FR3002544A1 - Procede et kit pour evaluer le pouvoir d'un compose ou d'un extrait a proteger les proteines contre un stress oxydant - Google Patents
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Abstract
Procédé d'évaluation du pouvoir d'un composé ou d'un extrait à protéger les protéines contre un stress oxydant, comprenant : - l'incubation du composé ou de l'extrait avec : o une enzyme sensible au stress oxydant, dont l'activité peut être mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie ; o un substrat de l'enzyme ; en présence du stress oxydant la mesure de l'activité enzymatique par colorimétrie ou fluorimétrie.
Description
PROCEDE ET KIT POUR EVALUER LE POUVOIR D'UN COMPOSE OU D'UN EXTRAIT A PROTEGER LES PROTEINES CONTRE UN STRESS OXYDANT Domaine de l'invention La présente invention a pour objet un procédé permettant d'évaluer le pouvoir d'un composé ou d'un extrait à protéger les protéines contre un stress oxydant, aussi bien généré par des radicaux libres que par une irradiation aux ultra-violets ou en lumière visible. De manière plus précise, le procédé est basé sur la mesure, par une méthode aisée telle que la colorimétrie ou la fluorimétrie, de l'activité d'une enzyme sensible au(x) stress oxydant(s).
Ainsi, le procédé selon l'invention permet de tester de manière aisée, rapide, fiable et reproductible un grand nombre de composés ou d'extraits, et ce vis-à-vis d'un grand nombre de stress oxydants variés.
Selon un autre aspect, la présente invention vise un kit permettant la mise en oeuvre d'un tel procédé, très utile pour le criblage à haut-débit (« high-throughput screening » ou HTS). Etat de la technique Chez les organismes aérobies et notamment chez l'homme, l'oxygène est nécessaire à la survie mais est également responsable de dommages oxydatifs liés à ses métabolites réactifs. Ainsi, le terme RO S (pour « reactive oxygen species ») ou ROM (pour « reactive oxygen metabolites ») est couramment utilisé pour désigner tous les radicaux libres et les espèces chimiques non radicalaires qui prennent part aux processus biologiques oxydatifs et dont l'excès est considéré comme la base d'un nombre croissant de procédés dégénératifs et de maladies. Plus précisément, le terme ROS inclut le radical anionique superoxyde 02-., le radical hydroxyl OH., l'oxygène singulet '02 et le peroxyde d'hydrogène H202, ainsi que les radicaux alkoxys RO- et les radicaux peroxys ROO., qui sont formés à partir des molécules organiques dans les processus oxydatifs. La production d'origine exogène de ces métabolites dépend essentiellement d'évènements physiques, tels que les irradiations aux ultraviolets (UV), ou des évènements chimiques, tels que des agents xénobiotiques. La production endogène, quant à elle, est essentiellement liée à la respiration cellulaire au niveau des mitochondries.
Quel que soit leur procédé de formation, ces métabolites sont dangereux pour l'organisme en raison de leur haute réactivité et leur action affecte divers composants cellulaires, parmi lesquels un grand nombre de protéines structurales, des enzymes, des acides aminés, l'ADN et l'ARN, les glucides, ainsi que les lipides et les phospholipides.
A noter que dans le cas d'irradiations aux UV, outre la génération d'espèces réactives, il peut y avoir en plus un dommage physique direct sur les composants cellulaires. Ainsi, les UV sont connus pour induire des dimères de thymine qui peuvent engendrer des mutations, voire des cassures de l'ADN.
Dans une situation de production excessive de métabolites réactifs, l'organisme est confronté à un processus dit de « stress oxydatif » ou « stress oxydant ». Pour se défendre contre les dommages causés par ces métabolites, l'organisme a développé des systèmes de défense contre l'oxydation pour diminuer la réactivité de ces substances, voire pour les neutraliser. Ces systèmes peuvent être de nature protéique, comme l'albumine sérique (HSA), la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, les peroxydases ou des petits peptides, ou de nature non protéique, tels que l'ubiquinol, les anthocyanines, les flavonoïdes, les vitamines liposolubles (vitamines A et E) et les vitamines hydrosolubles (vitamine C). Les cellules possèdent également des systèmes de réparation et de dégradation des molécules oxydées.
Ainsi, pour lutter contre le stress oxydatif, il est conseillé d'adopter un régime riche en substances naturellement anti-oxydantes et de prendre des médicaments ou compléments alimentaires à base notamment de vitamines capables de neutraliser les espèces réactives. Dans le domaine cosmétique, de nombreux produits intègrent des agents antioxydants permettant notamment de lutter contre le vieillissement prématuré lié au stress oxydatif. Par conséquent, la recherche de nouvelles molécules ou de nouveaux extraits présentant une activité anti-oxydante, à intégrer notamment dans des compléments alimentaires ou des compositions cosmétiques, est depuis de nombreuses années un enjeu majeur. Une difficulté dans ce criblage est de disposer de tests fiables et informatifs concernant le pouvoir antioxydant et protecteur d'un composé ou d'un extrait.
Le test TEAC (« Trolox Equivalent Antioxydant Capacity » ou test ABTS-+ Decolorization Assay ; Re et al., Free Radic. Biot. Med. 26(9-10) : 1231-7) est basé sur la capacité d'un antioxydant à réduire le radical cationique ABTS-+ de coloration bleu-verte en le transformant en ABTS incolore par piégeage d'un proton par l'antioxydant. En raison de sa normalisation avec un antioxydant de référence, le Trolox ou 6-Hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylic acid (analogue structural hydrosoluble de la vitamine E), ce test permet d'obtenir des résultats comparables à des milliers d'autres molécules ou extraits déjà testés.
Un autre exemple est le test DPPH basé sur la dégradation du radical DPPH-. Ainsi, un antioxydant a la capacité de donner un électron singulet au radical synthétique DPPH- de couleur violette pour le réduire en DPPH de coloration j aune-verte. Le test ORAC (« Oxygen Radical Absorbance capacity » ; Ou et al., J. Agric. Food Chem. 22 ;50(11) : 3122-8) repose sur la décroissance de la fluorescence de la fluorescéine en présence d'un oxydant chimique 1'APPH (un radical peroxyl libre stable). Un composé ou un extrait présente un pouvoir antioxydant s'il est capable de protéger la fluorescéine et ainsi de réduire la vitesse de dégradation de la fluorescence. Il ressort de ce qui précède que ces tests sont uniquement basés sur une approche chimique. En outre, ils doivent être combinés car chacun n'apporte qu'une réponse partielle sur le pouvoir antioxydant d'un composé ou d'un extrait : les différences de valeurs observées entre ces méthodes viennent du fait que les sources de radicaux libres sont différentes et que les antioxydants répondent différemment à ces méthodes de mesure.
Il existe donc un besoin évident de développer de nouvelles méthodes permettant d'évaluer le potentiel de protection contre l'oxydation de molécules ou d'extraits, notamment alimentaires ou végétaux. De manière plus générale, il serait intéressant de pouvoir suivre directement, au niveau d'une cible cellulaire, l'impact de tels molécules ou extraits. Description de l'invention La présente invention repose sur la mise en évidence de l'intérêt de mesurer ou suivre, non plus comme dans l'art antérieur un composé chimique sensible à un type particulier de radicaux, mais directement l'activité d'une enzyme. Ainsi, l'enzyme est avantageusement choisie en fonction des critères suivants : - son activité est sensible au(x) stress oxydant (s), notamment celui appliqué dans le cadre du procédé et du kit selon l'invention ; - son activité est mesurable par colorimétrie ou fluorimétrie, ce qui permet un criblage aisé, rapide et performant. En choisissant de se focaliser sur une activité enzymatique, c'est une cible biologique cellulaire qui est testée, reflétant les processus pouvant avoir lieu in vivo sur d'autres protéines importantes pour le métabolisme (notamment les protéines structurales), mais également sur les protéines impliquées dans la protection contre l'oxydation et dans la réparation des dommages oxydatifs. En mesurant l'activité enzymatique en présence d'un composé ou d'un extrait, au moins deux effets protecteurs dudit composé ou extrait sont ainsi testés : son efficacité à piéger différents types de radicaux, en d'autres termes son pouvoir antioxydant. De manière remarquable, différents types de radicaux peuvent être testés à l'aide du même procédé et du même kit selon l'invention, simplement en faisant varier la nature du stress oxydant appliqué, avec toujours la même enzyme de référence. Au contraire, les tests selon l'art antérieur ne permettaient de tester qu'un type de radical ; son éventuelle protection directe de l'enzyme, par un effet « écran » et/ou stabilisateur, empêchant le stress oxydant d'atteindre et d'affecter l'enzyme. Cette deuxième activité protectrice ne pouvait en aucun cas être mise en évidence par les tests selon l'art antérieur. Comme déjà dit, l'enzyme mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention est avantageusement une enzyme dont l'activité peut être mesurée par colorimétrie. En d'autres termes, le substrat de cette enzyme et le produit généré par réaction de l'enzyme sur ce substrat absorbent différentiellement, dans le visible et/ou dans les ultraviolets (UV). Ce changement de couleur peut par exemple être suivi à l'aide d'un spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde fixe, adaptée. Alternativement et lorsque la réaction enzymatique est réalisée dans les puits d'une plaque, elle peut être suivie à l'aide d'un lecteur de plaques doté d'un filtre à la longueur d'onde adaptée. Ainsi et de manière avantageuse, l'enzyme utilisée dans le cadre de l'invention est la phosphatase alcaline ou AP (EC 3.1.3.1.), capable d'hydrolyser des groupements phosphates. Il peut aussi bien s'agir d'une enzyme purifiée que d'une enzyme 30 recombinante.
De manière connue (Sommer, 1954, Am. I Med. Technol. 20(4) :244-53) et comme illustré à la figure 1, cette enzyme est capable de transformer en milieux aqueux une solution incolore de p (ou 4)-nitrophényl phosphate (substrat) en une solution jaune de p-nitrophénol (produit de la réaction) qui absorbe à 405nm. Ainsi, l'absorbance à 405 nm est directement corrélée à l'activité de la phosphatase alcaline. A noter que pour cette enzyme, l'activité enzymatique en fonction du temps suit une courbe Michaélienne, caractérisée par une phase linéaire au cours de laquelle il existe une relation linéaire entre l'activité enzymatique et le temps, suivie d'une phase plateau correspondant à un épuisement du substrat.
A noter que des préparations enzymatiques, ainsi que des solutions de substrat, prêtes à l'emploi, sont disponibles commercialement, par exemple auprès de Sigma-Aldrich. La quantité de phosphatase alcaline est généralement exprimée en unités (U), une unité étant définie comme capable d'hydrolyser 1 iamole de 4-nitrophényl phosphate par minute à pH 9,8 et à 37°C. Alternativement, tout autre substrat hydrolysable par la phosphatase alcaline et générant une réaction colorée (apparition ou disparition d'une couleur) peut être mis en oeuvre. Le phénylphosphate peut par exemple être utilisé comme substrat alternatif. En effet, le phénol libéré par hydrolyse du substrat forme ensuite, en présence d'amino-4-antipyrine et de ferricyanure de potassium, un complexe rouge dont l'absorbance est mesurée à 510 nm. Il existe également d'autres systèmes de substrat tels que : - le Nitroblue Tetrazolium (NBT) à utiliser avec le 5-Bromo-4-Chloro-3- Indolyl Phosphate (BCIP) ; ou - le 4-Chloro-2-methylbenzenediazonium à utiliser avec le 3- Hydroxy-2- naphthoic acid 2,4-dimethylanilide phosphate. D'autres enzymes, dont l'activité peut être suivie facilement peuvent être envisagées, comme par exemple la béta-galactosidase. Des enzymes à activité réductase peuvent également être mises en oeuvre, leur activité pouvant être aisément suivie grâce au test MTT impliquant un sel de tétrazolium comme réactif, susceptible d'être réduit en formazan de couleur rouge détectable à 550 nm. Selon un autre mode de réalisation, l'enzyme mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention est une enzyme dont l'activité peut être mesurée par fluorimétrie. En d'autres termes, le substrat de cette enzyme et le produit généré par réaction de l'enzyme sur ce substrat ont une fluorescence différentielle à une longueur d'onde donnée. Cette variation de la fluorescence peut être suivie à l'aide d'un fluorimètre.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé d'évaluation du pouvoir d'un composé ou d'un extrait à protéger les protéines contre un stress oxydant, comprenant : - l'incubation du composé ou de l'extrait avec : o une enzyme sensible au stress oxydant, dont l'activité peut être mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie ; o un substrat de l'enzyme ; en présence du stress oxydant - la mesure de l'activité enzymatique par colorimétrie ou fluorimétrie.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé comprend les étapes suivantes : a/ l'incubation du composé ou de l'extrait avec : - une enzyme sensible au stress oxydant, dont l'activité peut être mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie ; - le stress oxydant; b/ l'ajout du substrat de l'enzyme pour la mesure de l'activité enzymatique par colorimétrie ou fluorimétrie. Dans le cadre de l'invention, on entend par « composé », une molécule isolée quelle que soit sa nature. Il peut par exemple s'agir d'un composé obtenu par synthèse chimique ou d'un composé purifié à partir d'une source naturelle, notamment animale ou végétale. Dans ce cas, l'éventuel pouvoir de protection des protéines, mis en évidence par le procédé selon l'invention, peut être directement attribué au composé testé. On entend par « extrait » un mélange de substances ou composés dont la nature et les proportions ne sont pas nécessairement déterminées. Il peut par exemple s'agir d'un extrait bactérien ou d'un extrait de plante. Comme déjà mentionné, on entend par « pouvoir à protéger les protéines contre un stress oxydant » à la fois la capacité à piéger différents types de radicaux préjudiciables aux protéines mais également la capacité de protéger physiquement les protéines par un effet « bouclier » ou stabilisateur direct. Il s'agit donc d'incuber l'enzyme en présence de son substrat mais également : - d'un stress oxydant affectant l'activité de ladite enzyme ; - un composé ou un extrait dont la capacité à protéger l'enzyme contre ce stress oxydant est testée. Dans un mode de réalisation particulier, dans une première étape et avant l'ajout du substrat de l'enzyme, il s'agit donc d'incuber l'enzyme en présence : - d'un stress oxydant affectant l'activité de ladite enzyme ; - d'un composé ou un extrait dont la capacité à protéger l'enzyme contre ce stress oxydant est testée. En l'absence de ces deux éléments (stress oxydant et composé ou extrait), le procédé consiste donc à mesurer (si la mesure est ponctuelle) ou à suivre (dans le cas où une cinétique est réalisée) l'activité de l'enzyme native, pleinement fonctionnelle. L'ajout du composé ou de l'extrait seul peut avoir un impact sur l'activité de l'enzyme et affecter la mesure ou le suivi. Ces conditions (enzyme + composé ou extrait + substrat) correspondent donc au témoin positif de l'activité enzymatique. Ainsi, en présence de certains composés ou extraits, il peut être observé une légère augmentation de l'activité enzymatique, possiblement stabilisée par le composé ou le substrat, ou une diminution par inhibition ou dégradation de l'enzyme. L'ajout du stress oxydant a pour effet de diminuer l'activité enzymatique. Dans le cadre de l'invention, le stress oxydant peut avoir plusieurs sources, indépendantes ou combinés : l'ajout d'un ou plusieurs radicaux libres, voire de précurseurs capables de générer ces radicaux. En particulier, il peut s'agir des composés suivants : radical superoxyde 02.- ; le peroxyde d'hydrogène H202 ; l'ion hypochlorite C10- ; le radical hydroxyle OH- ; les radicaux peroxyde (ROO-) ou alkoxyle (RO-) où R est une chaîne carbonée ; les radicaux dérivés d'acides gras insaturés ; le peroxynitrite ONOO- ; le monoxyde d'azote NO- ; le dioxygène singulet 102. Selon un mode de réalisation particulier, du peroxyde d'hydrogène H202 est combiné avec du fer ionique, avantageusement sous forme d'ions ferreux Fe2+, pour générer un radical hydroxyle OH- + OH- selon la réaction de Fenton. Dans un autre mode de réalisation particulier, le rose bengal est utilisé comme agent inducteur de singulet de l'oxygène. l'exposition à des rayonnements ultraviolets (UV) ou visibles. Il peut par exemple s'agir d'UV-A (400-315nm), d'UV-B (315-280nm), ou d'UV-C (280-153nm), éventuellement en combinaison. De manière avantageuse, les radicaux libres sont ajoutés à une concentration et pendant une durée adaptées pour inactiver significativement l'enzyme en présence. De même, l'intensité et la durée de l'irradiation sont choisies pour inactiver de manière appropriée l'enzyme. Dans le cadre de l'invention, on considère des conditions appropriées lorsqu'elles permettent une inactivation de l'enzyme d'au moins 50%, voire 60%, voire 70%, voire 80%, avantageusement de l'ordre de 90%. Le niveau d'inactivation de l'enzyme est aisément déterminé par mesure de l'activité enzymatique.
Les conditions nécessaires pour arriver au niveau d'inactivation souhaitée de l'enzyme sont déterminées au cas par cas par l'homme du métier.
Ainsi et à titre d'illustration, en rapport avec la quantité de phosphatase alcaline mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention, une concentration en radical hydroxyl comprise entre 1 et 100 nM dans le milieu réactionnel est adaptée.
Avantageusement, l'agent oxydant se présente sous forme d'une solution, encore plus avantageusement préparée dans le tampon adapté à l'enzyme en présence. Le volume de cette solution peut représenter de 1/10 à 1/2 du volume réactionnel total, par exemple 1/3. Le temps de la réaction d'oxydation correspond avantageusement au temps de pré-incubation (avant l'ajout du substrat), typiquement compris entre 5 et 30 minutes, par exemple égal à 15 minutes. Dans le cas d'une exposition aux UV, notamment en relation avec les UV-C, la dose est avantageusement supérieure à 0,1 J/cm2, voire 0,5 J/cm2, encore plus avantageusement de l'ordre de 2J/cm2. Cette dose est ajustée notamment en fonction de la puissance de la lampe délivrant les radiations, la distance entre le milieu réactionnel et la lampe, et le temps d'exposition. De manière adaptée, le temps d'exposition correspond au temps de pré-incubation (avant l'ajout du substrat), avantageusement compris entre 1 et 2 heures.
En l'absence du composé ou de l'extrait protecteur, l'ajout du stress oxydant entraîne une chute de l'activité enzymatique et sert de témoin pour mesurer l'effet délétère du stress oxydant en présence sur l'enzyme (témoin négatif). Il s'agit donc de comparer l'activité enzymatique obtenue dans des conditions oxydantes données, en l'absence ou en présence du composé ou de l'extrait à tester. Dans le cas où le composé ou l'extrait n'a aucun effet protecteur sur les protéines, une activité similaire à celle obtenue en l'absence de ce composé ou extrait est observée. Au contraire, dans le cas où le composé ou l'extrait a un effet protecteur sur les protéines, une activité comprise entre celle du témoin positif et celle du témoin négatif, voire égale à celle du témoin positif est observée, ce qui permet de quantifier l'efficacité du composé ou de l'extrait en présence.
En pratique et selon un mode de réalisation privilégié, lors d'une première étape du procédé selon l'invention, l'enzyme et le composé ou extrait à tester sont mélangés puis de manière simultanée ou postérieure, le stress oxydant est appliqué. Le stress oxydant est appliqué dans des conditions permettant l'endommagement de l'enzyme, comme déterminé en l'absence dudit composé ou extrait. En d'autres termes, il s'agit d'une étape de préincubation au cours de laquelle l'enzyme est éventuellement endommagée. Typiquement, l'enzyme est présente dans le milieu réactionnel dans une quantité adaptée pour pouvoir suivre son activité pendant quelques minutes. De manière avantageuse, la quantité d'enzyme est ajustée pour qu'au temps de mesure choisi, avantageusement compris entre 5 minutes et 20 minutes, il existe une relation linéaire entre l'activité enzymatique et le temps. Ainsi et dans le cas particulier de la phosphatase alcaline, la quantité d'enzyme dans le milieu réactionnel est avantageusement comprise entre 0,005 et 0,05 unité (U). Comme déjà dit, une unité (U) est définie comme la quantité permettant l'hydrolyse d'l [tmole de 4-nitrophényl phosphate par minute à pH 9,8 et à 37°C. Selon un autre mode de réalisation avantageux, cette quantité d'enzyme est apportée dans un volume représentant de 1/20 à 1/2 du volume final du mélange réactionnel, par exemple 1/10.
Le milieu réactionnel est avantageusement aqueux. Si besoin, les réactifs sont avantageusement dilués dans du tampon adapté à l'enzyme en présence. Dans le cas de la phosphatase alcaline, il s'agit avantageusement d'un tampon à pH 8, tel qu'un tampon à base de Tris (« Tris Buffer Saline » ou TB S), par exemple à 0,05M. Le pH du milieu réactionnel est avantageusement proche du pH optimum de l'enzyme en présence, par exemple compris entre 7,5 et 9. Si nécessaire et dans le cas de la phosphatas alcaline, le pH du milieu réactionnel peut être ajusté à l'aide du tampon Tris à pH8. 30 La température du milieu réactionnel est typiquement comprise entre 25°C et 40°C, avantageusement égale à 37°C. Plus généralement, les conditions de température correspondent avantageusement aux conditions optimales pour l'activité de l'enzyme en présence. Le temps de préincubation peut être compris entre quelques minutes et quelques heures, avantageusement compris entre 10 et 30 minutes, par exemple 15 minutes dans le cas de l'ajout d'un agent oxydant. Dans le cas d'une irradiation, ce temps peut être compris entre 1 et 2 heures. Les témoins positifs et négatifs subissent une préincubation dans les mêmes 10 conditions. La réaction enzymatique à proprement parler est avantageusement déclenchée par ajout du substrat de l'enzyme en présence. De manière adaptée, le substrat est avantageusement du p-nitrophényl-phosphate. La quantité de substrat ajouté dans le 15 milieu réactionnel est avantageusement telle qu'elle n'est pas limitante pour l'activité enzymatique. En d'autres termes, la quantité de substrat est avantageusement en excès par rapport à la quantité d'enzyme en présence, au moins au temps de mesure choisi, avantageusement compris entre 5 minutes et 20 minutes. La quantité nécessaire de substrat est aisément déterminée par l'homme du métier au cas par cas 20 par suivi de l'activité enzymatique, notamment en fonction de l'enzyme en présence et de sa quantité. Selon un mode de réalisation privilégiée, le substrat subit une faible dilution dans le milieu réactionnel. Ainsi, le volume du substrat peut représenter jusqu'à 1/2 du volume réactionnel total. 25 La réaction enzymatique à proprement parler, par exemple la conversion du p- nitrophényl-phosphate en p-nitrophénol, peut durer de 1 minute à 1 heure, avantageusement entre 1 et 30 minutes. Le suivi de la réaction enzymatique peut être réalisé de manière ponctuelle, par exemple après 5 minutes, ou par cinétique, par exemple pendant 20 minutes. Comme déjà dit, la réaction enzymatique se trouve 30 alors avantageusement dans sa phase linéaire. Cette étape est avantageusement réalisée sous agitation.
Selon un autre mode de réalisation, tous les réactifs sont ajoutés simultanément lors de cette étape d'incubation. Dans ce cas de figure, l'endommagement de l'enzyme par le stress oxydant et la conversion du substrat par l'enzyme ont lieu en même temps. La mesure de l'activité enzymatique est avantageusement réalisée par détection colorimétrique à une longueur d'onde adaptée au substrat en présence. De manière adaptée, une telle mesure est réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre ou d'un lecteur à plaques. Dans le cas particulier du suivi de la conversion du p-nitrophényl- phosphate par la phosphatase alcaline, cette mesure est avantageusement réalisée à 405 nm. En d'autres termes, l'activité enzymatique est proportionnelle à l'absorbance à 405 nm.
Comme déjà dit, la mesure peut être réalisée de manière ponctuelle, c'est-à-dire à un temps donné après l'ajout du substrat, temps pouvant aller de 1 minute à 1 heure, avantageusement entre 1 et 30 minutes, par exemple 5 minutes. Alternativement, une cinétique est réalisée, c'est-à-dire que l'activité enzymatique est suivie dans le temps, avec une mesure faite à intervalles réguliers par exemple, toutes les minutes ou toutes les 5 minutes, et ce sur une durée totale pouvant aller de 1 minute à 1 heure, avantageusement entre 15 et 30 minutes, par exemple 20 minutes. Cette seconde option permet de vérifier que les conditions mises en oeuvre n'aboutissent pas à une saturation du système de détection.
Dans le cas d'un substrat fluorescent, la mesure de l'activité enzymatique est réalisée par fluorimétrie, à l'aide d'un fluorimètre. De manière à mieux maîtriser le pouvoir protecteur du composé ou de l'extrait en présence, le procédé selon l'invention est avantageusement mis en oeuvre avec des quantités variables de composé ou d'extrait. En rapport avec la phosphatase alcaline, il a été montré que l'effet de la concentration du composé ou de l'extrait sur la protection de l'enzyme suit une courbe logarithmique.
De manière appropriée, une gamme de dilution est réalisée avec le composé ou l'extrait, avantageusement à l'aide d'un tampon adapté à l'enzyme en présence, par exemple un tampon Tris à pH 8 dans le cas de la phosphatase alcaline. De manière avantageuse, le composé ou l'extrait représente de l'ordre de 1/10 du volume réactionnel. Il est bien sûr possible de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention pour tester le pouvoir protecteur de nouveaux composés ou extraits. De manière complémentaire, ce procédé peut être mis en oeuvre avec un composé antioxydant connu, qui peut alors servir de référence et permet de normaliser ledit procédé. Ainsi, le pouvoir protecteur de tout composé ou extrait pourra être exprimé en équivalent par rapport à cet agent antioxydant de référence. De manière adaptée, l'agent antioxydant de référence peut être le Trolox ou 6-Hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylic acid. Ainsi et dans le cadre du procédé selon l'invention, il a été montré que le Trolox à une concentration comprise entre 10 et 200 1.1M restaurait de 10 à 70% de l'activité de la phosphatase alcaline dans les conditions d'oxydation testées. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un kit permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Dans une version, un tel kit contient avantageusement : - l'enzyme, avantageusement la phosphatase alcaline ; - un substrat de l'enzyme, avantageusement du p-Nitrophényl-phosphate ; - au moins une source de stress oxydant. L'enzyme peut être sous forme déshydratée ou se présenter sous forme de solution. Il s'agit avantageusement d'une solution aqueuse. La solution peut être sous forme concentrée, à diluer extemporanément dans de l'eau ou du tampon, ou être à une concentration adaptée à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Ainsi et selon un mode de réalisation particulier, le kit comprend également un tampon (sous forme de poudre ou de solution) adapté à l'enzyme en présence, par exemple du tampon Tris pour la phosphatase alcaline, avantageusement à pH 8 et à 0,05M. Ce tampon est destiné à la dilution des différents réactifs et sert de base au milieu réactionnel. De manière avantageuse, le substrat est également sous forme de solution, encore plus avantageusement une solution aqueuse. La solution peut être sous forme concentrée, à diluer extemporanément dans de l'eau ou du tampon, ou être à une concentration adaptée à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. La source de stress oxydant peut être comme décrite ci-dessus, par exemple une solution de peroxyde d'hydrogène et une solution d'ions ferreux. Avantageusement ces solutions sont fournies sous forme concentrée puis diluées et mélangées de manière extemporanée à l'aide du tampon. Un kit selon l'invention peut également inclure un agent inducteur de singulet de l'oxygène, tel que le rose bengal.
Selon un autre mode de réalisation, le kit selon l'invention peut contenir une lampe à UV, permettant la délivrance d'une dose d'UV variable, avantageusement comprise entre 0,1 et 3,5 J/cm2, et de longueur d'onde variable UV (UV-A et/ou UV-B- et/ou UV-C), ou une lampe à diodes électroluminescentes pour la lumière visible.
Bien évidemment, différentes sources de stress oxydant peuvent être fournies dans un même kit, permettant de définir de manière précise et complète le profil de protection du composé ou de l'extrait à tester. Un kit selon l'invention permet notamment : - de tester un grand nombre de composés ou d'extraits différents ; et/ou - de tester l'effet protecteur d'un composé ou d'un extrait vis-à-vis de différents stress oxydants ; et/ou - de déterminer l'effet dose-dépendant du composé ou de l'extrait testé. Par conséquent et pour ces différents criblages, le kit comprend avantageusement une ou plusieurs plaques à 96 puits, permettant de mener en parallèle un grand nombre de tests. De telles plaques, généralement réalisées en plastique transparent, sont commercialement disponibles sous le nom par exemple de MicroWellTM. Elles peuvent comprendre des puits à fond plat, rond ou conique, ayant un volume de 200p1 à 500p1 (typiquement 3041) et pouvant accueillir un milieu réactionnel de volume compris entre 1041 et 250 pl.
Ces plaques peuvent être lues à l'aide d'un lecteur de plaques qui réalise une lecture automatique et enregistre les résultats obtenus, permettant ainsi leur exploitation aisée. Un filtre adapté à la longueur d'ondes d'intérêt, par exemple 405 nm, équipe le lecteur de plaques.
Dans un kit selon l'invention, il peut également être intéressant d'avoir un certain nombre de témoins, notamment un agent anti-oxydant dit de référence tel que le Trolox ou 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, avantageusement en solution. Ce témoin peut également être fournie sous forme d'une solution mère à diluer extemporanément ou à une concentration adaptée pour la protection de l'enzyme en présence. Alternativement ou en complément, d'autres molécules protectrices de référence peuvent être fournis. De manière classique, le kit selon l'invention peut également comprendre : - des informations relatives aux réactifs fournis dans le kit ; - des instructions permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, notamment relatives aux éventuelles dilutions des réactifs, aux quantités des différents réactifs à introduire, au temps d'incubation, à la température d'incubation, aux étalonnages et contrôles à réaliser, ....30 Exemples de réalisation La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent, ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non limitatif, à l'appui des figures annexées. La figure 1 représente le principe du test selon l'invention. La figure 2 représente l'activité de la phosphatase alcaline (AP) pour des doses croissantes de radicaux hydroxyles (OH-). La figure 3 représente l'activité de la phosphatase alcaline (AP) pour des doses croissantes d'UV. La figure 4 représente une cinétique permettant d'évaluer l'effet protecteur d'une molécule ou d'un extrait sur l'activité de la phosphatase alcaline (AP).
La figure 5 illustre l'effet dose du Trolox sur la protection de l'activité de la phosphatase alcaline (AP). 1/ Sensibilité de la phosphatase alcaline aux radicaux hydroxyles : Le stress oxydant testé est celui causé par les radicaux hydroxyles OH-. En pratique, le système oxydant utilisé est le peroxyde d'hydrogène (H202) qui génère des radicaux hydroxyles en présence d'ions ferreux Fe2+ par la réaction de Fenton (Fenton, 1894, 1 Chem. Soc., Trans., 65 :899-910). Ces radicaux sont utilisés comme modèle car ils ont été décrits par Cabiscol et al. (Int. Microbiol., 3(1) :3-8) comme étant les plus réactifs et les plus nocifs vis-à-vis des protéines, conduisant à leur carbonylation et leur inactivation. Les résultats sont représentés à la figure 2. Il apparaît que l'activité de la phosphatase alcaline est sensible à la présence des radicaux hydroxyles. Plus précisément, il existe une relation linéaire entre la concentration en radicaux hydroxyles et la perte d'activité de l'enzyme.
Comme révélé par la figure 2, dans les conditions de l'expérience, une inactivation significative de la phosphatase alcaline (au moins égale à 50%, voire égale à 90%) est observée pour une concentration en radical hydroxyl au moins égale à 30mM, voire égale à 55mM. 2/ Sensibilité de la phosphatase alcaline aux irradiations UV-C : De manière connue, l'irradiation d'une protéine en solution par les ultraviolets peut également mener à son inactivation.
La phosphatase alcaline a été soumise à une irradiation UV à 254 nm correspondant aux UV-C. Sous agitation constante, différentes doses d'UV, allant de 0J/cm2 à 3,5J/cm2 ont été appliquées sur un milieu réactionnel et dans des conditions similaires à ceux mentionnés ci-dessus. A noter que le volume occupé par l'agent oxydant est ici remplacé par du tampon. En pratique, il été utilisé une lampe d'une puissance égale à 0,0365J/cm2/min. Ainsi, le temps d'exposition a varié de 0 à 2 heures environ. Comme montré à la figure 3, la phosphatase alcaline perd progressivement son activité. Plus précisément, on observe un effet-dose exponentiel. Idéalement, on se place dans les conditions d'irradiation permettant d'inactiver l'enzyme à hauteur de 90%, ce qui correspond à une dose d'environ 2J/cm2 dans les conditions expérimentales testées. 3/ Test du pouvoir protecteur d'une molécule ou d'un extrait sur la phosphatase alcaline : Le test mis en oeuvre est celui schématise à la figure 1.
Pour tester la capacité d'un composé ou d'un extrait à protéger la phosphatase alcaline, il suffit donc d'ajouter ledit composé ou extrait, avant l'application du stress oxydant. Après incubation, le substrat de l'enzyme est ajouté et la cinétique de la réaction enzymatique est suivie, typiquement pendant environ 20 minutes (Figure 4). L'absorbance à 405 nm est liée à l'apparition du p-nitrophénol, résultant de l'action de la phosphatase alcaline sur son substrat, et est donc directement corrélée à l'activité enzymatique. La quantité d'enzyme, en relation avec la quantité de substrat qui doit être en excès dans la réaction, est choisie de sorte qu'au temps de mesure (20 minutes), il y a une corrélation linéaire entre l'activité enzymatique et le temps de réaction.
Un contrôle positif de l'activité enzymatique consiste à mettre en oeuvre le même procédé en l'absence de stress oxydant, alors que le contrôle négatif correspond au suivi de l'activité de l'enzyme incubée en présence du stress oxydant mais en l'absence du composé ou de l'extrait testé. Afin de pouvoir comparer le pouvoir protecteur d'un composé ou d'un extrait avec son potentiel antioxydant total (le plus souvent exprimé en équivalent Trolox via les tests ABTS ou ORAC), une concentration connue ou une gamme de Trolox peut être utilisée comme standard. 4/ Effet dose du pouvoir protecteur d'une molécule ou d'un extrait sur la protection de la phosphatase alcaline : A titre d'exemple, le Trolox a été testé comme composé protecteur d'intérêt. Comme 25 illustré à la figure 5, l'effet de la concentration sur la protection de l'enzyme suit une courbe logarithmique, ce qui permet de tester une gamme plus large de concentrations des composés ou extraits d'intérêt. 20 5/ Kit et protocole pour le criblage à haut débit : Réactifs : Tampon : poudre de « Tris Buffered Saline » (Sigma ; Référence produit : T6664- 10PAK) ; Enzyme : Phosphatase alcaline 10KU à 125U/µL dans une solution de glycérol tamponnée (Sigma ; Référence produit : P0114) ; Agent oxydant : 1/ Peroxyde d'hydrogène à 30% ou 9M (Sigma ; Référence produit : H1009-5ML) : solution B1 ; 2/ Sulfate de fer II heptahydrate (Fe504, 7H20) 9M (Fluka ; Référence produit : 44970) : solution B2 ; Substrat : solution de 4-nitrophényl phosphate (« Alkaline Phosphatase yellow substrate » ; Sigma ; Référence produit : P7998-100ML).
Kit : - Plaque 96 puits ; - Tampon : 20 ml d'une solution TBS 0,05M à pH 8 ; - Solution A : 10 1.1.1 de la solution mère diluée au 1/1000 (1,25U soit 0,125U/pL) dans du tampon ; - 100 1.1.1 de solution B1 et 100 1.1.1 de solution B2 ou solution B correspondant au mélange des solutions B1 et B2 à une dilution adaptée dans du tampon (par exemple 3 ml de solution B à 90 mM, obtenue à partir de 30 1.1.1 de solution B1 + 30111 de solution B2 soit une dilution au 1/100) ; - Solution C : 5 ml de la solution commerciale. Protocole : - Diluer la solution A dans du tampon à une dilution adaptée ; - déposer, dans chaque puits, 10 11.1 de la solution A diluée de sorte à avoir une quantité d'enzyme comprise entre 0,005 et 0,05 U; - Ajouter 10 11.1 de l'extrait à tester, éventuellement dilué dans du tampon, dans chaque puits. Les différents puits peuvent servir à tester une gamme de dilution. Le puits dans lequel 10 Ill de tampon sont ajoutés sert de témoin négatif. Dans un puits, un agent antioxydant de référence tel que le Trolox peut être ajouté à la place de l'extrait testé, de manière à évaluer le pouvoir protecteur de l'extrait testé ; - Ajouter 30 Ill de la solution B dans chaque puits. La concentration de la solution B est ajustée pour obtenir une inactivation d'au moins 50%, voire 90% de la quantité d'enzyme en présence. La concentration finale de l'agent oxydant correspondant à 30% de la concentration de la solution B. Le puits dans lequel 30 Ill de tampon sont ajoutés sert de témoin positif ; - Incuber 15 minutes à 37°C sans agitation ; - Ajouter 50 Ill de la solution C. Le volume réactionnel est donc égal à 100 ûl ; - Placer la plaque à 37°C sous agitation ; - Lire l'absorbance à 405 nm pendant 20 minutes (cinétique) ou après 5 minutes de réaction (ponctuelle).
Comme il ressort de ce qui précède, l'originalité du procédé et du kit selon l'invention réside dans leur capacité à déterminer le potentiel protecteur des protéines de n'importe quelle substance. Les tests mesurant le potentiel antioxydant, tels que les tests ABTS et ORAC, ne donnent qu'une valeur chimique du potentiel antioxydant mais ne tiennent pas compte des particularités biochimiques des protéines. Les données obtenues à l'aide du procédé et du kit selon l'invention sont donc complémentaires des mesures existantes. En outre, les tests selon l'invention montrent une très grande robustesse et reproductibilité. Le calcul du Z-factor pour ces tests donne des valeurs supérieures à 0.8, ce qui en fait d'excellents tests de criblage (« screening ») à haut-débit. Ces tests sont en outre rapides et requièrent un matériel commun et peu coûteux. Ils permettent donc le screening rapide d'un grand nombre de molécules. Les données obtenues pouvant être systématiquement normalisées par le contrôle positif, des variations sur les quantités d'oxydants ou de protéines utilisées sont sans conséquence sur les résultats finaux.30
Claims (5)
- REVENDICATIONS1/ Procédé d'évaluation du pouvoir d'un composé ou d'un extrait à protéger les protéines contre un stress oxydant, comprenant : - l'incubation du composé ou de l'extrait avec : o une enzyme sensible au stress oxydant, dont l'activité peut être mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie ; o un substrat de l'enzyme ; en présence du stress oxydant - la mesure de l'activité enzymatique par colorimétrie ou fluorimétrie.
- 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a/ l'incubation du composé ou de l'extrait avec : - une enzyme sensible au stress oxydant, dont l'activité peut être mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie ; - le stress oxydant; b/ l'ajout du substrat de l'enzyme pour la mesure de l'activité enzymatique par colorimétrie ou fluorimétrie.
- 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme est la phosphatase alcaline (AP), le substrat étant avantageusement le p-nitrophénylphosphate.
- 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le stress oxydant est causé par l'ajout de radicaux libres, avantageusement des radicaux libres générés par le peroxyde d'hydrogène et les ions ferreux.
- 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le stress oxydant est causé par une exposition aux radiations lumineuses, par exemple aux UV-C.6/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pouvoir d'un composé ou d'un extrait est évalué par comparaison avec l'activité enzymatique mesurée en l'absence du composé ou de l'extrait. 7/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pouvoir d'un composé ou d'un extrait est évalué par comparaison avec l'activité enzymatique mesurée en l'absence du stress oxydant. 8/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pouvoir d'un composé ou d'un extrait est évalué par comparaison avec l'activité enzymatique mesurée en présence d'un agent anti-oxydant de référence, tel que le Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid). 9/ Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 8 comprenant : - une enzyme sensible au stress oxydant, dont l'activité peut être mesurée par colorimétrie ou fluorimétrie ; - un substrat de ladite enzyme ; - une source de stress oxydant pour cette enzyme. 10/ Kit selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comprend en outre un agent anti-oxydant de référence, tel que le Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman2-carboxylic acid). 11/ Kit selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il comprend une plaque à 96 puits. 12/ Kit selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend un tampon adapté à l'enzyme, par exemple un tampon Tris. 13/ Kit selon l'une des revendications 9 à 12 caractérisé en ce qu'il comprend des instructions d'utilisation.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| FR3117339A1 (fr) | 2020-12-16 | 2022-06-17 | Naos Institute Of Life Science | Utilisation des bactériorubérines et leurs dérivés glycosylés pour prévenir et traiter les maladies impliquant une dérégulation de l’agrégation des protéines, comme les maladies neurodégénératives |
-
2013
- 2013-02-26 FR FR1351697A patent/FR3002544B1/fr active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FRANCESCA BERTOLINI ET AL: "Novel screening assay for antioxidant protection against peroxyl radical-induced loss of protein function", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 96, no. 11, 1 November 2007 (2007-11-01), pages 2931 - 2944, XP055065724, ISSN: 0022-3549, DOI: 10.1002/jps.20881 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3117339A1 (fr) | 2020-12-16 | 2022-06-17 | Naos Institute Of Life Science | Utilisation des bactériorubérines et leurs dérivés glycosylés pour prévenir et traiter les maladies impliquant une dérégulation de l’agrégation des protéines, comme les maladies neurodégénératives |
| WO2022129407A1 (fr) | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Naos Institute Of Life Science | Utilisation des bactériorubérines et leurs dérivés glycosylés pour prévenir et traiter les maladies impliquant une dérégulation de l'agrégation des protéines, comme les maladies neurodégénératives |
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