FR2976578A1 - Nouveaux derives des sterols inhibant l'activite des transporteurs abc et/ou des transporteurs pin - Google Patents

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Bilal Camara
Florence Bouvier
Dimitri Heintz
Michel Miesch
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
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Universite de Strasbourg
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J53/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by condensation with a carbocyclic rings or by formation of an additional ring by means of a direct link between two ring carbon atoms, including carboxyclic rings fused to the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton are included in this class
    • C07J53/002—Carbocyclic rings fused
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
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Abstract

La présente invention se rapporte à de nouvelles molécules dérivant du stérol et qui inhibent à des doses micromolaires voire nanomolaires l'activité des transporteurs ABC et/ou des transporteurs PIN. Par conséquent, ces dérivés sont capables d'inhiber, en particulier, le transfert de l'auxine de cellule à cellule. L'invention concerne également l'utilisation de ces molécules en tant que médicament ou agent phytosanitaire.

Description

Nouveaux dérivés des stérols inhibant l'activité des transporteurs ABC et/ou des transporteurs PIN
DESCRIPTION 5 Domaine technique La présente invention se rapporte à de nouvelles molécules dérivant des stérols qui inhibent à des doses micromolaires, voire nanomolaires, l'activité des transporteurs ABC et/ou des transporteurs PIN. Par conséquent, ces dérivés sont 10 capables d'inhiber, en particulier, le transfert de l'auxine de cellule à cellule. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets [] renvoient à la liste de références présentée à la fin du texte. Etat de la technique L'essor de la culture des céréales a été favorisé, ces dernières années, par la 15 découverte de mutants naturels semi-nains ayant une productivité 2 à 3 fois plus élevée que les variétés traditionnelles. L'analyse de ces mutants a permis de montrer que le nanisme était dû à des mutations affectant le taux d'une classe d'hormones végétales, les gibbérellines. La Demanderesse a posé le postulat selon lequel la réduction du transport de 2 0 l'auxine, principale hormone végétale produite par les plantes, permettrait d'aboutir à un résultat similaire. L'auxine ou acide beta indole acétique, abrégé AIA, est une des principales hormones végétales. Elle régule de nombreuses phases du développement des plantes telles que 25 l'embryogenèse, l'organogenèse, le développement des vaisseaux conducteurs, la croissance normale et les tropismes (croissance orientée par la lumière, la gravité...). Par ailleurs, l'auxine est également impliquée dans l'adaptation des plantes au stress biotique (attaque d'agents pathogènes tels que les bactéries, champignons et insectes...) ou abiotique (réchauffement climatique, stress 30 hydrique...).
Toutes ces régulations nécessitent le transport polarisé de l'auxine, ce qui génère un gradient de concentration que la cellule interprète pour déclencher toute la cascade de signalisation spécifique à l'auxine. Les facteurs qui modulent l'activité de ces transporteurs sont encore mal connus.
Cependant, deux types de transporteurs impliqués dans ce phénomène ont été identifiés : - des transporteurs d'influx (AUX1/LAX) ; et - des transporteurs d'efflux (PGP/ABC, PIN).
Des molécules susceptibles d'inhiber le transport de l'auxine ont été obtenues par synthèse chimique mais leur utilisation chez les plantes se heurte au fait qu'elles sont soit hydrolysées par des protéases végétales, soit conjugués à des glucides qui les rendent inactives.
La Demanderesse a maintenant caractérisé au plan génétique, biochimique et physiologique, pour la première fois une nouvelle famille de molécules triterpéniques synthétisées par les plantes qui régulent le transport polarisé de l'auxine en inhibant l'activité des transporteurs d'efflux, et qui, de ce fait conditionnent très étroitement tous les phénomènes contrôlés par l'auxine dans le 2 0 cadre d'une étude du métabolisme des terpénoïdes chez Arabidopsis thaliana.
En modulant l'expression des gènes ERG25 (At4g12110), ERG26 (At1g47290), ERG27 (At5g18210) et ERG28 (Atlgl0030) d'Arabidopsis thaliana, la Demanderesse a ainsi obtenu de nouveaux dérivés des stérols présentant une 25 fonction acide, alcool ou aldéhyde dans la position 4 selon la nomenclature des stérols (A) représentée ci-dessous. 16 7 HO 3 5 4 6 (A) Ces molécules selon l'invention ou conformes à l'invention sont capables d'inhiber à des doses micromolaires, voire nanomolaires, l'activité des transporteurs ABC et/ou des transporteurs PIN, impliqués en particulier dans l'efflux de l'auxine.
Elles permettent de ce fait d'inhiber le transport d'efflux de cellules à cellules, en particulier le transport de l'auxine. L'inhibition du transport de l'auxine permet, par conséquent, aux plantes de réduire leur croissance en hauteur et de ce fait oriente leur développement vers la production de rameaux latéraux et fructifères chez les arbres. Dans le cas des céréales, cela permet d'augmenter le nombre de tiges fertiles par pied et donc d'accroitre la productivité de 10 à 20% environ. Par ailleurs, l'inhibition du transport de l'auxine favorise la résistance des plantes au réchauffement climatique, au stress hydrique et au stress salin que l'on rencontre dans 20% des terres cultivées et dans 50% des terres irriguées.
En outre, les dérivés des stérols, selon l'invention ou conformes à l'invention, ne sont pas dégradés par les protéases, en particulier les protéases des plantes, et leur relative lipophilie favorise leur transport à travers les membranes cellulaires les rendant ainsi absorbables par les cellules, en particuliers les cellules végétales, par simple pulvérisation sur les organismes vivants à traiter, en particulier les plantes. 2 0 A ce jour, aucune molécule naturelle produite par les plantes ne possède une activité biologique comparable aux nouvelles molécules triterpéniques selon l'invention ou conformes à l'invention.
Description de l'invention 25 Au sens de la présente invention : On entend par « transporteur ABC ou transporteurs à ATP Binding Cassette », un vaste ensemble de protéines transmembranaires dont le rôle est le transport unidirectionnel de part et d'autre de la membrane cytoplasmique de diverses substances (ions, stérols, macromolécules...) en utilisant l'énergie fournie par l'hydrolyse de 1'ATP. Les transporteurs des P Glycoprotéine (« P G1ycoProtein » PGP) PGP PGP1, 4, 19 de l'auxine appartiennent à cette catégorie. On entend par « transporteur PIN », un ensemble de protéines transporteuses dont certaines assurent le transport basipète de l'auxine. L'auxine est principalement synthétisée par l'apex de la tige et transportée vers l'extrémité de la racine, avant d'être redistribuée de manière latérale. Ces transporteurs au nombre de huit sont localisés de manière polarisée sur une face des cellules et assurent un efflux d'auxine, ce qui contraint la direction du flux d'auxine. Les transporteurs AUX et LAX sont aussi des transporteurs d'auxine qui favorisent l'entrée d'auxine dans la cellule. On entend par « formulation phytosanitaire », une composition destinée aux organismes végétaux. Elle comprend au moins un composé selon l'invention ou conforme à l'invention. Elle peut aussi comprendre au moins un liant et éventuellement au moins un solvant éventuellement accompagnés d'au moins un adjuvant et/ou d'au moins un tensioactif ou agent mouillant. Les phytosanitaires font partie de la famille des pesticides, elle même englobée dans la famille des biocides. On entend par « médicament », une substance possédant des propriétés curatives ou préventives, destinée à guérir, à favoriser la guérison, à soulager ou à 2 0 prévenir des maladies humaines ou animales. On entend par « Ci », un atome de carbone situé en position i telle que définie dans la molécule du composé (I) ci-dessous ou du composé (A) ci-dessus. On entend par « groupement (CX Cz) », un groupe comprenant entre x et z atomes de carbone.
On entend par « double liaison C,-CW», une double liaison entre le carbone situé en position v et le carbone situé en position w, lesdites positions étant indiquées par des nombres dans le composé (I) tel que représenté ci-dessous. On entend par « groupement alkyle », un groupe aliphatique saturé linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un groupe alkyle saturé linéaire, ramifié ou cyclique. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tertbutyle, cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, méthylcyclopropyle, cyclopropylméthyle. On entend par un « groupement alcène», un groupe aliphatique comprenant au moins une double liaison, ledit groupe étant linéaire ou ramifiée ou cyclique. A titre d'exemple, on peut citer le propylène, le butylène, l'isobutylène, le cyclobutène, le cyclopentène, le cyclohexène. On entend par « groupement aryle », un groupe aromatique mono ou bicyclique comportant de 6 à 10 atomes, avantageusement 6 à 10 atomes de carbone. A titre d'exemples de groupes aryles, on peut citer le phényle et le naphthyle. L'invention concerne un composé de formule (I) dans laquelle, 2 0 - RI représente un substituant choisi parmi l'atome d'hydrogène, les groupements alkyles Cl-C6, linéaires ou ramifiés, les aryles, le groupement acétyle et le groupement carbohydrate ; (I) - Rz représente un substituant choisi dans le groupe comprenant l'atome d'hydrogène et les groupements alkyles Cl-C6, linéaires ou ramifiés; - R3 représente un substituant choisi dans le groupe comprenant un hydroxyle, un carbinole, un aldéhyde et un carboxyle ; - R4 représente en absence de double liaison en C8-C14 et en C14-C15 un substituant choisi parmi l'hydrogène et les alkyles Cl-C6 ; - Y un groupement alkyle ou alcène choisi parmi le groupement Yi et le groupement Y2 ; Y1= R5 Y2= - R5 représente un substituant choisi parmi l'atome d'hydrogène et les alkyles C1-C6 ; ledit composé (I) pouvant éventuellement comprendre, en outre, au moins une double liaison choisie parmi une double liaison en C7-C8, C8-C9, C8-C14, C14-15 C15, C24-C28 et C24-25 ; et le carbone C19 étant soit un groupement méthyle, substituant du carbone CIO, soit un groupement méthylène formant dans ce cas un cyclopropane avec les carbones C9 et ClO lorsque ledit carbone C9 n'est pas engagé dans une double liaison C8-C9. 2 0 Selon un mode de réalisation, ledit composé comprend : - (i) Une double liaison en C7-C8 ou en C8-C9 ou en C8-C14 ; ou (ii) Une double liaison en C7-C8 et en C14-C15 ; ou (iii) Une double liaison en C8-C9 et en C14-C15 ; et/ou 25 - (i) Un groupement YI avec une double liaison en C24-C25 ou en C24-C28, ou (ii) Un groupement Y2 avec une double liaison en C24-C25 et/ou - le carbone C19 un groupement méthylène formant un cyclopropane avec les carbones C9 et CIO lorsque ledit carbone C9 n'est pas engagé dans une double liaison C8-C9. Selon un mode de réalisation, il s'agit d'un composé tel que défini précédemment dans lequel : - RI est choisi parmi l'atome d'hydrogène, le groupement méthyle ou RI est un aryle choisi parmi le groupe benzyle, le groupe p-méthoxybenzyle et le groupe benzoyle ; et/ou - R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène et le groupement méthyle ; et/ou - R4 est choisi parmi l'atome d'hydrogène et le groupement méthyle ; et/ou - R5 est choisi parmi l'atome d'hydrogène et le groupement méthyle. Selon un mode de réalisation, il s'agit d'un composé tel que défini précédemment, dans lequel le substituant -OR1 est en position alpha ou béta. Selon un mode de réalisation, il s'agit d'un composé tel que défini précédemment, dans lequel le substituant R4 est en position alpha ou béta. Selon un mode de réalisation, il s'agit d'un composé tel que défini précédemment, dans lequel le substituant R2 est en position alpha ou béta. Selon un mode de réalisation, il s'agit d'un composé tel que défini précédemment, dans lequel le substituant R3 est en position alpha lorsque le 2 0 substituant R2 est en position béta et dans lequel le substituant R3 est en position béta lorsque le substituant R2 est en position alpha. Selon un mode de réalisation, ledit composé, tel que défini précédemment, fait partie de la famille des (i) cycloartenol, (ii) 24-méthylène-cycloartenol, (iii) cycloeucalenol, (iv) obtusifoliol, (v) ergosta-8, 14, 24(28)-trienol, (vi) fecosterol, 25 (vii) 24-méthylenelophenol, (viii) 24-ethylenelophenol, (ix) lanosterol, (x) cholesta-8, 14, 24-trienol, (xi) 14-demethyllanosterol ou des (xii) zymosterol. Selon un mode de réalisation, il s'agit d'un composé, tel que défini précédemment, dans lequel RI est un atome d'hydrogène et R2 est un groupement méthyle. 30 Selon un mode de réalisation, ledit composé selon l'invention est tel que défini précédemment et est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : 8 I 10 (Id), et Selon un mode de réalisation, ledit composé selon l'invention est tel que défini précédemment dans lequel RI est un atome d'hydrogène et R2 est un atome 10 d'hydrogène. Selon un mode de réalisation, le composé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : 9 1510 (Ik), et 10 Selon un mode de réalisation, le composé selon l'invention est choisi parmi : - Cycloarténol-4-carboxy-4-méthyle - Cycloarténol-4-hydroxyméthyl-4-méthyle - Cycloarténol-4-aldehyde-4-méthyle 115 - Cycloarténol-4-hydroxy-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-carboxy-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-hydroxyméthyl-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-aldehyde-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-hydroxy-4-méthyle - Cycloeucalénol-4-carboxy - Cycloeucalénol-4-hydroxyméthyle - Cycloeucalénol-4-aldehyde - Cycloeucalénol-4-hydroxy - Obtusifoliol-4-carboxy - Obtusifoliol-4-hydroxyméthyle - Obtusifoliol-4-aldehyde - Obtusifoliol-4-hydroxy - Ergosta-8,14,24(28)-triénol-4-carboxy - Ergosta-8,14,24(28)-triénol-4-hydroxyméthyle - Ergosta-8,14,24(28)-triénol-4-aldéhyde - Ergosta-8,14,24(28)-triénol-4-hydroxy - Fecosterol-4-carboxy - Fecosterol-4-hydroxyméthyle 2 0 - Fecosterol-4-aldehyde - Fecosterol-4-hydroxy - 24-méthylénelophenol-4-carboxy - 24-méthylénelophenol-4-hydroxyméthyle - 24-méthylénelophenol-4-aldehyde 2 5 - 24-méthylénelopheno1-4-hydroxy - 24-éthylénelopheno1-4-carboxy - 24-éthylénelophenol-4-hydroxyméthyle - 24-éthylénelophenol-4-aldehyde - 24-éthylénelophenol-4-hydroxy 3 0 - Lanostérol-4-carboxy-4-méthyle - Lanostérol-4-hydroxymethyl-4-méthyle - Lanostérol-4-aldehyde-4-méthyle - Lanostérol-4-hydroxy-4-méthyle - Cholesta-8,14,24-triénol-4-carboxy-4-méthyle - Cho le sta- 8,14 ,24-triénol-4-hydroxyméthyl-4-méthyle - Cholesta-8,14,24-triénol-4-aldehyde-4-méthyle - Cholesta-8,14,24-triénol-4-hydroxy-4-méthyle - Acide cho le stane- 3 -hydroxy-4-méthyl-4- carboxylique - cho le stane- 3 -hydroxy-4-méthyl-4- aldéhyde - cho le stane- 3 -hydroxy-4-méthyl-4-hydroxyméthyle - cho le stane- 3 ,4- dihydroxy-4-méthyle - 14-deméthyllanostérol-4-carboxy-4-méthyle - 14-deméthyllanostérol-4-hydroxymethyl-4-méthyle - 14-deméthyllanostérol-4-aldehyde-4-méthyle - 14-deméthyllanostérol-4-hydroxy-4-méthyle - Zymostérol-4-carboxy - Zymostérol-4-hydroxyméthyle - Zymostérol-4-aldehyde - Zymostérol-4-hydroxy. 2 0 Selon un mode de réalisation, le composé selon l'invention est choisi parmi : I04 HO - - 113 HO ÔÔ ,- OH COOH 107 HO'> . 114 HO CH2OH Ôôôe CHO I08 - I15 HO ÔÔ '- HO CHO OH I09 I16 /- ÔÔ C HO HO\/ OH COOH I10 _- I17 HO Ôe 0s HO COOH CH2OH I11 _- I18 - HOHO CH2OH CHO I19 0s 128 Ôe HO ÔÔ HO Ôe CHO CHO 120 HO .1' I29 HO'e HO OH I22 ,. I30 '- HO ÔÔ 'e CH2OH HO CHZOH I23 Ôe I31 Ôe HO ÔÔ HO Ôe CHO CHO I24 '- I32 '- HO'Ô HO'e OH CH I27 ,/ I35 /- HO ,e HO'Ô CH2OH CHO I36 /- 140 HO Ôe HO'Ô HO OH I37 HO COOH .1* I43 HO'Ô CHO I38 HO .1* I44 HO'Ô OH CH2OH I39 I48 Ôe HO Ôe HO ÔÔ CHO OH L'invention concerne également un composé selon l'invention, tel que défini précédemment, ou un composé conforme à l'invention choisi parmi : I01 HO COOH 121 HO ÔÔ Ôe COOH 102 HO CH2OH - 126 HO Ôe Ôe COOH 103 HO = - 129 HO'Ô CHO COOH I05 HOC> COOH . I33 HO ÔÔ Ôe _ COOH I06 HO I34 HO ÔÔ Ôe CH2OH CH2OH I12 .~ I41 HO ÔÔ Ôe HO e\./\./ COOH OH I4 2 HO CH2OH .1' Dl HO COOH I45 HO ÔÔ Ôe D2 COOH Ho _ OH 146 HO ÔÔ Ôe D3 HO = - CH2OH CHO CHO I47 D4 pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation comme agent phytosanitaire. L'invention concerne aussi un composé selon l'invention, tel que défini précédemment, ou un composé conforme à l'invention choisi parmi : I01 HO COOH 121 HO *el Ôe COOH 102 HO CH2OH - 126 HO Ôe Ôe COOH 103 HO - - 129 HO'Ô CHO COOH 105 HOC> . 133 HO ÔÔ Ôe COOH COOH I06 HO I34 HO ÔÔ Ôe CH2OH CH2OH 112 .~ 141 HO ÔÔ Ôe HO ~u COOH OH I42 HO ÔÔ Ôe Dl HO COOH CH2OH I45 HO ÔÔ 1 D2 COOH HO OH I46 HO ÔÔ Ôe D3 HO = - CH2OH CHO CHO I47 D4 pour son utilisation comme inhibiteur de transporteur ABC et/ou de transporteur PIN. L'invention est également relative à un composé selon l'invention, tel que défini précédemment, ou un composé conforme à l'invention choisi parmi : I01 HO COOH 121 HO ÔÔ Ôe COOH 102 HO CH2OH - 126 HO Ôe Ôe COOH 103 HO - - 129 HO'Ô CHO COOH 105 HOC> . 133 HO ÔÔ Ôe COOH COOH I06 HO I34 HO ÔÔ Ôe CH2OH CH2OH 112 .~ 141 HO ÔÔ Ôe HO ~u COOH OH I42 HO ÔÔ Ôe Dl HO COOH CH2OH I45 HO ÔÔ 1 D2 COOH HO OH I46 HO ÔÔ Ôe D3 HO = - CH2OH CHO CHO I47 D4 pour son utilisation comme inhibiteur du transfert de l'auxine de cellule à cellule. Enfin, l'invention est aussi relative à un composé selon l'invention ou conforme à l'invention, tel que défini précédemment, pour traiter une maladie impliquant un transporteur ABC et/ou un transporteur PIN.
Selon un mode de réalisation, ledit composé selon l'invention ou conforme à l'invention est utilisé à une dose comprise entre 1 micromolaire à 1 nanomolaire.
Les molécules ou composés selon l'invention ou conformes à l'invention, peuvent constituer la matière active de formulations phytosanitaires destinées à obtenir un accroissement de la productivité et une meilleure résistance des plantes au réchauffement climatique et au stress salin. L'invention a donc, en outre, pour objet une formulation phytosanitaire comprenant un composé selon l'invention, tel que défini précédemment, ou un composé conforme à l'invention choisi parmi : I01 HO COOH 102 HO~i ' CH2OH 103 HO CHO - 105 HO COOH I06 HO I12 .~ CH2OH H Oe\/\~ OH I21 HO ÔÔ Ôe I26 HO Ôe Ôe COOH COOH I29 HO'Ô I33 HO 1Ô '- COOH COOH I34 HO ÔÔ 1- 141 HO ÔÔ '- CH2OH COOH I42 HO CH2OH .1' I45 HO ÔÔ COOH I46 HO CH2OH .1' I47 HO ÔÔ CHO D1 HO COOH D2 HO OH D3 - D4 Ôe HO = HO CHO _ CH2OH Selon un mode de réalisation, ladite formulation phytosanitaire selon l'invention comprend, en outre, au moins un agent mouillant. L'application par simple pulvérisation des molécules terpéniques selon l'invention ou conformes à l'invention sous forme de formulations pouvant contenir, en outre, des agents mouillants, sur les cultures céréalières (blé, orge, maïs, ...) à un stade précoce du développement est susceptible d'augmenter le rendement grâce à une multiplication des rameaux fertiles issus de la tige principale. De même, dans le cas des arbres fruitiers, l'application de ces molécules terpénique permettraient de favoriser la formation de rameaux fructifères.
Dans le domaine agronomique, ces traitements peuvent conduire à des augmentations de rendement de l'ordre de 10 à 20%. En plus d'une meilleure résistance au stress hydrique des plantes traitées par ces molécules terpéniques selon l'invention ou conformes à l'invention, la réduction de la croissance végétative en hauteur obtenue dans ces conditions conduit à une meilleure utilisation de l'eau du fait de l'augmentation de la densité du couvert végétal qui peut limiter d'environ 20% les pertes en eau par évaporation à partir du sol. Dans le domaine horticole, la pratique courante qui consiste à couper manuellement les 2 0 boutons terminaux des plantes de manière à augmenter le nombre de fleurs par pied pourrait être remplacée par une simple pulvérisation de ces molécules terpéniques et ce processus permettrait de réduire les coûts de main d'oeuvre liée à ce procédé. En outre, les blessures occasionnées lors de la réalisation des coupes des boutons terminaux favorisent l'intrusion de pathogènes dans la plante ce qui conduit à utiliser des produits phytosanitaires. Or, ces derniers sont couteux, toxiques pour l'homme et polluants pour l'environnement. La pulvérisation par les molécules terpéniques selon l'invention ou conformes à l'invention, présente donc un triple avantage: - une diminution de l'utilisation de produits phytosanitaires chimiques, - une meilleure protection de l'environnement, - une économie financière.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et illustrés par la figure annexée.
Brève description de la figure La figure 1 représente schématiquement le complexe de déméthylation à travers la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire avec ses protéines (i) ERG25 (SMO) 2 0 signifiant stérol-4alpha-oxidase, (ii) ERG26 (CD) signifiant 4alpha-carboxystérol-C3-déhydrogenase/C4-decarboxylase, (iii) ERG 27 (SCR) signifiant stérol 3-cétroreductase et (iv) ERG 28 à travers la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire. Le complexe de déméthylation en C4, nécessite l'oxydation du méthyle en C4 par ERG25 (Stérol-4a-Méthyl oxydase, SMO) en présence d'oxygène moléculaire. Le 25 groupement acide qui résulte de cette réaction est éliminé par ERG26 (4acarboxystérol-C3-dehydrogénase/C4-décarboxylase, SCD), ce qui conduit à un dérivé stérol cétonique réduit par ERG27 (Stérol 3-céto réductase, SCR). Afin de canaliser ces réactions, pour éviter l'accumulation des intermédiaires, ERG28 constitue une plateforme qui permet de lier le complexe (ERG25+ ERG26+ 30 ERG27). 26 EXEMPLES
Exemple 1: Obtention de lignées transgéniques d'Arabidopsis thaliana accumulant les intermédiaires du complexe 313-hydroxystérol C4 deméthylase 5 (SC4DM) - Matériel végétal Des plants d'Arabidopsis thaliana (At) ont été cultivés en milieu de Murashige et Skoog (milieu MS, M 0221 et M 0238 (modification n°4), DUCHEFA BIOCHIMIE, B.V.) sur milieu sélectif dans une chambre de croissance 10 (conditions : lumière / obscurité : 12/12 H ; température 21/18°C sous éclairage Néon Bio lux) pendant 2 à 3 semaines puis transférés dans des serres (conditions : lumière / obscurité : 16/8H ; température 22/18°C sous éclairage Sodium Plantastar) jusqu'à l'obtention de graines.
15 - Obtention des ADN complémentaires des gènes du complexe SC4DM Les ADNc de SMOs, SCDs, SCRs et Erg28 ont été clonés à partir d'Arabidopsis par RT-PCR. Les ARNs totaux de feuilles d'Arabidopsis ont été préparés en utilisant le NucleoSpin RNA plant kit commercialisé par Macherey-Nagel. Les réactions de RT-PCR ont été réalisées respectivement avec le 20 SuperScript (marque enregistrée) III Reverse Transcriptase (Kit 18080-093 commercialisé par Invitrogen) et avec le kit « Phusion High-Fidelity DNA Polymerase » commercialisé par Finnzymes. Les amorces utilisées pour l'amplification des ADNc sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. Les ADNc ont été séquencés en utilisant un séquenceur automatique (ABI 3100; Applied 25 Biosystems). Les comparaisons de séquences ont été réalisées via le centre national d'information biotechno logique (« National Center for Biotechnology Information ») en utilisant le programme BLAST (Altschul et al., 1997) [1].
Les différentes séquences et comparaison obtenus sont indiquées ci-3 0 dessous : ERG25 (AtSMO), des stérols a-4-méthyl-oxydase - AtSMO1 (stérol-4a-méthyl-oxydase) - o AtSMO1-1 : At4g12110 (298 AA) o AtSMO1-2 : At4g22756 (299 AA) o AtSMO1-3 : At4g22753 (581 AA) AtSMO2 o AtSMO2-1: At1g07420 (266 AA) o AtSMO2-2: At2g29390 (260 AA) ERG26 (AtSCD), 4a-carboxystérol-C3-dehydrogénase/C4-décarboxylase
- AtSCD1 :At1g47290 (439 AA) - AtSCD2: At2g26260 (564 AA) ERG27 (AtSCR), Stérol 3-céto réductase.
- AtSCR1 : At5g18210 (277 AA) - AtSCR2 : At3g03980 (270 AA) - AtSCR3 : At3g04000 (272 AA) - AtSCR4 : At3g66658 (596 AA) ERG28 - AtERG28: Atlgl0030 (129 AA) Tableau 1 : amorces utilisées pour amplifiées les ADNc des gènes SMOs, SCDs, 2 0 SCRs and Erg28. Gène Positioi Amorce sens Amorce anti-sens AtSMO1- At4g121 5'- 5'- 1 10 ATGATTCCTTACGCTACA ATCGGATTTTATTCC GTCGAAGAAG TCCGTTATGC- -3' (SEQ ID NO 126) 3'(SEQ ID NO 116) AtSMO1- At4g227 5'- 5'- 2 56 ATGATCCCATACGCAAC ATCGAATTTCTCTCCT AATCGAAG-3'(SEQ ID NO CATTAACC-3'(SEQ ID 127) NO 128) AtSMO1- At4g227 5'- 5'- 3 53 ATGATCCCTTATCCAACC TAGAGACTGAAGCG (szj oN Qi Ôas) (izï oN o£ 8Z9x1Jv £-3119119919 QI Ô as) , £-J,LVV,Lloli oolâ1JV 19V99,LLLDVVVDV V19999,LLDD99VV9,LV -S -S (slz oN Qi Ôas) (tu oN 8S9 b2IDS;V £-9viloDVDIDDI QI Ôas), £-DioDivolD 99â£;V L19VIDIL,LDID9919 VDD99199,LLLLDDDD1V -S -S (17tï OI~I (£tï OI~I 00 £xDSJV I Ô as) , £-olvDDovui QI Ô as) , £-DIIDIIIov 0b0â£IV )DVDDDVDVDVDVVD DIVDIDDDVD LD99,LV -S -S (zjJ OI~I (Itï 08 ZUDSIV iii Ô as) , £-91VV99vD OI~I QI Ô as) , £-DoDi iv 6£0â£IV iLLVDDVDDIVIVDVI VDIVDLLVDVDVLDI LV -S -S (OIT OI~I (6£I OI I2IISIV QI Ô as) , £-oIID.L o oI~I QI Ôis), £-9I.Lo1D1 ZBIâSIV L119VDDIII LDOV91 DDIDIDVDIDD LLD99IV -S -,S (8£I OI~I QI Ôis),£ (L£I 09 ZQDSIV -DIIIVVDVVDDDI OI~I QI Ôis), £-ooDvovoo Z9ZâZIV IDDIID LLL9,LVD19 DVIDOVD99DDODIOIV -S -S (9£I (S£I 06 IQDSIV QI Ô as) £-wwvoD OI~I QI Ôis), £-o1Dvovov ZLt 1IV J1DD11D11D1VDD19 DV,LL9VV99,LV9,L99,LV -~ S -,S (t£I OI~I QI Ôis),£ (££I 06 Z -Dillio VIIDD OI~I QI Ô as) , £-9.L199DDI £6ZâZIV -ZOIAISJV 999VIILL ,LLL99 VV9119DI LDIIV991V -S -S (Z£ï OI~I QI (I£I OZ I Ô as) £-~ L L L L9~~V OI~I QI Ôis), £-o11oo1D1 tLOâ1IV -ZOIAISIV 3191VD LLL9,LLLDD VV9919DIIDD LLD991V -5 -S (0£I OI~I QI Ô s),£ (6zI -993131913139 oI~I QI Ôis), £-ovvovio 8z 8LS9L6Z
- Transformation des plantes et sélection Les plantes ont été transformées en utilisant les vecteurs suivants : o ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR), et o vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al., 1993) [13] Les transformants stables ont été obtenus selon la méthode d'immersion florale (Clough et Bent, 1998) [6] et les transformations transitoires (« transient transformation ») ont été obtenues par biolistique et infiltration tel que décrit dans les références suivantes : Batoko et al, 2000 [2] , Mialoundama et al. 2009 [14] et/ou Eastmond et al, 2010 [9]. - Production et analyse d'Arabidopsis thaliana : accumulation des intermédiaires du complexe de déméthylation SC4DM En raison des mécanismes de déméthylation en C4 des stérols par le complexe 3[3-hydroxystérol C4 deméthylase (SC4DM) chez les mammifères, les levures et les plantes (Bouvier et al., 2005 [3]) et des homologies de séquences, des lignées transgéniques stables d'Arabidopsis (5 par gène étudié) spécifiquement bloquées à différentes étapes de la voie de signalisation de SC4DM ont été générées et analysées. Le blocage de la voie a permis d'induire l'accumulation d'intermédiaires transitoires présumés et d'évaluer leurs fonctions biologiques. 2 0 La voie de biosynthèse a été bloquée au niveau des enzymes suivantes dans différents plants par interférence d'ARN (RNAi, comme indiqué). Pour chaque gène ou enzyme, 5 lignées RNAi ont été obtenues comme indiqué ci-dessous : ERG25 (AtSMO), des stérols a-4-méthyl-oxydase - AtSMO1 (sterol-4a-méthyl-oxydase) 25 o Lignée AtSMO1-1(RNAi) : At4g 12110 o Lignée AtSMO1-2(RNAi) : At4g22756 o Lignée AtSMO1-3(RNAi) : At4g22753 - AtSMO2 o Lignée AtSMO2-1(RNAi): At 1 g07420 30 o Lignée AtSMO2-2(RNAi) : At2g29390 ERG26 (AtSCD), 4a-carboxystérol-C3-dehydrogénase/C4-décarboxylase - Lignée AtSCD1(RNAi) :At1g47290 - Lignée AtSCD2(RNAi): At2g26260 ERG27 (AtSCR), Stérol 3-céto réductase. - Lignée AtSCR1(RNAi) : At5g18210 - Lignée AtSCR2(RNAi) : At3g03980 - Lignée AtSCR3(RNAi) : At3g04000
ERG28 (AtERG28) - Lignée AtERG28(RNAi): At1g10030 Exemple I : Production d'ARN; des enzymes de la voie (SC4DM) I.1. AtSMO1-1: At4g12110 I.1.A. zone inactive (épingle à cheveux): E139DY-> PGH199 (61 AA) I.1.A.1. ARN; utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Une courte répétition inversée (« hairpin ») de l'ADNc AtSMO1-1 (en épingle à cheveux) a été utilisée pour construire AtSMO1-1-ARN;. Deux fragments de 201 pb ont été amplifiés en suivant les instructions du Kit Phusion High-Fidelity PCR de Finnzymes à partir de l'ADNc AtSMO1-1 (du 2 0 nucléotide 415 au nucléotide 597) contenant respectivement soit le site de restriction BamHI ou le site de restriction BglII à leurs extrémités 5', et EcoRl à leur extrémité 3'. Après amplification des fragments précités, les amplicons ont été digérés par EcoRI (NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) selon les 2 5 recommandations de NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc.. Une auto ligation et digestion par BamHI (NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) selon les recommandations de NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc., et BglII (NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) selon les recommandations de NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc., a été 3 0 effectuée.
Le fragment de 385pb ainsi obtenu a été ensuite ligaturé avec un Kit «rapid DNA ligation»(K1422) selon les instructions du Kit « rapid DNA ligation»(K1422) (Fermentas Inernational Inc) aux sites BamHI-BglIl de l'ImpactVector 1.1. La cassette d'expression résultant de cette construction a été sous-clonée selon les recommandations de NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc. (Ascl-Pacl) dans le vecteur binaire pBIN Plus (Plant Research International, Wageningen, UR). - Amorce sens possédant le site de restriction BamHI ((NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc): 5'-CGCGGATCCAGAAGACTACACTAACTACTGGGTACATAGATTC-3' (SEQ ID NO 1) - Amorce sens possédant le site de restriction BglII ((NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc): 5'-GAAGATCTGCGAAGACTACACTAACTACTGGGTACATAGATTC-3' (SEQ ID NO 2) - Amorce anti-sens possédant le site de restriction EcoRI ((NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc): 5'-CGGAATTCATGACCAGGAGCAATAGCTGGTCCCATAAACG-3' (SEQ ID N0 3) Le tableau 2 ci-dessous résume la souche, la taille des deux fragments utilisés pour 2 0 créer le ARNi (pb), les sites de restriction en 5', le site de restriction en 3', le Vecteur, les amorce sens, l'Amorce anti-sens et la taille du fragment ARNi.
Tableau 2 Souche AtSMO1-1 Taille des 201 pb (415-597) fragments pour créer le ARNi (pb) Site de restriction BamHI; BglII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCAGAAGACTACACTAACTACTGGGTAC ATAGATTC-3 '(SEQ ID NO 1) BglIl: 5'- AAGATCTGCGAAGACTACACTAACTACTGGGTACA TAGATTC-3 '(SEQ ID NO 2) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCATGACCAGGAGCAATAGCTGGTCCCAT AAACG-3' (SEQ ID NO 3) Taille du fragment 385 pb ARN; I.1.A. 2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993 [13] ) Une courte répétition inversée de l'ADNc de AtSMO1-1 (en épingle à cheveux) a été utilisée pour construire At5MO1-1-ARN;. Deux fragments de 202pb ont été amplifiés avec le kit Phusion High-Fidelity PCR (F-553S) de Finnzymes en suivant les instructions du Kit Phusion High-Fidelity PCR (F-553S) de Finnzymes à partir de l'ADNc de AtSMO1-1 (à partir du nucléotide 415 au nucléotide 597) contenant respectivement Xhol et Xbal à leurs extrémités 5 'et EcoRl à leur extrémité 3'. A la suite de l'amplification, les amplicons ont été digérés par EcoRI ((NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) selon les recommandations de NEW ENGLAND BioLabs® Inc.. Une auto ligation et digestion par Xhol ((NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) selon les recommandations de NEW ENGLAND BioLabs® Inc.) et Xbal ((NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) selon les recommandations de NEW ENGLAND BioLabs® Inc.) a été effectuée. Le fragment de 386 pb ainsi obtenu a été ensuite ligaturé selon les instructions du Kit « rapid DNA ligation»(K1422) (Fermentas Inernational Inc) aux sites Xhol- 2 0 Xbal du vecteur binaire pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993.[13]). - Amorce sens possédant le site de restriction Xhol (NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) 5 '-CCGCTCGAGCTGAAGACTACACTAACTACTGGGTACATAGATTC-3 ' (SEQ ID NO 4) - Amorce sens possédant le site de restriction Xbal (NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc) 5 '-TGCTCTAGAGGGAAGACTACACTAACTACTGGGTACATAGATTC-3 ' (SEQ ID NO 5) - Amorce anti-sens possédant le site de restriction EcoRI: 5'- CGGAATTCATGACCAGGAGCAATAGCTGGTCCCATAAACG -3' (SEQ ID NO 6) Le tableau 3 ci-dessous résume la souche, la taille des deux fragments utilisés pour créer le ARNi (pb), les sites de restriction en 5', le site de restriction en 3', le Vecteur, les amorce sens, l'Amorce anti-sens et la taille du fragment ARNi.
Tableau 3 Souche AtSMO1-1 Taille des 202 pb (415-597) fragments pour créer le ARNi(pb) Site de Xhol ; Xbal restriction en 5' Site de EcoRI restriction en 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTGAAGACTACACTAACTACTGGGTACA TAGATTC-3'(SEQ ID NO 4) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGGAAGACTACACTAACTACTGGGTACA TAGATTC-3'(SEQ ID NO 5) Amorce anti- EcoRI: 5'- sens CGGAATTCATGACCAGGAGCAATAGCTGGTCCCATAA ACG -3'(SEQ ID NO 6) Taille du 386 pb fragment ARNi L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous.
Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactivée (du nucléotide 343 au nucléotide 674): - Amorce sens (SIGMA): 5'- GAGATACGATCTGGATTACCATTAC-3'(SEQ ID NO 9) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-CATGGAAAATCATATCCACTGTGAGTC-3'(SEQ ID NO 10)
I.1.B. Zone inactive (épingle à cheveux): Y176AH -> PWS226 (51 AA) I.1.B.1. ARN; en utilisant le ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.lAl décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 Souche AtSMO1-1 Taille des 171 pb (526-678) fragments pour créer le ARN-(pb) Site de BamHI; BglII restriction en 5' Site de EcoRI restriction en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCATATGCACATTGGGCTGAAGTTTTGCTTC TCGG-3 ' (SEQ ID NO 7) BglII: 5'- GAAGATCTGCTATGCACATTGGGCTGAAGTTTTGCTTC TCGG-3 '(SEQ ID NO 8) Amorce anti- EcoRI: 5'- sens CGGAATTCACTCCATGGAAAATCATATCCACTGTGAG TCTC-3 '(SEQ ID NO 11) Taille du 325 pb fragment ARN; I.1.B.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-35S2 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole 1.1 A 2 décrit précédemment a été utilisé 5 avec les différents éléments indiqués dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5 Souche AtSMO1-1 Taille des 172 pb (526-678) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de Xhol ; - Xbal restriction en 5' Site de EcoRI restriction en 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTTATGCACATTGGGCTGAAGTTTTGCTT CTCGG -3'(SEQ ID NO 12) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGTATGCACATTGGGCTGAAGTTTTGCTT CTCGG -3'(SEQ ID NO 13) Amorce anti- EcoRI : 5'- sens CGGAATTCACTCCATGGAAAATCATATCCACTGTGAGT CTC -3' (SEQ ID NO 11) Taille du 326 pb fragment ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous. Amorces à l'extérieur de la région silencieuse/ inactivée (du nucléotide 439 au nucléotide 745): - Amorce sens (SIGMA) 5'-CATAGATTCTTTCATAGTAAATG-3 ' (SEQ ID NO 17) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-GTCCTCCAACGTAGTGATGATAGTCATG-3 '(SEQ ID NO 18) 10 I.2. AtSMO1-2 : At4g22756 I.2. A. Zone inactive (épingle à cheveux): E139DY-> PGH199 (61 AA) I.2.A.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) 15 Dans cette expérience, le protocole I.lAl décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6 Souche AtSMO1-2 Taille des 201 pb (415-597) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI ' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCAGAGGATTATACTAATTACTGGGTTCA TAGATTC(SEQ ID NO 14) -3' BglII: 5 - GAAGATCTGCGAGGATTATACTAATTACTGGGTTCA TAGATTC -3 '(SEQ ID NO 15) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCATGACCAGGAGCAATAGCAGGTCCAAG AAAC -3 '(SEQ ID NO 16) Taille du fragment 385 pb ARN; I.2.A.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-35S2 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé 5 avec les différents éléments indiqués dans le tableau 7 ci-dessous.
Tableau 7 Souche AtSMO1-2 Taille des fragments 202 pb (415-597) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTGAGGATTATACTAATTACTGGGTT CATAGATTC-3' (SEQ ID NO 19) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGGAGGATTATACTAATTACTGGGTT CATAGATTC-3'(SEQ ID NO 20) Amorce anti-sens EcoRI : 5'- CGGAATTCATGACCAGGAGCAATAGCAGGTCCAA GAAAC -3'(SEQ ID NO 16) Taille du fragment 326 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a 10 été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous.
Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactivée (à partir du nucléotide 343 au nucléotide 674): - Amorce sens (SIGMA): 5'- GAGATACGAAGTGGATTACCATTAC-3'(SEQ ID NO 21) - Amorce anti-sens (SIGMA): 5'- CATGGGAAATCATATCCGCTATGAG-3' (SEQ ID NO 22)
1. 2. B. Zone silencieuse (épingle à cheveux): Y176AH -> PWS226 (51 AA) I.2.B.1. ARN; en utilisant le ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1 décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 8 ci-dessous.
Tableau 8 Souche AtSMO1-2 Taille des 171 pb (526-678) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI ' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCATATGCTCATTGGGCTGAGGTTTTGCT TCTTGGC-3 '(SEQ ID NO 23) BglII: 5 - GAAGATCTGCTATGCTCATTGGGCTGAGGTTTTGCT TCTTGGC-3 '(SEQ ID NO 24) Amorce anti-sens EcoRI: S'- CGGAATTCAGACCATGGGAAATCATATCCGCTATGA GTTTC-3 '(SEQ ID NO 25) Taille du fragment 325 pb ARN; 15 I.2.B.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-35S2 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 9 ci-dessous. Tableau 9 Souche AtSMO1-2 Taille des 172 pb (526-678) fragments pour créer le ARN-(pb) Site de Xhol ; - Xbal restriction en 5' Site de EcoRI restriction en 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTTATGCTCATTGGGCTGAGGTTTTGCTT CTTGGC-3' (SEQ ID NO 26) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGTATGCTCATTGGGCTGAGGTTTTGCTT CTTGGC-3'(SEQ ID NO 27) Amorce anti- EcoRI : 5'- sens CGGAATTCAGACCATGGGAAATCATATCCGCTATGAG TTTC-3'(SEQ ID NO 25) Taille du 326 pb fragment ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 1 0 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous. Amorces extérieur de la région silencieuse / inactivée (à partir du nucléotide 439 au nucléotide 745): - Amorce sens (SIGMA) : 5'- CATAGATTCTTTCATTGTAAATGG-3'(SEQ ID NO 28)5 - Amorce anti-sens (SIGMA) : 5'- GTCCTCCAACGTAGTGATGGTAATCATG-3'(SEQ ID NO 29)
1.3. AtSMO1-3 : At4g22753 I.3.A. Zone inactive (épingle à cheveux): E135DY-> PGH195 (61 AA) I.3.A.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 10 ci-dessous.
Tableau 10 Souche AtSMO1-3 Taille des 201 pb et 208 pb (403-585) fragments pour créer le ARN-(pb) Site de NotI; BgIII restriction en 5' Site de EcoRI restriction en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens Notl: 5'- ATAAGAATGCGGCCGCAGAAGATTACACTAACTAC TGGATCCATAGATGGATG -3 '(SEQ ID NO 30) BglIl: 5 - GAAGATCTGCGAAGATTACACTAACTACTGGATCCA TAGATGGATG -3 '(SEQ ID NO 31) Amorce anti- EcoRI: 5'- sens CGGAATTCATGGCCAGGAGCAATTGCCGGTCCAAG AAACGTC -3 '(SEQ ID NO 32) Taille du 386 pb fragment ARN; I.3.A.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 11 ci-dessous.
Tableau 11 Souche AtSMO1-3 Taille des fragments 202 pb (403-585) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTGAAGATTACACTAACTACTGGATC CATAGATGGATG-3'(SEQ ID NO 33) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGGAAGATTACACTAACTACTGGATC CATAGATGGATG-3'(SEQ ID NO 34) Amorce anti-sens EcoRI : 5'- CGGAATTCATGGCCAGGAGCAATTGCCGGTCCAA GAAACGTC-3' (SEQ ID NO 32) Taille du fragment 386 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous. Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactivée (à partir du 10 nucléotide 343 au nucléotide 671): - Amorce sens (SIGMA) : 5'- GGTTTGCCATTACCATCGTTAATGGAG-3'(SEQ ID NO 35) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'- GTCACACTCCATGGAAAATCATATCCG-3'(SEQ ID NO 36) 15 I.3.B. zone inactive (épingle à cheveux): Y172AH -> PWS2.22 (51 AA) I.3.B.1. ARN; en utilisant le ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé 5 avec les différents éléments indiqués dans le tableau 12 ci-dessous.
Tableau 12 Souche AtSMO1-3 Taille des 178 pb et 171 pb (514-666) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction Notl; Bglll en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens Notl: 5'- ATAAGAATGCGGCCGCATATGCGCATTGGGCCGA GATTTTGATTCTTGGGATTC-3' (SEQ ID NO 37) BglIl: 5 - GAAGATCTGCTATGCGCATTGGGCCGAGATTTTGA TTCTTGGGATTC-3'(SEQ ID NO 38) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCACTCCATGGAAAATCATATCCGCTGTG GGTCTC-3 '(SEQ ID NO 39) Taille du fragment 326 pb ARN; I.3.B.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 10 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 13 ci-dessous. 15 Tableau 13 Souche AtSMO1-3 Taille des fragments 172 pb (514-666) pour créer le ARN-(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTTATGCGCATTGGGCCGAGATTTT GATTCTTGGGATTC -3' (SEQ ID NO 40) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGTATGCGCATTGGGCCGAGATTTT GATTCTTGGGATTC -3' (SEQ ID NO 41) Amorce anti-sens EcoRI : 5'- CGGAATTCACTCCATGGAAAATCATATCCGCTGT GGGTCTC -3' (SEQ ID NO 39) Taille du fragment 326 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous. Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactivée (à partir du nucléotide 439 au nucléotide 745): - Amorce sens (SIGMA): 5'- CATTGCAAATGGGGTTACGAGAAGATTC-3'(SEQ ID NO 42) - Amorce anti-sens (SIGMA): 5'- GCTCTGGCTTTGTCCTCCAACGTAGTG-3'(SEQ ID NO 43)
I.4. AtSMO2-1 : At1g07420 I.4.A. Zone inactive (épingle à cheveux): V1o8SA-> PHL18o (73 AA) 5 10 I.4.A.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 14 ci-dessous.
Tableau 14 Souche AtSMO2-1 Taille des 237 pb (322-540) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCAGTGTCTGCCCAGATATTATTCTACT TTATC -3 '(SEQ ID NO 44) BglII: 5 - GAAGATCTGCGTGTCTGCCCAGATATTATTCTACT TTATC -3 '(SEQ ID NO 45) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCTAGGTGAGGGCCAGTAAGAGCTGGAC CGAC -3 '(SEQ ID NO 46) Taille du fragment 457 pb ARN; I.4.A.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993.[13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 15 ci-dessous. 15 Tableau 15 Souche AtSMO2-1 Taille des fragments 238 pb (322-540) pour créer le ARN-(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTGTGTCTGCCCAGATATTATTCTA CTTTATC -3' (SEQ ID NO 47) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGGTGTCTGCCCAGATATTATTCTA CTTTATC -3' (SEQ ID NO 48) Amorce anti-sens EcoRI : 5'- CGGAATTCTAGGTGAGGGCCAGTAAGAGCTGGA CCGAC-3'(SEQ ID NO 46) Taille du fragment 458 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous : Amorces extérieur de la région silencieuse/ inactivée (à partir du nucléotide 247 au nucléotide 596): - Amorce sens (SIGMA) 5'-CTGATGTTGGCCTCCTACCCTGTC-3'(SEQ ID NO 49) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-CAATGTGCCTCAACTGTCTCCAGCAC-3'(SEQ ID NO 50)
I.4.B. zone inactive (épingle à cheveux): Y156AH -> PWS706 (51 AA) I.4.B.1. ARN; en utilisant le ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) 5 10 Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 16 ci-dessous.
Tableau 16 Souche AtSMO2-1 Taille des 171 pb (466-618) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCATATGCTCACCCCGCTGAGATTCTAT TTCTGG-3' (SEQ ID NO 51) BglII: 5 - GAAGATCTGCTATGCTCACCCCGCTGAGATTCTAT TTCTGG -3' (SEQ ID NO 52) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCGCTCCATGGGAAATGATAACCACAATG TGCC-3' (SEQ ID NO 53) Taille du fragment 325 pb ARN; I.4.B.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 17 ci-dessous.
Tableau 17 Souche AtSMO2-1 Taille des fragments 172 pb (466-618) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTTATGCTCACCCCGCTGAGATTCT ATTTCTGG -3' (SEQ ID NO 54) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGTATGCTCACCCCGCTGAGATTCT ATTTCTGG -3' (SEQ ID NO 55) Amorce anti-sens EcoRI : 5'- CGGAATTCGCTCCATGGGAAATGATAACCACAAT GTGCC -3' (SEQ ID NO 56) Taille du fragment 326 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous.
Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactive (à partir du nucléotide 403 au nucléotide 702): - Amorce sens (SIGMA) 5'-CTGTACAAGAACGTGCATAGTGTGC-3' (SEQ ID NO 57) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-GTAGTTTCCGGACTTTGTGTATAG-3' (SEQ ID NO 58)
I.5. AtSMO2-2 : At2g29390 I.5.A. Zone inactive (épingle à cheveux): V108SA-> PHL180 (73 AA) I.5.A.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 18 ci-dessous.
Tableau 18 Souche AtSMO2-2 Taille des 243 pb et 237 pb (322-540) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCAGTGTCTGCCCAGATCTTATTCTACTT CRTC -3'(SEQ ID NO 59) BglII: 5 - ATAAGAATGCGGCCGCGTGTCTGCCCAGATCTTAT TCTACTTCATCATTGAG -3' (SEQ ID NO 60) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCCAGGTGAGGCCCGGTGAGAGCCGGAC CAAC-3' (SEQ ID NO 61) Taille du fragment 456 pb ARN; I.5.A.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 19 ci-dessous.
Tableau 19 Souche AtSMO2-2 Taille des fragments 238 pb (322-540) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTGTGTCTGCCCAGATCTTATTCTA CTTCATC -3' (SEQ ID NO 62) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGGTGTCTGCCCAGATCTTATTCTA CTTCATC -3' (SEQ ID NO 63) Amorce anti-sens EcoRI : 5'- CGGAATTCCAGGTGAGGCCCGGTGAGAGCCGGA CCAAC -3' (SEQ ID NO 61) Taille du fragment 458 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen-en utilisant les amorces indiquées ci-dessous : Amorces extérieur de la région silencieuse / inactive (à partir du nucléotide 247 au nucléotide 596) - Amorce sens (SIGMA) 5'-CTCATGATGGCGTCGTATCCTGTATTC-3' (SEQ ID NO 64) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-CAATGTGCCTCAACTGTCTCAATAAC-3' (SEQ ID NO 65)
I.5.B. zone inactive (épingle à cheveux): Y156AH -> PWS706 (51 AA) I.5.B.1. ARN, en utilisant le ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 20 ci-dessous.
Tableau 20 Souche AtSMO2-2 Taille des 171 pb et 177 pb (466-618) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI' NotI en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI : 5'- CGCGGATCCATATGCTCATCCCGCTGAAATTCTGTT CCTTGG-3 '(SEQ ID NO 66) Notl: 5 - ATAAGAATGCGGCCGCTATGCTCATCCCGCTGAAAT TCTGTTCCTTGGTTTGC-3 ' (SEQ ID NO 67) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCGCTCCATGGGAAATGATAACCACAATGT GC-3' (SEQ ID NO 56) Taille du fragment 324 pb ARN; I.5.B.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé 5 avec les différents éléments indiqués dans le tableau 21 ci-dessous.
Tableau 21 Souche AtSMO2-2 Taille des fragments 172 pb (466-618) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTTATGCTCATCCCGCTGAAATTCTG TTCCTTGG -3'(SEQ ID NO 68) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGTATGCTCATCCCGCTGAAATTCTG TTCCTTGG -3' (SEQ ID NO 69) EcoRI : 5'- Amorce anti-sens CGGAATTCGCTCCATGGGAAATGATAACCACAAT GTGC -3' (SEQ ID NO 56) Taille du fragment 326 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous.
Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactive (à partir du nucléotide 403 au nucléotide 702): - Amorce sens (SIGMA) 5'-CTCTACAAGAACGTGCACAGTGTGC-3' (SEQ ID NO 70) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-GTAGTTGCCAGACTTTGTGTAGAG-3' (SEQ ID NO 71)
I.6. AtSCD1 : At1g47290 Zone inactive (épingle à cheveux): K251AA-> LSC326 (76 AA) 1. 6.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 22 ci-dessous.
Tableau 22 Souche AtSCD1 Taille des 246 pb (751-978) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI; BglII 5 en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCAAAAGCTGCTGGCCAGGCTTACTTCA TTACC -3 ' (SEQ ID NO 72) BglIl: 5'- GAAGATCTGCAAAGCTGCTGGCCAGGCTTACTTCA TTACC -3 '(SEQ ID NO 73) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCGCAAGAGAGTAGCCTAACCCTAGAAG GTGTTAG -3 ' (SEQ ID NO 74) Taille du fragment 475 pb ARN; 1. 6.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 23 ci-dessous.
Tableau 23 Souche AtCD1 Taille des fragments 247 pb (751-978) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-35S2 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTAAAGCTGCTGGCCAGGCTTACTTC ATTACC -3' (SEQ ID NO 75) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGAAAGCTGCTGGCCAGGCTTACTTC ATTACC -3' (SEQ ID NO 76) EcoRI : 5'- Amorce anti-sens CGGAATTCGCAAGAGAGTAGCCTAACCCTAGAAG GTGTTAG -3' (SEQ ID NO 74) Taille du fragment 476 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous : Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactive (du nucléotide 685 au nucléotide 1035): - Amorce sens (SIGMA) 5'-GAAAATGTTGTGCACGCCCATGTCTG-3' (SEQ ID NO 77) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-GACAACAGGAGAATAGCCTAAACG-3' (SEQ ID NO 78)
I.7. AtSCD2 : At2g26260 Zone inactive (épingle à cheveux): K260AA-> LSC235 (76 AA) I.7.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 24 ci-dessous.
Tableau 24 Souche AtSCD2 Taille des 248 pb et 252 pb (478-705) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction Ncol; Notl en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS 5 Amorce sens Ncol: 5'- CATGCCATGGATAAAGCTGCAGGACAGGCATATTT CATTACCAAC -3 ' (SEQ ID NO 79) Notl: 5 - ATAAGAATGCGGCCGCAAAGCTGCAGGACAGGCA TATTTCATTACCAAC -3 ' (SEQ ID NO 80) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCGCATGAGAGAAGCCTAACTCTTGAAG GTGTTAG -3 ' (SEQ ID NO 81) Taille du fragment 475 pb ARN; I.7.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 25 ci-dessous.
Tableau 25 Souche AtSCD2 Taille des fragments 247 pb (478-705) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-3552 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTAAAGCTGCAGGACAGGCATATTT CATTACCAAC -3' (SEQ ID NO 82) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGAAAGCTGCAGGACAGGCATATTT CATTACCAAC -3' (SEQ ID NO 83) Amorce anti-sens EcoRI : 5'- CGGAATTCGCATGAGAGAAGCCTAACTCTTGAAG GTGTTAG -3' (SEQ ID NO 81) Taille du fragment 476 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous : Amorces à l'extérieur de la région silencieuse /inactive (à partir du nucléotide 412 au nucléotide 762): - Amorce sens (SIGMA) 5'-GAGAATGTTGCTCATGCCCATGTTTG-3' (SEQ ID NO 84) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-GACCACAGGAGCATAGCCTAGTCG-3' (SEQ ID NO 85) I.B. AtSCR1 : At5g18210 Zone inactive (épingle à cheveux): P94VH-> ILL153 (60 AA) I.8.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 26 ci-dessous.
Tableau 26 Souche AtSCR1 Taille des 199 pb (280-459) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI ' BgIII en 5' Site de restriction HindIII en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCACCGGTTCACATCCTAGTTAACTCAG CTGGAATCC -3 ' (SEQ ID NO 86) BglII: 5 - GAAGATCTGCCCGGTTCACATCCTAGTTAACTCAG CTGGAATCC -3 ' (SEQ ID NO 87) Amorce anti-sens Hi ndlll: 5'- CCCAAGCTTTAGCAGTATAATCCTACCACCGCCTC CACGTTTTAG -3 ' (SEQ ID NO 88) Taille du fragment 379 pb ARN; I.8.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-35S2 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 27 ci-dessous. Tableau 27 Souche AtSCR1 Taille des fragments 200 pb (280-459) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en HindIII 3' Vecteur pKYLX71-3552 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTCCGGTTCACATCCTAGTTAACTC AGCTGGAATCC -3' (SEQ ID NO 89) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGCCGGTTCACATCCTAGTTAACTC AGCTGGAATCC -3' (SEQ ID NO 90) Amorce anti-sens HindIII: 5'- CTTTAGCAGTATAATCCTACCACCGCCTCCACGT TTTAG -3' (SEQ ID NO 88) Taille du fragment 380 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 10 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous :5 Amorces extérieur de la région silencieuse (à partir du nucléotide 211 au nucléotide 523): - Amorce sens (SIGMA) 5'- CTCGCCGATATCTCAGAACCAAGCC -3' (SEQ ID NO 91) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'- CAGCTGCCTTTGATGCTGTATAAGCTC -3' (SEQ ID NO 92)
I.9. SCR2 : At3g03980 Zone inactive (épingle à cheveux): P104VH-> ILL163 (60 AA) I.9.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 28 ci-dessous.
Tableau 28 Souche AtSCR2 Taille des 198 pb (280-459) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI ' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCACCGGTTCACATTCTGGTTAACTCTGC TGGGATTC -3 ' (SEQ ID NO 93) BglII: 5 - GAAGATCTGCCCGGTTCACATTCTGGTTAACTCTGC TGGGATTC -3 ' (SEQ ID NO 94) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCCAGAAGTATGATCCGACCACCACCTCCT TGTTTTAG-3 ' (SEQ ID NO 95) Taille du fragment 379 pb ARN; 1.9.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-35S2 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 29 ci-dessous. Tableau 29 Souche AtSCR2 Taille des fragments 199 pb (310-489) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-3552 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTCCGGTTCACATTCTGGTTAACTCT GCTGGGATTC -3' (SEQ ID NO 96) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGCCGGTTCACATTCTGGTTAACTCT GCTGGGATTC-3' (SEQ ID NO 97) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCCAGAAGTATGATCCGACCACCACCTCC TTGTTTTAG-3' (SEQ ID NO 95) Taille du fragment 380 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 10 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous : Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactive (à partir du nucléotide 241 au nucléotide 553): - Amorce sens (SIGMA) 5'- CAGGCCAATGTCTCTGAGCCAAGCCAGG-3' (SEQ ID NO 98) 15 - Amorce anti-sens (SIGMA)5 59 5'- CAGCTGCCTTTGATGCGGCATAGCCAC -3' (SEQ ID NO 99)
1.10. AtSCR3 : At3g04000 Zone inactive (épingle à cheveux): P104VH-> ILL163 (60 AA) 1.10.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 30 ci-dessous.
Tableau 30 Souche AtSCR3 Taille des 198 pb (313-492) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCACCGGTTCATATCTTGGTTAACTCAG CGGC-3' (SEQ ID NO 100) BglII: 5 - GAAGATCTGCCCGGTTCATATCTTGGTTAACTCAG CGGC -3' (SEQ ID NO 101) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCGAGGAGAATTATCCGGCCACCGCCTCC ACG-3' (SEQ ID NO 102) Taille du fragment 379 pb ARN; I.10.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.2. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 31 ci-dessous.15 Tableau 31 Souche AtSCR3 Taille des fragments 199 pb (313-492) pour créer le ARN,(pb) Site de restriction en XhoI ; XbaI Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-3552 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTCCGGTTCATATCTTGGTTAACTC AGCGGC -3' (SEQ ID NO 103) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGCCGGTTCATATCTTGGTTAACTC AGCGGC -3' (SEQ ID NO 104) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCGAGGAGAATTATCCGGCCACCGCCTC CACG -3' (SEQ ID NO 102) Taille du fragment 380 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous : Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactive (à partir du nucléotide 246 au nucléotide 556): - Amorce sens (SIGMA) 5'- GGCTGATATCTCAGAGCCGAGCCGAGC-3' (SEQ ID NO 105) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-CGGCTGCCTTTGAAGCCGTGTATGAGCC -3' (SEQ ID NO 106)
I.11. Erg28 : Atlg10030 Zone inactive (épingle à cheveux): W27AL-> LSF78 (52 AA) 1.11.1. ARN; en utilisant un ImpactVector 1,1 (Plant Research International, Wageningen, UR) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé avec les différents éléments indiqués dans le tableau 32 ci-dessous. Tableau 32 Souche Erg28 Taille des 174 pb (79-234) fragments pour créer le ARN,(pb) Site de restriction BamHI' BgIII en 5' Site de restriction EcoRI en 3' Vecteur ImpactVector 1.1; pBIN PLUS Amorce sens BamHI: 5'- CGCGGATCCATGGGCTCTTCGTCTCGCTGTCTTCTCT CAGAC-3' (SEQ ID NO 107) BglII: 5 - GAAGATCTGCTGGGCTCTTCGTCTCGCTGTCTTCTCT CAGAC-3' (SEQ ID NO 108) Amorce anti-sens EcoRI: 5'- CGGAATTCAAATGATAGAAACGTAGCCAAGTATAA TGGTTTG-3' (SEQ ID NO 109) Taille du fragment 331 pb ARN; 1.11.2. ARN; en utilisant le vecteur pKYLX71-3552 (Maiti et al, 1993. [13]) Dans cette expérience, le protocole I.1.A.1. décrit précédemment a été utilisé 10 avec les différents éléments indiqués dans le tableau 33 ci-dessous.
Tableau 33 Souche Erg28 Taille des fragments 175 pb (79-234) pour créer le 5 ARN-(pb) Site de restriction en Site de restriction en EcoRI 3' Vecteur pKYLX71-3552 Amorce sens Xhol: 5'- CCGCTCGAGCTTGGGCTCTTCGTCTCGCTGTCTTCT CTCAGAC -3' (SEQ ID NO 110) Xbal: 5'- TGCTCTAGAGGTGGGCTCTTCGTCTCGCTGTCTTCT CTCAGAC -3' (SEQ ID NO 111) Amorce anti-sens EcoRI: S'- CGGAATTCAAATGATAGAAACGTAGCCAAGTATA ATGGTTTG -3' (SEQ ID NO 109) Taille du fragment 380 pb ARN; L'inactivation du gène (« silenced gene ») dans les transformants végétaux a été vérifiée par RT-PCR selon les instructions du Kit 18080-093 et du Kit 10342020 d'Invitrogen en utilisant les amorces indiquées ci-dessous : Amorces à l'extérieur de la région silencieuse / inactive (à partir du nucléotide 15 au nucléotide 309): - Amorce sens (SIGMA) 5'-GTATTGGTTAATGGTGGTTGGTTCACTG -3'(SEQ ID NO 212) - Amorce anti-sens (SIGMA) 5'-CACAGTTGAGAGATTCGCGATGGTC -3'(SEQ ID NO 213)
Exemple II : Caractérisation des ADN-T des gènes SC4DM Les lignées de mutant ont été obtenues à partir du centre de stock Arabidopsis Nottingham (« Nottingham Arabidopsis Stock Centre ») (lignées Cs et SALK) (University of Nottingham, UK) et à partir de la collection GABI-KAT (lignées GK). 5 Des analyses par RT-PCR en utilisant les amorces indiquées dans le tableau 34 ci-dessous ont été réalisées afin de caractériser les lignées homologues tel que décrit dans (Bouvier et al., 2006) [4]. La Tubuline (AtTubulin) a été utilisée comme contrôle positif.
Tableau 34 : amorces utilisées pour caractériser les lignées homologues Souche Locus Amorce sens Amorce anti-sens Gène AtSMO1-1 At4g12 Position nucléotide 1 Position nucléotide 402 SALK_021394 110 5'- 5'- SALK_021399 ATGATTCCTTACGC GACTACTAACTGTGACA TACAGTCGAAGAA CATCTCTG-3' (SEQ ID N( G-3' (SEQ ID NO 126) 145) 5'- 5'- ATGATTCCTTACGC GACTACTAACTGTGACA TACAGTCGAAGAA CATCTCTG-3' (SEQ ID N( G-3' 145) (SEQ ID NO 126) AtSMO1-2 At4g22 Position nucléotide 670 Position nucléotide 1179 GK-376H07 756 5'- 5'- CCATGGTCTCTGAC CTTAACTTAACTTAAT AAAGTACATTCC-3' ACTATCAGAGTAGG-3' (SEQ ID NO 146) (SEQ ID NO 147) AtSMO1-3 At4g22 Position nucléotide 682 Position nucléotide 1089 SALK_069481 753 5'- 5'- SALK_069604 CCATTTTACGGTGG CGTTGGAACACCACCA ACCTGAGTATC-3' GGGTCCGTCAC - (SEQ ID NO 148) 3'(SEQ ID NO 149) 5'- 5'- CCATTTTACGGTGG CGTTGGAACACCACCA ACCTGAGTATC-3' GGGTCCGTCAC-3' (SEQ ID NO 148) (SEQ ID NO 149) AtSMO2-1 AtlgO7 Position nucléotide 1 Position nucléotide 402 420 SALK_105017 5'- 5'- ATGGCTTCCTTCGT CCATTTTGAATGCAAGA GGAATCTGGTTG- CGATGACC-3'(SEQ ID N( 3'(SEQ ID NO 131) 150) SALK_105018 5'- 5'- ATGGCTTCCTTCGT CCATTTTGAATGCAAGA GGAATCTGGTTG- CGATGACC-3' (SEQ ID N 3'(SEQ ID NO 131) 150) AtSMO2-2 At2g29 Position nucléotide 1 Position nucléotide 402 390 SALK_030719 5'- 5'- ATGGATTCTCTCGT CCATTTAGTATGCAAGA TGAATCCGGTTG-3' CTGTGACC-3' (SEQ ID N( (SEQ ID NO 133) 151) GK-587H06 5'- ATGGATTCTCTCGT 5'- TGAATCCGGTTG-3' CCATTTAGTATGCAAG (SEQ ID NO 133) ATCCTGTGACC-3' (SEQ ID NO 151) AtSCD1 Atlg47 Position nucléotide 1 Position nucléotide 417 290 SALK_074782 5'- 5'- ATGGTGATGGAAG GTCAAACACAACACTC TTACAGAGACTGA GGAGAACTTG-3' (SEQ G-3'(SEQ ID NO 152) ID NO 153) SALK_126057 5'- ATGGTGATGGAAG 5'- TTACAGAGACTGA GTCAAACACAACACTC G -3'(SEQ ID NO 152) GGAGAACTTG-3'(SEQ ID NO 153) AtSCD2 At2g2 Position nucléotide 1 Position nucléotide 435 6260 SALK_115861 5'- 5'- ATGTCGCCGGCAG CAAAATACCATGAAC CTACGGAGACGG- ACCATCAAACAC- 3'(SEQ ID NO 137) 3'(SEQ ID NO 154) SALK_147575 5'- 5'- ATGTCGCCGGCAG CAAAATACCATGAAC CTACGGAGACGG- ACCATCAAACAC- 3'(SEQ ID NO 137) 3'(SEQ ID NO 154) AtSCR1 AtSgl Position nucléotide 1 Position nucléotide 500 8210 SALK_060676 5'- 5'- ATGGCTTCCTCAGT GCTCCTTGCCCCGGGA CTCCTCTCTCG- TTAACGCCTCG-3' (SEQ 3'(SEQ ID NO 139) ID NO 155) GK-255F10 5'- ATGGCTTCCTCAGT 5'- CTCCTCTCTCG- GCTCCTTGCCCCGGGAT' 3'(SEQ ID NO 139) ACGCCTCG-3'(SEQ ID N( 155) AtSCR2 At3gO Position nucléotide 406 Position nucléotide 786 3980 CS26438 5'- 5'- GTCAACACAAAAG GATTTGACCATTGACC GAGCGTTCCTGTG- CATTCACCACCG- 3'(SEQ ID NO 156) 3'(SEQ ID NO 157) 5'- 5'- CS26559 GTCAACACAAAAG GATTTGACCATTGACC GAGCGTTCCTGTG- CATTCACCACCG- 3'(SEQ ID NO 156) 3'(SEQ ID NO 157) AtSCR3 At3gO Position nucléotide 1 Position nucléotide 500 4000 SALK_068469C 5'- 5'- ATGGCTGCAGCGTC GATGTTGAGAGGAGA ATCAGTTTCTTC- ATTATCCGGCCACCG- 3'(SEQ ID NO 143) 3'(SEQ ID NO 158) SALK_037317C 5'- 5'- ATGGCTGCAGCGTC GATGTTGAGAGGAGA ATCAGTTTCTTC- ATTATCCGGCCACCG- 3'(SEQ ID NO 143) 3'(SEQ ID NO 158) AtERG28 Atlgl Position nucléotide 1 Position nucléotide 386 0030 SALK_025834 5'- 5'- ATGAAGGCGTTGG GAAAGTTTGGAGTGTG GGTATTGGTTAATG GTTGTTCAAGG-3' (SEQ -3'(SEQ ID NO 124) ID NO 159) 5'- 5'- SALK_000240 ATGAAGGCGTTGG GAAAGTTTGGAGTGTG GGTATTGGTTAATG GTTGTTCAAGG-3' (SEQ -3'(SEQ ID NO 124) ID NO 159) AtTubulin AtlgO Position nucléotide 337 Position nucléotide 843 4820 5'- 5'- GAGATTGTTGACCT GTGCTTAGACCG-3' (SEQ ID NO 160) GGCTTTCTCTGCGGAGA ACTGGGGC-3'(SEQ ID N( 161) Exemple III : Complémentation avec les ADNt de la voie SC4DM Pour la complémentation des plantes génétiquement modifiées au niveau de smos, cds, scrs et erg28, des fragments correspondant aux régions codantes ont été insérés individuellement dans le vecteur pCAMBIA-1300 (http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors) selon le protocole de NEW ENGLAND BioLabs (marque déposée) Inc.. Des plantes Ti (« Ti plants » ) ont été sélectionnées sur un milieu MS contenant de l'hygromycine. Les amorces utilisées pour générer les différentes constructions sont listées dans le tableau 35 ci-dessous. Les différentes amorces utilisées comprenaient le site de restriction Xbal. Tableau 35: amorces utilisées pour la complémentation de smos, cds, scrs et erg28 des plantes modifiées (« mutant plants ») Gene Locus Amorce sens Amorce anti-sens comprenant le site de comprenant le site de restriction Xbal restriction Xbal AtSM01-1 At4g121 5'- 5'- 10 TGCTCTAGAGATGAT TGCTCTAGAGGATCGG TCCTTACGCTACAGT ATTTTATTCCTCCGTTA CGAAGAAG-3' (SEQ TGC-3' (SEQ ID NO 163) ID NO 162) AtSMO1-2 At4g227 5'- 5 _ 56 TGCTCTAGAGATGAT TGCTCTAGAGGATCGA CCCATACGCAACAAT ATTTCTCTCCTCCATTA CGAAG -3' (SEQ ID NO ACC-3 (SEQ ID NO 165) 164) AtSMO1-3 At4g227 5'- 5'- 53 TGCTCTAGAGATGAT TGCTCTAGAGGTAGAG15 CCCTTATCCAACCGT ACTGAAGCGGCTCTGT AGAAG-3' (SEQ ID NO CTCGG-3' (SEQ ID NO 166) 167) 5'- TGCTCTAGAGATGGC 5'- AtSMO2-1 At1g074 TTCCTTCGTGGAATCT TGCTCTAGAGGCGTTTG 20 GGTTG-3' (SEQ ID NO TTTCATGTCACCGTTTT 168) C-3' (SEQ ID NO 169) 5'- 5'- AtSMO2-2 At2g293 TGCTCTAGAGATGGA TGCTCTAGAGGGGTTTC 90 TTCTCTCGTTGAATCC TTTTAGGGCCTTAAGTT GGTTG-3' (SEQ ID NO TTC-3' (SEQ ID NO 171) 170) 5'- 5'- AtSCD1 At1g472 TGCTCTAGAGATGGT TGCTCTAGAGGGTCGA 90 GATGGAAGTTACAGA TCTTCTTGCTCCCGAAC GACTG-3' (SEQ ID NO AC-3' (SEQ ID NO 173) 172) 5'- 5 AtSCD2 At2g2626 TGCTCTAGAGATGTC TGCTCTAGAGGGTCGT 0 GCCGGCAGCTACGGA GTTTCTTGCTTCCGAAC GACGG-3' (SEQ ID NO AATTTC-3' (SEQ ID NO 174) 175) 5'- 5'- AtSCR1 At5g18 TGCTCTAGAGATGGC TGCTCTAGAGGTGAGC 210 TTCCTCAGTCTCCTCT TTTTCCAGTTTTGCTTC CTCG-3' (SEQ ID NO TTG-3' (SEQ ID NO 177) 176) 5'- 5 AtSCR2 At3g03 TGCTCTAGAGATGTC TGCTCTAGAGGTACAT 980 TACACATTCATCAAT ATCCACCATTAACAGG CTCGC-3' (SEQ ID NO AATG-3' (SEQ ID NO 178) 179) AtSCR3 At3g04 000 5'- 5'- TGCTCTAGAGATGGC TGCTCTAGAGGCAAGA TGCAGCGTCATCAGT GACAGCCACCATTAGC TTCTTC-3' (SEQ ID NO CATG-3' (SEQ ID NO 181) 180) AtERG28 At1gl0 5'- 5'- 030 TGCTCTAGAGATGAA TGCTCTAGAGGAGAAA GGCGTTGGGGTATTG GTTTGGAGTGTGGTTGT GTTAATG-3' (SEQ ID TC-3' (SEQ ID NO 183) NO 182) Exemple IV : Expression transitoire des enzymes de la voie SC4DM pour analyser leur compartimentation cellulaire L'expression transitoire de AtSMOs, AtSCDs, AtSCRs et AtERG28 marquée avec la GFP dans des feuilles d'Arabidopsis a été réalisée tel que décrit dans (Eastmond et al., 2010) [9]. La protéine du type reticulon AtRTNLB2 (At4g11220) fusionnée avec la GFP (GFP-AtRTNBLB2) a été utilisée comme marqueur protéique du Réticulum Endoplasmique (Nziengui et al., 2007) [16].
Les amorces utilisées pour générer les différentes constructions sont listées dans le tableau 36 ci-dessous. Les différentes amorces utilisées comprenaient le site de restriction Pcil ou Ncol ou BspHI. Les feuilles exprimant les constructions GFP individualisées ont été analysées par microscopie confocale-selon le procédé décrit dans (Bouvier et al., 2006) [4]. Tableau 36A: amorces utilisées pour le marquage GFP de SMOs, SCDs, SCRs et Erg28. Gene Locus Amorce sens comprenant le Amorce anti-sens site de restriction Pcil comprenant le site de restriction Pcil AtSMO At4g12 1-1 110 5'- 5'- GCGACATGTGAATGATTC GCGACATGTCATCGGAT CTTACGCTACAGTCGAAG TTTATTCCTCCGTTATGC AAG-3'(SEQ ID NO 184) -3'(SEQ ID NO 185) AtSMO At4g22 1-2 756 5'- 5'- GCGACATGTGAATGATCC GCGACATGTCATCGAAT CATACGCAACAATCGAAG TTCTCTCCTCCATTAACC AAGCG-3'(SEQ ID NO 186) AGCTTG-3'(SEQ ID NO 187) AtSMO At4g22 5'- 5'- 1-3 753 GCGACATGTGAATGATCC GCGACATGTCTAGAGAC CTTATCCAACCGTAGAAG TGAAGCGGCTCTGTCTC ATGCG-3'(SEQ ID NO 188) GG-3'(SEQ ID NO 189) AtSMO AtlgO7 5'- 5'- 2-1 420 GCGACATGTGAATGGCTT GCGACATGTCCGTTTGT CCTTCGTGGAATCTGGTTG TTCATGTCACCGTTTTCT -3'(SEQ ID NO 190) TTAAGGGT-3'(SEQ ID NO 191) AtSMO At2g29 5'- 5'- 2-2 390 GCGACATGTGAATGGATT GCGACATGTCGGTTTCT CTCTCGTTGAATCCGGTTG TTTAGGGCCTTAAGTTT -3'(SEQ ID NO 192) TCTGTAACC-3'(SEQ ID NO 193) AtSCD1 Atlg47 5'- 5'- 290 GCGACATGTGAATGGTGA GCGACATGTCGTCGATC TGGAAGTTACAGAGACTG TTCTTGCTCCCGAACAC AG-3'(SEQ ID NO 194) TTTC-3'(SEQ ID NO 195) AtSCD2 At2g26 5'- 5'- 260 GCGACATGTGAATGTCGC GCGACATGTCGTCATGT CGGCAGCTACGGAGACGG TTCTTGCTTCCGAACAA AGCG-3'(SEQ ID NO 196) TTTCTC-3'(SEQ ID NO 196) Tableau 36B Gene Locus Amorce sens comprenant le Amorce anti-sens site de restriction NcoI comprenant le site de restriction NcoI AtSCR1 At5g18 5'- 5'- 210 CATGCCATGGGAATGGCT CATGCCATGGCTGAGCT TCCTCAGTCTCCTCTCTCG TTTCCAGTTTTGCTTCTT C-3'(SEQ ID NO 198) G-3'(SEQ ID NO 199) AtERG2 At1gl0 5'- 5'- 8 030 CATGCCATGGGAATGAAG CATGCCATGGCAGAAAG GCGTTGGGGTATTGGTTA TTTGGAGTGTGGTTGTT ATG-3'(SEQ ID NO 200) CAAG-3'(SEQ ID NO 201) AtRTNL At4gll 5'- 5'- B2 220 CATGCCATGGGAATGGCG CATGCCATGGCATCCTT GATGAACATAAGCATGAA CTTCTTGTCTTTCAACGG G-3'(SEQ ID NO 202) TCC-3'(SEQ ID NO 203) AtSCR2 At3g03 980 5'- 5'- CATGCCATGGGAATGTCT CATGCCATGGCTACATA ACACATTCATCAATCTCGC TCCACCATTAACAGGAA AACCG-3'(SEQ ID NO 204) TGATTTG-3'(SEQ ID NO 205) Tableau 36C Gene Locus Amorce sens comprenant le Amorce anti-sens site de restriction BspHI comprenant le site de restriction BspHI AtSCR3 At3g04 5'- 5'- 000 GCGTCATGAGAATGGCTG GCGTCATGACCAAGAGA CAGCGTCATCAGTTTCTTC CAGCCACCATTAGCCAT TC-3'(SEQ ID NO 206) GATGACTTG-3'(SEQ ID NO 207) Exemple V : Expression hétérologue des enzymes de la voie SC4DM Les ADNc des enzymes de la voie SC4DM ont été sous-clonés dans le vecteur pBAD-TOPO (Invitrogen, K370-01), en utilisant le vecteur pBAD/TOPO Thio fusion (Invitrogen, K370-01) tel que décrit dans le document Bouvier et al., 2006 [4]. Les caractéristiques des différentes enzymes ont été obtenues à partir des cultures bactériennes après induction par l'arabinose (0,02%) et analyse par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) tel que décrit dans le document Bouvier et al., 2006 [4] sont les suivantes :
ERG25 (SMO), sterol-4 alpha-methyl-oxidase SMO1 AtSMO1-1 : At4g12110 - L'ADNc obtenue est le suivant : 5'- ATGATTCCTTACGCTACAGTCGAAGAAGCTTCAATCGCACTGGGA CGAAACCTCACACGTCTCGAAACTCTATGGTTCGATTACTCCGCC ACGAAGTCCGATTACTATCTCTACTGTCACAACATTTTGTTCTTGT TCCTCGTCTTCTCTCTCGTTCCTCTCCCTCTCGTTTTCGTCGAATTG GCTCGATCTGCTTCTGGTTTGTTTAATCGGTATAAGATCCAGCCTA AGGTTAATTACTCTTTATCTGATATGTTCAAATGTTACAAAGACG TCATGACGATGTTTATCCTCGTCGTTGGTCCATTGCAACTCGTTTC TTATCCTTCGATTCAGATGATTGAGATACGATCTGGATTACCATT ACCAACAATTACAGAGATGCTGTCACAGTTAGTAGTCTACTTCTT GATAGAAGACTACACTAACTACTGGGTACATAGATTCTTTCATAG TAAATGGGGATACGATAAGATTCATCGAGTTCATCACGAGTACAC AGCTCCTATAGGATATGCTGCTCCTTATGCACATTGGGCTGAAGT TTTGCTTCTCGGAATCCCGACGTTTATGGGACCAGCTATTGCTCCT GGTCATATGATAACCTTTTGGTTGTGGATTGCTTTAAGGCAAATG GAAGCTATTGAGACTCACAGTGGATATGATTTTCCATGGAGTCCA ACAAAATACATCCCTTTCTACGGTGGTGCTGAGTACCATGACTAT CATCACTACGTTGGAGGACAAAGTCAAAGCAACTTCGCTTCAGTG TTCACGTACTGTGATTACATTTATGGAACTGACAAGGGTTACAGA TTCCAAAAGAAGCTTCTTGAGCAGATCAAGGAGTCGTCGAAGAA GAGCAACAAGCATAACGGAGGAATAAAATCCGATTAG -3' (SEQ ID NO 208) - Région exprimée : de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 298 - Poids moléculaire de la protéine exprimée : 34,59 + 16,2 (Thiorédoxin depuis pBAD/TOPO Thio fusion) = 50,79 kDa - Séquence de la protéine MIPYATVEEASIALGRNLTRLETLWFDYSATKSDYYLYCHNILFLFL VFSLVPLPLVFVELARSASGLFNRYKIQPKVNYSLSDMFKCYKDVM TMFILVVGPLQLVSYPSIQMIEIRSGLPLPTITEMLSQLVVYFLIEDYT NYWVHRFFHSKWGYDKIHRVHHEYTAPIGYAAPYAHWAEVLLLGI PTFMGPAIAPGHMITFWLWIALRQMEAIETHSGYDFPWSPTKYIPFY GGAEYHDYHHYVGGQ SQSNFASVFTYCDYIYGTDKGYRFQKKLLE QIKESSKKSNKHNGGIKSD (SEQ ID NO 114) - Amorces utilisées pour isoler la séquence du nucléotide 1 au nucléotide 894 sont les suivantes : Amorce sens : 5'-ATGATTCCTTACGCTACAGTCGAAG-3' (SEQ ID NO 115) Amorce anti-sens : 5'-ATCGGATTTTATTCCTCCGTTATGC-3' (SEQ ID NO 116)
ERG26 (AtSCD), 4a-carboxystérol-C3-déshydrogénase/C4-décarboxylase AtSCD1 : At1g47290 2 0 - L'ADNc obtenue est le suivant : 5 ATGATCCCATACGCAACAATCGAAGAAGCGTCGATCGCATTATCT CGAAACCTCACATGGCTAGAGACTCTCTGGTTCGATTACTCCGCC ACCAAATCCGATTACTACCTCTACTGCCACAACATTCTCTTCCTCT 25 TCCTCATCTTCTCTCTCGTTCCTCTCCCTCTCGTTTTCATCGAATCA TCTCAATCCACCTCAGATTTGTTCAATCGCTACAAAATCCAACCA AAAGTGAAAAACTCATTCTCATCGATGTTCAAATGTTACAAAGAC GTCATGAAGATGTTCATCCTCGTCGTTGGTCCATTACAACTCGTTT CTTATCCTTCGATTCAGATGATTGAGATACGAAGTGGATTACCAT 30 TACCATCATGTATGGAGATTGTAGCACAGTTAGTGGTTTACTTCTT GGTAGAGGATTATACTAATTACTGGGTTCATAGATTCTTTCATTGT AAATGGGGTTATGAGAAGTTTCATCATATTCATCATGAGTATACA GCTCCTATTGGTTATGCTGCTCCTTATGCTCATTGGGCTGAGGTTT TGCTTCTTGGCATTCCCACGTTTCTTGGACCTGCTATTGCTCCTGG TCATATGATTACCTTTTGGTTGTGGATTGCTTTACGACAGATTGAG GCTATCGAAACTCATAGCGGATATGATTTCCCATGGTCTCTGACA AAGTACATTCCATTTTATGGTGGAGCTGAGTATCATGATTACCAT CACTACGTTGGAGGACAAAGCCAGAGTAACTTTGCTTCAGTTTTT ACTTACTGCGATTACATCTATGGAACTGATAAAGGTTACCGATTC CAGAAGAAGCTTCTTCAGCAGATGAAGGAGAAGTCCAAGAAGAG CAACAAGCTGGTTAATGGAGGAGAGAAATTCGATTAA -3' (SEQ ID NO 209) - Région exprimée : de l'acide aminé 134 à l'acide aminé 322 - Poids moléculaire de la protéine exprimée : 20,36 + 16,2 (Thiorédoxin depuis pBAD/TOPO Thio fusion) = 36,56 kDa - Séquence de la protéine MVMEVTETERWCVVTGGRGFAARHLVEMLVRYQMFHVRIADLAP AIVLNPHEETGILGEAIRSGRVQYVSADLRNKTQVVKGFQGAEVVFH MAAPDSSINNHQLQYSVNVQGTTNVIDACIEVGVKRLIYTSSPSVVF DGVHGTLNADESLPYPPKHNDSYSATKAEGEALILKANGRSGLLTC 2 0 CIRPSSIFGPGDKLMVPSLVTAARAGKSKFIIGDGSNFYDFTYVENVV HAHVCAERALASGGEVCAKAAGQAYFITNMEPIKFWEFMSQLLEGL GYERPSIKIPASLMMPIAYLVELAYKLLGPYGMKVPVLTPSRVRLLS CNRTFDSSKAKDRLGYSPVVPLQEGIKRTIDSFSHLKAQNQPKTEVT ETIQWKKQTLIAIVILITLYHNFVATTGSSSVIITAVSKVLLVSSIFMFI 2 5 NGILPEKMKVFGSKKID (SEQ ID NO 117) - Amorces utilisées pour isoler la séquence du nucléotide 400 au nucléotide 966 : Amorce sens : 5'-CCGAGTGTTGTGTTTGACGGGGTC-3' (SEQ ID NO 118) 3 0 Amorce anti-sens : 5'-CCTAACCCTAGAAGGTGTTAGCAC-3' (SEQ ID NO 119) ERG27 (AtSCR), Sterol 3-céto-réductase AtSCR1 : At5g18210 - L'ADNc obtenue est le suivant: 5'- ATGGCTTCCTCAGTCTCCTCTCTCGCCGGACGAGTCGCGATAGTC ACCGGTTCTTCTCGCGGAATCGGCCGAGCTATAGCCATACATCTC GCCGAGCTCGGCGCCAAGATAGTCATCAACTACACCACCAGATC CACCGAGGCCGATCAAGTCGCCGCAGAAATCAACTCATCCGCCG GCACCGTTCCGCAACCGATCGCCGTCGTGTTCCTCGCCGATATCT CAGAACCAAGCCAAATTAAGTCTCTCTTCGACGCGGCGGAGAAA GCCTTTAACTCGCCGGTTCACATCCTAGTTAACTCAGCTGGAATC CTCAATCCCAATTACCCTACCATCGCCAACACTCCCATTGAAGAA TTCGATCGCATCTTCAAGGTGAACACAAGAGGATCATTCTTATGC TGTAAAGAAGCAGCAAAAAGGCTAAAACGTGGAGGCGGTGGTAG GATTATACTGCTAACGTCGTCGTTAACCGAGGCGTTAATCCCGGG GCAAGGAGCTTATACAGCATCAAAGGCAGCTGTTGAAGCAATGG TGAAGATTCTTGCTAAGGAACTTAAAGGTTTAGGCATCACTGCAA ACTGTGTATCTCCAGGGCCTGTTGCGACGGAGATGTTTTTTGACG GGAAGAGTGAAGAGACGGTGATGAATATCATTGAGAGGAGTCCT TTTGGTAGGCTTGGTGAGACTAAAGATATTGCTTCTGTTGTTGGTT TCTTAGCTAGTGATGGTGGATTCAAATTGCAATTTAGTGGTGACA CAAGAATCAGCAATATACTACAATGCATAAACAATGCTAAAACA ACCAAGAAGCAAAACTGGAAAAGCTCATAG-3'(SEQ ID NO 210) - Région exprimée : de l'acide aminé 98 à l'acide aminé 229) - Poids moléculaire de la protéine exprimée : 14,03 + 16,2 (Thiorédoxine depuis pBAD/TOPO Thio fusion) = 28.23 kDa - Séquence de la protéine MAS S V S SLAGRVAIVTGS SRGIGRAIAIHLAELGAKIVINYTTRSTEA 3 0 DQVAAEINSSAGTVPQPIAVVFLADISEPSQIKSLFDAAEKAFNSPVHI LVNSAGILNPNYPTIANTPIEEFDRIFKVNTRGSFLCCKEAAKRLKRG GGGRIILLT S SLTEALIPGQGAYTASKAAVEAMVKILAKELKGLGITA NCVSPGPVATEMFFDGKSEETVMNIIERSPFGRLGETKDIASVVGFLA SDGGFKLQFSGDTRISNILQCINNAKTTKKQNWKSS (SEQ ID NO 120) - Amorces utilisées pour isoler la séquence du nucléotide 292 au nucléotide 687 : Amorce sens : 5'-CTAGTTAACTCAGCTGGAATCCTC-3' (SEQ ID NO 121) Amorce anti-sens : 5'-CTCACCAAGCCTACCAAAAGGACTC-3' (SEQ ID NO 121) AtSCR4 : At3g66658 - L'ADNc obtenue est le suivant: 5 ATGCCGTTTTGGTGGCCACTGATCGTCCTCGCCTTCGCTTACGCGATC TGCAAGTTCCTTCTTATGCTCATTCCTCCCAATGTTCCTTCCATTGAC GTTGACGCATCCGATGTGTTGGCTCATGGGAAAGATACGGAGGAGA ATAGCTTCATCTATATTCCTCCCAGAGGAAGGAGCCAACAGTCTGAC AAAAAAGTTCAATGTTATGAACCTGCCACAATGAAATATCTGGGATA TTTCCCTGCTCTGTCGCCTACTGAGGTCGAGGAGCGCGTAACACTAT CAAGGAAGGCTCAAAAGACATGGGCTCAAAGTAGCTTCAAGCTTAG AAGGCAGTTCTTGCGGATTCTTCTTAAGTACATTATTGAACACCAAG AGCTTATATGCGAAGTCTCTTCACGTGATACTGGAAAGACTATGGTA GATGCGTCCCTGGGAGAAATTATGACTACTTGTGAGAAAATTACTTG GCTTCTTTCTGAGGGCGAACGATGGTTAAAGCCTGAATCTCGTTCTTC AGGAAGAGCTATGCTTCATAAAGTATCACGAGTAGAGTTCCATCCCC TTGGTGTCATTGGAGCTATAGTCCCATGGAATTATCCCTTCCACAATA TTTTCAACCCTATGCTGGCTGCAGTCTTCTCTGGGAATGGCATTGTTA TTAAGGTTTCAGAACACGCTAGCTGGTCGGGATGCTTTTACTTCCGC ATAATCCAGGCAGCTTTAGCTGCTGTTGGAGCACCAGAAAATCTAGT CGATGTGATAACAGGGTTTGCGGAGACCGGAGAAGCACTTGTCTCAT CTGTTGATAAAATGATATTTGTTGGATCCACAGCTGTTGGCAAGATG ATAATGAGAAATGCTGCCGAGACATTGACACCTGTCACTCTTGAGCT TGGTGGAAAAGATGCATTTATCATATGTGAAGACGCAGATGTCTCAC ATGTTGCACAAGTGGCTGTAAGGGGCACTCTTCAGTCCAGCGGGCAA AACTGTGCCGGTGCTGAAAGATTTTATGTCCACAAAGACATTTATAC TGCATTCATTGGCCAAGTAACCAAGATTGTGAAGTCAGTTTCTGCTG GTCCTCCTCTAACTGGAAGGTATGACATGGGAGCTATATGTTTGCAA GAGCACTCTGAACACCTACAGAGCCTTGTAAATGACGCCTTAGACAA AGGAGCTGAAATTGCAGTCCGTGGCAGCTTTGGTCATCTGGGGGAAG ATGCAGTCGATCAATATTTCCCTCCAACTGTTCTCATCAATGTGAACC ACAACATGAAAATAATGAAAGAAGAGGCTTTTGGACCAATAATGCC AATCATGCAATTCAGCACCGATGAAGAGGTCATAAAGCTGGCAAAT GATTCACGTTATGCTCTAGGCTGTGCTGTTTTCTCTGGAAGCAAGCAT CGCGCCAAACAAATAGCTTCTCAAATTCAGTGCGGTGTTGCTGCAAT CAATGACTTTGCATCAAATTACATGTGCCAGTCGCTCCCGTTTGGAG GTGTAAAGGATAGTGGGTTTGGACGGTTTGCTGGAATAGAAGGTTTA AGAGCATGCTGTCTTGTGAAATCGGTGGTTGAAGATAGATTTTGGCC ACTCATCAAGACCAAGATTCCAAAACCTATTCAGTATCCGGTAGCAG AAAACGCATTTGAATTCCAGGAGGCCCTAGTCGAAACTCTTTATGGA CTCAACATTTGGGACCGGCTAAGATCCCTAATCGATGTCCTCAAGTT CCTTACCGATCAGAGCTCTAACGTGAGCAGAACTAGAAAGAGCCAC 2 0 TGA -3'(SEQ ID NO 216) - Séquence de la protéine MPFWWPLIVLAFAYAICKFLLMLIPPNVPSIDVDASDVLAHGKDTEENSF IYIPPRGRSQQSDKKVQCYEPATMKYLGYFPALSPTEVEERVTLSRKAQ KTWAQSSFKLRRQFLRILLKYIIEHQELICEVSSRDTGKTMVDASLGEIM 2 5 TTCEKITWLLSEGERWLKPESRSSGRAMLHKVSRVEFHPLGVIGAIVPW NYPFHNIFNPMLAAVF S GNGIVIKV SEHAS WSGCFYFRIIQAALAAVGAP ENLVDVITGFAETGEALVS SVDKMIFVGSTAVGKMIMRNAAETLTPVTL ELGGKDAFIICEDADVSHVAQVAVRGTLQSSGQNCAGAERFYVHKDIY TAFIGQVTKIVKSVSAGPPLTGRYDMGAICLQEHSEHLQSLVNDALDKG 3 0 AEIAVRGSFGHLGEDAVDQYFPPTVLINVNHNMKIMKEEAFGPIMPIMQ FSTDEEVIKLANDSRYALGCAVFSGSKHRAKQIASQIQCGVAAINDFASN YMCQSLPFGGVKDSGFGRFAGIEGLRACCLVKSVVEDRFWPLIKTKIPK PIQYPVAENAFEFQEALVETLYGLNIWDRLRSLIDVLKFLTDQSSNVSRT RKSH (SEQ ID NO 217) ERG28 ERG28 : Atlgl0030 - L'ADNc obtenue est le suivant: 5'- ATGAAGGCGTTGGGGTATTGGTTAATGGTGGTTGGTTCACTGAGA CTAGCTTCTGTTTGGTTTGGTTTCTTCAACATTTGGGCTCTTCGTC TCGCTGTCTTCTCTCAGACCACCATGAGTGAAGTTCATGGACGTA CATTCGGAGTATGGACACTCTTGACCTGCACTCTCTGCTTTCTTTG TGCATTCAACCTCGAAAACAAACCATTATACTTGGCTACGTTTCT ATCATTTATCTATGCGTTAGGCCATTTTCTGACTGAATACCTCTTT TACCAAACAATGACCATCGCGAATCTCTCAACTGTGGGCTTCTTT GCAGGTACATCGATTGTGTGGATGCTCTTGGAGTGGAATTCCCTT GAACAACCACACTCCAAACTTTCTTGA-3'(SEQ ID NO 211) - Région exprimée : de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 129) - Poids moléculaire de la protéine exprimée : 14,77 + 16,2 (Thiorédoxine 2 0 depuis pBAD/TOPO Thio fusion) = 30,77 kDa - Séquence de la protéine MKALGYWLMVVGSLRLASVWFGFFNIWALRLAVFSQTTMSEVHGR TFGVWTLLTCTLCFLCAFNLENKPLYLATFLSFIYALGHFLTEYLFYQ TMTIANLSTVGFFAGTSIVWMLLEWNSLEQPHSKLS (SEQ ID NO 2 5 123) - Amorces utilisées pour isoler la séquence du nucléotide 1 au nucléotide 387: Amorce sens :5'-ATGAAGGCGTTGGGGTATTGGTTAATG-3' (SEQ ID NO 124). Amorce anti-sens :5'-AGAAAGTTTGGAGTGTGGTTGTTC-3' (SEQ ID 3 0 NO 125).
Exemple VI : Préparation des anticorps Les anticorps dirigés contre AtSMO1-1, AtSCD1, AtSCR1 et AtERG28 ont été obtenus à partir de la protéine recombinante produite avec le vecteur pBAD/TOPO Thio fusion. La bande correspondant à la protéine excisée d'un gel SDS-PAGE a été utilisée pour l'immunisation d'un lapin selon le protocole décrit précédemment (Harboe et Ingild 1977) [10].
Exemple VII : Test d'affinité entre les différents constituants protéiques de la voie SC4DM Les protéines foliaires issues de feuilles de Nicotiana benthamiana transfectées par les constructions GFP-AtSMO1, GFP-AtSMO2, GFP-AtSCD, GFP-AtSCRD et GFP-AtERG28 selon une méthode précédemment décrite (Batoko et al, 2000 [2] ; Mialoundama et al. 2009 [14]) ont été extraites dans un tampon contenant : 50 mM Tris-HC1, pH 7,6, 2 mM PMSF (phénylméthanesulfonylfluoride), 0,2% Triton X-100 et 3% digitonin. Après centrifugation à 10 000g pendant 10 minutes, le surnageant (750 µl) a été incubé à 4°C pendant 6h avec 100 µl d'anticorps anti-AtERG28 couplé au Sepharose selon un procédé décrit préalablement (Schneider et al. 1982) [19]. Après lavage par le tampon (50 mM Tris-HC1, pH 7,6, 0,25 M KC1, 2 mM PMSF, 0,3% digitonin), les protéines immunoadsorbées sont éluées par 0,1 M glycine (pH 2,5). L'éluant est neutralisé à pH 7,6 et analysé par SDS-PAGE immunoblot en utilisant l'anticorps anti-GFP (Invitrogen) comme décrit précédemment (Bouvier et al., 2006) [4]. Dans la capture par « pull-down » la protéine recombinante AtERG28 a été purifiée en utilisant une colonne d'affinité TALON selon les instructions du fournisseur (Clontech) et couplée à la biotine streptavidin-Agarose en utilisant le kit Pull-Down Biotinylated protein :protein interaction (Thermo Scientific) selon les instructions du fournisseur. La Streptavidine Agarose (200 µl) a été incubée pendant 30 min a 25°C avec 250 µg d' AtERG28 biotinylée. La Rubisco protein (Sigma) est biotinylée dans les mêmes conditions et utilisée comme témoin négatif.
Les extraits de E. coli (500 µg) obtenus par lyse des bactéries exprimant les protéines recombinantes ont été incubés pendant 2h à 6°C avec AtERG28 biotinylée et couplée à la streptavidine agarose dans un tampon contenant :50 mM Tris-HC1, pH 7,6, 3% digitonin, 2 mM PMSF, 0,2% Triton X-100 et 0,1 M KC1. Après lavage, les billes d'agarose sont lavées par centrifugation en présence d'un tampon contenant : 50 mM Tris-HC1 pH 7,6, 2 mM PMSF, 0,3% digitonin et 0,25 M KC1, pour éliminer les protéines retenues non spécifiquement. Les protéines interagissant spécifiquement avec AtERG28 ont été éluées par 0.1 M glycine (pH 2,5) et analysées par Nano Liquid Chromatographie MS/MS (NanoLC-MS/MS) selon le procédé suivant : Les bandes de gel d'acrylamide ont été prédigérées en utilisant un système automatique MassPREP (Waters, Manchester, GB). Les bandes de gel ont été lavées deux fois dans le bicarbonate d'ammonium 25 mM et l'acétonitrile. Les liaisons S-S ont été par la suite réduites dans du dithiothréitol 10 mM (Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne) à 57° C et les cystéines sont alors alkylées dans de l'iodoacetamide 55 mM (Sigma Aldrich). Après la déshydratation avec l'acétonitrile, les protéines ont été coupées dans le gel en utilisant soit 125 ng de trypsine porcine (Promega, WI, E.U.) modifiée, soit 125 ng de chymotrypsine bovine pancréatique (Roche, Penzberg, Allemagne), ou 130 ng de Pseudomonas fragi AspN (Promega). Les peptides ont été extraits séquentiellement avec 1% d'acide trifluoroacétique dans un mélange acétonitrile/eau (60v/40v) et 100% 2 0 d'acétonitrile avant concentration par Speed Vac. Puis, les échantillons ont été dilués 60 fois dans de l'eau avant l'analyse. L'analyse NanoLC-MS/MS a été réalisée par chromatographie liquide ultra performance (NanoAcquity, Waters, Milford MA, E.U.) couplée à la spectrométrie de masse haute résolution nanoElectrospray-Quadrupole-Time of Flight (Maxis, 25 Bruker Daltonics, Bremen, Allemagne). 2 µL de chaque échantillon ont été injectés sur une précolonne C18 Symmety, 20 x 0,18 mm, 5 µm (Waters) et les peptides sont séparés sur une colonne ACQUITY UPLC® BEH130 C18 (Waters), 75 µm x 200 mm, 1,7 µm de taille de particule. Le solvant a été constitué de 0,1% d'acide formique dans l'eau (solvant A) et de 0,1% d'acide formique dans l'acétonitrile 30 (solvant B). L'analyse a été réalisée pendant 3 min à une vitesse de 5 µL/min avec 99% de solvant A et 1% de solvant B. L'élution a été réalisée à une vitesse de 450 nL/min, en utilisant un gradient de solvant 6-35% (solvant B) pendant 21 min à 45°C suivi par 90% (solvant B) pendant 1 min avant le remplissage de la colonne à 99% de solvant A pendant 6 min. Le spectromètre de masse Maxis équipé d'un nanosprayer a été utilisé en mode d'ionisation positif. La calibration massique de l'analyseur à temps de vol a été réalisée avant l'analyse sur des valeurs de m/z allant de 50 à 2200 avec Tunemix (Agilent technologies, Waldbronn, Allemagne). Une correction online de cette calibration a été réalisée en utilisant deux ions Tunemix (m/z 299.2945 et 922.0098) en tant que masses de recalibration. La valeur de caper a été fixée à 4500 V et la tension de contre électrode à été fixée à -500 V. Pour la spectrométrie de masse en tandem, le système a été réalisé par basculement automatique du mode MS au mode MS/MS. Le scan MS est réalisé pour une gamme m/z [50;2200] à 0,2 secondes/scan. Le temps MS/MS est étalonné par l'intensité du pic sélectionné sur le spectre de masse; il varie de 0,1 à 1,4 secondes/scan pour la même gamme de m/z. Les quatre peptides les plus abondants, de préférence des ions doublement et triplement chargés, ont été sélectionnés sur chaque spectre de masse pour une isolation et une dissociation de collision induite en utilisant une énergie de collision optimisée dépendante de l'état de charge et du m/z de l'ion. Les peptides sélectionnés sont alors analysés pendant 0,6 secondes. Le système complet a été 2 0 contrôlé dans sa totalité par Compass Hystar (Bruker). Les données de spectrométrie de masse collectées durant l'analyse ont été converties en fichiers .mgf en utilisant « Compass Data Analysis 4 » (Bruker). Les fichiers mgf comprenant la liste des pics MS et MS/MS ont été alors soumis au moteur de recherche Mascot (Matrix Sciences, London, GB) dans sa version 2.3.01 25 sur un serveur local. Les recherches ont été réalisées sur une base de données d'un composite cible généré en utilisant les outils développés en interne (http://msda.ustrasbg.fr) et contenant les séquences NCBI des protéines de la plante Arabidopsis thaliana et les contaminants communs (trypsine et kératines humaines) téléchargées le 4 mars 2011. Les recherches ont été réalisées avec une erreur de masse tolérée de 30 10 ppm pour les ions précurseurs et de 0,05 Da pour les ions fragmentés. Un maximum d'une erreur de coupure est tolérée pour la trypsine et la chymotrypsine et 3 erreurs de coupure sont tolérées pour AspN. La carbamidométhylation des résidus cystéine a été cherchée comme une modification fixe- L'oxydation des résidus de la méthionine et l'acétylation des résidus N-terminal de la protéine ont été cherchées comme modification variable. Les protéines identifiées avec deux peptides ou plus ayant un résultat d'ion Mascot supérieur à 25 et supérieur ou égal au résultat du seuil de Mascot d'identité à 95 % du niveau de confiance ont été validées après vérification manuelle.
Les résultats obtenus chez Nicotiana benthamiana et par « pull-down » montrent que chez les plantes, AtERG28 interagit avec AtSMO1-1(At4g12110), AtSCD1(At1g47290) et AtSCRl(At5g18210) et l'ensemble forme un complexe in vivo.
Exemple VIII : Analyse de métabolites de dérivés du stérol d'extraits de plantes utilisant l'UPLC-APCI+/APPI+ - MS/MS Des extraits de plante contenant des molécules dérivées du stérol ont été obtenus en utilisant le mélange CH2C12/MeOH (2/1, v/v) et concentrés à 500µl dans le même mélange de solvants. Chaque échantillon a été analysé par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une spectrométrie de masse (UPLC- 2 0 MS/MS). Les analyses ont été exécutées sur un triple Quadripôle Waters Quattro Premier XE (Waters, Mildorf, MA Etats-Unis) équipé d'une source chimique d'ionisation à pression atmosphérique (APCI) et d'une source d'ionisation photonique à pression atmosphérique (APPI) couplées à un système de chromatographie d'Acquity UPLC (Waters) avec un détecteur UV à réseau de 25 diodes (DAD). Des spectres UV ont été enregistrés de 200 à 500 nanomètres. Des séparations chromatographiques ont été réalisées en utilisant une colonne d'Acquity UPLC BEH C18 (100 x 2,1 millimètres, 1,7 µm ; Waters), couplées à une pré-colonne d'Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 5 millimètres, 1.71um ; Waters). Les solvants de phase mobile étaient le méthanol à 75% dans l'eau acidifiée avec 0,01% 30 d'acide formique (solvant A) et 100% d'isopropanol acidifié avec 0,01% d'acide formique (solvent B). La séparation a commencé avec 100% de solvant A maintenu pendant 2 minutes, suivi par 25 minutes de gradient linéaire de 50% de solvant A qui a été maintenu pendant 4 minutes avant d'appliquer un gradient linéaire de 50% de A à 100% de B en 8 minutes et l'élution isocratique avec du solvant B pendant 3 min. Un gradient linéaire de 4 minutes pour atteindre 100% de solvant A, suivi par 7 minutes à 100% de solvant A a été appliqué pour ré-équilibrer la colonne. Le temps d'exécution total était de 48 min. La colonne a été chauffée à 47°C avec un débit de 0,3 ml unitaire par minute et le volume d'échantillon injecté était de 41. Le gaz de séchage et le gaz nebulisant étaient l'azote produit à partir d'air pressurisé dans un générateur d'azote N2G (Mistral, Schmidlin-dbs-AG, Suisse).
Les paramètres comportant la détection MS et l'ionisation APCI étaient comme suit : le débit de gaz du nébuliseur a été fixé à approximativement 501.h-', et le débit de gaz de desolvatation à 500 l.h -'. La température de sonde APCI a été fixée à 450°C, et la température de source à 120°C. La tension capillaire a été fixée à 1,5 kilovolts et la tension de cône après optimisation pour chaque molécule dérivée du stérol a été fixée à 25V. Le mode d'ionisation était positif. La résolution de faible masse et de masse élevée étaient de 15 pour les deux analyseurs de masse, les énergies d'ion 1 et 2 étaient de 1V, le potentiel d'entrée et de sortie étaient de 30V et le gain du détecteur (multiplicateur) était de 650V. Des spectres de masse des molécules dérivées du stérol ont été acquis avec une gamme de balayage m/z de 350-1100 2 0 amu. Le mode d'enregistrement d'ion choisi (SIR) a été employé pour déterminer la masse m/z de la molécule dérivée du stérol. Le mode de balayage « ion fils » a été alors employé pour déterminer le modèle de fragmentation pour chaque molécule au mode MS/MS. La « Multiple Reaction Monitoring » et l'ionisation positive en mode APCI et APPI ont été alors employées pour les analyses qualitatives. La 25 combinaison du temps de rétention du chromatogramme (t), de la masse de l'ion moléculaire et du modèle de fragmentation a été utilisé sélectivement pour contrôler les différentes molécules dérivées du stérol. L'acquisition et l'analyse de données ont été exécutées avec le logiciel de MassLynx (version 4,1) fonctionnant sous Windows XP professionnel sur un Pentium PC. 30 Exemple IX : Synthèse chimique d'un dérivé du stérol Le dérivé Dl du stérol, ci-dessous représenté, et conformes à l'invention a été synthétisé chimiquement selon l'article de H-J Knoelker et al: Eur. J. Org. Chem. 2006, 3687-3706 et l'article de T.A.Spencer et al : J. Org. Chem. 1975, 40, 2079-2085 à partir de Cholest-3-ène 3 [(trimethylsily) loxy].
Exemple IX.1 : Synthèse du Cholest-3-ene 3 [(trimethylsily) loxvl Me3SiO 10 Une solution a été préparée à partir de 3 g (7,8 mmole, léq) de (+) 4 cholesten-3-one (commercial Aldrich 18,817-4) dans du THF anhydre (60 mL). Il est ajouté à froid (-78°C) de l'ammoniac (50mL) puis 0,12 g (17 mmole, 2,2 éq) de lithium métal en morceaux. L'ensemble est porté à reflux (-35°C) pendant 2 heures. 15 L'ammoniac est évaporé par réchauffement progressif jusqu'à température ambiante (20°C). Après addition de 20 mL de THF anhydre, l'ensemble est refroidit à -10°C et de la triéthylamine (4,4mL, 4éq) et du triméthylchlorosilane (3,9mL, 3,9éq) sont ajoutés successivement. L'ensemble est agité pendant 15h avec retour progressif à température ambiante. Le mélange est dilué avec 100 mL d'éther 2 0 éthylique, lavé avec une solution saturée de hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) (40mL) puis une solution de chlorure de sodium (NaCl) (40 mL) et séché sur sulfate de sodium (Na2SO4). Après filtration et évaporation des solvants sous pression réduite (2000 Pa, 20mbar, 20°C), le solide blanc obtenu a été purifié rapidement sur gel de silice (300g, EP+ 1% de triéthylamine puis EP + 1% de 25 triéthylamine et 1% d'éther éthylique) pour donner un solide blanc (1,43g, 3.1 mmole). Le produit est obtenu avec un rendement de 40%. C30H54OSi 13C (75 MHz, C6D6) : 149,69; 108,08; 56,72; 53 ,36; 45,52; 43,04; 40,50; 39,95; 36,68; 36,25; 35,91; 35,41; 35,14; 32,42; 28,68; 28,59; 28,41; 38,37; 24,53; 24,38; 23,04; 22,79; 21,86; 19,03; 12,4; 12,13; 0,53.
Exemple IX.2 : Synthèse du Cholestane 4-carboxylic acid, 3-oxo, methyl ester (4alpha,5alpha) Une solution a été préparée à partir de 0,5 g (1,09 mmole, léq) de 3- trimethylsilyloxy-3-cholestene dans de l'éther éthylique (20mL). Le mélange est agité à température ambiante et une solution de nBuLi dans l'hexane (0,75mL, 1,1 mmole, 1,01 éq) est ajoutée. Après 1h, le mélange est refroidit à -78°C et du cyanoformate de méthyle (0,105 mL, 1,32 mmole, 1,21 éq) est ajouté. Le mélange est laissé sous agitation 24h avec un retour progressif à température ambiante. De l'eau (lOmL) est ajoutée et le mélange est agité pendant l0min. La phase aqueuse est extraite à l'éther éthylique (3 x 20mL). Les phases organiques sont réunies et lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium (NaCl) puis séchées sur sulfate de sodium (Na2SO4). Après filtration et concentration sous pression réduite (2000Pa, 20mbar, 20°C), l'huile orange obtenue est purifiée par chromatographie 2 0 sur gel de silice (100g, EP/AcOEt 90/10) pour obtenir 0,208 g (0,467 mmole) d'un solide blanc. Le produit est obtenu avec un rendement de 43%. C29H4803 MW: 444,69 1H (300MHz, CDC13): 3,74 (s,3H); 3,23 (d, 2H, J= 12,9Hz); 2,36-2,48 (m, 2H); 25 1,75-2,08 (m, 4H); 0,74-1,74 (m, 35H), 0,67 (s,3H) 0 CO2CH 3 13C (75 MHZ, CDC13) : 206,67; 171,03; 60,51; 56,65; 56,61; 54,17; 52,36; 49,18; 43,01; 40,27; 39,96; 38,32; 38,15; 36,58; 36,22; 35,96; 35,59; 31,82; 28,67; 28,46; 27,37; 24,61; 24,27; 23,27; 23,01; 21,79; 19,11; 12,87; 12,52 Exemple IX.3 : Synthèse du Cholestane 4-carboxylic acid, 4-méthyl, 3-oxo, méthyl ester (4alpha,5alpha) Sur une suspension de NaH (60% dispersion dans l'huile 20 mg, 0,48 mmole, 1,06éq) dans du DME (5mL) est ajoutée la 4-carbomethoxy cholestanone (0,2 g, 0,45 mmole, léq) et une demi goutte de tBuOH. Après la fin de l'évolution du dégagement gazeux, le mélange est traité par de l'iodure de méthyle (lmL, 16 mmole, 35,7 éq) et le milieu est porté à 70°C pendant 4h. Le milieu est traité par de l'eau (lmL) puis évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est dissout dans de l'eau (lOmL) et extrait avec de l'éther éthylique (3x 20mL). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée de chlorure de sodium (NaCl) puis séchées sur sulfate de sodium (Na2SO4). Après filtration et concentration sous pression réduite (2000Pa, 20mbar, 20°C), l'huile incolore obtenue est purifiée par 2 0 flash chromatographie (50g, EP/AcOEt 97/3) pour donner le 4-carbométhoxy-4alpha-methyl cholestanone 34 mg (0,074 mmole) et le 4-carbométhoxy 4bétaméthyl cholestanone 100mg (0,218 mmole) . Les produits sont obtenus avec un rendement de 64%. C30HSO03 2 5 MW : 458,72 - Composé moins polaire iH (300MHz, CDC13): 3,04 (s, 3H), 2,92 (dt, 1H, J = 6,3 et 14,7Hz), 2,37 (ddd, 1H, J= 2,4, 4,5 et 14,4Hz); 1,70- 2,1 (m, 6H); 0,70-1,65 (m, 36H); 0,63 (s,3H) 13C (75 MHZ, CDC13) : 209,27; 173 (manque); 57,85; 57,60; 56,26; 56,23; 55,29; 51,95; 42,44; 39,86; 39,51; 37,12; 36,92; 36,15; 35,78; 35,13; 32,85; 28,26; 28,02; 24,22; 23,83; 23,68; 22,82; 22,57; 21,13; 21,07; 18,66; 12,56; 12,00. - Composé plus polaire 1H (300MHz, CDC13): 3,70 (s, 3H) ; 2,60 (ddd, 1H, J = 6,3, 13,5, 16,2 Hz) ; 2,38 (ddd, 1H, J = 2,7, 4,8, 16,2Hz) ; 2,24 (dd, 1H J = 2,7, 12,6 Hz) ; 1,98 (dm, 2H, J = 12,6Hz) ; 1,64- 1,90 (m, 2H) ; 0,78-1,68 (m, 37H), 0,65 (s, 3H). 13C (75 MHZ, CDC13) : 211,23; 173,97; 61,80; 56,31; 56,20; 55,58; 52,47; 50,97; 42,50; 39,76; 39,53; 37,13; 36,15; 35,81; 35,66; 35,24; 34,83; 32,09; 28,25; 28,04; 24,25; 24,02; 23,87; 22,85; 22,59; 20,89; 18,68; 17,10; 13,80; 12,03.
Exemple IX.4 : Synthèse du Cholestane 4-carboxylic acid, 4-méthyl, 3- hydroxy, méthyl ester (3béta,4alpha,5alpha) Une solution a été préparée à partir de 0,070 g (0,152 mmole, l éq) de 4-béta- 2 0 méthyl, 4-alpha-carbométhoxy cholestanone dans du méthanol (l OmL). On ajoute 0,010 g de NaBH4 (0,264 mmole, 1,7 éq) et on agite à température ambiante pendant 15h. Le milieu est traité par une solution de HC1 à 10% jusqu'à neutralité. L'ensemble est concentré sous pression réduite puis repris par de l'eau (lOmL) et extrait au dichlorométhane (3x 20 mL). Les phases organiques sont séchées sur 25 sulfate de sodium (Na2SO4) puis filtrées et concentrées sous pression réduite (2000Pa, 20 mbar, 20°C). Le solide blanc est purifié par chromatographie sur gel de
silice (10g, EP/AcOEt 90/10) pour donner 0,030 g (0,065 mmole) d'un solide blanc. Le produit est obtenu avec un rendement de 42%. C30H5203 MW: 460,73 Exemple IX.5 : Synthèse du Cholestane 4-carboxylic acid, 4-méthyl, 3-hydroxy (3béta,4alpha,5alpha) Dl (Dl) Une solution alcoolique de potasse à 20 % (6mL) a été préparée. Le 4béta-méthyl, 10 4alpha-carbométhoxy, 3béta- hydroxy cholestane précédent 0,018 g (0,039 mmole, léq) dans lmL de méthanol est ajouté. Le milieu est agité sous reflux pendant 8h et à température ambiante pendant 15h. Cette solution est versée à température ambiante sur de l'eau (100mL) et extraite avec de l'acétate d'éthyle (3x 20mL). Après séchage sur sulfate de sodium (Na2SO4), la phase organique est filtrée et 15 concentrée sous pression réduite pour donner 0,015 g (0,033 mmole) d'un solide blanc. Le produit est obtenu avec un rendement de 85%. C29HSO03 MW: 446,71
2 0 Exemple X : Essais sur le transport et le "binding" de l'auxine Le transport basipète de l'auxine est déterminé comme décrit précédemment (Okada et al. 1991 [17] ; Lewis et Muday 2009 [12]) en utilisant l'auxine radioactive [5-3H]-IAA (20 Ci/mmol) de American Radiolabeled Chemical, Inc.. Des segments (2,5 cm) de tiges florifères de plantes d'Arabidopsis agées de 40 jours sont placées 25 dans des tubes de microcentrifugeuses contenant 30 microlitres de tampon MES 5 mM (pH 5,5) et contenant 200 nM d'auxine [5-3H]-IAA (American Radiolabeled5 Chemical, Inc.) et des quantités variables d'inhibiteurs terpéniques ou d'acide naphtylphtalamique (SIGMA). Après 18h d'incubation à 20°C, la radioactivité correspondant au transport spécifique de l'auxine est mesurée au compteur à scintillation liquide. Les études de « binding » ont été réalisées selon les techniques décrites précédemment en analysant la compétition entre l'acide [2, 3, 4, 5, 3H]-Naphtylphtalamique (60 Ci/mmol) (American Radiolabeled Chemical, Inc.) et les dérivés terpéniques au niveau des sites de fixation de l'auxine (Jacobs et Rubery, 1988 [11]; Brown et al. 2001[5]; Dixon et al. 1996 [9] ; Noh et al. 2001 [15]).
Listes des références
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Claims (18)

  1. REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) RI-O (1) dans laquelle, - RI représente un substituant choisi parmi l'atome d'hydrogène, les groupements alkyles C1-C6, linéaires ou ramifiés, les aryles, le groupement acétyle et le groupement carbohydrate ; lesdits aryles comprenant le phényle, le naphthyle, le benzyle, le p-méthoxybenzyle, et le benzoyle - R2 représente un substituant choisi dans le groupe comprenant l'atome d'hydrogène et les groupements alkyles C1-C6, linéaires ou ramifiés; - R3 représente un substituant choisi dans le groupe comprenant un hydroxyle, un carbinole, un aldéhyde et un carboxyle ; - R4 représente en absence de double liaison en C8-C14 et en C14-C15 un substituant choisi parmi l'hydrogène et les alkyles C1-C6 ; - Y un groupement alkyle ou alcène choisi parmi le groupement YI et le groupement Y2 ; R5 28 Y1= sss <, 24 25 25 R5 représente un substituant choisi parmi l'atome d'hydrogène et les alkyles C1-C6 ; 2976578, Version propre 92 Demande de Brevet Français n°1155159 ledit composé (I) pouvant éventuellement comprendre en outre au moins une double liaison choisie parmi une double liaison en C7-C8, C8-C9, C8-C14, C14-C15, C24-C28 et C24-25 ; et le carbone C19 étant soit un groupement méthyle, substituant du carbone 5 C10, soit un groupement méthylène formant dans ce cas un cyclopropane avec les carbones C9 et C10 lorsque ledit carbone C9 n'est pas engagé dans une double liaison C8-C9.
  2. 2. Composé selon la revendication 1 comprenant 10 > (i) Une double liaison en C7-C8 ou en C8-C9 ou en C8-C14 ; ou (ii) Une double liaison en C7-C8 et en C14-C15 ; ou (iii) Une double liaison en C8-C9 et en C14-C15 ; et/ou > (i) Un groupement YI avec une double liaison en C24-C25 ou en C24- 15 C28, ou (ii) Un groupement Y2 avec une double liaison en C24-C25 et/ou > le carbone C19 un groupement méthylène formant un cyclopropane avec les carbones C9 et C10 lorsque ledit carbone C9 n'est pas engagé 20 dans une double liaison C8-C9.
  3. 3. Composé selon l'une des revendications 1 ou 2 dans lequel RI est choisi parmi l'atome d'hydrogène, le groupement méthyle ou RI est un aryle choisi parmi le groupe benzyle, le groupe p-méthoxybenzyle et le groupe benzoyle ; et/ou R2 est choisi parmi l'atome d'hydrogène et le groupement méthyle ; et/ou > R4 est choisi parmi l'atome d'hydrogène et le groupement méthyle ; et/ou > R5 est choisi parmi l'atome d'hydrogène et le groupement méthyle.
  4. 4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le substituant -OR1 est en position alpha ou béta.Version propre 93 Demande de Brevet Français n°1155159
  5. 5. Composé selon la revendication 4, dans lequel le substituant R4 est en position alpha ou béta.
  6. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, dans lequel le substituant R2 est en position alpha ou béta.
  7. 7. Composé selon la revendication 6, dans lequel le substituant R3 est en position alpha lorsque le substituant R2 est en position béta et dans lequel le substituant R3 est en position béta lorsque le substituant R2 est en position alpha.
  8. 8. Composé selon l'une des revendications précédentes faisant partie de la famille des (i) cycloartenol, (ii) 24-méthylène-cycloartènol, (iii) cycloeucalenol, (iv) obtusifoliol, (v) ergosta-8, 14, 24(28)-trienol, (vi) fecosterol, (vii) 24- méthylenelophenol, (viii) 24-ethylenelophenol, (ix) lanosterol, (x) cholesta-8, 14, 24-trienol, (xi) 14-demethyllanosterol ou des (xii) zymosterol.
  9. 9. Composé selon l'une des revendications précédentes dans lequel RI est un atome d'hydrogène et R2 est un groupement méthyle.
  10. 10. Composé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : HO25Version propre 94 Demande de Brevet Francais n'1155159 HO 'R (IC), HO HO (Id), et10Version propre 95 Demande de Brevet Français n°1155159 HO 10
  11. 11. Composé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel RI est un 5 atome d'hydrogène et R2 est un atome d'hydrogène.
  12. 12. Composé selon la revendication précédente caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : HO 15 2976578= Version propre 96 Demande de Brevet Français n°1155159 HO HO HOVersion propre 97 Demande de Brevet Français n°1155159 HO (Ik), et R
  13. 13. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes choisie parmi: - Cycloarténol-4-carboxy-4-méthyle - Cycloarténol-4-hydroxyméthyl-4-méthyle - Cycloarténol-4-aldehyde-4-méthyle - Cycloarténol-4-hydroxy-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-carboxy-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-hydroxyméthyl-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-aldehyde-4-méthyle - 24-méthylène-cycloarténol-4-hydroxy-4-méthyle - Cycloeucalénol-4-carboxy - Cycloeucalénol-4-hydroxyméthyle - Cycloeucalénol-4-aldehyde - Cycloeucalénol-4-hydroxy 2976578, Version propre 98 Demande de Brevet Français n°1155159 - Obtusifoliol-4-carboxy - Obtusifoliol-4-hydroxyméthyle - Obtusifoliol-4-aldehyde - Obtusifoliol-4-hydroxy 5 - E rgosta-8, 14 ,24(28)-triénol-4-carboxy - Ergosta-8, 14 ,24(28)-triénol-4-hyd roxyméthyle - Ergosta-8,14,24(28)-triénol-4-aldéhyde - Ergosta-8,14,24(28)-triénol-4-hydroxy - Fecosterol-4-carboxy 10 - Fecosterol-4-hydroxyméthyle - Fecosterol-4-aldehyde - Fecosterol-4-hydroxy - 24-méthylènelophenol-4-carboxy - 24-méthylènelophenol-4-hydroxyméthyle 15 - 24-méthylènelophenol-4-aldehyde - 24-méthylènelophenol-4-hydroxy - 24-éthylènelophenol-4-carboxy - 24-éthylènelophenol-4-hydroxyméthyle - 24-éthylènelophenol-4-aldehyde 2 0 - 24-éthylènelophenol-4-hydroxy - Lanostérol-4-carboxy-4-méthyle - Lanostérol-4-hydroxymethyl-4-méthyle - Lanostérol-4-aldehyde-4-méthyle - Lanostérol-4-hydroxy-4-méthyle 2 5 - Cholesta-8,14,24-triénol-4-carboxy-4-méthyle - C h olesta-8, 14,24-triénol-4-hyd roxyméthyl-4-méthyle - Cholesta-8,14,24-triénol-4-aldehyde-4-méthyle - Cholesta-8,14,24-triénol-4-hydroxy-4-méthyle - Acide cholestane-3-hydroxy-4-méthyl-4-carboxylique 30 - cholestane-3-hydroxy-4-méthyl-4-aldéhydeversion propre 99 Demande de Brevet Français n°1155159 - cholestane-3-hydroxy-4-méthyl-4-hydroxyméthyle - cholestane-3,4-dihydroxy-4-méthyle -
  14. 14-deméthyllanostérol-4-carboxy-4-méthyle - 14-deméthyllanostérol-4-hydroxymethyl-4-méthyle - 14-deméthyllanostérol-4-aldehyde-4-méthyle - 14-deméthyllanostérol-4-hydroxy-4-méthyle - Zymostérol-4-carboxy - Zymostérol-4-hydroxyméthyle - Zymostérol-4-aldehyde - Zymostérol-4-hydroxy. 14. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes choisi parmi: 104 HO (5H :- 113 HO eô Ô. COOH 107 HO - 114 HO ,~ Ôe - CHO CH2OH 108 HO Ô^e* 115 HO CHO , - OHVersion propre 100 Demande de Brevet Français n°1155159 109 >s. 116 Ô. I\/\/ HO ,Ô HO 6H COOH 110 _- 117 HO ee HO' COOH CH2OH 111 . 118 ee HO i\/\/ HO Oe CHO CH2OH 119 ee 128 HO HO OÔ CHO CHO 120 ee 129 Ôe HO ee HO ', HO OH 122 Ôe 130 Ôe HO Ôe HO CH20H CH2OHVersion propre 101 Demande de Brevet Français n°1155159 123 Ôe 131 Ôe HO ÔÔ HO ee CHO CHO 124 Ô. 132 Ô. ÔÔ HO 'S HO ÔH OH OH 127 HO .1' 135 HO'~ CH20H CHO 136 ee 140 ee HO ÔÔ HO Ôe 0H HO 137 HO Ôe ee 143 Ô. COOH HO,Ô CHO 138 HO CH2OH .1* HO'~ OH 139 *Io> 148 Ôe HO Ôe HO Ôe CHO OHVersion propre 102 Demande de Brevet Français n°1155159
  15. 15. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes ou composé choisi parmi 101 COOH Ô. 121 H O Ôe - COOH 102 HO CH2OH ~,- 126 HO OÔ Ôe COOH 103 HO _ ,- 129 HO Ôe Ô. CHO COOH 105 H01> COOH " 133 HO COOH ee 106 HO CH2OH 134 HO CH2OH /-Version propre 103 Demande de Brevet Français n°1155159 112 141 ,- HOC HO OH COOH 142 HO Ôe Ô. Dl HO COOH CH2OH 14 5 HO COOH .1' D2 Ho re) OH 146 HO Ôe Ôe D3 HO CHO CH2OH 147 Ôe D4 HO CHZOH - ÔÔ HO CHO pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation comme agent phytosanitaire.5Version propre 104 Demande de Brevet Francais n°1155159
  16. 16. Composé selon la revendication 15, caractérisé en ce ladite utilisation est à une dose comprise entre 1 micromolaire à 1 nanomolaire.
  17. 17. Formulation phytosanitaire comprenant un composé selon l'une des 5 revendications 1 à 14 ou un composé choisi parmi : 101 COOH Ôe 102 CHZOH :- 103 HO CHO - 105 i COOH 106 ~,~ 112 H ~\~ HO " = OH CHZOH 121 HO ee 126 OÔ Ôe COOH HO COOH 129 Ôe 133 HO ÔÔ ,- HO = COOH COOHVersion propre 105 Demande de Brevet Français n°1155159 134 HO ÔÔ Ô. 141 HO ÔÔ Ôe CH2OH COOH 142 HO ÔÔ Ôe 145 HO ÔÔ ee CH2OH COOH 146 HO CH2OH Ôe 147 Ô. HO CHO Dl HOC/^I D2 HO~ (13r.- COOH OH D3 HOC/\ CHO D4 HOC` = CHZOH
  18. 18. Formulation phytosanitaire selon la revendication 17 comprenant, en outre, au moins un agent mouillant.
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