production de peptides recombinants sont bien connus de l'homme du métier. Pour plus de détails concernant cette technique, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : « Recombinant DNA Technology I », Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991.

Afin de produire des peptides recombinant, l'homme du métier pourra utiliser des vecteurs nucléotidiques comprenant des acides nucléiques codant les polypeptides à synthétiser. De tels vecteurs, ainsi que leur utilisation sont bien connus de l'homme du métier et sont par exemple décrits dans « Recombinant DNA Technology I », Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991). Ces vecteurs pourront ensuite être introduits dans des cellules hôtes afin que celles-ci produisent lesdits polypeptides. Les peptides recombinants correspondant à l'Urotensine II humaine, et/ou aux analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou à leurs précurseurs seront alors de préférence purifiés ou isolés à partir de lysats de cellules et/ou de surnageants de cellules par lesquelles ils sont exprimées et/ou sécrétées. Cette purification peut se faire par tout moyen connu de l'homme du métier. On citera par exemple la précipitation différentielle ou l'ultracentrifugation. Il peut être également avantageux de purifier les protéines recombinantes par chromatographie d'échange ionique, par chromatographie d'affinité, par tamisage moléculaire, ou par isofocalisation. Ces techniques, ainsi que d'autre techniques applicables, sont décrites dans Voet D et Voet JG, « Techniques de purification des protéines et des acides nucléiques », chapitre 6, Biochimie, 2nde édition.

Les anticorps polyclonaux peuvent ainsi être obtenus par immunisation, éventuellement multiple, d'un animal avec au moins une des protéines recombinantes susmentionnées, puis récupération du sérum dudit animal et purification des anticorps recherchés, notamment par chromatographie d'affinité à l'aide du polypeptide utilisé pour l'immunisation. Un grand nombre de techniques sont connues de l'homme du métier pour produire des anticorps monoclonaux. Les anticorps monoclonaux peuvent par exemple être obtenus par la méthode des hybridomes. Par exemple, des cellules productrices d'anticorps (lymphocytes) peuvent être récoltées à partir de l'animal immunisé tel que décrit ci-dessus et fusionnées avec des cellules de myélome par des procédures de fusion de cellules somatiques standards ainsi immortalisé ces cellules et produisant des cellules d'hybridomes.

La méthode des hybridomes peut être mise en oeuvre selon différentes techniques, telles que par exemple la technique des hybridomes développée initialement par Kohler et Milstein (Nature, 256:495-497, 1975), la technique des hybridomes de lymphocytes B humains développée par Kozbor et al. (Immunology Today, 4 :72, 1983), la technique des hybridomes EBV pour produire des anticorps monoclonaux humains (Cole et al, Methods Enzymol, 121 : 140-67, 1986). Alternativement, il est possible d'utiliser des anticorps disponibles commercialement, tels que par exemple l'anticorps anti-UII humain et anti-URP dont les références commerciales sont G5 071-05, ou l'anticorps anti-UII humain et anti-URP dont les références commerciales sont G071-17, commercialisé par Phoenix Pharmaceuticals. L'invention présente l'avantage de pouvoir être effectuée in vitro, à partir d'échantillon biologique du sujet. Au sens de la présente invention, une méthode est qualifiée de méthode in vitro lorsque sa mise en oeuvre ne nécessite pas de disposer du sujet, c'est-à-dire dont chacune 10 des étapes peut être réalisée in vitro. Ainsi, une méthode est in vitro lorsqu'elle est mise en oeuvre en dehors d'un organisme animal ou humain, par exemple dans du matériel de laboratoire (tube, éprouvette, eppendorfs, etc.), donc de façon artificielle. Par échantillon biologique, on entend au sens de la présente invention tout échantillon biologique issu d'un sujet. Ce terme inclut tout type de fluides biologiques, d'échantillons de 15 tissus, de cellules, d'organes, de biopsies, ainsi que les cultures de cellules ou de tissus dérivés de ceux-ci. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit échantillon biologique est un échantillon de plasma et/ou de sérum. Par échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum, on entend au sens de l'invention tout échantillon comprenant du sang et/ou du plasma et/ou du sérum, ainsi que tout échantillon 20 dérivé de ces produits, tel que par exemple un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum préalablement traité avant son utilisation. L'homme du métier sait en effet qu'en fonction de la méthode de détection et/ou de quantification employée, il peut s'avérer nécessaire ou avantageux de traiter l'échantillon préalablement à son analyse. Un exemple de traitement préalable de l'échantillon consiste à le faire passer sur un support d'immunocapture, comportant 25 un des composés recherchés dans la méthode de l'invention, par exemple un anticorps dirigé contre le ou les composés recherchés dans la méthode de l'invention. Un autre exemple de traitement préalable de l'échantillon peut être le pré-fractionnement de l'échantillon biologique, afin de séparer les protéines de l'échantillon. Il est par exemple possible de dépléter certaines protéines de l'échantillon, en particulier l'albumine, par des techniques bien connues de 30 l'homme du métier. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le sang et/ou le sérum et/ou le plasma du sujet est traité par une étape de purification, tel que par exemple une purification par passage sur colonne capable d'absorber des médicaments et leurs métabolites dans le sérum, telle que par exemple les colonnes Sep Pack C18, préalablement à son analyse.

Par analyse de l'échantillon, on entend au sens de l'invention les analyses physico-chimiques et/ou biologiques effectuées en vue de la détermination du niveau d'expression de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et/ou de leurs précurseurs. De tels traitements sont bien connus de l'homme du métier.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit au moins un composé est choisi dans le groupe consistant en l'analogue de l'Urotensine II humaine dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 5 ; et le précurseur de l'analogue de l'Urotensine II humaine dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 6. Selon un mode de réalisation encore plus particulier de l'invention, ledit au moins un composé est choisi dans le groupe consistant en : l'analogue de l'Urotensine II humaine dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID NO: 5 ; et le précurseur de l'analogue de l'Urotensine II humaine dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID NO: 6. La méthode de l'invention peut en outre comprendre une étape ii) de comparaison du niveau 20 d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine et/ou leurs précurseurs, déterminé selon la méthode de l'invention, avec au moins une valeur de référence. Ladite valeur de référence peut être notamment, sans s'y limiter : -la valeur moyenne du niveau d'expression dudit composé déterminé dans un échantillon 25 biologique équivalent, pour un groupe de sujets sains ; -la valeur moyenne du niveau d'expression dudit composé déterminé dans un échantillon biologique équivalent, pour un groupe de sujets présentant un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. Par échantillon biologique équivalent, on entend au sens de la présente demande tout 30 échantillon biologique correspondant physiologiquement à celui utilisé dans la mise en oeuvre de l'invention.

De façon générale, les Inventeurs ont montré que lorsque le niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine et/ou leurs précurseurs est au-dessus d'une valeur seuil de référence d'au moins 5 pmo1/100uL d'échantillon sanguin, la sensibilité et la spécificité de la méthode sont particulièrement importantes. Ainsi, il est particulièrement avantageux d'utiliser comme valeur de référence des valeurs supérieures ou égales à 5 pmo1/100uL d'échantillon sanguin, afin d'améliorer la sensibilité et la spécificité du diagnostic obtenue avec la méthode de l'invention. Les Inventeurs ont en particulier montré sur une population de sujets que l'indice de Youden est le plus élevé lorsque le niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine et leurs précurseurs est égal ou supérieur à 5,8 pmo1/100uL d'échantillon sanguin (IY à 0,827). L'indice de Youden correspond à la valeur pour laquelle le calcul (sensibilité + spécificité - 1) est le plus élevé. Cette valeur peut donc être utilisée comme valeur de référence par l'homme du métier.

Pour cette valeur de référence, la sensibilité est de 92% et la spécificité de 90%, soit les plus importantes calculées. Selon un mode de réalisation particulier, la valeur de référence correspond à un niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine et/ou leurs précurseurs égal ou supérieur à 5,8 pmo1/100uL d'échantillon biologique, où l'échantillon biologique est du sang, ou du sérum ou du plasma sanguin. Ainsi, par exemple, lorsque le niveau d'expression dudit composé déterminé à l'étape i) est significativement plus élevé que la valeur de référence, ladite valeur de référence correspondant à une concentration d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine et leurs précurseurs de 5,8 pmo1/100uL d'échantillon biologique, alors le sujet est prédit comme atteint d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. De même, par exemple, lorsque le niveau d'expression dudit composé déterminé à l'étape i) est significativement moins élevé que la valeur de référence, ladite valeur de référence correspondant au niveau d'expression dudit composé déterminé dans un échantillon biologique équivalent pour un groupe de sujets sains, alors le sujet est prédit comme non atteint d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne.

En outre, par exemple, lorsque le niveau d'expression dudit composé déterminé à l'étape i) est significativement moins élevé que la valeur de référence, ladite valeur de référence correspondant au niveau d'expression dudit composé déterminé dans un échantillon biologique équivalent pour un groupe de sujets présentant un vasospasme après hémorragie sous- arachnoïdienne, alors le sujet est prédit comme non atteint d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. D'autre part, par exemple, lorsque le niveau d'expression dudit composé déterminé à l'étape i) est significativement plus élevé que la valeur de référence, ladite valeur de référence correspondant au niveau d'expression dudit composé déterminé dans un échantillon biologique équivalent pour un groupe de sujets sains, alors le sujet est prédit comme atteint d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. De plus, par exemple, lorsque le niveau d'expression dudit composé déterminé à l'étape i) est significativement plus élevé que la valeur de référence, ladite valeur de référence correspondant au niveau d'expression dudit composé déterminé dans un échantillon biologique équivalent pour un groupe de sujets présentant un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne, alors le sujet est prédit comme atteint d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. Un niveau d'expression dudit composé déterminé à l'étape i) significativement moins élevé que la valeur de référence peut correspondre à un niveau inférieur d'au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, au moins 35% par rapport au niveau de référence.

Un niveau d'expression dudit composé déterminé à l'étape i) significativement plus élevé que la valeur de référence peut correspondre à un niveau supérieur d'au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, au moins 35% par rapport au niveau de référence. Grâce à la méthode de l'invention, les signes du vasospasme après hémorragie sous arachnoïdienne sont décelés précocement, ce qui permet d'administrer au sujet une thérapie 25 appropriée très rapidement. Ainsi, l'invention a aussi pour objet une méthode de traitement du vasospasme après hémorragie sous arachnoïdienne comprenant les étapes de: i. détermination du niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine et 30 leurs précurseurs dans un échantillon biologique dudit sujet selon la méthode de l'invention; et ii. comparaison du niveau d'expression obtenu à l'étape i) avec au moins une valeur de référence; et iii. prédiction que ledit sujet est atteint d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne en fonction du résultat de la comparaison de l'étape ii) ; et iv. administration d'un médicament pour prévenir ou traiter les séquelles du vasospasme audit sujet prédit comme atteint d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne selon l'étape iii). A l'heure actuelle, un médicament reconnu comme efficace pour prévenir les séquelles du vasospasme est la nimopidine, un inhibiteur calcique, commercialisé notamment sous le nom de 10 Nimotop®. La nimopidine améliore le pronostic des patients mais ne semble pas diminuer l'incidence de survenue du vasospasme. Outre le traitement médical du vasospasme, il existe des techniques invasives utilisées pour lever le spasme, par radiologie interventionnelle: l'angioplastie intraluminale des artères proximales dans des délais très précoces, telle que décrite dans Rosenwasser et al. 15 (Neurosurgery; 44: 975-9; 1999) et l'injection in situ d'agents vasodilatateurs dans chaque axe vasculaire. L'invention peut aussi avantageusement être utilisée pour suivre l'évolution du sujet en cours de traitement ou après traitement, afin de s'assurer de l'efficacité des mesures thérapeutiques mises en oeuvre. 20 L'invention a pour troisième objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez un sujet humain, comprenant l'étape de : comparaison du niveau d'expression d'au moins un composé, déterminé avant et après administration dudit traitement audit sujet, à partir d'échantillons biologiques 25 dudit sujet ; dans laquelle ledit composé est choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine, et leurs précurseurs, la séquence desdits analogues comprenant la séquence SEQ ID N°1. Cette méthode est avantageusement mise en oeuvre dans le cadre des traitements du vasospasme 30 après hémorragie sous-arachnoïdienne mentionnés ci-dessus.

L'invention a aussi pour objet un kit de diagnostic du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez un sujet humain comprenant des moyens de détermination du niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II, les analogues de l'Urotensine II, et leurs précurseurs, la séquence desdits analogues comprenant la séquence SEQ ID N°1. Les moyens de détermination du niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II, les analogues de l'Urotensine II, et leurs précurseurs peuvent être un agent de liaison tel qu'un anticorps spécifique de l'Urotensine II humaine, et/ou des analogues de l'Urotensine II humaine, et /ou de leurs précurseurs. Le kit peut en outre comprendre des instructions d'utilisation desdits moyens pour diagnostiquer le vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif. Légendes des figures Figure 1. Courbes de réaction croisée de l'anticorps utilisé. Les courbes de compétitions montrent que l'UII humaine (UIIh) (90%), l'UII de souris (70%) et dans une moindre mesure l'URP (30%) déplace la liaison de l'UIIh radioiodée de l'anticorps. Figure 2. Concentrations plasmatiques d'UII en pg/100 pt pour chaque patient de JO à J8 et résultats du bilan d'imagerie réalisé entre J8 et J11 recherchant un vasospasme (Vs) et/ou une 20 ischémie cérébrale retardée (« Delayed Cerebral Ischemia » ou DCI). Figure 3: Courbe ROC. Corrélation des taux plasmatiques d'UII entre J3 et J8 et la survenue d'un vasospasme (VS) post-HSA. Figure 4 : Courbe ROC. Corrélation des taux plasmatiques d'UII entre J3 et J8 et la survenue d'une DCI post-HSA. 25 Les exemples suivants sont fournis ici à titre d'illustration et ne sont pas, sauf indication contraire, destinés à être limitatifs. Corrélation entre les niveaux d'expression de l'Urotensine II et des analogues de l'Urotensine II dans le liquide céphalorachidien et les troubles consécutifs à une hémorragie sous-arachnoïdienne : les niveaux d'expression de l'Urotensine II et des analogues de l'Urotensine II 30 corrèlent avec le vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne.

Cette étude a été réalisée sur des patients admis pour hémorragie sous arachnoïdienne (HSA) par rupture d'anévrysme, appartenant aux grades de la classification de la World Federation of Neurological Surgeons (WFNS) II à IV tels que décrits dans « Conférences d'actualisation » (pages 177-187, document publié par Elsevier Masson SAS), et ayant bénéficié de la pose d'une dérivation externe du liquide céphalo-rachidien (DVE) et d'une exclusion anévrysmale dans les 3 jours suivant la prise en charge hospitalière. Le grade de la classification de la WFNS croît de I à V avec l'importance du risque de développer un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne Les sujets présentant des HSA sans étiologie retrouvée ou d'une autre cause que la rupture 10 anévrysmale, les HSA par rupture d'anévrysme côtées WFNS I ou V, ou n'ayant pas bénéficié d'une exclusion anévrysmale dans les délais requis ont été exclus de l'étude. Les femmes enceintes, les mineurs, les patients de plus de 70 ans, les patients aux antécédents d'accident vasculaire cérébral ischémique ou hémorragique et les insuffisants rénaux ou hépatiques ont aussi été exclus de cette étude. 15 Les patients inclus ont été suivis sur une période de 6 mois selon la chronologie suivante : - Suspicion diagnostique, évaluation neurologique et score de Glasgow; - Confirmation de l'HSA par une TDM crânio-encéphalique; - Hospitalisation en service de réanimation (neuro-chirurgicale, chirurgicale ou médicale) ; - Evaluation du statut neurologique selon les critères de la WFNS ; 20 - Confirmation du diagnostic d'anévrysme rompu par un angioscanner ou une angiographie ; - Information du patient et/ou de sa famille sur la pathologie, ses modalités thérapeutiques, et ses complications éventuelles. Vérification des antécédents, information sur le protocole, vérification des critères d'inclusion et de l'absence de critères d'exclusion. Le protocole de recherche est de nouveau expliqué au décours de l'admission du patient et le consentement est 25 obtenu par oral et par écrit ; - Prise de décision multidisciplinaire de la modalité thérapeutique: clipping ou coiling ; - Pose d'une DVE à la prise en charge initiale ou en per opératoire selon la présentation clinique initiale et les données de l'imagerie ; - Exclusion du sac anévrysmal ; 30 - Poursuite de la prise en charge dans une unité adaptée à l'état clinique du patient. - Evaluation neurologique et globale quotidienne ; - Réalisation de d'analyse par Doppler transcrânien (DTC) quotidiens, imagerie par TDM ou angiographie réalisée selon l'évolution clinique ; - TDM cérébrale avec séquences de perfusion réalisée entre J8 et J11 pour évaluer l'évolution des lésions par rapport à la TDM initiale, le spasme éventuel des artères proximales, le débit sanguin cérébral, et localiser une éventuelle ischémie cérébrale ; - Visite de suivi, avec évaluation clinique fonctionnelle par le score de Rankin à 2 mois et à 6 5 mois, complétée si possible par une évaluation de la qualité de vie. L'ensemble du suivi, hormis les dosages plasmatiques d'UII, fait partie de la surveillance standard des patients ayant eu une HSA réalisée dans le service de Réanimation Neurochirurgicale du CHU. 10 Les évènements indésirables au cours de cette période ont été colligés. En cas de décès, les causes exactes ont été recherchées et une déclaration a été réalisée. La date de la pose de la DVE a servi de référence. Les premiers prélèvements sanguins ont été réalisés dans les 24 heures suivant sa pose, et correspondent à JO. Tous les prélèvements ont été réalisés entre 8h et 9h, jusqu'à J8. 15 Les données de chaque patient ont été recueillies dans un cahier d'observation dédié spécifiquement à la recherche. Les critères suivants ont été recueillis : âge, sexe, antécédents personnels et familiaux cardiovasculaires, autres antécédents, et traitements habituels. Les caractéristiques de l'HSA ont été colligées. La date supposée de la rupture anévrysmale et la date d'hospitalisation ont été notées, ainsi que le statut clinique et scanographique à l'admission 20 (score WFNS et grade de Fisher, tous deux tels que définis dans « Conférences d'actualisation » (pages 177-187, document publié par Elsevier Masson SAS)). Entre JO et J8, le score WFNS, les résultats des DTC, quand ils ont pu être effectués, et les éventuels évènements indésirables ont été consignés. La date de l'exclusion anévrysmale et la modalité choisie ont été répertoriées. Les données d'imagerie ont été consignées. La distribution de l'hémorragie initiale, permettant 25 d'établir le score de Fisher, la localisation de l'anévrysme en cause, les caractéristiques radiologiques de l'hydrocéphalie ont été renseignées. L'imagerie réalisée entre J8 et J11 a permis d'obtenir des informations sur la qualité de l'exclusion anévrysmale, sur la présence d'un vasospasme, et sur la présence d'une ischémie cérébrale et sa topographie. Ces données ont été étudiées en parallèle avec les données des DTC. 30 L'état clinique initial était évalué par les équipes accueillant le patient. Le score WFNS à l'admission était retranscrit dans le dossier et a permis d'apprécier les patients présentant les critères d'inclusion pour notre étude.

La dégradation postopératoire a été définie par la survenue au décours de la procédure d'exclusion anévrysmale d'une dégradation neurologique (DNI) durant au moins 24 heures. Cette dégradation se traduit en termes d'échelle WFNS par un changement d'au moins une catégorie.

Dans certains cas les diagnostics différentiels ont été posés: déséquilibre hydroélectrolytique, hydrocéphalie, vasospasme cérébral, accident vasculaire cérébral secondaire à la procédure (ischémie par thrombose ou par embolie, hémorragique, contusion d'approche). Seules les suspicions de DNI liée à l'ischémie cérébrale ont été étudiées. Une TDM de contrôle avec des séquences de perfusion a été réalisée entre J8 et J11, afin de 10 caractériser la présence d'une ischémie cérébrale et/ou d'un vasospasme et d'identifier la topographie des lésions. L'étiologie des lésions hypodenses a été rapportée à l'ischémie postHSA après avoir éliminé les ischémies procédurales et celles secondaires à l'hématome initial. Le handicap fonctionnel a été évalué selon les critères de l'échelle de Rankin modifiée, à 2 mois et à 6 mois de l'HSA (Rinkel et al., 2011; Passier et al., 2011). 15 Les prélèvements de sang ont été réalisés entre JO et J8. Dix millilitres de sang ont été prélevés sur un cathéter artériel, ou par ponction veineuse, dans les conditions habituelles d'asepsie. Ces prélèvements étaient placés immédiatement au réfrigérateur, avant leur préparation. Le sang était centrifugé pendant 15 minutes à 1000 tours/min, à 4°C. Le plasma était extrait et placé dans un tube neutre, au congélateur à -20°C, avant son transport au laboratoire. Pour 20 chaque tube, une identification était établie par les initiales du patient et le jour de prélèvement au moyen d'un étiquetage spécial. Les prélèvements ont été analysés par une méthode de radio-immunoanalyse (RIA). Le RIA est une méthode microanalytique qui utilise des radionucléides pour mesurer des concentrations infinitésimales de substances. Elle permet des mesures à partir d'échantillons de liquide de 25 faible abondance. La mesure de la radioactivité permet l'obtention de résultats fiables. L'UII humain a été marqué à l'iode radioactif selon le protocole du laboratoire décrit ci-dessous, qui a été validé par l'utilisation d'un KIT de dosage RIA commercialisé par Phoenix pharmaceuticals sous la référence RK-071-05. Préparation du standard radioactif L'UII humaine (hUII, 3 p.g) est marquée à l'iode 125 (0,5 mCi; Amersham, Les Ulis, France) par la méthode de la lactoperoxidase (Chatenet et al., 2004). La fraction monoiodée de [125I]hUII est purifiée par HPLC sur une colonne Adsorbosphere C18 (0,46 X 25 cm, Alltech) à l'aide d'un gradient d'acétonitrile/acide trifluoroacétique (TFA 0,1%; pH 2,4) allant de 20 à 60%. Cette fraction est ensuite diluée (1/2, v /v) dans de l'acétonitrile 100% et conservée à 20°C. Dosage radioimmunologique : protocole du laboratoire Des travaux antérieurs ont permis de mettre en évidence des concentrations plasmatiques élevées d'UII en cas de dysfonctionnement chronique rénal et chez des patients atteints de cirrhose ou de diabète. La concentration plasmatique de peptides immunologiquement apparentés à l'hUII est déterminée par un dosage radioimmunologique mis au point au laboratoire. Le dosage est réalisé en doublet sur 100 pi de chaque échantillon de plasma incubé (48 h, 4°C) en présence de 400 p.L de tampon véronal (0,02 M; pH 8,6) contenant le traceur (100 pL, 6000 cpm/tube) et les anticorps dirigés spécifiquement contre l'hUII (300 p.L; 1/200000ème final). Voir référence Phoenix pharmaceuticals (071-05). Après une seconde incubation (48 h, 4°C) en présence d'anticorps dirigés contre les y-globulines de Lapin (1/30) et de sérum de lapin normal (1/150), le complexe antigène-anticorps (Ag-Ac) est centrifugé (4000 g, 30 min, 4 °C) et la radioactivité contenue dans les culots est mesurée à l'aide d'un compteur LKB Wallac 1277 Gammamaster. La quantité de peptide de chaque échantillon est déterminée à l'aide d'une gamme standard réalisée avec de l'hUII synthétique (1-2500 pg/tube). La courbe est linéarisée selon la méthode Logit-log: Logit ((B-C)/(B0-C) = f(log (hUII)) où B correspond à la radioactivité liée au complexe Ag-Ac; BO, à la radioactivité liée au complexe Ag-Ac en l'absence d'ODN "froid" et C, à la radioactivité non spécifique.

Des dilutions connues d'UII marquées (standard radioactif) ont été réalisées afin d'établir une courbe standard. Les taux plasmatiques d'UII de nos patients ont été mesurés à l'aide d'un compteur gamma. La concentration plasmatique de l'Urotensine II est donnée en picogrammes par 100 microlitres (pg/100e). Le paramètre de jugement principal était la définition d'un taux plasmatique seuil d'UII corrélé à 30 la survenue d'un vasospasme des artères cérébrales proximales diagnostiqué soit à la TDM soit à l'angiographie, soit au DTC.

Le paramètre secondaire était la définition d'un taux plasmatique seuil d'UII corrélé à la survenue d'une ischémie cérébrale post-HSA définie par une hypodensité à la TDM sans autre cause identifiée. Les dosages de l'UII ont été analysés à partir de J3 (correspondant au 4ème jour de pose de la DVE). La courbe ROC et l'aire sous la courbe ROC (AUC) ont servi à déterminer l'intérêt du dosage plasmatique de l'UII dans la survenue d'un vasospasme et d'une ischémie cérébrale post HSA. L'indice de Youden (W) a permis de définir une valeur seuil de la concentration plasmatique de l'UII. La sensibilité et la spécificité du test ont été définies pour le seuil identifié. Les prélèvements étaient réalisés lors de l'hospitalisation du patient à heure fixe entre 8 et 9 10 heures. Après ponction veineuse (10 ml), les échantillons étaient centrifugés et le plasma obtenu était conservé à -80°C. L'UII était dosé directement dans le plasma, puis un deuxième dosage était réalisé après purification sur colonne Sep Pack (résultats non montrés). Le dosage radioimmunologique permet une mesure quantitative d'un peptide par l'utilisation d'anticorps liant spécifiquement cette substance. La réaction antigène-anticorps est révélée par 15 une substance radioactivement marquée qui reconnaît ce complexe. L'iode radioactif (iode 125) se fixe sur les résidus tyrosyl du peptide par une réaction l'oxydation. Après la réaction de marquage on sépare l'hormone marquée ou chaude de l'hormone non marquée ou froide par une méthode biochimique appropriée (chromatographie en phase liquide haute performance HPLC). 20 L'analyse des courbes de réactions croisées du dosage révèle que l'anticorps utilisé (Phoenix Pharmaceuticals) ne reconnaît pas la somatostatine-14 humaine, reconnait l'UII humaine (90%), l'URP (30%) et l'UII de souris (70%) (Figure 1). Le Tableau I représente les résultats obtenus chez 7 patients. ACTD Patient Age Sexe ACTD CV HSA Tabac WNFS Fisher Durée (ans) familiaux (jours) 1 33 Homme non oui oui II 4 16 2 48 Homme non non oui III 2 30 3 51 Homme oui non non II 3 8 4 55 Femme non dm non IV 4 9 5 63 Femme non non oui II 4 4 6 57 Femme non non non IV 4 43 7 41 Homme oui non oui IV 4 8 Tableau I : Caractéristiques démographiques des patients, durées d'hospitalisation en Réanimation et caractéristiques de l'HSA. dm: données manquantes. ACTD: antécédents. CV: cardiovasculaires.

Les dosages plasmatiques de l'UII ont été analysés à partir de J3 (correspondant au 4ème jour de pose de la DVE). Sur l'angio-imagerie, un vasospasme a été documenté pour 3 de nos cas (patients 3, 4 et 7). Deux des cas avaient été suspectés sur les données des DTC (66,6%). Un vasospasme et une ischémie étaient associés pour les patients 3 et 7 (Figure 2). Le troisième ne présentait pas d'hypodensité à la TDM de contrôle, mais il a présenté à J8 une deuxième dégradation neurologique liée à un resaignement de l'anévrysme partiellement exclu, nécessitant une réintervention en urgence. Conclusion : La courbe ROC et l'aire sous la courbe ROC (AUC) ont servi à déterminer l'intérêt du dosage plasmatique de l'UII dans la survenue d'un vasospasme et d'une ischémie cérébrale post HSA. L'indice de Youden (IY) a permis de définir une valeur seuil de la concentration plasmatique de l'UII permettant de discriminer les patients souffrant de vasospasme. La sensibilité et la spécificité du test ont été définies pour le seuil identifié (Figure 2). Le taux plasmatiques d'UII augmente entre J3 et J8 chez les patients ayant présenté un vasospasme documenté au scanner de contrôle. La courbe ROC suggère qu'il existe une corrélation entre l'élévation de la concentration d'UII plasmatiques et la survenue d'un vasospasme (Figure 3). L'aire sous la courbe (AUC) est calculée à 0,939. L'indice de Youden est le plus élevé pour le seuil de 5,8 pmo1/100uL (IY à 0,827). Pour ce seuil, la sensibilité est de 92% et la spécificité de 90%, soit les plus importantes calculées.

Sur les 7 patients de l'étude, deux ont présenté des taux plasmatiques d'UII élevés à JO. Ces deux patients avaient comme antécédent soit une HTA soit une artériopathie oblitérante des membres inférieurs. En 2004, Cheung et al. ont mis en évidence que le taux d'UII était plus élevé chez 62 patients atteints d'HTA essentielle par rapport à des patients normotendus (Cheung et al., 2004). Par ailleurs, des taux plasmatiques d'UII ont été retrouvés plus élevés chez les patients atteints d'athérosclérose, notamment coronarienne et carotidienne [Maguire et al., 2004, Ban et al., 2009; Hassan et al., 2005). Les antécédents cardiovasculaires de ces 2 patients peuvent donc expliquer cette concentration initiale d'UII élevée. En résumé : Le taux de protéines mesurés par l'anticorps commercial à partir d'échantillons plasmatiques des sujets reflètent à la fois les niveaux d'expression de l'Urotensine II et de l'URP. Ces niveaux d'expression sont corrélés à la survenue d'un vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne. En particulier, l'augmentation des niveaux d'expression de l'Urotensine II et de l'URP mesurés entre J3 et J8 après hémorragie sous-arachnoïdienne, est significativement corrélée au vasospasme. Cette augmentation est donc un des signes précoces du vasospasme après hémorragie sous arachnoïdienne. La sensibilité et la spécificité de la méthode sont maximales lorsque le taux de protéines mesurés par l'anticorps commercial est de 5,8 pmo1/100e . La sensibilité est alors de 92% et la spécificité est de 90%.

La méthode de l'invention permet donc un diagnostic précoce, sensible et spécifique du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Méthode de diagnostic in vitro du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez un sujet humain comprenant une étape i) de détermination du niveau d'expression d'au moins un composé choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine , les analogues de l'Urotensine II humaine et leurs précurseurs dans un échantillon biologique dudit sujet, la séquence desdits analogues comprenant la séquence SEQ ID NO: 1.
2. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'Urotensine II humaine est le peptide de séquence SEQ ID NO: 2.
3. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle ledit précurseur de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 3 ou la séquence SEQ ID NO:
4. 4. 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit précurseur de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID NO: 3 ou la séquence SEQ ID NO: 4.
5. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit analogue de l'Urotensine II humaine est un peptide dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 5.
6. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit précurseur de l'analogue de l'Urotensine II humaine est un peptide dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 6.
7. 7. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ledit au moins un composé est choisi dans le groupe consistant en : - l'analogue de l'Urotensine II humaine dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 5 ; et- le précurseur de l'analogue de l'Urotensine II humaine dont la séquence comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 6.
8. 8. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle ledit analogue de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID No.NO: 5 et ledit précurseur de l'analogue de l'Urotensine II est un peptide dont la séquence consiste en la séquence SEQ ID No.NO: 6.
9. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de plasma et/ou de sérum.
10. 10. Méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement du vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne chez un sujet humain, comprenant l'étape de : comparaison du niveau d'expression d'au moins un composé, déterminé avant et après administration dudit traitement audit sujet, à partir d'échantillons biologiques dudit sujet ; dans laquelle ledit composé est choisi dans le groupe consistant en l'Urotensine II humaine, les analogues de l'Urotensine II humaine, et leurs précurseurs, la séquence desdits analogues comprenant la séquence SEQ ID NO: 1.20