FR2980578A1 - Procede et kit pour le diagnostic in vitro du cancer du sein - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro du cancer du sein chez un individu, comprenant la détection, dans un échantillon biologique issu dudit individu, d'un ensemble d'auto-anticorps dirigés respectivement contre les protéines GAL3, PAK2, PHB2, RUVBL1 et RACK1. Un kit pour la mise en oeuvre d'un tel procédé comporte au moins une protéine parmi l'ensemble comprenant GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2.

Description

9805 7 8 1 La présente invention s'inscrit dans le domaine du diagnostic en oncologie. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de diagnostic in vitro du cancer du sein chez un individu, notamment du cancer du sein à un stade précoce du développement tumoral, et plus particulièrement encore des carcinomes in situ du sein. Elle concerne également un kit pour un tel diagnostic. Parmi les cancers solides, les cancers du sein sont les plus fréquents chez la femme et la première cause de mortalité parmi les cancers 10 gynécologiques des pays développés. De façon générale, l'observation d'une lésion mammaire peut s'effectuer à l'heure actuelle de différentes manières : découverte fortuite par l'autopalpation des seins, existence d'une symptomatologie clinique ou recherche de signes d'appels radiographiques (mammographie, IRM, 15 échographie) lors d'un dépistage systématique ou organisé du cancer du sein. En particulier, parmi les cancers du sein, le pourcentage de cancers détectés en tant que carcinome canalaire in situ (CCIS) a été multiplié par dix au cours des vingt dernières années, notamment chez les femmes âgées de plus de cinquante ans, cette augmentation s'expliquant en grande partie par le 20 développement du dépistage mammographique. 20 à 25 % des nouveaux cas de cancer du sein diagnostiqués chaque année s'avèrent être des CCIS (Jernal et al., 2009). La mise en évidence des formes précoces de cancer du sein, et notamment des CCIS, constitue à l'heure actuelle un objectif prioritaire en 25 oncologie, car le diagnostic précoce d'un stade pré-invasif permet de diminuer significativement le risque de rechute et d'augmenter également significativement le taux de survie des patientes. Si l'efficacité du dépistage organisé par mammographie pour la détection des formes précoces du cancer du sein ne fait aucun doute, plusieurs 30 études ont cependant montré une diminution significative de la sensibilité de la mammographie avec l'augmentation du degré de la densité mammaire, et notamment en ce qui concerne les CCIS. La sensibilité d'un test de dépistage ou de diagnostic est définie dans la présente description de manière classique en elle-même, c'est-à-dire comme la proportion d'individus positifs effectivement bien détectés par le test. La spécificité du test correspond quant à elle à la proportion d'individus négatifs effectivement bien détectés par le test. Ainsi, la majorité des femmes pour lesquelles l'examen par mammographie montre des anormalités ne présentent pas de cancer, la variabilité étant principalement basée sur la densité mammaire mais également sur un certain nombre de paramètres tels que l'évaluation par le radiologiste, l'âge de la femme, de mauvaises pratiques opératoires, etc. Des études rétrospectives ont en particulier montré un taux substantiel de faux-négatifs, avec des mammogrammes antérieurs montrant une anormalité jusqu'à la moitié des cas (Brem et al., 2003). La mammographie expose ainsi à un risque de sur-diagnostic correspondant à un faux-positif : la patiente est considérée comme porteuse d'un cancer du sein alors qu'elle ne l'est pas, l'exposant ainsi à un traitement non justifié avec tous les effets secondaires et les risques qui s'ensuivent. Des efforts considérables ont été accomplis pour développer une méthode de dépistage efficace des CCIS, sans résultats entièrement probants à ce jour. La présente invention vise à proposer un nouvel outil non invasif pour la détection des formes précoces de cancer du sein, notamment des CCIS, qui soit fiable et qui présente en particulier une sensibilité et une spécificité de détection plus élevées que celle des techniques mises en oeuvre par l'art antérieur, et ce y compris pour les patientes présentant une densité mammaire élevée. Dans cette optique, les présents inventeurs se sont plus particulièrement intéressés aux techniques mettant en oeuvre la détection in vitro, par des techniques issues de la biologie moléculaire, de marqueurs tumoraux présents dans un échantillon biologique issu de l'individu. De tels procédés ont notamment été proposés pour les marqueurs tumoraux CA15-3 et l'antigène carcinoembryonaire (CEA), pour la détection du cancer du sein à un stade avancé. Ces procédés présentent notamment les avantages généraux d'être non-invasifs et d'un degré élevé de reproductibilité.

Cependant, aucun biomarqueur permettant un dépistage fiable de formes précoces du cancer du sein n'a encore été identifié à ce jour. Il a maintenant été découvert par les présents inventeurs que certains auto-anticorps circulants dans le sang des patientes atteintes de cancer constituaient, seuls ou en combinaison, des biomarqueurs tumoraux particulièrement fiables pour la détection des formes précoces des cancers du sein, et notamment des CCIS. De façon générale, les auto-anticorps sont des anticorps produits de manière naturelle et dirigés contre un antigène que le système immunitaire de l'individu a reconnu comme étant étranger à l'organisme. En particulier, pour un individu atteint de cancer, la tumeur produit des protéines dites tumorales. Une protéine tumorale telle que définie dans la présente description peut être une protéine surexprimée par les cellules tumorales par rapport aux cellules normales, en raison par exemple d'une régulation transcriptionnelle anormale, aussi bien qu'une forme altérée d'un protéine sauvage exprimée par les cellules normales, cette altération pouvant par exemple consister en une modification dans la séquence d'acides aminés primaire, dans la structure secondaire, tertiaire ou quaternaire, ou en une modification posttraductionnelle, par exemple une glycosylation anormale. La production de telles protéines tumorales peut ainsi déclencher une réponse immunitaire chez l'individu, ce qui se traduit par la production d'auto-anticorps dirigés contre ces protéines. Ces auto-anticorps peuvent être présents sous forme d'anticorps libres circulants ou encore sous forme de complexes immuns circulants comprenant des auto-anticorps liés à leur protéine tumorale cible. Ceci se produisant des mois, voire des années, avant le diagnostic clinique d'une tumeur, et, de par la nature de la réponse immunitaire, des auto-anticorps pouvant être produits en réponse à la présence d'une quantité très faible de protéine tumorale circulante, la détection de ces auto-anticorps s'avère particulièrement adaptée au diagnostic précoce des cancers (Qiu et al., 2008). Toutefois, les procédés de détection des auto-anticorps circulants identifiés à ce jour présentent une sensibilité et une spécificité insuffisantes pour constituer des outils fiables de diagnostic des formes précoces pré-invasives des cancers du sein. Les présents inventeurs ont maintenant découvert que des auto-anticorps dirigés contre les protéines Galectin-3 (GAL3), p21 activated kinase 2 (PAK2), Prohibitin-2 (PHB2), Receptor for activated C-kinase 1 (RACK1), et RuvB-like 1(RUVBL1), constituaient des biomarqueurs tumoraux permettant de réaliser un diagnostic fiable du cancer du sein, y compris dans ses formes précoces. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro du cancer du sein chez un individu, notamment des formes précoces du cancer du sein, et plus particulièrement des carcinomes in situ du sein, qui comprend la détection, dans un échantillon biologique issu dudit individu, d'un ensemble d'auto-anticorps dirigés respectivement contre chacune des protéines GAL3, PAK2, PHB2, RUVBL1 et RACK1. Ainsi, plus précisément, le procédé comprend la détection, dans ledit échantillon biologique, d'auto-anticorps dirigés contre la protéine GAL3, d'auto- anticorps dirigés contre la protéine PHB2, d'auto-anticorps dirigés contre la protéine RUVBL1, d'auto-anticorps dirigés contre la protéine RACK1 et d'auto-anticorps dirigés contre la protéine PAK2. La détection combinée de ces cinq types d'auto-anticorps permet avantageusement d'obtenir une sensibilité, une spécificité et une précision particulièrement élevées, pour le diagnostic du cancer du sein, notamment concernant le CCIS et les formes précoces du cancer du sein, tout en étant associée à une grande facilité de mise en oeuvre et à un coût de mise en oeuvre réduit, en raison notamment du nombre qui reste faible de types d'auto- anticorps détectés.

Ainsi, par la détection et/ou la quantification de la présence d'une réponse immunitaire particulière chez l'individu testé, cette réponse immunitaire étant liée à la présence de cellules tumorales de cancer du sein, le procédé selon l'invention constitue avantageusement un moyen fiable et non- invasif de diagnostic du cancer du sein, y compris à des stades précoces. Plus généralement, la présente invention concerne l'utilisation d'une protéine parmi GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2, pour le diagnostic ou pour le pronostic in vitro du cancer du sein, ou encore pour l'évaluation de l'efficacité d'un traitement thérapeutique.

Les protéines GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2 sont connues en elles-mêmes. La protéine GAL3, également nommée « Mac-2 » ou « LGALS3 » (pour lectin, galactoside binding, soluble, 3, ou galectin-3) (Genbank Gene ID: 3958, NC_000014.8; NG_017089.1), appartient à la famille des lectines solubles liées aux 8-galactosides. Elle a plusieurs rôles régulateurs importants, notamment dans la réponse immunitaire humorale par les processus de régulation des lymphocytes T, et dans le cancer par la résistance à l'apoptose, la régulation des processus de croissance, d'adhésion, de différenciation et d'angiogenèse cellulaire, ainsi que la régulation de l'invasion cellulaire et des métastases. GAL3 est sécrétée dans la matrice extracellulaire, et est fortement exprimée dans les lignées cellulaires agressives du cancer du sein MCF10 DCIS.com and MCF1OCA. La surexpression de GAL-3 dans les lignées non tumorales entraine la formation de tumeurs et de métastases, tandis que sa suppression entraine la disparition des propriétés tumorigènes et métastatiques des cellules. PHB2 pour « prohibitine 2 » (Genbank Gene ID: 11331, NC 000012.11, NG 021408.1, Gl:299758502) est une protéine qui joue un rôle important dans la modulation de la transcription génique induite par les oestrogènes, par le recrutement d'histone déacétylases. Les niveaux de PHB2 sont plus élevés dans le plasma des patients cancéreux. De plus, l'expression de PHB2 est corrélée positivement avec les niveaux du récepteur aux oestrogènes, et inversement avec le grade des tumeurs dans les biopsies de cancer du sein humain. RACK1, nommée également GNB2L1 pour « guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 » (Genbank Gene ID: 10399, NC_000005.9) est une protéine homologue de la sous-unité b des protéines G héterotrimériques. RACK1 participe à l'ancrage membranaire de plusieurs protéines (notamment la Protéine Kinase C) et à la coordination de la croissance, l'adhésion et la division cellulaire. RACK1 promeut la prolifération, l'invasivité et/ou la formation de métastases dans le cancer du sein in vitro et in vivo. RUVBL1, pour RuvB-like 1, également nommée « Pontine » ou « Tip49 » (Genbank Gene ID: 8607, NC_000003.11 6I:224589815) est une protéine qui fait partie de plusieurs complexes protéiques de haut poids moléculaire fortement impliqués dans les fonctions tumorales telles que la régulation de la transcription, la détection et la réparation des dommages de l'ADN, la transformation cellulaire, et la croissance cellulaire. Le niveau d'expression de RUVBL1 augmente dans les tissus cancéreux, mais son niveau d'expression dans le cancer du sein n'a pas été étudié à l'heure actuelle.

PAK2 pour « P21-activated kinase 2 » (Genbank Gene ID: 5062, NC_000003.11, NG 009227.1 01:219521842) est une protéine appartenant à la famille des sérine/thréonine kinases qui relient les Rho GTPases à la réorganisation du cytosquelette et à la signalisation nucléaire. PAK2 est unique dans la famille des PAK, car clivée et activée par la caspase 3 et les protéases similaires. De plus, PAK2 phosphoryle c-Jun, promouvant ainsi la transformation cellulaire stimulée par le facteur de croissance épidermique (EGF). Dans le cancer du sein, il a été récemment montré que PAK2 est fortement exprimée dans les lignées cellulaires humaines de cancer du sein et dans les tissus de carcinomes mammaires invasifs humains, par rapport respectivement aux lignées cellulaires mammaires épithéliales humaines non tumorales et aux tissus mammaires normaux adjacents.

Si ces cinq protéines sont connues en elles-mêmes en liaison avec le cancer du sein, la détection d'auto-anticorps présents dans un échantillon biologique et dirigés contre l'une d'elles n'a cependant jamais été évoquée par l'art antérieur, et d'autant moins en liaison avec le diagnostic in vitro de ce cancer. En particulier, les présents inventeurs ont maintenant découvert que les cellules tumorales de cancer du sein, et notamment du CCIS, produisaient des protéines tumorales qui provoquaient la production par l'organisme d'auto-anticorps dirigés contre elles, et que, pour GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2, ces auto-anticorps réagissaient avec la protéine sous forme sauvage, c'est-à-dire telle qu'exprimée par les cellules normales, sous forme recombinante ou encore obtenue par synthèse chimique, et qu'ils constituaient des biomarqueurs tumoraux particulièrement sensibles et spécifiques, facilement détectables et quantifiables, notamment par des techniques immuno-enzymatiques classiques en elles-mêmes.

Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, le procédé de diagnostic est réalisé à partir d'un échantillon d'un fluide de l'individu. Cet échantillon peut par exemple être un échantillon sanguin, d'urine, de lymphe, de fluide cérébrospinal ou d'un fluide mammaire de l'individu. De préférence, il s'agit d'un échantillon de sérum sanguin ou d'un échantillon de plasma.

De préférence, le procédé selon l'invention prévoit le dosage des auto- anticorps dirigés contre une protéine conforme à l'invention et présents dans l'échantillon biologique à tester, et la comparaison de la valeur de concentration obtenue avec une valeur seuil prédéterminée. Cette valeur seuil est de préférence déterminée expérimentalement, par la même méthode de dosage, au moyen de la même isoforme de la protéine, appliquée sur des cohortes de populations de même type (même âge) et dont le statut vis-à-vis du cancer est connu. En dernière étape, le procédé comprend l'attribution d'un statut sain ou atteint à l'individu concerné, en fonction du résultat de cette comparaison.

Lorsque le procédé de diagnostic prévoit le dosage d'une pluralité d'auto-anticorps dirigés chacun contre une protéine différente, il comprend de préférence avantageusement des étapes d'analyse statistique multivariée, classiques en elles-mêmes, pour obtenir pour chaque cohorte de population à statut connu donnée, une formule de combinaison linéaire et une valeur seuil définissant un statut sain et un statut atteint. Le procédé selon l'invention comprend alors une étape d'application de la formule de combinaison linéaire aux valeurs de concentration mesurées pour chaque type d'auto-anticorps de l'individu testé, la comparaison de la valeur finale ainsi obtenue avec la valeur seuil, puis l'attribution d'un statut sain ou atteint à l'individu concerné, en fonction du résultat de cette comparaison.

Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, la détection de l'ensemble d'auto-anticorps comprend la mise en contact de l'échantillon biologique avec un réactif d'analyse immunologique comportant au moins une protéine parmi GAL3, PAK2, PHB2, RUVBL1 et RACK1, et la détection de la présence de complexes formés par liaison spécifique de cette protéine et d'un auto-anticorps présent dans l'échantillon. Cette étape est réalisée pour chacune des protéines GAL3, PAK2, PHB2, RUVBL1 et RACK1. Le procédé selon l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre par des techniques de dosage immuno-enzymatique classiques en elles- mêmes, telles que le dosage dit ELISA (pour l'anglais « enzyme-linked immunosorbent assay »). Cette technique permet avantageusement de détecter et de doser la présence d'auto-anticorps dans l'échantillon biologique à tester. Elle présente notamment les avantages d'une grande facilité de mise en oeuvre, au moyen de réactifs et de matériels couramment disponibles dans le commerce et dans les laboratoires d'analyse. Le procédé selon l'invention est ainsi avantageusement simple et rapide à mettre en oeuvre, et il présente un fort degré de reproductibilité. Il est notamment particulièrement adapté pour être mis en oeuvre comme examen de routine, et qui plus est par des techniques de criblage à haut débit.

Dans des modes préférés de mise en oeuvre, le procédé de diagnostic décrit ci-dessus comprend des étapes de dosage de type ELISA indirect, qui comprennent, pour chaque auto-anticorps à détecter : - une étape de préparation, dans laquelle on fixe la protéine associée audit auto-anticorps sur un support, - une étape de mise en contact de l'échantillon biologique, à tester pour la présence des auto-anticorps, avec ledit support, - une étape de révélation comprenant la mise en contact du support avec un réactif comportant au moins un partenaire de liaison de l'auto- anticorps, ledit partenaire de liaison étant associé à un composé détectable, Le procédé tel que décrit ci-dessus, comprend préférentiellement une série de témoins de contrôle négatifs et positifs. Le partenaire de liaison est préférentiellement un anticorps, dit « anticorps secondaire ».

De préférence, mais non limitativement, le composé détectable est un fluorochrome, dont la détection et la quantification peuvent être effectuées par exemple au moyen d'un microscope à fluorescence. Selon des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, lorsque le support est une plaque à puits, une seule protéine conforme à l'invention peut être fixée dans chaque puits, permettant la détection d'un seul type d'auto- anticorps par puits, ou bien une pluralité de protéines différentes peuvent être fixées dans un même puits, permettant alors la détection d'une pluralité d'auto-anticorps simultanément dans chaque puits. Un deuxième aspect de l'invention concerne un kit pour le diagnostic in vitro du cancer du sein chez un individu, notamment des formes précoces du cancer du sein, et plus particulièrement des CCIS, qui comporte au moins une protéine parmi l'ensemble comprenant GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite au moins une protéine est une protéine recombinante. L'invention n'exclut pas pour autant la mise en oeuvre dans le kit de protéines extraites de fluides corporels ou de cultures de cellules d'individus sains ou atteints de cancer, ou de protéines entières ou fragments de protéines contenant l'épitope avec lequel réagit l'auto-anticorps, obtenus par synthèse chimique.

De préférence, le kit comporte au moins deux protéines parmi l'ensemble comprenant GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2, de préférence au moins trois, et préférentiellement au moins quatre. Préférentiellement encore, le kit comporte l'ensemble des protéines GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2, conditionnées séparément ou dans 10 un même contenant. Le kit objet de l'invention comporte en outre de préférence des réactifs et/ou des matériels classiquement utilisés pour la mise en oeuvre des tests ELISA, par exemple des plaques à puits, des moyens de détection de complexes formés par liaison de l'auto-anticorps et de la protéine associée, 15 comportant par exemple des anticorps secondaires anti-IgG humains, etc. Un autre aspect de l'invention vise une composition comportant au moins une protéine parmi l'ensemble comprenant GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2, pour son utilisation en tant que vaccin contre le cancer du sein. 20 De préférence, la composition comporte en outre un adjuvant, classique en lui-même pour entrer dans la constitution des vaccins. Les caractéristiques et avantages du procédé selon l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec 25 l'appui des figures 1 à 3, dans lesquelles : - la figure 1 représente, schématiquement, la stratégie appliquée pour identifier les auto-anticorps selon l'invention ; - la figure 2A montre le résultat d'une analyse par Western Blot bidimensionnel des fractions respectivement cytosolique (piste 1), 30 membranaire (piste 2) et nucléaire (piste 3) obtenues par fractionnement subcellulaire de cellules de la lignée MCF1ODCIS.com, mettant en évidence les marqueurs subcellulaires associés à chaque fraction, HSP90 pour la fraction cytosolique, Calnexine pour la fraction de la membrane/organelle, PARP1 pour la fraction nucléaire (dépôt de 1-10 pg / piste) ; - la figure 2B représente des gels d'électrophorèse bidimensionnelle de lysats de fractions subcellulaires, respectivement cytosolique (gel 1), membranaire (gel 2) et nucléaire (gel 3) de cellules de la lignée MCF1ODCIS.com après criblage avec un mélange de sérums d'individus atteints de CCIS ; - la figure 2C montre des agrandissements de régions de gels d'électrophorèse bidimensionnelle de lysats de fractions subcellulaires, respectivement cytosolique et membranaire, de cellules de la lignée MCF1ODCIS.com après criblage avec un mélange de sérums d'individus atteints de CCIS (1ère ligne), présentant des lésions du sein bénignes (BBL) (2ème ligne), immuno-déficients (AID) (3ème ligne) et sains (HC) (4ème ligne). Pour chaque colonne, les flèches indiquent respectivement la localisation des tâches correspondant aux protéines GAL3 (1ère colonne), RACK1 (2ème colonne), PAK 2 (3ème colonne), PHB2 (4ème colonne) et RUVBL1 (5ème colonne) ; - et les figure 3A à 3B représentent les courbes issues d'une analyse multiparamétrique ROC illustrant la spécificité et la sensibilité pour les auto-anticorps (biomarqueurs) réagissant avec la protéine GAL3, la protéine PAK2, la protéine RUVBL1, la protéine PHB2, la protéine RACK1, séparément ou en combinaison (panel des cinq biomarqueurs), pour des groupes d'individus atteints de CCIS versus individus sains (figure 3A), d'individus présentant un cancer du sein primaire de stade précoce versus individus sains (figure 3B) et d'individus atteints de DCIS plus présentant un cancer du sein primaire de stade précoce versus individus sains (figure 3C). Matériel et Méthodes 1. Sélection des patientes Les échantillons de sérum de femmes atteintes de cancer du sein ont été obtenus du centre cancéreux du Val d'Aurelle (Montpellier, France) entre septembre 2004 et Février 2008. Le protocole de l'étude a été approuvé par les Comités-Consultatifs-de-Protection-des-Personnes de Montpellier (Saint Eloi) et la commission de révision de RBM03-63-INSERM. Toutes les patientes ont fourni leur consentement éclairé par écrit afin de participer à l'étude. Les échantillons ont été collectés, traités et stockés de la manière telle que décrite dans la publication de Desmetz et al., 2009. La population utilisée pour l'étape de recherche, nommée « Groupe de découverte » (Groupe 1) comprend 80 individus de statut connu : 20 femmes ayant subi une chirurgie et un diagnostic histopathologique de CCIS (grade Ill, n= 10 ; grade III, n= 10), 20 femmes de même âge présentant des lésions du sein bénignes (BBL), 20 femmes de même âge en tant que contrôles sains (HC) et présentant des mamogrammes négatifs, des examens physiques des seins négatifs pour au moins les quatre dernières années, et pas d'historique de malignité, immunodéficience, désordre auto-immun, hépatite, ou infection HIV antérieurs, et enfin 20 femmes atteintes de déficience auto-immune (AID) accompagnée par une inflammation (arthrite rhumatoïde, n= 10; lupus érythémateux systémique, n= 10).

Le sérum d'un groupe entièrement différent est aléatoirement divisé en deux groupes : - un groupe d'apprentissage (Groupe 2) comprenant 91 échantillons d'individus de même âge (28 CCIS, 29 patientes atteintes d'un cancer du sein primaire à un stade précoce (PBC), et 34 HC), - un groupe de validation (Groupe 3) comprenant 91 échantillons indépendants de même âge (27 CCIS, 30 patientes atteintes de PBC, et 34 HC). Les CCIS ont été classifiés d'après la classification des tumeurs de l'Organisation Mondiale de la Santé et ont été gradés d'après Bloom and Richardson. Les patientes ont été classifiées selon leurs stades de cancer grâce au Manuel sur la classification du cancer de l'« American Joint Committee », sixième édition. Aucune patiente n'a reçu de thérapie par néoadjuvant, toutes ont subi une chirurgie dans les quatre semaines suivant le diagnostic initial de cancer du sein. 2. Culture cellulaire La lignée cellulaire humaine MCF1ODCIS.com de cancer du sein, plus précisément de CCIS de type comedo, du modèle de xénogreffe MCF10A a été cultivée par des méthodes connues (par exemple de Tait et al., 2007). 3. Fractionnement subcellulaire Le fractionnement subcellulaire a été effectué grâce au kit « ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit » (Calbiochem, Merckbiosciences, Germany), en suivant les recommandations du fabricant. La qualité du fractionnement du protéome subcellulaire a été confirmée en utilisant le kit « ProteoExtract® S-PEK Antibody Control kit » (Calbiochem). 4. Electrophorèse à deux dimensions (2-DE) et analyse Western Blot L'ensemble des réactifs et des matériels pour les expériences 2DE/western blot proviennent de GE Healthcare (Uppsala, Sweden). Toutes les expériences ont été dupliquées.

Les techniques mises en oeuvre sont telles que décrites dans Desmetz et al., 2009. 5. Digestion enzymatique sur gel et spectrométrie de masse Une coloration argentique des gels d'électrophorèse à deux dimensions permet de visualiser les spots qui sont ensuite excisés et digérés dans le gel par de la trypsine (Promega), comme indiqué dans Desmetz et al., 2009. Les analyses de spectrométrie de masse pour identifier les protéines ont été effectuées grâce à un spectromètre de masse Applied Biosystems MALDI TOF/TOF 4800 Proteomics Analyzer. 6. Analyses des biomarqueurs Les auto-anticorps dirigés contre les antigènes GAL3, PAK2, PHB2, RACK1 et RUVBL1 ont été détectés grâce à des plaques à haute capacité de fixation des protéines MaxiSorp® (Nunc, Roskilde, Denmark), et dosés comme décrit dans Desmetz et al., 2009. Plus précisément le procédé immuno-enzymatique utilisé pour les analyses de ces biomarqueurs est un procédé de type ELISA indirect, classique en lui-même. Des contrôles négatifs et positifs ont également été réalisés : a- témoins positifs : une gamme de dilutions de l'anticorps à doser b- témoins négatifs : absence d'antigène, absence d'anticorps à doser, absence d'anticorps de détection, absence de substrat détectable, substrat seul, tampon seul Le procédé ELISA mis en oeuvre comprend les étapes suivantes, pour chaque antigène : - fixation de l'antigène (Ag) : 200 pl d'une solution d'Ag (100 ng / puits) dilué dans du tampon phosphate salin (PBS) sont distribués dans chacun des puits utilisés de la plaque MaxiSorp® (à l'exception des puits pour les témoins négatifs sans antigène).La plaque est ensuite incubée à 4°C durant la nuit, - les puits sont lavés (PBS 0,1 %, Tween®20) pour enlever l'excès d'antigène, à 3 reprises, - les plaques sont bloquées 2 heures à température ambiante (TA) avec du PBS 0,1 % Tween®20, 2 % BSA (albumine de sérum bovin), - fixation de l'auto-anticorps à doser : 100 pl des sérums de patientes dilués au 1/500ème dans du PBS sont déposés dans les puits (à l'exception des témoins), - les plaques sont incubées 2 h à TA, - les plaques sont lavées 3 fois, - révélation des auto-anticorps fixés : les plaques sont incubées avec un anticorps polyclonal secondaire anti-IgG humain pendant 1 h à TA. Après 4 lavages, les plaques sont incubées avec le substrat (tetramethylbenzidine, TMB) pendant 15 min et l'absorbance calculée à 450 nm après addition de H2SO4 pour stopper la réaction. Les antigènes PAK2, RACK1, PHB2 et RUVBL1 utilisés sont des protéines recombinantes provenant de Abnova (Heidelberg, Germany), et GAL3 est une protéine recombinante provenant de Calbiochem. 7. Méthodes d'analyse statistique Les données quantifiées par ELISA sont exprimées par les médianes. Les différences entre les groupes sont analysées par un test de Wilcoxon. Les différences sont considérées comme statistiquement significatives lorsque p < 0,05. Les performances des tests basés sur les valeurs individuelles des auto-anticorps et sur les valeurs combinées (combinaison linéaire) sont basées sur l'analyse des courbes ROC. La précision, la sensibilité et la spécificité des tests basés sur les auto-anticorps pris individuellement et combinés ont été évaluées en utilisant la valeur seuil optimale calculée pour maximiser l'indice de Youden. Cet indice est défini comme la somme de la sensibilité et la spécificité moins 1. Les analyses statistiques ont été réalisées avec l'InStat (v3.06, GraphPad), STATA 11,0 (2009 StataCorp) et m ROC. EXEMPLE 1 La figure 1 représente, schématiquement, les étapes de l'approche utilisée par les inventeurs pour parvenir à l'invention, qui sont décrites de façon détaillée ci-après. 1/ Etape 1 de recherche : identification d'auto-anticorps spécifiquement associés avec le CCIS Les fractions respectivement cytosolique, nucléaire et membranaire obtenues par fractionnement subcellulaire de cellules de la lignée MCF1ODCIS.com, ont été soumises à analyse par Western Blot bidimensionnel. La pureté de ces fractions a été confirmée par la présence des marqueurs subcellulaires respectivement associés : HSP90 pour la fraction cytosolique (fraction 1), Calnexine pour la fraction membrane/organelle, et PARP1 pour la fraction nucléaire (figure 2A). Le marqueur de poids moléculaire (PM) est représenté à droite sur cette figure. Les protéines de chacune de ces fractions ont été ensuite criblées avec les échantillons de sérum du groupe de découverte (Groupe 1), pour chaque catégorie CCIS, BBL, AID et HC. Les solutions obtenues ont été soumises à électrophorèse bidimensionnelle et les gels d'électrophorèse soumis à coloration argentique, pour mettre en évidence les spots correspondant aux protéines présentant une réactivité vis-à-vis de ces sérums. Au total, 85 protéines ont montré une réactivité remarquablement élevée avec les échantillons de sérum des patientes CCIS, tout en n'ayant pas de réactivité avec les autres catégories de sérum. Les gels obtenus pour chacune des fractions subcellulaires, après criblage avec les sérums des patientes CCIS, sont montrés sur la figure 2B, chaque spot correspondant à une protéine réactive vis-à-vis du sérum CCIS.

Ces spots ont été excisés et digérés dans le gel par de la trypsine, puis le matériel protéique obtenu a été analysé par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS/MS. 37, 22, and 8 protéines ayant des fonctions biologiques différentes ont été identifiées respectivement dans les fractions cytosolique, membranaire et nucléaire.

GAL3, RACK1 et PAK2, localisées dans la fraction cytosolique, et PHB2 et RUVBL1, localisées dans la membrane ou l'organelle, ont été sélectionnées pour des analyses subséquentes. La sélection de ces cinq protéines a été basée sur des informations publiées les associant avec le développement du cancer épithélial et sa progression, en particulier du cancer du sein.

La figure 2C illustre, pour chacune de ces cinq protéines, leur présence dans les gels après criblage avec les sérums CCIS, et leur absence après criblage avec les autres sérums contrôles (BBL, Al D, HC) (flèches noires sur la figure).

Cette première étape démontre que des auto-anticorps aptes à réagir respectivement avec les protéines GAL3, PHB2, RUVBL1, RACK1 et PAK2, sont présents dans le sérum des patientes atteintes de CCIS, et absents dans le sérum des individus sains, immuno-déficients ou présentant des lésions du sein bénignes (BBL). 2/ Etape 2 d'essais et de validation : analyse statistique du panel des cinq biomarqueurs Les niveaux des cinq biomarqueurs dans les sérums (auto-anticorps dirigés respectivement contre GAL3, PAK2, PHB2, RACK1 et RUVBL1) ont été déterminés en mettant en oeuvre sur les sérums du groupe d'apprentissage (Groupe 2) des tests spécifiques de type ELISA, au moyen des antigènes respectifs : GAL3, PAK2, PHB2, RACK1 et RUVBL1. Tout d'abord, la reproductibilité de l'expérience a été vérifiée. Tous les échantillons ont été testés en aveugle et dupliqués dans au moins deux expériences indépendantes. La reproductibilité a été testée en effectuant l'expérience sur des échantillons représentatifs en double. De plus, les échantillons provenant des mêmes patientes ont été testés sur différentes plaques, sur différents jours. Pour l'ensemble des cinq biomarqueurs, les échantillons répliqués ont montré une forte corrélation, avec des valeurs R2 > 0,99. De plus, une variabilité inférieure à 10% entre les résultats indique que la méthode utilisée est fiable et reproductible. Les valeurs médianes pour chaque biomarqueur individuel ont été mesurées. A partir de ces valeurs, il a été réalisé une analyse univariée. Pour chaque biomarqueur, la courbe ROC représentant les valeurs individuelles 30 obtenues a été établie, pour CCIS versus HC, PBC versus HC, (CCIS + PBC) versus HC. Les figures 3A à 3B illustrent respectivement les courbes obtenues.

Il en ressort notamment que les auto-anticorps dirigés respectivement contre GAL3, PHB2, et RACK1 permettent de discriminer les sujets atteints de PBC et les individus sains. Cette différence est également significative pour les auto-anticorps spécifiques de GAL3 et RACK1, pour le groupe cumulé (PBC + CCIS) versus HC. Des modèles d'analyse multivariée mROC ont également été générés pour évaluer la fiabilité d'un test de diagnostic basé sur la détection combinée, dans le sérum issu des individus, d'auto-anticorps spécifiques respectivement de GAL3, PHB2, RACK1, RUVBL1 et PAK2.

Les courbes mROC obtenues sont illustrées sur les figures 3A à 3C, respectivement pour CCIS versus HC, PBC versus HC et (CCIS + PBC) versus HC. De manière surprenante, il en ressort qu'il est possible de discriminer entre les individus nouvellement diagnostiqués comme étant atteints de CCIS et les sujets sains HC, avec une aire sous la courbe AUC (pour l'anglais « area under the curve ») de 0,85 (avec un intervalle de confiance 95% Cl entre 0,76 et 0,95) (figure 3A). Ces résultats montrent clairement l'amélioration du test de diagnostic du CCIS par rapport à chaque biomarqueur individuel, grâce à l'utilisation du panel des cinq biomarqueurs.

Chez les patients atteints de PBC, on obtient une valeur de l'aire sous la courbe AUC de 0,84 (95% Cl [0,75-0,94]), comme le montre la Figure 3B. La discrimination entre le groupe contenant les individus atteints de stades précoces de cancer du sein (CCIS + PBC) et le groupe d'individus sains (HC) est élevée, avec une AUC de 0,81 (95% Cl [0,72-0,90]), comme le montre la Figure 3C. La sensibilité, la spécificité et la précision globale du diagnostic du CCIS, du PBC et du groupe (CCIS + PBC) se sont ainsi avérées élevées pour le panel des cinq auto-anticorps conformes à l'invention. La performance du test de ces cinq auto-anticorps en tant que biomarqueurs a été validée sur un groupe indépendant de validation (Groupe 3), qui contient 91 patients supplémentaires, toujours par des tests ELISA. La performance de diagnostic du CCIS, du PBC précoce et du groupe cancer (CCIS + PBC) a été maintenue, avec une AUC de 0,81 (95% Cl [0,70-0,93]), 0,78 (95% Cl [0,66-0,90]), et 0,80 (95% Cl [0,70-0,89]), respectivement.

EXEMPLE 2 Au moyen des mêmes tests ELISA que décrit précédemment, la combinaison des cinq auto-anticorps a été évaluée pour la détection des cancers du sein dans des sérums de 68 femmes saines (HC), 15 patientes ayant un diagnostic de mastopathies et 114 patientes atteintes d'un cancer du sein, dont 59 avec un cancer du sein primaire invasif (PBCI) et 56 avec un CCIS. A partir des niveaux d'auto-anticorps mesurés dans les sérums, il a été réalisé une analyse statistique. L'efficacité de la combinaison pour le diagnostic 15 du cancer a été évaluée par l'aire sous la courbe ROC. Pour le groupe Cancer (PBCI + CCIS) versus groupe HC, il a été obtenu une aire sous la courbe de 0,8071, avec un intervalle de confiance 95 % Cl entre 0,744 et 0,870. La formule de combinaison linéaire suivante a été établie : 20 3,04 x [GAL3] - 5,62 x [PAK2] + 2,41 x [PHB2] + 5,51 x [RACK1] - 5,31 x [RUVBL1] où [ ] exprime la concentration de l'auto-anticorps dans le sérum. Pour le groupe CCIS versus groupe HC, il a été obtenu une aire sous la courbe de 0,8476, avec un intervalle de confiance 95 % Cl entre 0,779 et 25 0,916. La formule de combinaison linéaire suivante a été établie : 2,05 x [GAL3] - 5,89 x [PAK2] + 1,93 x [PHB2] + 7,68 x [RACK1] 5,93 x [RUVBL1] où [ ] exprime la concentration de l'auto-anticorps dans le sérum.

Ces résultats démontrent clairement que le procédé selon l'invention, en particulier mettant en oeuvre la détection dans le sérum de l'individu d'un ensemble d'auto-anticorps dirigés respectivement contre une des 5 protéines parmi GAL3, PHB2, RACK1, RUVBL1 et PAK2, s'avère particulièrement fiable pour effectuer le diagnostic in vitro des formes précoces de cancer du sein, et en particulier des CCIS. Les résultats ci-avant démontrent clairement que la détection dans le sérum issu d'un individu d'auto-anticorps spécifiques de GAL3, PAK2, PHB2, RUVBL1 et RACK1, permet d'établir un diagnostic du cancer du sein précoce qui est précis, spécifique et sensible, et qui donne notamment des résultats particulièrement avantageux en termes de compromis entre fiabilité élevée du diagnostic et faibles coût et difficulté de mise en oeuvre du test. Le procédé selon l'invention permet avantageusement de détecter efficacement in vitro des formes non-invasives précoces du cancer du sein, telles que le CCIS ou le PBC précoce, qui peuvent potentiellement évoluer vers des formes invasives de cancer du sein. Ainsi, les patientes à risques peuvent être dépistées et traitées plus rapidement, ce qui augmente les chances de guérison, évite les traitements lourds pour les patientes et réduit les dépenses.

La très bonne fiabilité de ce test permet d'éviter les erreurs de diagnostic du type faux-positifs, ou faux négatifs, par rapport aux méthodes classiques de diagnostic du cancer du sein. Le procédé selon l'invention est également facile et rapide de mise en oeuvre, ce qui le rend particulièrement adapté pour une application en tant 25 qu'examen de routine.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Brem R.F. et al., 2003, Improvement in sensitivity of screening mammography with computer-aided detection: a multiinstitutional trial. AJR Am J Roentgenol 181:687-93 Desmetz C. et al., 2008, Proteomics-Based Identification of HSP60 as a Tumor-Associated Antigen in Early Stage Breast Cancer and Ductal Carcinoma in situ. Journal of Proteome Research 7:3830-7 Desmetz C. et al., 2009, Identification of a new panel of serum autoantibodies associated with the presence of in situ carcinoma of the breast in younger women. Clin Cancer Res 15:4733-41 Jernal A. et al., 2009, Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 59:225-49 Qiu J. et al., 2008, Occurrence of autoantibodies to annexin I, 14-3-3 theta and LAMR1 in prediagnostic lung cancer sera. J Clin Oncol 26:5060-6 Tait L.R. et al., 2007, Dynamic stromal-epithelial interactions during progression of MCF1ODCIS.com xenografts. Int J Cancer 120:2127-34

Claims (7)

1. REVENDICATIONS1 - Procédé de diagnostic in vitro du cancer du sein chez un individu, caractérisé en ce qu'il comprend la détection, dans un échantillon biologique issu dudit individu, d'un ensemble d'auto-anticorps dirigés respectivement contre les protéines GAL3, PAK2, PHB2, RUVBLI et RACK1.
2. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est un échantillon d'un fluide de l'individu.
3. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est un échantillon sanguin de l'individu.
4. 4- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détection dudit ensemble d'auto-anticorps comprend la mise en contact dudit échantillon biologique avec un réactif d'analyse immunologique comportant au moins une protéine parmi GAL3, PAK2, PHB2, RUVBLI et RACK1, et la détection de la présence de complexes formés par liaison spécifique de ladite protéine et d'un auto-anticorps présent dans ledit échantillon.
5. 5- Utilisation de l'ensemble des protéines GAL3, PHB2, RUVBLI, RACK1 et PAK2, pour le diagnostic in vitro du cancer du sein chez un individu.
6. 6- Kit pour le diagnostic in vitro du cancer du sein chez un individu, caractérisé en ce qu'il comporte l'ensemble des protéines GAL3, PHB2, 25 RUVBLI , RACK1 et PAK2.
7. 7- Kit selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites protéines sont des protéines recombinantes. 4