FR2983092A1

FR2983092A1 - METHOD AND DEVICE FOR FILLING NANOPIPETTES BY DYNAMIC MICRODISTILLATION

Info

Publication number: FR2983092A1
Application number: FR1160968A
Authority: FR
Inventors: Bernard Tinland; Evelyne Guirleo
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Provence Aix Marseille I
Current assignee: Aix Marseille Universite
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2013-05-31
Anticipated expiration: 2031-11-30
Also published as: WO2013079874A1; FR2983092B1

Abstract

Procédé de remplissage par un liquide d'une nano-pipette comprenant une extrémité proximale terminée par une grande ouverture et une extrémité distale terminée par une petite ouverture s'inscrivant dans un cercle de diamètre inférieur ou égal à 60 nanomètres, le procédé comprenant au moins les étapes suivantes : - une étape d'introduction de liquide dans la nano-pipette par la grande ouverture ; - une étape de chauffage d'une région chauffée de la nano-pipette, des régions froides proximales et distales de la nano-pipette restant froides, la région chauffée comprenant une partie du liquide, ladite partie se vaporisant et se condensant en gouttelettes dans la région froide distale ; et - une étape de déplacement relatif suivant la direction longitudinale, de la région chauffée par rapport à la nano-pipette pour amener ladite région chauffée à proximité de l'extrémité distale de la nano-pipette.A method of liquid filling a nano-pipette comprising a proximal end terminated by a large aperture and a distal end terminating in a small aperture in a circle of diameter less than or equal to 60 nanometers, the process comprising at least the following steps: a step of introducing liquid into the nano-pipette through the large opening; a step of heating a heated region of the nano-pipette, cold regions proximal and distal to the nano-pipette remaining cold, the heated region comprising part of the liquid, said part vaporizing and condensing into droplets in the distal cold region; and a step of relative displacement in the longitudinal direction, of the heated region relative to the nano-pipette to bring said heated region near the distal end of the nano-pipette.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE REMPLISSAGE DE NANOPIPETTES PAR MICRODISTILLATION DYNAMIQUE. La présente invention est relative aux procédés de 5 remplissage de tubes possédant une région de très faible section ainsi qu'aux dispositifs permettant de remplir de tels tubes. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un procédé de remplissage d'une nano-pipette par un liquide, 10 la nano-pipette s'étendant suivant une direction longitudinale, au moyen d'une paroi évasée présentant une surface intérieure, depuis une extrémité proximale terminée par une grande ouverture jusqu'à une extrémité distale terminée par une petite ouverture, la section interne de la 15 petite ouverture s'inscrivant dans un cercle de diamètre inférieur ou égal à 60 nanomètres. Dans plusieurs domaines d'applications, il est nécessaire de pouvoir remplir de façon complète une pipette en évitant la présence de bulles de gaz à son extrémité de 20 petit diamètre. Ainsi, par exemple en électrophysiologie, pour mesurer les courants et les potentiels électrochimiques présents dans des cellules comme les neurones, on cherche à établir un contact électrique avec un milieu extérieur par l'intermédiaire du fluide contenu 25 dans la pipette. La présence d'une bulle de gaz non-conducteur empêche donc le fonctionnement de l'appareil. On connait des façons de remplir une pipette dont la petite ouverture est de l'ordre du millionième de mètre (micron) ou plus. Il est par exemple possible d'appliquer 30 une forte pression au fluide ou à l'inverse, une dépression au milieu extérieur. Il est aussi possible d'utiliser une pipette comportant un filament de verre à l'intérieur. Cependant, pour des applications, par exemple dans le domaine de l'électrophysiologie, il est intéressant de 35 pouvoir utiliser des pipettes dont la dimension de petite ouverture est beaucoup plus petite que le micron, aussi appelées nano-pipette, afin d'améliorer la résolution spatiale de la mesure. Les méthodes de remplissages détaillées plus haut ne sont pas utilisables pour remplir de telles nanopipettes dont l'ouverture distale possède des dimensions nanométriques, par exemple de moins de 60 milliardièmes de mètres (nanomètres). Dans le cas de la méthode sous pression, par exemple, la tension de surface exercée par le fluide dont on cherche à remplir la pipette devient élevée et la pression à appliquer pour remplir la pipette dans un temps raisonnable est souvent telle que la pipette est brisée dans l'opération. Dans le cas des pipettes à filament de verre, l'extrémité distale du filament est fondue lors de la fabrication et introduit des impuretés de verre dans le quartz ainsi que des irrégularités dans l'ouverture distale. Il est à noter que l'invention concerne le remplissage des nano-pipettes à un seul canal. La présente invention a pour but de pallier à ces 20 inconvénients en présentant une méthode et un dispositif nouveaux. À cet effet, selon l'invention, un procédé de remplissage d'une nano-pipette par un liquide du genre en question comprend au moins les étapes suivantes : 25 une étape d'introduction de liquide dans la nano- pipette par la grande ouverture terminant son extrémité proximale, réalisée au moyen d'un dispositif d'introduction de liquide; une étape de chauffage, réalisée au moyen d'un 30 élément de chauffage, d'une région chauffée de la nanopipette, des région froides proximales et distales de la nano-pipette restant froides, la région chauffée comprenant une partie du liquide, de façon à ce que ladite partie se vaporise et se condense en gouttelettes sur la surface 35 intérieure de la nano-pipette dans la région froide distale ; et une étape de déplacement relatif suivant la direction longitudinale, de la région chauffée par rapport à la nano-pipette, réalisée au moyen d'un élément de déplacement, pour amener ladite région chauffée à proximité de l'extrémité distale de la nano-pipette. Grâce à ces dispositions, on peut utiliser une pipette en quartz pur, sans l'introduction d'un filament en verre et l'on remplit la pipette rapidement et sans exercer d'efforts sur celle-ci, ce qui garantit son intégrité à la fin du procédé. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l'une et/ou à l'autre des dispositions suivantes : - la vitesse de déplacement relatif de la région chauffée par rapport à la nano-pipette lors de l'étape de déplacement est supérieure à une vitesse basse en dessous de laquelle les gouttelettes forment des bouchons, et inférieure à une vitesse haute au-dessus de laquelle une pluralité de gouttelettes se trouve du côté de l'extrémité proximale par rapport à la région chauffée. - la vitesse de déplacement relatif de la région chauffée par rapport à la nano-pipette lors de l'étape de déplacement est définie par un procédé de calibration comprenant au moins une succession d'étapes comprenant au moins l'étape de chauffage, l'étape de déplacement relatif ainsi qu'une étape de contrôle de la quantité de liquide déplacée jusqu'à l'extrémité distale réalisée au moyen d'un dispositif de contrôle, ladite succession d'étapes étant réalisée pour des vitesses de déplacement relatif différentes. - la vitesse de déplacement relatif de la région chauffée par rapport à la nano-pipette lors de l'étape de déplacement est comprise entre 10 millionièmes de mètre par 35 seconde et 1 millième de mètre par seconde. - l'étape de déplacement est réitérée au moins une fois. - la vitesse de déplacement relatif de la région chauffée par rapport à la nano-pipette lors de l'étape de 5 déplacement augmente lorsque la région chauffée se rapproche de l'extrémité distale de la nano-pipette. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif de remplissage d'une nano-pipette par un liquide, la nano-pipette s'étendant suivant une direction 10 longitudinale d'une extrémité proximale terminée par une grande ouverture, à une extrémité distale terminée par une petite ouverture, la section interne de la petite ouverture s'inscrivant dans un cercle de diamètre inférieur ou égal à 60 nanomètres, le dispositif comprenant au moins : 15 un élément de chauffage adapté pour chauffer une partie du liquide situé dans la nano-pipette et un élément de déplacement adapté pour déplacer au moins un élément choisi dans la liste comprenant l'élément de chauffage et la nano-pipette. 20 Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l'une et/ou à l'autre des dispositions suivantes : - l'élément de chauffage est un filament parcouru par un courant. 25 - l'élément de chauffage est un laser. Un dernier aspect de l'invention concerne une machine de séquençage caractérisée en ce qu'elle comprend un dispositif de remplissage tel que décrit ci-dessus. D'autres caractéristiques et avantages de 30 l'invention apparaîtront au cours de la description suivante d'une de ses formes de réalisation, donnée à titre d'exemple non limitatif, en regard des dessins joints. Sur les dessins : - la figure 1 présente un schéma simplifié d'un 35 système d'électrophysiologie employant une nano-pipette. - la figure 2 illustre une nano-pipette telle que celles sur lesquelles le procédé peut être appliqué, - la figure 3a présente un mode de réalisation d'un dispositif de remplissage selon l'invention, - les figures 3b et 3c illustrent deux modes de réalisation d'un dispositif de remplissage selon l'invention, - la figure 4 est un organigramme illustrant les étapes d'un procédé de remplissage selon l'invention, - les figures 5a, 5b, 5c et 5d illustrent l'état d'une nano-pipette à différents moments au cours d'un procédé de remplissage selon l'invention, - les figures 6a et 6b illustrent le cas où des bouchons se forment dans la nano-pipette, - les figures 7a et 7b illustrent le cas où la région chauffée dépasse les gouttelettes, - les figures 8a à 8d présentent des images de microscopie électronique à balayage d'extrémités de nanopipettes ainsi qu'un schéma explicatif, - la figure 9a est une photographie d'une nano- pipette dans l'état de la figure 5b, - la figure 9b est une photographie d'une nanopipette dans l'état de la figure 6a. Sur les différentes figures, les mêmes références 25 désignent des éléments identiques ou similaires. La figure 1 présente un schéma d'un système usuel d'électrophysiologie 56 employant une nano-pipette 10. Le système 56 comprend deux électrodes 50, 51. L'électrode 50 30 est insérée dans une nano-pipette 10 par sa grande ouverture 12a. La nano-pipette 10 contient un liquide 14 dans lequel trempe l'électrode 50. Le liquide 14 rempli une partie de la nano-pipette 10 jusqu'à la petite ouverture 13a de la nano-pipette 10 et est par exemple en contact au 35 niveau de cette petite ouverture 13a avec une cellule 52 dont on cherche mesurer les caractéristiques électrochimiques. La seconde électrode 51 est immergée dans un liquide 53 formant le milieu dans lequel baigne la cellule 52. La seconde électrode 51 permet de fournir un potentiel de référence. Les deux électrodes 50, 51 sont reliées à un d'amplifier le signal à un dispositif de mesure constitué par une carte amplificateur 54 permettant électrique qui est lui-même relié et de traitement 55, par exemple 10 d'acquisition et un ordinateur. Un tel système 56 permet donc caractéristiques électrochimiques de la exemple son potentiel ou les courants qui de mesurer les cellule 52, par y circulent. Plus l'ouverture 13a est petite, plus la résolution spatiale de 15 la mesure est grande. La figure 2 présente une nano-pipette 10 s'étendant suivant une direction longitudinale X d'une extrémité proximale 12 terminée par une grande ouverture 12a, à une extrémité distale 13 terminée par une petite ouverture 13a. 20 La section interne de la petite ouverture 13a peut par exemple s'inscrire dans un cercle de diamètre inférieur ou égal à 60 nanomètres. La nano-pipette comprend une paroi évasée 11 tubulaire, comportant une surface intérieure 16 et une 25 surface extérieure 17. La paroi évasée 11 de la nanopipette 10 possède une section, prise perpendiculairement à la direction longitudinale X, diminuant progressivement depuis l'extrémité proximale 12 jusqu'à l'extrémité distale 13. 30 Les figures 8a à 8c présentent des images de microscopie électronique à balayage d'extrémités distales 13 de nano-pipettes 10 tandis que la figure 8d est un schéma explicatif illustrant une nano-pipette 10 vue sous le même angle que les figures 8a à 8c. 35 Une telle nano-pipette 10 peut par exemple être réalisée au moyen d'une étireuse laser. Elle peut par exemple être constituée de quartz ou de verre. Le quartz présente des propriétés physiques et électriques intéressantes telles qu'une forte résistance mécanique, un 5 faible facteur de dissipation ainsi qu'une faible constante diélectrique. Ceci permet d'obtenir des nano-pipettes 10 solides et de réduire les bruits électriques lors de l'utilisation de ces nano-pipettes 10 pour réaliser des mesures électriques. Des nano-pipettes 10 constituées 10 d'autres matériaux pourront être utilisées par l'homme du métier suivant les besoins et les contraintes. La figure 2 correspond à l'état initial 100 de la nano-pipette 10. Le liquide 14, introduit par la grande ouverture 12a terminant l'extrémité proximale 12, est 15 localisé majoritairement à proximité de l'extrémité proximale 12 et une bulle de gaz 15 est présente au niveau de l'extrémité distale 13 de petit diamètre. La figure 3a présente un dispositif 1, selon l'invention, de remplissage d'une nano-pipette 10. 20 Le dispositif 1 comprend un dispositif d'introduction de liquide 70 permettant d'introduire du liquide 14 dans la nano-pipette 10 par l'intermédiaire de la grande ouverture 12a. Le dispositif d'introduction de liquide 70 peut par exemple être constitué par un tube 71 25 relié à un réservoir 72 adapté pour être mis sous pression à l'aide d'une pompe 73 afin d'injecter le liquide 14 dans la nano-pipette 10. Le dispositif comprend en outre un élément de chauffage 20 pouvant être activé pour chauffer une région 30 chauffée 21 de la nano-pipette sans chauffer des régions froides proximale 22 et distale 23 de la nano-pipette 10. La région chauffée 21 peut comprendre une partie 14a du liquide 14 situé dans la nano-pipette 10. L'élément de chauffage 20 est adapté pour permettre de chauffer la 35 région chauffée 21 jusqu'à la vaporisation de la partie 14a du liquide 14 comprise dans ladite région chauffée 21. Selon un premier mode de réalisation indiqué figure 3b, l'élément de chauffage 20 comprend un filament de tantale 24 placé à l'extérieur de la nano-pipette 10 et en entourant une section, prise perpendiculairement à la direction longitudinale X. Le filament de tantale 24 peut être activé par le passage d'un courant électrique, par exemple d'environ 1,5 Watt dans ledit filament. Le matériau constituant le filament pourra être choisi par l'homme du métier pour s'adapter au mode de réalisation. Le matériau sera de préférence résistif et de telle sorte qu'il supporte l'élévation de température induite par le passage du courant. La région chauffée 21 de la nano-pipette 10 correspond dans ce mode de réalisation à la section de la nano-pipette 10 entourée par le filament et possède une certaine extension latérale en direction des extrémités proximale et distale, induite par la conduction thermique du matériau constituant la nano-pipette 10. METHOD AND DEVICE FOR FILLING NANOPIPETTES BY DYNAMIC MICRODISTILLATION. The present invention relates to methods of filling tubes having a region of very small section as well as devices for filling such tubes. More particularly, the invention relates to a method of filling a nano-pipette with a liquid, the nano-pipette extending in a longitudinal direction, by means of a flared wall having an inner surface, from a proximal end terminated by a large aperture to a distal end terminated by a small aperture, the inner section of the small aperture falling within a circle of diameter less than or equal to 60 nanometers. In several fields of application, it is necessary to be able to completely fill a pipette avoiding the presence of gas bubbles at its small diameter end. Thus, for example in electrophysiology, for measuring the currents and the electrochemical potentials present in cells such as neurons, it is sought to establish an electrical contact with an external medium via the fluid contained in the pipette. The presence of a non-conductive gas bubble thus prevents the operation of the apparatus. There are known ways to fill a pipette whose small opening is of the order of a millionth of a meter (micron) or more. For example, it is possible to apply a high pressure to the fluid or vice versa, a depression to the external environment. It is also possible to use a pipette having a glass filament therein. However, for applications, for example in the field of electrophysiology, it is interesting to be able to use pipettes whose small aperture size is much smaller than the micron, also called nano-pipette, in order to improve the spatial resolution of the measurement. The filling methods detailed above can not be used to fill such nanopipettes whose distal opening has nanometric dimensions, for example less than 60 billionths of meters (nanometers). In the case of the pressurized method, for example, the surface tension exerted by the fluid which is to be filled with the pipette becomes high and the pressure to be applied to fill the pipette in a reasonable time is often such that the pipette is broken. in the operation. In the case of glass filament pipettes, the distal end of the filament is melted during manufacture and introduces glass impurities into the quartz as well as irregularities in the distal opening. It should be noted that the invention relates to the filling of nano-pipettes with a single channel. The present invention aims to overcome these disadvantages by presenting a new method and a new device. For this purpose, according to the invention, a method of filling a nano-pipette with a liquid of the kind in question comprises at least the following steps: a step of introducing liquid into the nano-pipette through the large opening terminating its proximal end, performed by means of a liquid introduction device; a heating step, performed by means of a heating element, of a heated region of the nanopipette, cold regions proximal and distal of the nano-pipette remaining cold, the heated region comprising a portion of the liquid, so said portion vaporizes and condenses into droplets on the inner surface of the nano-pipette in the distal cold region; and a step of relative displacement in the longitudinal direction, of the heated region relative to the nano-pipette, performed by means of a displacement element, for bringing said heated region near the distal end of the nano-pipette . Thanks to these arrangements, a pure quartz pipette can be used, without the introduction of a glass filament, and the pipette is filled quickly and without exerting any effort on it, which guarantees its integrity at the same time. end of the process. In preferred embodiments of the invention, one or more of the following provisions may also be used: the relative speed of displacement of the heated region relative to the nano-pipette during the moving step is greater than a low speed below which the droplets form plugs, and lower than a high speed above which a plurality of droplets are on the proximal end side with respect to the heated area. the relative speed of movement of the heated region relative to the nano-pipette during the displacement step is defined by a calibration method comprising at least a succession of steps comprising at least the heating step, relative displacement step and a step of controlling the amount of liquid displaced to the distal end made by means of a control device, said succession of steps being performed for different relative speeds of displacement. the relative speed of displacement of the heated region relative to the nano-pipette during the displacement step is between 10 millionths of a meter per second and one thousandth of a meter per second. the displacement step is repeated at least once. the relative rate of displacement of the heated region relative to the nano-pipette during the displacement step increases as the heated region approaches the distal end of the nano-pipette. Another aspect of the invention relates to a device for filling a nano-pipette with a liquid, the nano-pipette extending in a longitudinal direction from a proximal end terminated by a large opening to a completed distal end. by a small opening, the inner section of the small opening being in a circle of diameter less than or equal to 60 nanometers, the device comprising at least: a heating element adapted to heat a portion of the liquid located in the nano- pipette and a displacement member adapted to move at least one member selected from the list comprising the heating element and the nano-pipette. In preferred embodiments of the invention, one and / or other of the following arrangements may optionally be further used: the heating element is a filament traversed by a current. The heating element is a laser. A final aspect of the invention relates to a sequencing machine characterized in that it comprises a filling device as described above. Other features and advantages of the invention will become apparent from the following description of one of its embodiments, given by way of non-limiting example, with reference to the accompanying drawings. In the drawings: FIG. 1 shows a simplified diagram of an electrophysiology system employing a nano-pipette. FIG. 2 illustrates a nano-pipette such as those on which the method may be applied; FIG. 3a shows an embodiment of a filling device according to the invention; FIGS. 3b and 3c illustrate two modes of embodiment of a filling device according to the invention; FIG. 4 is a flowchart illustrating the steps of a filling method according to the invention; FIGS. 5a, 5b, 5c and 5d illustrate the state of a nano-pipette at different times during a filling process according to the invention, - Figures 6a and 6b illustrate the case where plugs are formed in the nano-pipette, - Figures 7a and 7b illustrate the case where the heated region exceeds the droplets; FIGS. 8a to 8d show scanning electron microscopy images of nanopipette tips as well as an explanatory diagram; FIG. 9a is a photograph of a nano-pipette in the state of Figure 5b, - the fi Figure 9b is a photograph of a nanopipette in the state of Figure 6a. In the different figures, the same references denote identical or similar elements. FIG. 1 shows a diagram of a usual electrophysiology system 56 employing a nano-pipette 10. The system 56 comprises two electrodes 50, 51. The electrode 50 is inserted into a nano-pipette 10 by its large opening 12a. . The nano-pipette 10 contains a liquid 14 in which the electrode 50 is quenched. The liquid 14 fills a part of the nano-pipette 10 up to the small opening 13a of the nano-pipette 10 and is, for example, in contact with the pipette 10. level of this small opening 13a with a cell 52 whose electrochemical characteristics are to be measured. The second electrode 51 is immersed in a liquid 53 forming the medium in which the cell 52 is immersed. The second electrode 51 makes it possible to provide a reference potential. The two electrodes 50, 51 are connected to one to amplify the signal to a measuring device consisting of an amplifier board 54 allowing electrical which is itself connected and processing 55, for example 10 acquisition and a computer. Such a system 56 thus allows electrochemical characteristics of the example its potential or the currents which measure the cell 52, by circulating there. The smaller the aperture 13a, the greater the spatial resolution of the measurement. Figure 2 shows a nano-pipette 10 extending in a longitudinal direction X from a proximal end 12 terminated by a large opening 12a, at a distal end 13 terminated by a small opening 13a. The inner section of the small opening 13a may for example be part of a circle of diameter less than or equal to 60 nanometers. The nano-pipette comprises a tubular flared wall 11 having an inner surface 16 and an outer surface 17. The flared wall 11 of the nanopipette 10 has a section, taken perpendicular to the longitudinal direction X, gradually decreasing from the proximal end 12 to the distal end 13. FIGS. 8a to 8c show scanning electron microscopy images of distal ends 13 of nano-pipettes 10 while FIG. 8d is an explanatory diagram illustrating a nano-pipette 10 from the same angle as Figures 8a to 8c. Such a nano-pipette 10 may for example be made by means of a laser stretching machine. It may for example be made of quartz or glass. Quartz exhibits interesting physical and electrical properties such as high mechanical strength, low dissipation factor, and low dielectric constant. This provides solid nano-pipettes and reduces electrical noise when using these nano-pipettes to perform electrical measurements. Nano-pipettes 10 made of other materials may be used by those skilled in the art depending on the needs and constraints. FIG. 2 corresponds to the initial state 100 of the nano-pipette 10. The liquid 14, introduced through the large opening 12a terminating the proximal end 12, is located mainly near the proximal end 12 and a bubble of gas 15 is present at the distal end 13 of small diameter. FIG. 3a shows a device 1, according to the invention, for filling a nano-pipette 10. The device 1 comprises a liquid introduction device 70 making it possible to introduce liquid 14 into the nano-pipette 10 through through the large opening 12a. The liquid introduction device 70 may for example be constituted by a tube 71 25 connected to a reservoir 72 adapted to be pressurized with a pump 73 in order to inject the liquid 14 into the nano-pipette. 10. The device further comprises an activatable heating element 20 for heating a heated region 21 of the nano-pipette without heating cold proximal regions 22 and distal 23 of the nano-pipette 10. The heated region 21 may comprise a portion 14a of the liquid 14 located in the nano-pipette 10. The heating element 20 is adapted to allow heating of the heated region 21 until the vaporization of the portion 14a of the liquid 14 included in said heated region 21. According to a first embodiment indicated in FIG. 3b, the heating element 20 comprises a tantalum filament 24 placed outside the nano-pipette 10 and surrounding a section, taken perpendicular to the direction X. The tantalum filament 24 can be activated by passing an electric current, for example about 1.5 Watt in said filament. The material constituting the filament may be chosen by those skilled in the art to adapt to the embodiment. The material will preferably be resistive and so that it will withstand the temperature rise induced by the current flow. The heated region 21 of the nano-pipette 10 in this embodiment corresponds to the section of the nano-pipette 10 surrounded by the filament and has a certain lateral extension towards the proximal and distal ends, induced by the thermal conduction of the material. constituting the nano-pipette 10.

Dans un autre mode de réalisation indiqué figure 3c, l'élément de chauffage 20 comprend un laser 26 générant un faisceau laser 25 focalisé sur la nano-pipette 10. La région chauffée 21 correspond à l'intersection entre le faisceau laser 25 et la nano-pipette 10. La région chauffée 21 possède à nouveau une extension latérale ayant les mêmes propriétés que dans le premier mode de réalisation décrit ci-dessus. Dans tous les modes de réalisation, si la position relative de la région chauffée 21 par rapport à la nano- pipette 10 reste inchangée au cours du temps, l'extension latérale de la région chauffée 21 va aller en s'accroissant du fait de la conduction thermique dudit matériau. Tout dispositif de chauffage permettant de chauffer, à un certain moment, une région chauffée 21 de la 35 nano-pipette 10 sans chauffer des régions froides 22, 23 de la nano-pipette 10, peut être utilisé comme élément de chauffage 20. Si l'on se réfère à nouveau à la figure 3a, le dispositif 1 comprend aussi un élément de déplacement 30 5 permettant de déplacer la région chauffée 21 par rapport à la nano-pipette 10. Dans le mode de réalisation où l'élément de chauffage 20 est un filament de tantale 24 entourant une section de la nano-pipette 10, l'élément de déplacement 30 10 peut, par exemple, être un actionneur linéaire adapté pour déplacer l'élément de chauffage 20 et/ou la nano-pipette 10 l'un par rapport à l'autre. Dans le mode de réalisation où l'élément de chauffage 20 est un laser 26, l'élément de déplacement peut comprendre un actionneur linéaire comme 15 décrit ci-dessus ou un dispositif rotatif orientant le faisceau du laser vers différentes région de la nanopipette 10 comme indiqué sur la figure 3c. Enfin, le dispositif 1 peut comprendre un dispositif de contrôle 40 adapté pour déterminer la 20 présence de liquide au niveau de l'extrémité distale 13 de la nano-pipette 10. Le dispositif de contrôle 40 peut par exemple comprendre un détecteur optique 41 couplé à un émetteur optique 42 émettant un rayonnement. Le dispositif de contrôle peut par exemple mesurer un changement 25 d'absorption ou de transmission du rayonnement en présence de liquide 14. Alternativement, le dispositif de contrôle 40 pourra être constitué de deux électrodes placées respectivement au niveau de l'extrémité proximale 12 et distale 13 ainsi que d'un élément de mesure de conductivité 30 électrique entre ces deux électrodes. Les électrodes seront adaptées pour que la mesure de conductivité soit positive lorsque la nano-pipette 10 est remplie, c'est-à-dire lorsqu'il n'existe plus de bulle de gaz 15 non-conductrice dans la nano-pipette 10. Le dispositif de contrôle 40 35 pourra employer d'autres principes physiques selon les besoins de l'homme du métier. Si l'on se réfère maintenant à la figure 4, celle-ci détaille l'organigramme d'un procédé de remplissage selon l'invention. Les figures 5a à 5d illustrent l'état de la nano-pipette 10 au cours des différentes étapes du procédé de remplissage. Une première étape d'introduction 100 consiste à introduire un liquide 14 dans la nano-pipette 10 par la grande ouverture 12a terminant son extrémité proximale 12. L'introduction du liquide 14 crée une bulle de gaz 15 au niveau de l'extrémité distale 13. Au cours de cette étape, l'élément de chauffage 20 est positionné à proximité de l'extrémité proximale 12 à l'aide de l'élément de déplacement 30 si besoin est, de façon à ce que la région chauffée 21 comprenne une partie 14a du liquide 14. L'élément de chauffage 20 est inactif au cours de l'étape d'introduction 100. L'état de la nano-pipette 10 à l'issue de l'étape d'introduction 100 est figuré sur la figure 5a. In another embodiment indicated in FIG. 3c, the heating element 20 comprises a laser 26 generating a focused laser beam 25 on the nano-pipette 10. The heated region 21 corresponds to the intersection between the laser beam 25 and the nano The heated region 21 again has a lateral extension having the same properties as in the first embodiment described above. In all embodiments, if the relative position of the heated region 21 relative to the nano-pipette 10 remains unchanged over time, the lateral extent of the heated region 21 will increase as a result of the thermal conduction of said material. Any heating device for heating, at a certain time, a heated region 21 of the nano-pipette 10 without heating cold regions 22, 23 of the nano-pipette 10, can be used as a heating element 20. If Referring again to Figure 3a, the device 1 also includes a displacement member 30 for moving the heated region 21 relative to the nano-pipette 10. In the embodiment where the heating element 20 is a tantalum filament 24 surrounding a section of the nano-pipette 10, the displacement member 30 may, for example, be a linear actuator adapted to move the heating element 20 and / or the nano-pipette 10 one with respect to the other. In the embodiment where the heating element 20 is a laser 26, the displacement element may comprise a linear actuator as described above or a rotating device directing the laser beam to different regions of the nanopipette 10 as shown in Figure 3c. Finally, the device 1 may comprise a control device 40 adapted to determine the presence of liquid at the distal end 13 of the nano-pipette 10. The control device 40 may for example comprise an optical detector 41 coupled to an optical transmitter 42 emitting radiation. The control device may, for example, measure a change in the absorption or transmission of the radiation in the presence of liquid 14. Alternatively, the control device 40 may consist of two electrodes placed respectively at the proximal end 12 and distal end. 13 as well as an electrical conductivity measuring element between these two electrodes. The electrodes will be adapted so that the conductivity measurement is positive when the nano-pipette 10 is filled, that is to say when there is no more non-conductive gas bubble in the nano-pipette 10. The control device 40 may employ other physical principles as required by those skilled in the art. Referring now to Figure 4, it details the flowchart of a filling process according to the invention. Figures 5a to 5d illustrate the state of the nano-pipette 10 during the various steps of the filling process. A first introduction step 100 involves introducing a liquid 14 into the nano-pipette 10 through the large opening 12a terminating its proximal end 12. The introduction of the liquid 14 creates a gas bubble 15 at the distal end 13 During this step, the heating element 20 is positioned near the proximal end 12 with the displacement element 30 if necessary, so that the heated region 21 comprises a portion 14a of the liquid 14. The heating element 20 is inactive during the introduction step 100. The state of the nano-pipette 10 at the end of the introduction step 100 is shown in FIG. 5a.

Au cours d'une étape de chauffage 200, on chauffe au moyen de l'élément de chauffage 20, la région chauffée 21 de la nano-pipette 10. La partie 14a du liquide 14 comprise dans la région chauffée 21 est donc aussi chauffée et va se vaporiser en un gaz 14g du liquide 14. Le gaz 14g va se condenser en gouttelettes 18 au niveau des régions froides de la nano-pipette 10 comme indiqué sur la figure 5b et sur la photographie de la figure 9a. Les régions froides proximales 22 et distales 23 sont des régions situées de part et d'autre de la région 21 suivant l'axe longitudinal X. La région froide proximale 22 est située du côté de l'extrémité proximale 12 par rapport à la région chauffée 21. Elle est remplie de liquide 14. La présence du liquide 14 empêche alors la formation de gouttelettes 18 au niveau de la région froide proximale 22. During a heating step 200, the heated region 21 of the nano-pipette 10 is heated by means of the heating element 20. The portion 14a of the liquid 14 included in the heated region 21 is therefore also heated and The gas 14g will condense into droplets 18 at the cold regions of the nano-pipette 10 as shown in FIG. 5b and in the photograph of FIG. 9a. The proximal cold regions 22 and distal regions 23 are regions located on either side of the region 21 along the longitudinal axis X. The proximal cold region 22 is situated on the side of the proximal end 12 relative to the heated region. 21. It is filled with liquid 14. The presence of the liquid 14 then prevents the formation of droplets 18 at the proximal cold region 22.

La région froide distale 23 est, quant à elle, située du côté de l'extrémité distale 13 par rapport à la région chauffée 21. Elle contient la bulle de gaz 15 et le gaz 14g peut donc se condenser sur la surface intérieure 16 de la nano-pipette 10. Le gaz 14g se condense sous la forme de gouttelettes 18 qui sont donc plus proches de l'extrémité distale 13 que ne l'était la partie 14a du liquide 14. Ceci a donc permis de déplacer une partie 14a du liquide 14 en direction de l'extrémité distale 13. Puis, au cours d'une étape de déplacement 300, la région chauffée 21 va être déplacée par rapport à la nanopipette 10 à l'aide du dispositif de déplacement 30 selon la direction longitudinale X. Le sens du déplacement est orienté de l'extrémité proximale 12 vers l'extrémité distale 13. La région chauffée 21 va donc se rapprocher des gouttelettes 18 déposées dans la région froide distale 23 et les régions froides proximales 22 et distales 23 vont donc être modifiées. The distal cold region 23 is, for its part, situated on the side of the distal end 13 with respect to the heated region 21. It contains the gas bubble 15 and the gas 14g can therefore condense on the inner surface 16 of the nano-pipette 10. The gas 14g condenses in the form of droplets 18 which are therefore closer to the distal end 13 than was the portion 14a of the liquid 14. This has allowed to move a portion 14a of the liquid 14 in the direction of the distal end 13. Then, during a displacement step 300, the heated region 21 will be displaced with respect to the nanopipette 10 by means of the displacement device 30 in the longitudinal direction X. The direction of movement is oriented from the proximal end 12 to the distal end 13. The heated region 21 will thus approach the droplets 18 deposited in the distal cold region 23 and the proximal cold regions 22 and distal 23 will therefore be changed.

La région froide proximale 22, située du côté de l'extrémité proximale 12 par rapport à la région chauffée 21, va s'étendre en direction de l'extrémité distale à la suite de la région chauffée 21. La région froide distale 23, située du côté de l'extrémité distale 13 par rapport à la région chauffée 21, va se contracter en direction de l'extrémité distale suite à l'avancée de la région chauffée 21. Ceci est illustré figure 5c. Lorsque les gouttelettes 18 entrent dans la région chauffée 21, elles vont être à nouveau chauffées, vont à nouveau s'évaporer et se redéposer en majorité dans la région froide distale 23, en direction de l'extrémité distale 13 de la nano-pipette 10. La présence de la région chauffée 21 empêche les gouttelettes 18 de venir se déposer dans la région froide proximale 22 comme indiqué sur la figure 5d. The proximal cold region 22, located on the proximal end 12 side with respect to the heated region 21, will extend toward the distal end following the heated region 21. The distal cold region 23, located on the side of the distal end 13 with respect to the heated region 21, will contract in the direction of the distal end following the advance of the heated region 21. This is illustrated in Figure 5c. When the droplets 18 enter the heated region 21, they will be heated again, will again evaporate and redeposit mostly in the distal cold region 23, towards the distal end 13 of the nano-pipette 10 The presence of the heated region 21 prevents the droplets 18 from settling in the proximal cold region 22 as shown in Figure 5d.

Le déplacement de l'élément de chauffage 20 permet donc de déplacer une partie 14a du liquide 14 en direction de l'extrémité distale 13. The displacement of the heating element 20 thus makes it possible to move a portion 14a of the liquid 14 towards the distal end 13.

Pour permettre un remplissage optimal de la nano- pipette 10, la vitesse de déplacement relatif de la région chauffée 21 par rapport à la nano-pipette 10 pourra être comprise entre deux vitesses limites, une vitesse basse 31 et une vitesse haute 32. To allow an optimal filling of the nano-pipette 10, the relative speed of movement of the heated region 21 with respect to the nano-pipette 10 may be between two limit speeds, a low speed 31 and a high speed 32.

Si l'on se réfère à la figure 6a et à la photographie de la figure 9b, la vitesse basse 31 correspond à la vitesse de déplacement relatif en dessous de laquelle des bouchons 19 se forment. Lorsque la vitesse de déplacement est faible, les gouttelettes 18 vont grossir et finir par remplir toute la section de la nano-pipette 10, prise perpendiculairement à la direction longitudinale X. Elles constituent alors des bouchons 19 formés d'une partie de liquide 19a entourée de deux bulles de gaz 15a et 15 b. Lorsque le déplacement de la région chauffée 21 amène celle-ci au niveau d'un bouchon 19, le liquide 19a va être chauffé et s'évaporer. La présence du bouchon 19 empêche cependant ledit gaz d'aller se déposer au niveau de la région froide distale 23 et celui-ci va donc se déposer en gouttelettes 19b au niveau de la région froide proximale 22. Les bouchons 19 vont donc entraîner un déplacement du liquide 19a vers l'extrémité proximale 12 ce qui correspond à un fonctionnement non optimal du dispositif de remplissage 1. Ce cas est illustré sur la figure 6b. Si l'on se réfère maintenant à la figure 7a, la vitesse haute 32 correspond à une vitesse au-dessus de laquelle la région chauffée 21 dépasse certaines des gouttelettes 18. On peut distinguer les gouttelettes proximales 18a situées du côté de l'extrémité proximale 12 par rapport à la région chauffée 21, selon la direction longitudinale X, et les gouttelettes distales 18b situées du côté de l'extrémité distale 13 par rapport à la région chauffée 21. Dans ce cas, illustré figure 7b, le fonctionnement est aussi non optimal car les gouttelettes proximales 18a se trouvant dans la région chauffée 21, une fois chauffées et vaporisées vont se condenser majoritairement dans la région froide proximale 22, l'accès à la région froide proximale 23 étant bloqué par la région chauffée 21. Les valeurs des vitesses basse 31 et haute 32 dépendent du liquide 14 utilisé et des caractéristiques de la nano-pipette 10 comme par exemple sa matière, son état de surface interne 16 et sa géométrie. Lesdites vitesses pourront être définies grâce à un procédé de calibration réalisé préalablement à l'exécution du procédé de remplissage selon l'invention. Un tel procédé de calibration consiste par exemple, en se référant à nouveau à la figure 4, à réaliser une succession 500 d'étapes comprenant par exemple les étapes de chauffage 200, de déplacement 300, ainsi qu'une étape de contrôle 400 de la quantité de liquide 14 déplacée jusqu'à l'extrémité distale 12. Cette étape de contrôle 400 pourra par exemple être réalisée au moyen d'un dispositif de contrôle 40 adapté pour déterminer la présence de liquide au niveau de l'extrémité distale 13 de la nano-pipette 10. Referring to Fig. 6a and the photograph of Fig. 9b, the low speed 31 corresponds to the relative speed of movement below which plugs 19 are formed. When the speed of movement is low, the droplets 18 will grow and eventually fill the entire section of the nano-pipette 10, taken perpendicular to the longitudinal direction X. They then constitute plugs 19 formed of a portion of liquid 19a surrounded two gas bubbles 15a and 15b. When the displacement of the heated region 21 brings it to a plug 19, the liquid 19a will be heated and evaporated. The presence of the plug 19, however, prevents said gas from being deposited at the level of the distal cold region 23 and it will therefore be deposited in droplets 19b at the proximal cold region 22. The plugs 19 will therefore cause a displacement liquid 19a to the proximal end 12 which corresponds to a non-optimal operation of the filling device 1. This case is illustrated in Figure 6b. Referring now to FIG. 7a, the high speed 32 corresponds to a speed above which the heated region 21 exceeds some of the droplets 18. The proximal end proximal droplets 18a can be distinguished. 12 relative to the heated region 21, in the longitudinal direction X, and the distal droplets 18b located on the side of the distal end 13 relative to the heated region 21. In this case, illustrated in Figure 7b, the operation is also not optimal because the proximal droplets 18a in the heated region 21, once heated and vaporized will condense predominantly in the proximal cold region 22, the access to the proximal cold region 23 being blocked by the heated region 21. The values of the low 31 and high 32 speeds depend on the liquid 14 used and the characteristics of the nano-pipette 10 such as its material, its surface state internal 16 and its geometry. Said speeds can be defined by means of a calibration process carried out prior to the execution of the filling method according to the invention. Such a calibration method consists for example, referring again to FIG. 4, to a succession of steps 500 comprising, for example, the heating steps 200, the displacement steps 300, and a control step 400 of FIG. amount of liquid 14 moved to the distal end 12. This control step 400 may for example be performed by means of a control device 40 adapted to determine the presence of liquid at the distal end 13 of the nano-pipette 10.

Le dispositif de contrôle peut par exemple comprendre un détecteur optique 41 couplé à un émetteur optique 42 émettant un rayonnement. Le dispositif de contrôle peut par exemple mesurer un changement d'absorption ou de transmission du rayonnement en présence de liquide 14. Le dispositif de contrôle pourra employer d'autres principes physiques selon les besoins et les contraintes. Cette succession d'étapes 500 pourra être réalisée pour différentes vitesses de déplacement relatif afin de comparer les quantités de liquide déplacées pour chaque 35 vitesse de déplacement. On déterminera ainsi une vitesse de déplacement relatif optimale 33. Dans le cas d'une nano-pipette 10 en quartz et d'un liquide 14 de caractéristiques proches de celles de l'eau, la vitesse de déplacement pourra être comprise entre 10 millionièmes de mètre par seconde et 1 millième de mètre par seconde. À mesure que la région chauffée 21 se rapproche de l'extrémité distale 13, la section de la nano-pipette prise perpendiculairement à la direction longitudinale X se rétrécit du fait de la paroi tubulaire évasée 11 de la nano-pipette 10. Ladite section se rétrécissant, les propriétés de condensation des gouttelettes 18 et de formation des bouchons 19 sont modifiées et la vitesse de déplacement pourra être adaptée en conséquence. The control device may for example comprise an optical detector 41 coupled to an optical transmitter 42 emitting radiation. The control device may for example measure a change in absorption or transmission of the radiation in the presence of liquid 14. The control device may employ other physical principles as required and constraints. This succession of steps 500 may be performed for different relative displacement speeds in order to compare the quantities of liquid displaced for each displacement speed. This will determine an optimum relative displacement speed 33. In the case of a quartz nano-pipette 10 and a liquid 14 with characteristics close to those of water, the speed of displacement may be between 10 millionths of a second. meter per second and 1 thousandth of a meter per second. As the heated region 21 approaches the distal end 13, the section of the nano-pipette taken perpendicular to the longitudinal direction X narrows due to the flared tubular wall 11 of the nano-pipette 10. narrowing, the condensation properties of the droplets 18 and formation of the caps 19 are modified and the speed of displacement can be adapted accordingly.

La vitesse de déplacement pourra par exemple augmenter lorsque la région chauffée 21 se rapproche de l'extrémité distale 13 de la nano-pipette 10. Il peut être nécessaire de réitérer l'étape de 20 déplacement 300 ainsi que l'étape de chauffage 200 une ou plusieurs fois pour déplacer une partie du liquide 14 jusqu'à l'extrémité distale 13. On peut par exemple désactiver l'élément de chauffage 20, déplacer la région chauffée 21 en direction 25 de l'extrémité proximale, jusqu'à une position adaptée pour que la région chauffée 21 comprenne une partie 14b du liquide 14. On procède ensuite à nouveau aux étapes de chauffage 200 et de déplacement 300 afin d'amener la majorité du liquide compris dans la partie 14b jusqu'à 30 l'extrémité distale 13. Au cours du procédé décrit ci-dessus, le déplacement d'une partie du liquide 14 vers l'extrémité distale 13 va entraîner le déplacement de la bulle de gaz 15 en direction de l'extrémité proximale 12. Il est 35 possible de déplacer ainsi la bulle de gaz 15 jusqu'à ce qu'elle se trouve au niveau de l'extrémité proximale 12. Il est ensuite possible de retirer cette bulle de gaz 15 de la nano-pipette 10, une fois que ladite bulle de gaz 15 se situe dans la partie de grand diamètre de la 5 nano-pipette 10, c'est-à-dire à proximité de l'extrémité proximale 12. La bulle de gaz 15 peut par exemple être retirée par des moyens mécaniques comme l'introduction d'une tige à l'intérieur de la nano-pipette 10 depuis l'extrémité proximale 12. The speed of displacement may for example increase when the heated region 21 approaches the distal end 13 of the nano-pipette 10. It may be necessary to repeat the displacement step 300 as well as the heating step 200. or several times to move a portion of the liquid 14 to the distal end 13. For example, the heating element 20 may be deactivated, the heated region 21 may be moved towards the proximal end to a position adapted for the heated region 21 to include a portion 14b of the liquid 14. The heating and displacement steps 300 are then again carried out in order to bring the majority of the liquid in the portion 14b to the distal end. 13. During the process described above, the displacement of a portion of the liquid 14 towards the distal end 13 will cause the gas bubble 15 to move towards the proximal end 12. It is thus possible to move the gas bubble 15 until it is at the proximal end 12. It is then possible to remove this gas bubble 15 from the nano-pipette 10, once said gas bubble 15 is located in the large diameter part of the nano-pipette 10, i.e. close to the proximal end 12. The gas bubble 15 may for example be removed by means such as the introduction of a rod inside the nano-pipette 10 from the proximal end 12.

Claims

REVENDICATIONS1. A method of filling a nano-pipette (10) with a liquid (14), the nano-pipette (10) extending in a longitudinal direction (X), by means of a flared wall (11) having a inner surface (16), from a proximal end (12) terminated by a large opening (12a) to a distal end (13) terminated by a small aperture (13a), the inner section of the small aperture (13a) forming a circle of diameter less than or equal to 60 nanometers, the method comprising at least the following steps: a step of introducing (100) liquid (14) into the nano-pipette (10) through the large opening ( 12a) terminating its proximal end (12), performed by means of a liquid introduction device (70); a heating step (200), performed by means of a heating element (20), a heated region (21) of the nano-pipette (10), proximal cold regions (22) and distal regions (23). ) of the nano-pipette (10) remaining cold, the heated region (21) comprising a portion (14a) of the liquid (14), so that said portion (14a) vaporizes and condenses into droplets (18) on the inner surface (16) of the nano-pipette (10) in the distal cold region (23); and a step of relative displacement (300) in the longitudinal direction (X) of the heated region (21) relative to the nano-pipette (10), performed by means of a displacement element (30), to bring said heated region (21) near the distal end (13) of the nano-pipette (10).

2. Method according to the preceding claim, wherein the relative speed of movement of the heated region (21) relative to the nano-pipette (10) during the displacement step (300) is greater than a low speed (31). ) below which the droplets (18) form plugs (19), and below a high speed (32) above which a plurality of droplets (18a) are on the proximal end (12) side relative to the heated region (21).

A method according to any one of the preceding claims, wherein the relative speed of movement of the heated region (21) relative to the nano-pipette (10) during the displacement step (300) is defined by a calibration method comprising at least one succession (500) of steps comprising at least the heating step (200), the relative displacement step (300) and a control step (400) of the quantity of liquid (14) moved to the distal end (12) performed by means of a control device (40), said succession (500) of steps being performed for different relative speeds of displacement.

A method according to any one of the preceding claims, wherein the relative rate of displacement of the heated region (21) relative to the nano-pipette (10) during the displacement step (300) is between 10 millionths of a meter per second and one thousandth of a meter per second.

The method of any one of the preceding claims, wherein the step of moving (300) is repeated at least once.

The method according to any one of the preceding claims, wherein the relative speed of movement of the heated region (21) relative to the nano-pipette (10) during the displacement step (300) increases when the region heated (21) approaches the distal end (13) of the nano-pipette (10).

7. Device for filling (1) a nano-pipette (10) with a liquid (14), the nano-pipette (10) extending in a longitudinal direction (X), by means of a flared wall ( 11) having an inner surface (16), from a proximal end (12) terminated by a large opening (12a) to a distal end (13) terminated by a small opening (13a), the inner section of the small opening (13a) falling within a circle of diameter less than or equal to 60 nanometers, the device comprising at least: a liquid introduction element (70) adapted to introduce liquid (14) into the nano-pipette (10) By the large opening (10a) of its proximal end (12); a heating element (20) adapted to heat a heated region (21) of the nano-pipette (10), cold proximal (22) and distal (23) regions of the nano-pipette (10) remaining cold, the heated region (21) comprising a portion (14a) of the liquid (14), the heating element (20) being adapted for said portion (14a) to vaporize and condense into droplets (18) on the inner surface (16); ) of the nano-pipette (10) in the distal cold region (23) and a displacement element (30) adapted to relatively move the heated region (21) relative to the nanopipette (10) in the longitudinal direction (X ) and adapted to bring said heated region (21) close to the distal end (13) of the nano-pipette (10).

8. Device according to claim 7, wherein the heating element (20) comprises a filament (24) traversed by a current.

Apparatus according to any one of claims 7 and 8, wherein the heating element (20) comprises a laser (26).