FR2990699A1 - Cassettes d'expression procaryotes regulees par le stress - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à des cassettes d'expression procaryotes comprenant un promoteur régulé par le stress, le promoteur de l'opéron GroESL de Lactococcus lactis. Ces cassettes peuvent être utilisées pour l'expression de gènes d'intérêt dans des bactéries à gram-positif , et en particulier pour produire et libérer une protéine d'intérêt lorsque les bactéries sont administrées à un individu.

Description

L'invention concerne la production de protéines hétérologues chez des bactéries à Gram-positif, notamment des bactéries lactiques. A côté de leurs usages traditionnels dans 5 l'industrie agro-alimentaire, qui ont prouvé leur innocuité, les bactéries lactiques, notamment les lactocoques et lactobacilles, sont actuellement de plus en plus utilisées en tant que cellules hôtes pour la production de protéines hétérologues d'intérêt. Des 10 bactéries lactiques -recombinantes servent de vecteurs vivants pour délivrer par voie mucosale des molécules d'intérêt pour la santé (pour revues : Daniel et al., Trends Biotechnol., 29(10), 409-508, 2011 ; et BermùdezHumaràn et al., Microb. Cell Fact., 10(Suppl 1):S4, 15 2011). Parmi les bactéries lactiques, Lactococcus lactis en particulier est une bactérie non invasive et non pathogène, largement utilisée dans la fabrication de produits laitiers, en particulier de fromages. Elle 20 résiste jusqu'à 90% au passage gastrique chez l'homme et chez la souris. L. lactis est la bactérie lactique modèle et fait partie des bactéries les mieux caractérisées avec Escherichia cou i et Bacillus subtilis. De ce fait, L. lactis est considérée comme une excellente candidate pour 25 l'expression de protéines d'intérêt pour la santé (antigènes, cytokines, hormones, etc.) au niveau des muqueuses. Steidler et al. (Science, 289, 1352-1355, 2000) décrivent par exemple l'utilisation d'une souche de 30 L. lactis recombinante exprimant la cytokine interleukine-10 (IL-10) sous contrôle du promoteur constitutif P1 de L. lactis. La même équipe a par la suite cherché à identifier des promoteurs constitutifs forts pouvant être 35 utilisés pour exprimer des protéines d'intérêt thérapeutique dans des bactéries du genre Lactococcus (Demande POT W02008/084115), ces promoteurs étant définis comme étant plus forts que le promoteur du gène de la thymidylate synthase (thyA) de L. lactis. 53 promoteurs candidats répondant potentiellement à cette définition 5 ont été identifiés par analyses transcriptomique et protéomique. Parmi ceux-ci, 17 ont pu être sous-clonés pour tester leur capacité à contrôler l'expression d'une protéine hétérologue : il s'agit des promoteurs des gènes rpoB, dpsA, glnA, glnR, pepV, atpD, pg*, fabF, fabG, 10 rpoA, pepO, rpsD, sodA, luxS, rpsK, rpIL, et hIIA (ainsi nommés chez L. lactis MG1363). 4 de ces promoteurs ont effectivement permis d'atteindre le niveau d'expression espéré : les promoteurs des gènes dpsA, pepV, sodA, et hIIA. 15 Les promoteurs décrits dans les documents cités ci-dessus sont tous des promoteurs constitutifs. Dans certains cas, il est préférable d'utiliser des promoteurs inductibles, permettant de déclencher ou d'arrêter l'expression au moment souhaité. En effet, 20 certaines protéines, telles que les cytokines, peuvent s'accumuler au sein du cytoplasme de la bactérie et dégrader la cellule hôte. Des systèmes d'expression intégrant un promoteur inductible permettent de mieux contrôler l'expression de la protéine hétérologue et de 25 prévenir les effets négatifs qui pourraient résulter de sa surproduction. Bien que l'on connaisse chez les bactéries lactiques et chez L. lactis en particulier, un très grand nombre de gènes dont l'expression est régulée par divers 30 facteurs, on ne dispose à l'heure actuelle que d'un choix restreint de promoteurs inductibles utilisables en pratique pour la construction de cassettes d'expression de gènes d'intérêt (pour revues : De Vos, Curr. Op. Microbiol., 2, 289-295, 1999 ; Morello et al., J. Moi. 35 Microbiol. Biotechnol., 14(1-3):48-58, 2008 ; Nouaille et al., Genet. Mol. Res., 2(1):102-111, 2003). En effet, cette utilisation demande non seulement que les promoteurs concernés soient inductibles, mais encore qu'il existe un différentiel d'expression suffisant entre les différents états d'induction ; idéalement, l'expression doit atteindre un niveau élevé en conditions d'induction, et être absente ou faible en conditions de non-induction. Le système NICE (« NIsin Controlled Expression system ») (Kuipers et al., J. of Biol. Chem., 270(45):27299-27304, 1995 ; de Ruyter et al., Appl. Environ. Microbiol., 62:3662-3667, 1996 ; Kuipers et al., J. of Biotechnol., 64(1):15-21, 1998; Mierau et al., App/ Microbiol Biotechnol., 68(6):705-17, 2005) est aujourd'hui le plus largement utilisé pour exprimer un gène d'intérêt en fonction de la présence ou non dans le milieu extérieur d'une bactériocine, la nisine. Cependant, les inconvénients inhérents à ce système sont, d'une part, la nécessité de la présence de gènes régulateurs de ce système (apportés par des plasmides, ou clonés et intégrés dans le chromosome bactérien), et d'autre part, la contrainte d'une étape constituée par la mise en présence de la bactérie avec la nisine. Dans ce contexte, les Inventeurs ont cherché à mettre en oeuvre un système d'expression inductible convenant pour l'expression de protéines hétérologues d'intérêt au sein de bactéries lactiques destinées à être utilisées comme vecteur thérapeutique ou vaccinal, et ont eu l'idée de rechercher un système d'expression qui serait induit lors de l'administration des bactéries au sujet que l'on souhaite traiter. Ils sont partis de l'hypothèse que cette administration, qui place les bactéries dans des conditions très différentes de leurs conditions de vie habituelles pouvait induire chez celles-ci différents types de stress : il peut s'agir notamment de stress thermique, si la température corporelle du sujet à traiter est suffisamment élevée par rapport à la température optimale de croissance de la bactérie administrée ; en cas d'administration orale, le stress thermique peut être accompagné d'un stress acide lors du passage dans l'estomac (où le pH est d'environ 1,5 à 2), puis d'un stress biliaire au niveau du duodénum. Les Inventeurs ont recherché s'il était possible d'identifier, parmi les promoteurs des nombreux gènes identifiés comme étant induits par un ou plusieurs de ces stress (pour revue cf. par exemple Van de Guchte et al., Antonie van Leeuwenhoek, 82, 187-216, 2002), un promoteur effectivement utilisable en pratique pour contrôler l'expression inductible de protéines hétérologues.

Ils se sont intéressés au promoteur de l'opéron GroESL de Lactococcus lactis. Les protéines GroES et GroEL, présentes dans de nombreuses bactéries, sont des chaperonines et des protéines de réponse au choc thermique ou hsp (pour « heat-shock p.roteins »). L'opéron GroESL de Lactococcus lactis subsp. lactis a été décrit par Kim et al. (Gene, 127(1) :121-126, 1993), qui ont rapporté que sa transcription était inductible par un choc thermique. Arnau et al. (MUcrobiology, 142, 16851691, 1996) ont étudié la cinétique d'induction de la transcription des gènes dnaK, dnaJ et groEL de Lactococcus lactis subsp. cremoris pendant un choc thermique provoqué par une élévation de température, de 30°C (température optimale de croissance de Lactococcus lactis) à 43°C. Ils ont observé un niveau de transcription allant de 10 fois (pour dnaJ et groEL) à 100 fois (pour dnaK) le niveau de base pendant les 15 premières minutes du choc thermique, et diminuant après 20 minutes. Les Inventeurs ont cloné le promoteur de 35 l'opéron GroESL de Lactococcus lactis, et ont testé ses capacités à contrôler l'expression d'une protéine hétérologue et son inductibilité dans des conditions reproduisant celles d'une administration in vivo chez l'homme. Ils ont constaté qu'en conditions, basales (c'est-à-dire en conditions optimales de croissance pour L. lactis), le promoteur PGroESL permettait l'expression d'une protéine hétérologue, à un niveau faible, et qu'une élévation de température à 37°C, bien que plus faible que les températures (supérieures à 40°C) habituellement utilisées pour l'induction d'un stress thermique chez L. lactis, suffisait pour augmenter de 1,3 à 5 fois la quantité de protéine hétérologue produite. La présente invention a donc pour objet une cassette d'expression comprenant : - le promoteur (PGroESL) de Lactococcus lactis, et une séquence nucléotidique hétérologue codant pour un polypeptide d'intérêt, placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.

On définit ici comme : « promoteur PGroESL de L. lactis » un polynucléotide de 82 à 150 pb constituant un promoteur fonctionnel chez L. lactis, et comprenant une séquence nuCléotidique présentant au moins 90%, et par ordre de préférence croissante, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, .au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99%, ou 100%, d'identité avec la séquence suivante : CTTGACTAAATCTGACCATTGAGATAAAATAAGAATATGTTAGCACTCAACTATTAA GAGTGCTAAAAATAAAAAATGGAGG (SEQ ID NO. : 1).

Le promoteur PGroESL contient les éléments de cis-régulation suivants, positionnés à titre d'exemple sur la SEQ ID NO. : 1 : - Un site de liaison pour la protéine régulatrice CtsR, aux positions 1-17, la protéine CtsR 35 étant impliquée dans la régulation de différents gènes intervenant dans la réponse au choc thermique ; - Un élément CIRCE (pour l'anglais « Controlling Inverted Repeat of Chaperone Expression »), aux positions 40-66, qui est une séquence répétée inversée impliquée dans la régulation de l'expression des protéines chaperonnes ; - Une boîte -35, aux positions 41-46 ; - Une boîte -10, aux positions 64-69 ; - Une boîte ACD (ou ACiD) (cf. Madsen et al., Mblec. Microbiol., 56(3), 735-746, 2005), aux positions 10 29-42, impliquée dans la réponse au pH acide ; et - Un site de liaison des ribosomes (RBS, pour l'anglais « Ribosome Binding Site »), aux positions 7882. La séquence SEQ ID NO. : 1, indiquée ici comme 15 séquence de référence, est issue de la souche modèle de Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 (GenBank NC 009004). D'autres promoteurs PGroESL utilisables pour la construction d'une cassette d'expression conforme à 20 l'invention peuvent également être isolés et clonés à partir de n'importe quelle souche de L. lactis, par les techniques classiques du génie génétique.. A titre d'exemples non-limitatifs, on citera : - le promoteur PGroESL de la souche A76 25 (GenBank CP003132) de Lactococcus lactis subsp. cremoris, qui comprend la séquence SEQ ID NO. : 1 ; - le promoteur PGroESL de la souche NZ9000 (GenBank CP002094) de Lactococcus lactis subsp. cremoris, qui comprend la séquence SEQ ID NO. : 1 ; 30 - le promoteur PGroESL de la souche SK11 (GenBank NC 008527) de Lactococcus lactis subsp. cremoris, qui comprend la séquence suivante : CTTGACTAAATCTGACCATTGAGATAAAATAAGAATATGTTAGCACACAACTATTAA GAGTGCTAAAAATAAAAAATGGAGT (SEQ ID NO. : 2) ; 35 - les promoteurs PGroESL des souches IL1403 (GenBank NC 002662) ou CV56 (GenBank CP002365) de Lactococcus lactis subsp. lactis, qui comprennent la séquence : CTTGACTAAATCTGACCATTGAGATAAAATAAGAATATGTTAGCACTCGTTTAATAA GAGTGCTAAAAAATAAAAAATGGAGG (SEQ ID NO. : 3) ; - le promoteur PGroESL de la souche KF147 (GenBank NC 013656) de Lactococcus lactis subsp. lactis, qui comprend la séquence suivante : CTTGACTAAATCTGACCATTGAGATAAAATAAGAATATGTTAGCACTCGTTTAACAA GAGTGCTAAAAAATAAAAAATGGAGG (SEQ ID NO. : 4).

On définit ici comme « séquence nucléotidique hétérologue » toute séquence nucléotidique autre que celle naturellement située chez L. lactis en aval du promoteur PGroESL, et notamment autre que celle codant pour les protéines GroES et GroEL de L. lactis. De préférence, il s'agira d'une séquence qui n'est pas issue de L. lactis. Il peut s'agir de toute séquence codant pour un polypeptide d'intérêt, notamment d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, que l'on souhaite faire exprimer par la bactérie hôte. Ledit polypeptide peut le cas échéant être un polypeptide chimérique, associant des séquences polypeptidiques d'origine diverse. A titre d'exemples non limitatifs, ladite séquence nucléotidique hétérologue peut être : - une séquence nucléotidique codant pour une cytokine, par exemple l'interleukine-10 (IL-10), 1'IL-12, l'IL-2, l'IL-4, le GM-CES (« Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor »), ou le TGF-p, (« Transforming growth factor-beta »); - une séquence nucléotidique codant pour un antigène vaccinal, d'origine virale ou bactérienne, ou d'origine eucaryote, tel qu'un antigène fongique, ou un antigène parasitaire ; l'antigène est par exemple une des protéines E6, E7, ou Li du virus du papillome humain (VPH) de type 16, la protéine VapA de Rhodococcus equi, la protéine L7/L12 de Brucella abortus, ou la protéine Nuc de Staphylococcus aureus ; - une séquence nucléotidique codant pour un inhibiteur de protéase, par exemple l'élafine (ou 5 trappine-2), le SLPI (« Secretory leukocyte p_notease inhibitor »), ou un des inhibiteurs de protéase à sérine (famille des serpines) ; - une séquence nucléotidique codant pour une hormone, par exemple la leptine, l'insuline, l'hormone de 10 croissance, l'IGF-1. (« Insulin-like growth factor »), l'IGF-2, ou le facteur de croissance épidermique (EGF) ; - une séquence nucléotidique codant pour une enzyme d'origine bactérienne ou eucaryote, par exemple une catalase, une superoxyde dismutase, une lipase, une 15 polymérase, une isomérase, ou une ligase. Une cassette d'expression conforme à l'invention peut, le cas échéant, comprendre en outre les éléments nécessaires pour permettre l'adressage de la protéine d'intérêt à la surface cellulaire, ou sa 20 sécrétion dans le milieu extérieur. Dans ce cadre, la cassette d'expression selon l'invention peut comprendre une séquence nucléotidique codant pour un peptide d'adressage extracellulaire placée sous contrôle transcriptionnel du promoteur PGroESL, 25 ladite cassette d'expression permettant le clonage de la séquence nucléotidique hétérologue d'intérêt en fusion traductionnelle avec ledit peptide d'adressage. Le peptide d'adressage peut être par exemple un peptide signal de sécrétion, un domaine transmembranaire, un 30 signal d'ancrage à la paroi, etc. De nombreux peptides d'adressage utilisables dans le cadre de la présente invention sont connus en eux mêmes. A titre d'exemples non limitatifs, on citera le peptide signal de la protéine Exp4 de L. lactis, défini 35 par la séquence : MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEQ ID NO. : 5), ou les peptides identifiés respectivement dans les publications de Poquet et al. (J. Bacteriol., 180, 19041912, 1998), de Le Loir et al. (Appl. Environ.

Alicrobiol., 67, 4119-4127, 2001), et de Ravn et al. (Gene, 242, 347-356, 2000). L'invention concerne aussi un vecteur recombinant comprenant un insert constitué par une cassette d'expression selon l'invention.

Des vecteurs recombinants conformes à l'invention peuvent être obtenus, de façon classique, par insertion d'une cassette d'expression conforme à l'invention dans un vecteur fonctionnel chez L. lactis. De très nombreux vecteurs fonctionnels chez L. 15 lactis sont connus en eux-mêmes. L'homme du métier choisira le vecteur le plus approprié (vecteur intégratif ou extra-chromosomique, vecteur à nombre de copies plus ou moins important) en fonction notamment de la nature de la protéine hétérologue à exprimer, et l'usage 20 particulier à laquelle elle est destinée. L'invention a également pour objet une bactérie de l'espèce Lactococcus lactis, transformée par au moins une cassette d'expression conforme à l'invention. 25 Le cas échéant, il peut s'agir d'une bactérie provenant d'une souche de L. lactis comportant une ou plusieurs modifications de son génome. Il peut s'agir par exemple de modifications visant à améliorer la production et/ou la sécrétion de protéines exprimées dans ladite 30 bactérie, et/ou à éviter leur dégradation. Par exemple, dans le cadre de la production de protéines exportées, on peut utiliser une souche bactérienne dans laquelle l'activité protéasique PrtP et/ou le cas échéant l'activité protéasique HtrA et/ou ClpP sont inactives, 35 telle que celle décrite dans la Demande PCT W000/39309, ou une souche bactérienne surproduisant une protéine permettant de stabiliser les protéines exportées, telle que la protéine N1p4 de Lactococcus lactis, ou un de ses homologues (Poquet et al. 1998, publication précitée), ou encore une souche bactérienne modifiée par ajout d'un gène hétérologue responsable de la sécrétion des protéines, tel que le gène secDF de Bacillus subtilis (Nouaille et al., Appl. Environ. Microbiol., 72(3) :22729, 2006). On peut aussi utiliser une bactérie incluant 10 un gène auxotrophique défectueux, afin de rendre la survie de cette bactérie dépendante de la présence d'un ou plusieurs composés spécifiques. Le gène auxotrophique visé peut être le gène thyA (Demande POT W02011/086172), codant pour la thymidylate synthase, enzyme générant la 15 thymidine monophosphate (dTMP) qui est ensuite phosphorylée en thymidine triphosphate, impliquée dans la synthèse et la réparation de l'ADN, ou le gène air, codant pour l'alanine racémase (Bron et al., Environ. Microbiol., 5663-5370, 2002). Le gène auxotrophique 20 choisi pourra être inactivé par toute méthode connue, et par exemple, par insertion de la séquence nucléotidique hétérologue au niveau du locus de ce gène, dans le chromosome bactérien. Les bactéries transformées conformes à 25 l'invention sont utilisables notamment comme médicaments ou comme vaccins, comme vecteurs d'administration d'une protéine thérapeutique ou vaccinale d'intérêt. Elles peuvent être administrées en particulier par voie mucosale, plus particulièrement par voies intra- 30 nasale, orale, rectale, ou vaginale, et de préférence par voie intra-nasale ou par voie orale. Leur utilisation permet l'expression in situ de la protéine d'intérêt, au niveau des muqueuses concernées. L'utilisation des bactéries transformées 35 conformes à l'invention est particulièrement intéressante dans le cadre du traitement de maladies telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), car elle permet de délivrer localement la protéine d'intérêt, directement dans l'intestin, lors du passage de la bactérie au niveau du duodénum, permettant ainsi 5 une action très localisée de la protéine et donc une efficacité plus importante. Dans ce cadre, elles peuvent notamment être utilisées pour l'administration de cytokines anti-inflammatoires, comme l'interleukine-10. A titre d'autres exemples non-limitatifs 10 d'utilisation de bactéries transformées conformes à U invention, on citera : - la vaccination contre le cancer du col de l'utérus, par l'administration intranasale de l'antigène E7 du papillomavirus humain de type 16 ; 15 - une thérapie contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), par l'administration orale de molécules anti-inflammatoires telles que la cytokine IL-10 ou l'élafine ; - une thérapie contre les allergies, par 20 l'administration intranasale de molécules pro-inflammatoires telles que la cytokine IL-12 ou le TGF-p. A titre indicatif, les lactocoques recombinantes conformes à l'invention peuvent être administrées à une dose comprise entre 1.108 et 1.101° UFC 25 (Unité formant colonies), de préférence entre 5.108 et 1.1010 UFC, avaritageusement entre 5.108 et 5.109 UFC pour une administration intranasale et entre 1.109 et 1.1010 UFC pour une administration orale. Par exemple, elles peuvent être administrées à une dose de 1.109 UFC par voie 30 intranasale ou de 5.109 UFC par voie orale. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs, illustrant la construction et l'utilisation de cassettes d'expression 35 conformes à l'invention.

EXEMPLE 1 : CLONAGE DU PROMOTEUR GROESL ET CONSTRUCTION DU SYSTEME D'EXPRESSION REGULE PAR LE STRESS. Une région d'ADN en amont du gène GroESL a été amplifiée par PCR à partir d'ADN génomique de la souche 5 de Lactococcus lactis MG1363. Les amorces utilisées sont l'amorce sens Bg/II-ProGroEL de séquence CCAAGATCTAAATGTTTTCTCTTGACTAAATCTGACC (SEQ ID NO. : 6) et l'amorce antisens NheI-ProGroEL de séquence 10 AGCTAGCGTTAATAAAGCAAGGTTTATTTTTTTCATATAC (SEQ ID NO. : 7). Ces amorces ont été conçues de façon à cloner, grâce aux sites de restriction BglII et NheI (soulignés), le produit de la PCR dans le vecteur pLB141 (Morello et al., 2008, précité). De plus, l'amorce antisens a été choisie 15 de manière à introduire le produit de la PCR dans ce vecteur en phase de lecture avec la séquence codant pour les 12 premiers acides aminés du peptide signal PSExp4. Le produit de la PCR a été digéré, purifié et cloné dans le vecteur intermédiaire pCR(D2.1 (TOPO®, 20 Invitrogen). La séquence du plasmide obtenu, pLB263 (pCR:TOPO:PGroESL) (Fig. 1A), a été confirmée par digestion enzymatique et par séquençage (Eurofins). Le fragment amplifié, contenant le promoteur PGroESL, a la séquence suivante : 25 ATCTAAATGTTTTCTCTTGACTAAATCTGACCATTGAGATAAAATAAGAATATGTTA GCACTCAACTATTAAGAGTGCTAAAAATAAAAAATGGAGGAAAGTATA (SEQ ID NO. : 8). Le promoteur PGroESL a été isolé du plasmide pLB263, par digestion avec les enzymes BglII et NheI, et 30 cloné dans le vecteur pLB141 (Fig. 15), préalablement digéré avec les mêmes enzymes, en remplacement du promoteur (P - nisA) initialement présent dans ce vecteur. Le plasmide résultant, pLB333 (pPGr0ESL:PSExp4:Nuc) (Fig. 1C), contient une cassette 35 d'expression exprimant PSExp4 en fusion avec la forme mature d'une protéine sécrétée modèle, la nucléase de Staphylococcus aureus (Nuc), sous le contrôle du promoteur PGroESL. Le plasmide pLB333 présente un site de restriction NsiI, entre la séquence codant pour PSExp4 et le gène rapporteur nuc codant pour la nucléase Nuc, et un site de clonage multiple à la fin du gène nuc et avant le terminateur de transcription trpA (ter), pour permettre le remplacement de ce gène par un gène d'intérêt. Ce plasmide a ensuite été introduit chez L. 10 lactis MG1363 pour obtenir la souche recombinante MG(pLB333). EXEMPLE 2 : EXPRESSION IN VITRO DE LA PROTEINE NUC. L'expression du gène rapporteur nuc a été testée par Western Blot après avoir induit un choc 15 thermique chez la souche recombinante MG(pLB333) obtenue à l'Exemple 1. Pour cela, une pré-culture de nuit de la souche MG(pLB333) a été diluée au 1/100ème le matin, jusqu'à une densité optique (DO) comprise entre 0,4 et 20 0,6. Ensuite, trois volumes de 6 ml de la pré-culture diluée ont été versés dans trois tubes. En parallèle, trois tubes de 6 ml de milieu de culture GM17 contenant 10 pg/ml de chloramphénicol (Cm) ont été préparés et incubés respectivement à 30°C et 37°C. Les trois cultures 25 ont chacune été centrifugées 5 min à 4700 rpm, puis reprises dans les 6 ml de milieu frais GM17+Cm préalablement chauffé. Les tubes ainsi obtenus ont été incubés pendant 5 et 30 min 'à 30°C et 37°C. Les tubes ont ensuite été centrifugés 10 min à 30 13000 rpm, et culot et surnageant ont été séparés. Le surnageant a été précipité au TCA 10% et repris dans du Na0H+bleu de charge (obtention de la fraction S). Le culot a été repris dans 150 pl de PBS+antiprotéase 1X, un volume de bille y a été ajouté, et le tout a été passé au 35 système FastPrep® afin de casser les bactéries et libérer les protéines cytoplasmiques (obtention de la fraction C). La production et la sécrétion de la protéine Nuc a été analysée par Western blot à l'aide d'anticorps antiNuc. Les résultats, illustrés à la Figure 2, démontrent qu'après le choc thermique (5 min à 37°C), la souche MG(pLB333) est capable de produire très fortement la protéine Nuc. EXEMPLE 3 : PRODUCTION IN VITRO D'INTERLEUKINE-10. L'interleukine-10 (IL-10) est une cytokine anti-inflammatoire précédemment proposée pour son 10 utilisation dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Le gène codant pour l'IL-10 murine a été inséré dans le vecteur pLB333 en remplacement du gène nuc. Le plasmide obtenu, pLB350 (pPGr0ESL:PSExp4:IL-10), 15 a été introduit chez L. lactis MG1363 pour obtenir la souche recombinante MG(pLB350). Selon le même protocole que celui décrit dans l'Exemple 2, la production d'IL-10 a été confirmée par Western Blot après avoir induit un choc thermique chez la 20 souche recombinante MG(pLB350). Les résultats, illustrés à la Figure 3, démontrent qu'après le choc thermique, la souche MG(pLB350) est capable de produire très fortement la protéine IL-10. EXEMPLE 4 : PRODUCTION IN VITRO DE L'ANTIGENE E7 DU VPH 25 DE TYPE 16. Le papillomavirus humain de type 16 (VPH-16) est un des principaux virus responsables du cancer du col de l'utérus. L'utilisation de l'antigène E7 du VPH-16, protéine retrouvée systématiquement dans les carcinomes 30 provoqués par une infection par un VPH, a déjà été proposée comme vaccin, prophylactique ou thérapeutique, contre le cancer du col de l'utérus (Bermudez et al., J. of Med. Microbiol., 53, 427-433, 2004). Le gène codant pour l'antigène E7 a été inséré 35 dans le vecteur pLB333 en remplacement du gène nuc. Le plasmide obtenu, pLB356 (pPGr0EL:PSExp4:E7), a été introduit chez L. lactis MG1363 pour obtenir la souche recombinante MG(pLB356). Selon le même protocole que celui décrit dans l'Exemple 2, la production d'antigène E7 a été confirmée 5 par Western Blot après avoir induit un choc thermique chez la souche recombinante MG(pLB356). Les résultats, illustrés à la Figure 4, démontrent qu'après le choc thermique (30 min à 37°C), la souche MG(pLB350) est capable de produire très fortement et de sécréter 10 efficacement la protéine E7. EXEMPLE 5 : UTILISATION DES, BACTERIES RECOMBINANTES PRODUISANT L'ANTIGENE E7 POUR IMMUNISER DES SOURIS. L'effet de l'administration intranasale (i.n.) de la souche recombinante MG(pLB356) obtenue à l'Exemple 15 4 a été testé dans un modèle de souris développant des tumeurs cancéreuses induites par une lignée tumorale (TC1) exprimant l'antigène E7 du VPH-16. Des groupes de 12 souris, de 6 à 8 semaines d'âge, ont été immunisés par voie i.n. avec du PBS, ou 20 avec la souche sauvage MG1363 (MG), ou avec la souche recombinante MG(pLB356). Pour cela, un total de 1.109 UFC (Unité formant colonies) de chaque souche a été resuspendu dans 10 pL de PBS. Il a été déterminé que 1.109 UFC de 25 bactéries recombinantes contenaient environ 15 pg d'antigène E7. 5 pL de la suspension ainsi obtenue ont été administrés à l'aide d'une micropipette dans chaque narine des souris, aux jours 0, 14 et 28. Au jour 35, soit 7 jours après la dernière immunisation, la moitié de 30 chaque lot de souris (n=6) a été sacrifiée pour l'analyse de la réponse immunitaire, et on a administré à l'autre moitié (n=6), par injection sous-cutanée (s.c.), une lignée tumorale TC-1. Le volume des tumeurs développées chez ces 35 souris a été mesuré une fois par semaine pendant 5 semaines. Les résultats des mesures sont montrés à la Figure 5. Le volume des tumeurs chez les souris vaccinées avec la souche MG(pLB356) est inférieur de 1 cm3 en moyenne à celui des tumeurs développées par les souris vaccinées avec la souche témoin MG ou avec du PBS, qui est respectivement de 2,7 cm3 et 2,9 cm3. Le volume des tumeurs est donc significativement réduit chez les souris vaccinées avec la souche recombinante MG(pLB356). Par ailleurs, chez les souris vaccinées avec la souche MG(pLB356), il n'y a pas eu de mortalité (les 6 souris ont survécu), alors que les souris témoins (MG ou PBS) présentent une mortalité de 16% (5 souris sur 6 ont survécu dans chaque lot). Pour l'analyse de la réponse immunitaire, des prélèvements sanguins ont été effectués au sinus rétro- orbital chez les souris avant leur sacrifice. A partir de ces prélèvements, les sérums ont été récupérés après centrifugation, et stockés à -80°C jusqu'à analyse des anticorps IgG et IgA spécifiques de l'antigène E7 et de différentes cytokines.

Afin de pouvoir déterminer la production de cytokines caractéristiques d'une réponse immune de type Thl et de déterminer leur activité cytotoxique in vitro, les splénocytes des souris sacrifiées ont également été isolés, puis cultivés et re-stimulés avec une protéine E7 marquée à l'aide d'une étiquette polyhistidine (« Histag »), et purifiée à partir d'Escherichia cou. Pour l'essai de cytotoxicité, les splénocytes re-stimulés ont été transférés sur une plaque de culture contenant des cellules TC-1 viables, et incubés pendant 5 jours.

La lyse des cellules TC-1 par les splénocytes a ensuite été observée au microscope (Fig. 6, micrographies au grossissement x100). Après 5 jours de co-culture, les splénocytes des souris immunisées avec la souche MG(pLB356) ont clairement proliféré (Fig.

6C, flèches blanches), contrairement aux traitements témoins (Fig.

6A et 6B). Par ailleurs, les cellules TC-1, qui ont formé une couche dense et bien adhérente en présence des splénocytes de souris témoins vaccinées avec du PBS (Fig.

6A) ou avec la souche témoin MG (Fig.

6B), ont presque complètement disparu en présence des splénocytes de 5 souris vaccinées avec la souche recombinante MG(pLB356) (Fig. 60, cercles blancs), confirmant que les splénocytes de ces souris immunisées induisent une lyse très efficace des cellules tumorales TC-1 in vitro. EXEMPLE 6 : UTILISATION DES BACTERIES RECOMBINANTES 10 PRODUISANT IL-10 POUR TRAITER DES SOURIS. La maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique sont les deux formes principales de Maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). L'inflammation observée dans la rectocolite hémorragique 15 atteint toujours le rectum et parfois le côlon. Elle ne touche en aucun cas d'autres segments du tractus digestif, alors que dans le cas de la maladie de Crohn, l'inflammation peut atteindre toutes les parties du tractus digestif (depuis la bouche jusqu'à l'anus), mais 20 se situe préférentiellement sur la partie terminale de l'intestin grêle (iléon) et sur le côlon. L'utilisation de probiotiques pour le traitement de ces maladies inflammatoires est suggéré depuis plusieurs années et différentes études ont montré 25 l'effet bénéfique de tels produits bactériens testés seuls ou en combinaison. Ces résultats ont suggéré que les bactéries probiotiques pourraient être utilisées comme porteurs d'un gène bénéfique dans l'intestin, en plus de leurs pouvoirs propres et intrinsèques comme 30 agent anti-inflammatoire. Cette stratégie a été utilisée pour exprimer l'IL-10 dans des bactéries L. lactis sous contrôle du promoteur P1 (Steidler et al., 2000, précité). Des essais cliniques de phase I conduits avec ces bactéries recombinantes ont montré que leur 35 administration n'occasionne pas d'effet délétère chez les patients mais ne permet d'obtenir qu'un effet protecteur de courte durée. La souche recombinante MG(pLB350) a montré un rôle protecteur dans deux modèles différents de souris, dans lesquels une colite aiguë était engendrée par du DSS (Dextran sulfate sodium) (modèle utilisé par Steidler et al., 2000, précité) ou par de l'acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS) (modèle utilisé par Foligne et al., Gastroenterology, 133(3):862-74, 2007) (résultats non montrés). Dans le présent exemple, la souche recombinante MG(pLB350) est testée dans un modèle de colite chronique. Le modèle utilisé reproduit les périodes de récupération et de récurrence observées chez les patients atteints de la maladie de Crohn. Pour ce faire, la colite a été induite chez la souris par l'injection intrarectale d'acide 2,4-dinitrobenzène sulfonique (DNBS). Des souris mâles C575L/6 âgées de 6 à 8 semaines, réparties en 4 groupes de 8 souris, ont d'abord reçu (J1 à 3) une première dose de 2 mg de DNBS (Groupes 1 à 3) ou de l'éthanol (Groupe 4) à titre de contrôle. Une période de récupération a suivi, entre J4 et J14. Puis, entre J14 et J23, on leur a administré quotidiennement par voie orale 5.109 UFC de bactéries recombinantes MG(pLB350) (Groupe 1), de la dexaméthasone (Groupe 2), ou du PBS (Groupes 3 et 4). La dexaméthasone est une hormone glucocorticoïde utilisée notamment pour traiter diverses maladies inflammatoires telles que les MICI. Un second épisode d'inflammation a été induit à J21 par administration d'l mg de DNBS. Les souris ont été sacrifiées à J24. L'inflammation a été évaluée selon les 30 critères de Wallace, et le score de Wallace (note de 0 à 10 selon les lésions macroscopiques du côlon) a été attribué à chaque souris. Les résultats obtenus (Figure 7) démontrent l'effet protecteur de la souche MG(pLB350) après la 35 réactivation de la colite par la seconde administration de DNBS (DNBS+IL10). Cet effet est supérieur à celui observé après traitement avec la dexaméthasone (DNBS+DEX).

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1) Cassette d'expression comprenant : - le promoteur (PGroESL) de l'opéron GroESL de Lactococcus lactis, et - une séquence nucléotidique hétérologue codant pour un polypeptide d'intérêt, placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
2. 2) Cassette d'expression selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une séquence nucléotidique codant pour un peptide d'adressage extracellulaire, sous contrôle transcriptionnel du promoteur, ladite cassette d'expression permettant le clonage de la séquence nucléotidique hétérologue en fusion traductionnelle avec ledit peptide d'adressage.
3. 3) Cassette d'expression selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit peptide d'adressage extracellulaire est le peptide signal de la protéine Exp4 de Lactococcus lactis, et a la séquence suivante : MKKINLALLTLATLMGVSSTAVVFA (SEQ ID NO. : 5).
4. 4) Vecteur recombinant comprenant un insert constitué par une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5. 5) Bactérie lactique du genre Lactococcus, transformée par une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 3.
6. 6) Bactérie selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie de l'espèce Lactococcus lactis.
7. 7) Bactérie selon la revendication 5 ou 6, pour son utilisation comme médicament ou comme vaccin, comme vecteur d'administration d'une protéine thérapeutique ou vaccinale d'intérêt.
8. 8) Bactérie selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est administrée par voie mucosale, de préférence par voie intra-nasale ou par voie orale.
9. 9) Bactérie selon la revendication 7 ou 8, pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques del'intestin, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue code pour l'interleukine-10.
10. 10) Bactérie selon la revendication 7 ou 8, pour son utilisation comme vaccin contre le cancer du col de l'utérus, dans laquelle la séquence nucléotidique hétérologue code pour l'antigène E7 du papillomavirus humain (VPH) de type 16.