FR2968672A1 - New viral genome construction of a recombinant Marek's disease virus, comprising fragments as their identification markers of two fragments, useful for the preparation of vaccines against the Marek's disease virus - Google Patents
New viral genome construction of a recombinant Marek's disease virus, comprising fragments as their identification markers of two fragments, useful for the preparation of vaccines against the Marek's disease virus Download PDFInfo
- Publication number
- FR2968672A1 FR2968672A1 FR1161641A FR1161641A FR2968672A1 FR 2968672 A1 FR2968672 A1 FR 2968672A1 FR 1161641 A FR1161641 A FR 1161641A FR 1161641 A FR1161641 A FR 1161641A FR 2968672 A1 FR2968672 A1 FR 2968672A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- marek
- recombinant
- disease virus
- virus
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 title claims abstract description 83
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 41
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000712909 Reticuloendotheliosis virus Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 18
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 18
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 16
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 15
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 15
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012873 virucide Substances 0.000 abstract 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 10
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 101150113191 cmr gene Proteins 0.000 description 6
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 6
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000948165 Milk vetch dwarf virus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010573 double replacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 101100041816 Homo sapiens SCD gene Proteins 0.000 description 1
- 241001397173 Kali <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101150014691 PPARA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150097713 SCD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028897 Stearoyl-CoA desaturase Human genes 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical group OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/16362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Construction des souches vaccinales SC9-1 et SC9-2 de virus recombinant de la maladie de Marek et leur utilisation Construction of recombinant Marek's disease virus strain SC9-1 and SC9-2 and their use
La présente invention concerne la construction et l'utilisation des souches vaccinales SC9-1 et SC9-2 de virus recombinant de la maladie de Marek (MDV). L'invention appartient au domaine de la biologie moléculaire des produits biologiques vétérinaires. Puisque le virus de la maladie de Marek (MDV) a été pour la première fois isolé et identifié en 1968, des programmes de vaccination pour lutter contre la maladie de Marek (MD) sont menés depuis plus de 40 ans. The present invention relates to the construction and use of recombinant Marek's disease virus (MDV) vaccine strains SC9-1 and SC9-2. The invention belongs to the field of molecular biology of veterinary biological products. Since the Marek's Disease Virus (MDV) was isolated for the first time and identified in 1968, vaccination programs for Marek's Disease (MD) have been conducted for more than 40 years.
A cause du changement continu de la pathogénicité du MDV, sa virulence et sa pathogénicité ont augmenté progressivement. Différents types de vaccins ont donc été développés et utilisés, depuis l'herpèsvirus monovalent des dindes de sérotype III jusqu'au vaccin bivalent de HVT plus SB-1 de sérotype II. Finalement, la souche CVI988/Rispens atténuée de MDV sérotype 7 a été utilisée dans le monde entier, bien qu'il ait été identifié que la souche CVI988/Rispens soit une souche atténuée présentant une certaine tumorigénicité avant que son utilisation soit autorisée aux USA au milieu des années 1990. Selon une étude épidémiologique, les MDV faiblement pathogènes (mMDV) étaient les principales souches sauvages que l'on trouvait dans les élevages de poulets, puis les MDV virulents (vMDV) sont devenus les principales sources sauvages. Ces 20 dernières années, des MDV très virulents (vvMDV) ont à nouveau remplacé Due to the continuing change in the pathogenicity of MDV, its virulence and pathogenicity have been steadily increasing. Different types of vaccines have therefore been developed and used, from turkey herpesvirus monovalent serotype III to the bivalent vaccine of HVT plus SB-1 serotype II. Finally, the attenuated CVI988 / Rispens strain of MDV serotype 7 has been used worldwide, although it has been identified that CVI988 / Rispens strain is an attenuated strain with some tumorigenicity before its use is allowed in the USA. mid-1990s. According to an epidemiological study, low pathogenic MDV (mMDV) were the main wild strains found in chicken farms, and virulent MDV (vMDV) became the main wild source. Over the last 20 years, very virulent MDVs (vvMDVs) have again replaced
les vMDV et sont devenus les principales souches sauvages. Des MDV très virulents plus (vv+MDV) sont même apparus dans certaines zones des USA il y a 10 ans (Witter RL. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates. Avian Diseases, 1997, 41 (1) . 149-163.). Depuis de nombreuses années, les scientifiques ont sélectionné diverses souches de MDV comme candidat pour l'élaboration d'un vaccin afin d'améliorer l'efficacité des vaccins de diverses manières, mais ces tentatives n'ont pas abouti. Par exemple, Witter et Kreager ont comparé 10 nouvelles souches candidates pour l'élaboration d'un vaccin en raison de leur efficacité protectrice contre la MD, mais aucune d'entre elles n'était meilleure que la souche CV1988/Rispens (Witter RL et Kreager KS. Serotype 1 viruses modified by backpassage or insertional mutagenesis : Approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek' s disease. Avian Dis. 2004, 48 : 768-782.). Face è l'augmentation de la virulence et de la pathogénicité des MDV sauvages, il semble qu'il n'y ait aucun espoir d'améliorer l'efficacité protectrice des vaccins au moyen des technologies traditionnelles ou classiques. Cependant, il est possible que la virulence des souches sauvages de MDV augmente encore ces prochaines années si l'on se base sur l'évolution de la virulence des MDV depuis 40 ans. Ces dernières années en Chine, il est apparu une augmentation de la mortalité par tumeur dans certains élevages de poulets vaccinés avec le CV1988/Rispens. vMDV and became the main wild strains. Very virulent MDV plus (vv + MDV) have even appeared in some areas of the US 10 years ago (Witter RL, Increased virulence of Marek's disease virus isolates, Avian Diseases, 1997, 41 (1) 149-163. ). For many years, scientists have selected various MDV strains as candidates for vaccine development to improve vaccine efficacy in a variety of ways, but these attempts have not been successful. For example, Witter and Kreager compared 10 new candidate strains for vaccine development because of their protective efficacy against MD, but none of them was better than the CV1988 / Rispens strain (Witter RL and Kreager KS, Serotype 1, modified by backpassage or insertional mutagenesis: Approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek's disease, Avian Dis., 2004, 48: 768-782. In view of the increased virulence and pathogenicity of wild-type MDVs, there appears to be no hope of improving the protective efficacy of vaccines using traditional or conventional technologies. However, it is possible that the virulence of wild MDV strains will increase further in the next few years based on the evolution of MDV virulence in 40 years. In recent years in China, there has been an increase in tumor mortality in some chicken farms vaccinated with CV1988 / Rispens.
Bien qu'il n'ait pas été confirmé la présence de souches sauvages vv+MDV en Chine, la mutation du MDV a été rapportée. Par exemple, les investigateurs ont isolé et identifié une souche sauvage GX0101 de MDV dont la virulence n'est pas supérieure à celle de la souche Md5 de vvMDV, mais dont la capacité de transmission horizontale est bien plus élevée que celle de la souche Md5 (Xu X. et al., Acta Microbioloogica Sinica, 2009, 49 : 590-543 ; Cui Z et al., Virus Genes, 2009). Il semble qu'il soit nécessaire de développer un vaccin plus efficace contre la MD au moyen de nouveaux procédés avant qu'une nouvelle souche sauvage plus virulente, capable de passer à travers la protection conférée par CV1988/Rispens, commence à se propager dans les élevages de poulets. Les investigateurs ont cloné la totalité du génome de GX0101 dans un vecteur de chromosome bactérien artificiel (BAC) et ont construit le clone infectieux GX0101-BAC. La transfection de cellules CEF avec l'ADN de GX0101-BAC a permis d'obtenir le virus MDV recombinant bac-GX0101 (Sun et al., Chinese Science Bulletin, 2009, 54 : 2641-2647). Ensuite, deux gènes meq du MDV bac-GX0101 ont été supprimés comme suit : en utilisant comme matrice le plasmide pKD13, FRT-gène kanr de résistance à la kanamycine a été amplifié par PCR. Pour remplacer les gènes meq dans le génome de la souche GX0101 de MDV par le gène kanr, les extrémités 5' des amorces sens et antisens servant à amplifier le FRT-gène kanr contiennent respectivement un fragment homologue à la séquence de 50 pb se trouvant devant et derrière le gène meq. Although vv + MDV wild strains have not been confirmed in China, the MDV mutation has been reported. For example, the investigators isolated and identified a wild-type MDV strain GX0101 whose virulence is no greater than that of vvMDV strain Md5, but whose horizontal transmission capacity is much higher than that of strain Md5 ( Xu X. et al., Acta Microbioloogica Sinica, 2009, 49: 590-543, Cui Z et al., Genes Virus, 2009). There appears to be a need to develop a more effective vaccine against MD using new methods before a new, more virulent wild strain, able to pass through the protection provided by CV1988 / Rispens, begins to spread in the bloodstream. chicken farms. The investigators cloned the entire genome of GX0101 into an artificial bacterial chromosome vector (BAC) and constructed the infectious clone GX0101-BAC. Transfection of CEF cells with GX0101-BAC DNA yielded the recombinant MDV bac-GX0101 virus (Sun et al., Chinese Science Bulletin, 2009, 54: 2641-2647). Then, two meq genes from the MDV bac-GX0101 were deleted as follows: using as template the plasmid pKD13, FRT-kanamycin resistance kanr gene was amplified by PCR. To replace the meq genes in the genome of the MDV strain GX0101 with the kanr gene, the 5 'ends of the sense and antisense primers used to amplify the kanr FRT gene respectively contain a fragment homologous to the 50 bp sequence in front of the kanr gene. and behind the meq gene.
Les séquences des fragments des deux amorces étaient les suivantes : ..meq-F, séquence ID NO. 1 : The sequences of the fragments of the two primers were as follows: ..meq-F, sequence ID NO. 1:
5'-AGAAACATGGGGCATAGACGATGTGCTGCTGAGAGTCACAATGCGGATCAcg tgtaggctggagctgcttc-3' ; ^meq-R, séquence ID NO. 2 : 5'-CTTGCAGGTGTATACCAGGGAGAAGGCGGGCACGGTACAGGTGTAAAGAGca ttccggggatccgtcgac-3' (les lettres en majuscule indiquent les séquences homologues de 50 pb se trouvant devant et derrière le gène meq, les lettres en minuscule indiquent les séquences provenant de la cassette FRT-gène kanr) . Le système réactionnel et les conditions utilisés pour amplifier la cassette FRT-gène kan'~ étaient : 2,5 pl. de tampon 10X, 1 pl de matrice pKD13 (environ 100 ng/pl), 2 pl de me (15 mmol/l), 2 pl de dNTP (2,5 mmol/l), 1 pl de chacune des amorces sens et antisens (25 pmol/pl), 0,1 pl d'enzyme Taq (5 U/pl), eau distillée deux fois ajoutée jusqu'à 25 pl. Condition PCR : 95 °C pendant 10 minutes, puis 95 °C pendant 1 minute, 55 °C pendant 1 minute, 72 °C pendant 1 minute, 30 cycles ; finalement, extension à 72 °C pendant 10 minutes. Les produits PCR ont été identifiés par électrophorèse sur gel. Dans la cassette FRT-gène kan' de pDK13, il existe des cibles de reconnaissance flp (FRT) aux deux extrémités de kant. La recombinase flp reconnaît le FRT de 34 pb et coupe spécifiquement la séquence d'ADN entre les deux sites de FRT. Le produit PCR a été digéré avec l'enzyme DpnI pendant 1 heure pour éliminer la matrice plasmidique circulaire pDK13. Le produit PCR digéré a été introduit dans E. cou FL250 transformé par GX0101-BAC par électroporation à 1800 V/100 Q/25 pF (Sun et a1., 2009, Chinese Science Bulletin. 54 : 2641-2647). Après l'électroporation, la réaction a été remise en suspension dans 1 ml de milieu LB et cultivée pendant 2 heures à 32 °C, puis 100 ml de culture bactérienne ont été mis sur une plaque LB contenant de la kanamycine. 16 heures plus tard, des colonies individuelles ont été indépendamment prélevées et identifiées par PCR pour déterminer si le gène meq avait été remplacé par le gène kanr (Schumacher, D., B. K. Tischer, W. Fuchs, et N. Osterrieder. 2000. Reconstitution of Marek' s disease virus serotype 1 (MDV-1) from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-1 mutant. J. Virol. 74 : 11088-11098). Une des colonies parmi les colonies individuelles identifiées dans lesquelles le gène meq a été remplacé par le gène kanr a été inoculée dans un milieu LB et soumise à une incubation avec secouage pendant une nuit à 32 °C. Quand la valeur de la DO a atteint environ 0,5, une solution d'arabinose à 10 % a été ajoutée à la culture bactérienne et l'incubation a été poursuivie pendant une heure pour induire l'expression de la recombinase flp et le gène de résistance à la kanamycine a été coupé. Les bactéries obtenues ont été mises sur des plaques de gélose LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol ou de gélose LB contenant à la fois du chloramphénicol et de la kanamycine pour confirmer que la colonie individuelle n'était plus du tout résistante à la kanamycine. Après la confirmation de la délétion du premier gène meq, ce protocole a été répété pour supprimer la seconde copie de Meq contenue dans GX0101-BAC. Le clone plasmidique infectieux obtenu a été appelé GX010làmeq-BAC, et le virus récupéré à partir des cellules CEF transfectées par l'ADN plasmidique de GXO101Ameq-BAC a été appelé GX01010meq. Pendant le procédé de délétion du second meq, un autre gène kanr a été introduit dans le clone plasmidique infectieux recombinant. Comme il n'est pas autorisé d'utiliser des virus contenant le gène kanr comme vaccin vivant conformément à la réglementation sur la biosécurité des produits biologiques, le gène kanr se trouvant dans le plasmide doit également être supprimé avant d'utiliser le virus comme candidat pour l'élaboration d'un vaccin. L'objet de la présente invention est de proposer une construction de génome viral d'un virus recombinant de la maladie de Marek, ladite construction de génome contenant les fragments suivants en tant que marqueurs d'identification de celle-ci : (1) deux fragments de 34 pb possédant la séquence ID No. 5, résultant de la délétion du gène Meq des deux sites originaux contenant le gène Meq ; (2) un fragment d'environ 539 pb de la répétition terminale longue du virus de la réticuloendothéliose (RPV-LTR) possédant la séquence ID No. 6, inséré à environ 370 pb en amont du site de jonction US/TRS dans le génome viral. 5'-AGAAACATGGGGCATAGACGATGTGCTGCTGAGAGTCACAATGCGGATCAcg tgtaggctggagctgcttc-3 '; ^ meq-R, sequence ID NO. 2: 5'-CTTGCAGGTGTATACCAGGGAGAAGGCGGGCACGGTACAGGTGTAAAGAGca ttccggggatccgtcgac-3 '(the letters in upper case indicate the 50 bp homologous sequences in front of and behind the meq gene, the lowercase letters indicate the sequences coming from the FRT-kanr gene cassette). The reaction system and the conditions used to amplify the FRT-kan gene cassette were: 2.5 μl. 10X buffer, 1 μl of pKD13 matrix (about 100 ng / μl), 2 μl of me (15 mmol / l), 2 μl of dNTPs (2.5 mmol / l), 1 μl of each of the sense and antisense primers. (25 pmol / μl), 0.1 μl of Taq enzyme (5 U / μl), distilled water twice added up to 25 μl. PCR condition: 95 ° C for 10 minutes, then 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute, 30 cycles; finally, extension at 72 ° C for 10 minutes. PCR products were identified by gel electrophoresis. In the pDK13 kd gene FRT-cassette, there are flp recognition targets (FRT) at both kant ends. The flp recombinase recognizes the 34 bp FRT and specifically cleaves the DNA sequence between the two FRT sites. The PCR product was digested with the DpnI enzyme for 1 hour to remove the pDK13 circular plasmid template. The digested PCR product was introduced into E. coli FL250 transformed with GX0101-BAC by electroporation at 1800 V / 100 Q / 25 pF (Sun et al., 2009, Chinese Science Bulletin 54: 2641-2647). After electroporation, the reaction was resuspended in 1 ml of LB medium and cultured for 2 hours at 32 ° C and then 100 ml of bacterial culture was plated on an LB plate containing kanamycin. 16 hours later, individual colonies were independently picked and identified by PCR to determine if the meq gene had been replaced by the kanr gene (Schumacher, D., BK Tischer, W. Fuchs, and N. Osterrieder, 2000. Reconstitution of Marek's disease virus serotype 1 (MDV-1) from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of a B-negative glycoprotein MDV-1 mutant J. Virol 74: 11088-11098). One of the identified individual colonies in which the meq gene was replaced by the kanr gene was inoculated into LB medium and incubated with shaking overnight at 32 ° C. When the OD value reached about 0.5, a 10% arabinose solution was added to the bacterial culture and incubation was continued for one hour to induce the expression of the flp recombinase and the gene. resistance to kanamycin was cut. The resulting bacteria were plated on LB agar plates containing 30 μg / ml of chloramphenicol or LB agar containing both chloramphenicol and kanamycin to confirm that the individual colony was no longer resistant to kanamycin. After confirming the deletion of the first meq gene, this protocol was repeated to delete the second copy of Meq contained in GX0101-BAC. The resulting infectious plasmid clone was designated GX010làmeq-BAC, and the virus recovered from CEF cells transfected with the GXO101Ameq-BAC plasmid DNA was designated GX01010meq. During the deletion process of the second meq, another kanr gene was introduced into the recombinant infectious plasmid clone. Since it is not permitted to use viruses containing the kanr gene as live vaccine according to biosecurity regulations for biologics, the kanr gene in the plasmid must also be removed before using the virus as a candidate. for the development of a vaccine. The object of the present invention is to provide a viral genome construct of a recombinant Marek's disease virus, said genome construct containing the following fragments as identification markers thereof: (1) two 34 bp fragments having the sequence ID No. 5, resulting from the deletion of the Meq gene from the two original sites containing the Meq gene; (2) a fragment of about 539 bp of the long terminal repeat of reticuloendotheliosis virus (RPV-LTR) having the sequence ID No. 6, inserted at about 370 bp upstream of the US / TRS junction site in the genome viral.
Un autre objet de l'invention est de proposer une souche vaccinale SC9-1 ou SC9-2 de virus recombinant de la maladie de Marek comprenant ladite construction de génome. La souche SC9-1 de MDV a été déposée au centre 30 général de collecte des cultures microbiologiques de Another object of the invention is to provide a vaccine strain SC9-1 or SC9-2 of recombinant Marek's disease virus comprising said genome construct. MDV strain SC9-1 has been deposited at the general center for microbiological culture collection.
Chine le 3 décembre 2010, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 4399 ; et la souche SC9-2 de MDV a été déposée au centre général de collecte des cultures microbiologiques de Chine le 24 novembre 2011, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 5502. Un autre objet de l'invention est de proposer des fibroblastes d'embryon de poulet infectés par la souche SC9-1 ou SC9-2 de MDV recombinant mentionnée ci-dessus. China on December 3, 2010, with the deposit number CGMCC No. 4399; and MDV strain SC9-2 was deposited at the General Microbiological Culture Collection Center of China on November 24, 2011, with the deposit number CGMCC No. 5502. Another object of the invention is to provide fibroblasts of Chicken embryo infected with the recombinant MDV strain SC9-1 or SC9-2 mentioned above.
Un autre objet de l'invention est de proposer un vaccin contre le virus de la maladie de Marek, contenant la construction de génome de virus recombinant de la maladie de Marek de la présente invention. Another object of the invention is to provide a vaccine against Marek's disease virus, containing the recombinant Marek's disease virus genome construct of the present invention.
Un autre objet de l'invention est de proposer un vaccin contre le virus de la maladie de Marek, contenant la souche vaccinale recombinante SC9-1 ou SC9-2 de la maladie de Marek de la présente invention. Le vaccin contre le virus de la maladie de Marek contient les fibroblastes d'embryon de poulet infectés par SC9-1 ou SC9-2 de la présente invention. Un autre objet de l'invention est de proposer l'utilisation de la construction de génome de virus recombinant de la maladie de Marek, de la souche vaccinale SC9-1 ou SC9-2 de virus de la maladie de Marek et des fibroblastes d'embryon de poulet infectés par SC9-1 ou SC9-2 de la présente invention, dans la préparation de vaccins contre le virus de la maladie de Marek. Another object of the invention is to provide a vaccine against Marek's disease virus, containing the recombinant Marek's disease strain SC9-1 or SC9-2 of the present invention. The Marek's disease virus vaccine contains the SC9-1 or SC9-2 infected chicken embryo fibroblasts of the present invention. Another object of the invention is to provide the use of Marek's disease recombinant virus genome construct, Marek's disease virus vaccine strain SC9-1 or SC9-2, and fibroblasts. SC9-1 or SC9-2 infected chicken embryo of the present invention, in the preparation of vaccines against Marek's disease virus.
L'invention concerne également un procédé de prévention de la maladie de Marek chez les poulets, The invention also relates to a method for preventing Marek's disease in chickens,
dans lequel les poulets reçoivent des doses efficaces d'un point de vue prophylactique de vaccins contre le virus la maladie de Marek contenant la construction de génome de virus recombinant de la maladie de Marek, la souche vaccinale SC9-1 ou SC9-2 de virus de la maladie de Marek et les fibroblastes d'embryon de poulet infectés par SC9-1 ou SC9-2. L'invention concerne en outre un procédé de préparation d'une construction de génome viral d'un virus recombinant de la maladie de Marek, ce procédé comprenant les étapes suivantes la délétion des premiers gènes Kant au moyen d'un procédé classique utilisant l'enzyme flp la délétion du second gène Kano par digestion partielle avec l'enzyme flp et criblage négatif de la résistance à la kanamycine, pour obtenir un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-1 ; et l'élimination des gènes parents du vecteur BAC, insérés lors de la construction originale des clones BAC, contenus dans un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC--Kana-Sv-Cre-US2, qui est capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-2. Dans le procédé, lesdits gènes parents comprennent 25 le gène de résistance au chloramphénicol et le facteur mini-F. En d'autres termes, l'induction incomplète de l'expression de la recombinase flp pour la digestion partielle des 3 sites FRT est utilisée pour supprimer 30 le gène kali!' en remplacement du second gène meq dans le clone plasmidique GX0101-BAC ; un clone plasmidique in which the chickens receive prophylactically effective doses of Marek's disease vaccines containing the recombinant Marek's disease virus genome construct, the vaccine strain SC9-1 or SC9-2 of virus of Marek's disease and chicken embryo fibroblasts infected with SC9-1 or SC9-2. The invention further relates to a method for preparing a viral genome construct of a recombinant Marek's disease virus, which method comprises the steps of deleting the first Kant genes using a conventional method utilizing the flp enzyme deletion of the second Kano gene by partial digestion with the flp enzyme and negative kanamycin resistance screening, to obtain a recombinant BAC plasmid pSC9-BAC capable of transfecting cells to produce the SC9-1 virus; and the elimination of BAC parent genes, inserted during the original construction of BAC clones, contained in a recombinant BAC plasmid pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2, which is capable of transfecting cells to produce the SC9-2 virus. In the method, said parent genes comprise the chloramphenicol resistance gene and the mini-F factor. In other words, the incomplete induction of flp recombinase expression for partial digestion of the 3 FRT sites is used to suppress the kali gene. replacing the second meq gene in the plasmid clone GX0101-BAC; a plasmid clone
GX0101-BAC ne contenant ni de gène meq ni de gène kanr pour récupérer un dérivé GX0101 en tant que candidat pour élaborer un vaccin est détecté par comparaison de colonies sur des plaques de gélose LB avec ou sans kanamycine. Comme résultat, un virus MDV SC9-1 à gène meq supprimé ne contenant pas de gène kanr par rapport à la souche sauvage pathogène GXO101 de MVD d'origine est obtenu et il est confirmé que SC9-1 est un bon candidat pour élaborer un vaccin. Une souche virale SC9-2 de MDV est également obtenue par la suppression supplémentaire de la majeure partie de la séquence de base du plasmide BAC contenant le gène du chloramphénicol (CMr). Deux gènes meq sont supprimés dans la construction de génome de l'invention au moyen de la cassette flpkanr, puis les deux gènes kanr sont également supprimés, la délétion du premier gène kan` étant réalisée selon un procédé classique utilisant l'enzyme flp et le second gène kanr est supprimé par digestion partielle avec l'enzyme flp et criblage négatif de la résistance à la kanamycine, pour obtenir un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC (figure 1) capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-1 ; puis les gènes parents du vecteur BAC insérés lors de la construction d'origine des clones BAC, tels que le gène de résistance au chloramphénicol et le facteur mini-F, sont ensuite éliminés d'un plasmide BAC recombinant pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 (figure 2), qui est capable de transfecter des cellules pour produire le virus SC9-2. GX0101-BAC containing no meq gene or kanr gene to recover a GX0101 derivative as a candidate for developing a vaccine is detected by comparison of colonies on LB agar plates with or without kanamycin. As a result, a suppressed meq SCD1 MDV virus does not contain a kanr gene relative to the original wild-type MVD pathogenic strain GXO101 and SC9-1 is confirmed to be a good candidate for developing a vaccine. . A viral strain SC9-2 of MDV is also obtained by the additional deletion of most of the base sequence of the plasmid BAC containing the chloramphenicol gene (CMr). Two meq genes are deleted in the genome construct of the invention by means of the flpkanr cassette, then the two kanr genes are also deleted, the deletion of the first kan` gene being carried out according to a conventional method using the flp enzyme and the second kanr gene is deleted by partial digestion with the flp enzyme and negative kanamycin resistance screening, to obtain a recombinant BAC plasmid pSC9-BAC (Figure 1) capable of transfecting cells to produce SC9-1 virus; then the parent BAC vector genes inserted during the original construction of the BAC clones, such as the chloramphenicol resistance gene and the mini-F factor, are then removed from a recombinant BAC plasmid pSC9-BAC-Kana-Sv -Cre-US2 (Figure 2), which is capable of transfecting cells to produce SC9-2 virus.
L'invention présente les effets techniques suivants . The invention has the following technical effects.
1. la résolution réussie d'un problème technique lié à la délétion du gène kanr par digestion de FRT par la recombinase fl.p quand il existe 3 sites FRT dans le plasmide pGX0101àMeq-BAC après le double remplacement des gènes meq par le gène kanr flanqué de 2 séquences FRT ; 2. les souches SC9-1 et SC9-2 de MDV peuvent être utilisées pour préparer des vaccins destinés à prévenir chez les poulets une maladie de Marek induite par les virus vvMDV ou les virus émergents vv+MDV et conférer une meilleure immunité protectrice que CV1988/Rispens, qui est le plus communément utilisé dans le marché global ; 3. en tant que virus parent primaire de SC9-1 et SC9-2, GX0101 est un MDV recombinant naturel contenant un insert de LTR provenant du virus de la réticuloendothéli_ose et est moins pathogène que vvMDV Md5, le virus parent de rMdMmeq. Bien que rMd5Ameq induise une bonne immunité protectrice et n'induise pas de tumeurs, il s'avère que ses effets immunosuppresseurs sont importants dans ses faibles passages et il ne peut pas être utilisé comme candidat pour élaborer un vaccin commercial. Les souches SC9-1. (SC90MegAKanr) et SC9-2 (SC9àmegàKanràCMr) peuvent conférer une bonne immunité protectrice identique à celle conférée par rMd5àmeq sans induire de tumeurs et d'immunosuppression, c'est pourquoi elles pourraient être utilisées comme candidats pour l'élaboration d'un vaccin commercial ; 4. en tant que virus parent primaire de SC9-1 et SC9-2, GX0101 est un MDV recombinant naturel contenant un insert de LTR provenant du virus de la réticulo- 1. the successful resolution of a technical problem related to the deletion of the kanr gene by FRT digestion by the fl.p recombinase when there are 3 FRT sites in the plasmid pGX0101 to Meq-BAC after the double replacement of the meq genes by the kanr gene flanked by 2 FRT sequences; 2. MDV strains SC9-1 and SC9-2 can be used to prepare vaccines to prevent chickens from developing Marek's disease induced by vvMDV viruses or emerging viruses vv + MDV and confer better protective immunity than CV1988 / Rispens, which is most commonly used in the global market; 3. As the primary parent virus of SC9-1 and SC9-2, GX0101 is a naturally occurring recombinant MDV containing an LTR insert derived from reticuloendotheliose virus and is less pathogenic than vvMDV Md5, the parent virus of rMdMmeq. Although rMd5Ameq induces good protective immunity and does not induce tumors, it is found that its immunosuppressive effects are important in its weak passages and it can not be used as a candidate to develop a commercial vaccine. Strains SC9-1. (SC90MegAKanr) and SC9-2 (SC9àmegàKanràCMr) can confer a good protective immunity identical to that conferred by rMd5àmeq without inducing tumors and immunosuppression, that is why they could be used as candidates for the development of a commercial vaccine ; 4. As the primary parent virus of SC9-1 and SC9-2, GX0101 is a naturally occurring recombinant MDV containing an LTR insert derived from the reticulocyte virus.
endothéliose et est moins pathogène que vvMDV Md5, le virus parent de rMd5émeq, mais sa capacité de transmission horizontale est supérieure à celle de Md5. On s'attend à ce que SC9-1 et SC9-2 présentent une capacité de transmission horizontale supérieure à celle de rMd5omeq. Dans les élevages de poulets de grande taille, un grand nombre de poulets doit être vacciné en un temps limité, il est donc inévitable que certains oiseaux ne reçoivent pas la vaccination. Une capacité de transmission horizontale plus élevée peut favoriser la vaccination naturelle des poulets non vaccinés par contact avec les oiseaux vaccinés, et cela diminuera un éventuel échec de la vaccination à cause de poulets n'ayant pas reçu la vaccination. endotheliosis and is less pathogenic than vvMDV Md5, rMd5émeq's parent virus, but its horizontal transmission capacity is greater than that of Md5. SC9-1 and SC9-2 are expected to have a higher horizontal transmission capacity than rMd5omeq. In large chicken farms, a large number of chickens must be vaccinated in a limited time, so it is inevitable that some birds will not receive the vaccination. A higher horizontal transmission capacity may favor natural vaccination of unvaccinated chickens by contact with vaccinated birds, and this will reduce a possible failure of vaccination because of chickens that have not received vaccination.
Par conséquent, l'invention concerne la construction et l'utilisation des souches SC9-1 et SC9-2 de MDV recombinant. Le procédé de construction de l'invention comprend la délétion du gène kanr par digestion de PRT avec la recombinase flp quand il existe 3 sites FRT dans le même génome viral après le double remplacement des gènes meq par le gène kanr flanqué de 2 fragments FRT. Les souches SC9-1 et SC9-2 de MDV recombinant résultantes peuvent être utilisées pour préparer des vaccins afin de produire un vaccin vivant protégeant contre le MDV et de prévenir chez les poulets des maladies de Marek induites par les virus vvMDV ou les virus émergents vv+MDV, lesquelles confèrent une meilleure immunité protectrice que la souche vaccinale CVI988/Ri.spens la plus communément utilisée dans le marché global. En outre, elles n'induisent ni tumeurs ni immunosuppression, ce qui les .2 Therefore, the invention relates to the construction and use of recombinant MDV strains SC9-1 and SC9-2. The construction method of the invention comprises the deletion of the kanr gene by digestion of PRT with the flp recombinase when there are 3 FRT sites in the same viral genome after the double replacement of the meq genes by the kanr gene flanked by 2 FRT fragments. The resulting recombinant MDV strains SC9-1 and SC9-2 can be used to prepare vaccines to produce a live vaccine protecting against MDV and to prevent in chickens Marek diseases induced by vvMDV viruses or emerging viruses. + MDV, which confer better protective immunity than the CVI988 / Ri.spens vaccine strain most commonly used in the global market. In addition, they induce neither tumors nor immunosuppression, which the .2
rend davantage appropriées pour être utilisées comme vaccin. La figure 1 représente le schéma de structure du plasmide BAC recombinant qui a été utilisé pour transfecter les cellules CEF afin d'obtenir la souche SC9-1 de MDV (SC9ôMegAKan), dans lequel 2 meq indique que le gène meq au niveau de ce site e été supprimé. Dans ce plasmide, il existe encore des séquences issues du vecteur BAC, notamment les séquences du gène CMr de résistance au chloramphénicol, du gène gpt et de mini-F. La figure 2 représente le schéma de structure du plasmide recombinant pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 qui a été utilisé pour construire la souche SC9-2 ne contenant plus les séquences du vecteur BAC. Par rapport à pSC9-BAC, la séquence du gène Kana-SV-cre est insérée sur le côté droit de mini-F, dans laquelle le gène SV-Cre exprime un type d'enzyme de restriction quand l'ADN plasmidique transfecte une cellule eucaryote, telle que des cellules CEF. Ce produit du gène SV--Cre peut reconnaître 2 sites loxP, puis supprimer la séquence entière du vecteur BAC se trouvant entre les sites. La figure 3 représente une partie de la structure génomique de la souche SC9-2, dans laquelle la séquence du vecteur BAC (comprenant le gène CMr) entre les sites Sorti et Us2 d'origine du génome de MDV a été supprimée, un seul site loxP étant encore présent. L'induction incomplète de l'expression de la recombinase flp pour la digestion partielle de 3 sites FRT a été utilisée pour supprimer le gène kans, ce qui a entraîné le remplacement du second gène meq dans le .3 makes it more suitable for use as a vaccine. Figure 1 shows the structural scheme of the recombinant BAC plasmid which was used to transfect the CEF cells to obtain the SC9-1 strain of MDV (SC9δMegAKan), in which 2 meq indicates that the meq gene at this site e been deleted. In this plasmid, there are still sequences derived from the BAC vector, in particular the sequences of the CMr gene for chloramphenicol resistance, the gpt gene and mini-F. Figure 2 shows the structural schematic of the recombinant plasmid pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 which was used to construct the SC9-2 strain no longer containing the BAC vector sequences. With respect to pSC9-BAC, the Kana-SV-cre gene sequence is inserted on the right side of mini-F, in which the SV-Cre gene expresses a type of restriction enzyme when the plasmid DNA transfect a cell. eukaryotic, such as CEF cells. This product of the SV - Cre gene can recognize 2 loxP sites, then delete the entire sequence of the BAC vector between the sites. FIG. 3 represents a part of the genomic structure of strain SC9-2, in which the BAC vector sequence (comprising the CMr gene) between the Sorti and Us2 sites of origin of the MDV genome has been deleted, a single site loxP still being present. Incomplete induction of flp recombinase expression for partial digestion of 3 FRT sites was used to suppress the kans gene, resulting in replacement of the second meq gene in the .3
clone plasmidique GX0101 BAC ; un clone plasmidique GX0101-BAC ne contenant ni de gène meq ni de gène kan' pour récupérer un dérivé GX0101 en tant que candidat pour élaborer un vaccin a été détecté par comparaison de colonies sur des plaques de gélose LB avec ou sans kanamycine. Dans des études précédemment publiées (Li Y. Biological Characteristics of a meq-deleted Marek's Disease Virus and Its Immune Bffects. Thèse de doctorat, 2010, Chinese Academy of Agricultural. ; Yanpeng Li, Aijun Sun, Shuai Su, Peng Zhao, Zhizhong Cui, Hongfei Zhu, Deletion of the Meq Bene significantly decreases immunosuppression in chickens caused by pathogenic Marek's disease virus. Virology Journal 2011, 8 : 2), le clone plasmidique BAC recombinant pGX010l meq-BAC ayant 2 gènes meq supprimés a été construit à partir du GX0101-BAC d'origine. Après le remplacement d'un gène meq par la cassette ERT-kan, la colonie détectée a été inoculée dans un milieu LB liquide et cultivée sous secouage. plasmid clone GX0101 BAC; a GX0101-BAC plasmid clone containing neither meq gene nor kan gene to recover a GX0101 derivative as a candidate for developing a vaccine was detected by comparison of colonies on LB agar plates with or without kanamycin. In previously published studies (Li Y. Biological Characteristics of a meq-deleted Marek's Disease Virus and Its Immune Bffects Ph.D., 2010, Chinese Academy of Agricultural, Yanpeng Li, Sun Aijun, Su Shuai, Peng Zhao, Zhizhong Cui Thus, the recombinant BAC plasmid clone pGX0101 meq-BAC with 2 deleted meq genes was constructed from GX0101-BAC of origin. After replacement of a meq gene by the ERT-kan cassette, the detected colony was inoculated into liquid LB medium and cultured under shaking.
Quand la DO de la culture a atteint 0,5, une solution d'arabinose à 10 % a été ajoutée à la culture bactérienne jusqu'à une concentration finale de 0,1 % d'arabinose, puis la culture a été soumise à une incubation pendant une heure supplémentaire afin d'induire l'expression de la recombinase fip pour couper le gène de résistance à la kanamycine. La culture bactérienne induite a été placée sur des plaques de gélose LB contenant 30 pg/m1. de chloramphénicol ou de gélose LB contenant 50 pg/m1. kanamycine. Si des colonies se développaient sur une plaque contenant du chloramphénicol et non sur une When the OD of the culture reached 0.5, a 10% arabinose solution was added to the bacterial culture to a final concentration of 0.1% arabinose, and then the culture was subjected to incubation for an additional hour to induce expression of the fip recombinase to cut the kanamycin resistance gene. The induced bacterial culture was placed on LB agar plates containing 30 μg / ml. chloramphenicol or LB agar containing 50 μg / ml. kanamycin. If colonies grow on a plate containing chloramphenicol and not on a
plaque contenant de la kanamycine, cela indiquait que les colonies induites contenaient encore le gène de résistance au chloramphénicol et aucun gène kanr. Une telle colonie bactérienne a été choisie pour effectuer ensuite une construction par recombinaison. Cependant, la colonie qui a été sélectionnée et son plasmide contiennent encore une cible de reconnaissance de la recombinase flp (FR'1') au niveau du site où le premier gène meq était localisé. kanamycin-containing plaque, this indicated that the induced colonies still contained the chloramphenicol resistance gene and no kanr genes. Such a bacterial colony was chosen to then perform a recombinant construct. However, the colony that was selected and its plasmid still contain a target for recognition of the flp recombinase (FR'1 ') at the site where the first meq gene was located.
Ce protocole a été répété pour supprimer la seconde copie de Meq contenue dans pGX010l-BAC. Le clone piasmidique infectieux obtenu a été appelé pGX0101êmeq-BAC, lequel contenait à nouveau un gène kanr et contenait 3 FRT, l'un d'entre eux provenant de la délétion du premier meq. Bien que la même technique d'induction avec de l'arabinose puisse être utilisée pour induire et activer totalement la recombinase flp pour la délétion du gène kanr, une certaine partie du génome de MDV pourrait être supprimée par coupure et aucun virus ne pourrait être récupéré. Lors de la construction des clones GX0101-BAC à meq supprimé, 12 colonies appelées pSCAMeq-BACI à pSCÊMeq-BAC12 ont été obtenues, toutes ne contenant plus les deux gènes meq qui avaient été supprimés, mais contenant un gène kan'. L'ADN a été préparé par culture sur grande échelle de chacune de ces colonies et utilisé pour la transfection de cellules CFF. Quand les cellules ont formé les plaques caractéristiques de MDV, les virus récupérés ont été obtenus et appelés SClAMeq à SC12àMeq. Leur capacité de réplication dans les cellules CEF a été comparée. Le virus récupéré à partir This protocol was repeated to delete the second copy of Meq contained in pGX010l-BAC. The infectious plasmid clone obtained was called pGX0101emeq-BAC, which again contained a kanr gene and contained 3 FRTs, one of them from the deletion of the first meq. Although the same induction technique with arabinose could be used to fully induce and activate flp recombinase for deletion of the kanr gene, some part of the MDV genome could be cut off and no virus could be recovered. . When constructing deleted meq GX0101-BAC clones, 12 colonies named pSCAMeq-BACI at pSCÊMeq-BAC12 were obtained, all no longer containing the two meq genes that had been deleted but containing a kan 'gene. DNA was prepared by large scale culture of each of these colonies and used for transfection of CFF cells. When the cells formed the characteristic plaques of MDV, the recovered viruses were obtained and called SClAMeq at SC12 to Meq. Their replication capacity in CEF cells was compared. The virus recovered from
du plasmide pSCAMeq-BAC9 formait davantage de plaques et cela plus rapidement que les autres clones. Ensuite, le plasmide pSCAMeq---BACS a été utilisé pour la délétion ultérieure du gène kanr. plasmid pSCAMeq-BAC9 formed more plaques and this faster than the other clones. Then, plasmid pSCAMeq --- BACS was used for the subsequent deletion of the kanr gene.
En raison de la présence de 3 sites FRT sur le plasmide pSCL Meq-BAC9, il est conçu un nouveau procédé comprenant en combinaison « l'induction incomplète de l'expression de la recombinase flp, la digestion partielle de FRT et un criblage sur deux plaques » pour la délétion du gène kanr dans le plasmide pSCQMeq-BAC9. Selon ce procédé, seulement deux des trois sites FRT sont soumis à une digestion par la recombinase flp dans une partie des molécules du plasmide pSCAmeq-BAC. Si seulement les deux sites FRT flanquant le gène kanr sont digérés, alors le gène kanr est seulement supprimé par digestion avec la recombinase flp et l'autre site FRT n'est pas touché, le génome de MDV associé étant ainsi totalement conservé. La procédure qui a permis cela est présentée ci- dessous : la souche EL250 d'E. coll. transformée avec pSCAMeq-BAC9 a été inoculée dans un milieu LB liquide et cultivée sous secouage. Quand la culture a atteint une DO de 0,5, une solution d'arabinose à 5 % a été ajoutée à la culture (1 : 100 en volume/volume) jusqu'à la concentration finale en arabinose de 0,05 % (par rapport à l'induction totale où la concentration finale était de 10 %) et l'induction a été réalisée pendant 40 minutes (par rapport à l'induction totale de 60 minutes). Cela a entraîné seulement une induction incomplète de l'expression de la recombinase flp et la digestion partielle des sites FRT sur les molécules de pSCAMeq--BACS. Grâce au procédé, seulement 2 sites FRT flanquant le gène kanr ont été soumis à la digestion et le gène kanr a été supprimé tandis que le génome de MDV n'a pas été touché. Due to the presence of 3 FRT sites on the plasmid pSCL Meq-BAC9, a new method is designed comprising in combination "the incomplete induction of the expression of the flp recombinase, the partial digestion of FRT and a screening on two plates "for the deletion of the kanr gene in the plasmid pSCQMeq-BAC9. According to this method, only two of the three FRT sites are digested with the flp recombinase in part of the pSCAmeq-BAC plasmid molecules. If only the two FRT sites flanking the kanr gene are digested, then the kanr gene is deleted only by digestion with the flp recombinase and the other FRT site is not affected, thus the associated MDV genome is completely conserved. The procedure that allowed this is presented below: E. coli strain EL250. al. transformed with pSCAMeq-BAC9 was inoculated into liquid LB medium and cultured under shaking. When the culture reached an OD of 0.5, a 5% arabinose solution was added to the culture (1: 100 v / v) to the final arabinose concentration of 0.05% (by relative to total induction where the final concentration was 10%) and induction was performed for 40 minutes (relative to the total induction of 60 minutes). This resulted only in incomplete induction of flp recombinase expression and partial digestion of FRT sites on pSCAMeq-BACS molecules. Due to the method, only 2 FRT sites flanking the kanr gene were digested and the kanr gene deleted while the MDV genome was not affected.
Après (.'induction avec l'arabinose, la culture bactérienne a été mise sur une plaque de gélose LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol et soumise à une incubation pendant une nuit à 32 °C. Les colonies individuelles présentant une résistance au chloramphénicol ont été mises séparément sur deux plaques de gélose LB, l'une contenant seulement 30 pg/ml de chloramphénicol (A), l'autre contenant à la fois 30 pg/ml de chloramphénicol et 50 pg/ml de kanamycine (B). Les deux plaques ont été numérotées sur leur partie inférieure externe, une colonie identique sur les deux plaques ayant le même numéro. Les colonies se développant sur la plaque A et non sur la plaque B ont été sélectionnées en tant que colonies contenant potentiellement le génome intact de MDV et aucun gène kanr. Elles ont été inoculées sur des plaques de gélose LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol et cultivées pendant une nuit à 32 °C. Ces colonies ont été prélevées et inoculées séparément dans un milieu LB contenant 30 pg/ml de chloramphénicol et soumises à une incubation pendant une nuit à 32 °C. Pour déterminer si les colonies étaient les bonnes, l'ADN génomique a été extrait de récoltes bactériennes provenant de chaque colonie, et une PCR a été menée avec des amorces spécifiques du gène kanr et du gène pp38 de MDV (pp38-F, 5'-AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG, séquence ID. NO. 3 et After induction with arabinose, the bacterial culture was plated on LB agar plate containing 30 μg / ml chloramphenicol and incubated overnight at 32 ° C. Individual colonies exhibiting chloramphenicol resistance were separately placed on two LB agar plates, one containing only 30 μg / ml chloramphenicol (A), the other containing both 30 μg / ml chloramphenicol and 50 μg / ml kanamycin (B). The two plates were numbered on their outer lower part, an identical colony on the two plates having the same number, colonies growing on plate A and not on plate B were selected as colonies potentially containing the intact genome. of MDV and no kanr genes were inoculated on LB agar plates containing 30 μg / ml chloramphenicol and cultured overnight at 32 ° C. These colonies were removed and inoculated. separately in LB medium containing 30 μg / ml chloramphenicol and incubated overnight at 32 ° C. To determine if the colonies were good, the genomic DNA was extracted from bacterial cultures from each colony, and PCR was run with primers specific for the kanr gene and the MDV pp38 gene (pp38-F, 5 ' AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG, sequence ID No. 3 and
pp38-R, 5'-ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA, séquence ID NO. 4). Les colonies positives à pp38 de MDV, mais négatives au gène kanr, lors de la PCR ont été sélectionnées pour la préparation de l'ADN du clone BAC. Chaque colonie sélectionnée a été inoculée dans un bouillon LB contenant 30 dag/ml de chloramphénicol dans 500 ml. L'ADN plasmidique purifié du clone BAC a été préparé avec le kit plasmid Maxi (QIAGEN). Le plasmide qui a été utilisé avec succès pour la transfection des fibroblastes d'embryon de poulet afin de produire la souche SC9-1 a été appelé pSC9-BAC (figure 1). Après une vérification supplémentaire de la structure de leur génome par PCR, chaque ADN de clone BAC a été transfecté séparément dans des cellules CEE'. Les plaques typiques de MDV indiquaient la récupération du MDV recombinants. L'un des virus récupérés, pour lequel il avait été confirmé qu'il ne contenait ni gène meq ni gène kanr, e été appelé MDV SC98MegoKan' (désigné par SC9-1) et envisagé comme candidat potentiel pour élaborer un vaccin, La souche SC9-1 e été déposée au centre général de collecte des cultures microbiologiques de Chine, dans le Bacterial reference lab, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Pékin, le 3 décembre 2010, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 4399. Comme la réglementation liée à la biosécurité pour les produits génétiques recombinants en ce qui concerne les gènes de résistance aux antibiotiques est différente selon les pays, la souche SC9-2 à gène CM'' supprimé e également été construite tandis que la souche SC9-1 était construite. Selon un procédé pp38-R, 5'-ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA, sequence ID NO. 4). The MDV pp38 positive colonies, but negative to the kanr gene, during the PCR were selected for the preparation of the BAC clone DNA. Each selected colony was inoculated into LB broth containing 30 dag / ml chloramphenicol in 500 ml. The purified plasmid DNA of clone BAC was prepared with the Maxi plasmid kit (QIAGEN). The plasmid that has been successfully used for transfection of chicken embryo fibroblasts to produce strain SC9-1 has been termed pSC9-BAC (Figure 1). After further verification of the structure of their genome by PCR, each BAC clone DNA was transfected separately into EEC cells. Typical MDV plates indicated recovery of recombinant MDV. One of the recovered viruses, for which it was confirmed that it contained no meq gene or kanr gene, was called MDV SC98MegoKan '(designated SC9-1) and considered as a potential candidate to develop a vaccine, the strain. SC9-1 was deposited at the General Microbiological Collection Center of China, in the Bacterial Reference Lab, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing, December 3, 2010, with CGMCC Deposit No. 4399. the biosafety regulation for recombinant gene products with respect to antibiotic resistance genes is different in different countries, SC9-2 has also been constructed while strain SC9-1 was deleted. built. According to a method
précédemment décrit (Zhao et al., Self-excision of the BAC sequences from the recombinant Marek's disease virus genome increases replication and pathogenicity, Virology Journal, 2008, 5 : 19), un vecteur plasmidique transgénique recombinant pPartial-F-Kan-Cre-US2-US3 a été tout d'abord construit. Il contient une cassette kanr et SV-cre flanquée d'un fragment partiel mini-F provenant d'un vecteur BAC et une zone de jonction US2-US3 de MDV CX0101. La souche 5.L250 d' E. cou a été co- transformée à la fois avec les ADN de pPar.tial.-F-Kan-Cre-US2-US3 et de pSC9-BAC, puis mise sur des plaques LB contenant à la fois de la kanamycine et du chloramphénicol pour trouver des colonies résistant à la kanamycine. Le plasmide provenant des colonies criblées a été appelé pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 et amplifié sur grande échelle. L'ADN de pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 a été préparé et purifié avec des colonnes de purification d'ADN plasmidique. Des monocouches de cellules CEF ont été transfectées avec l'ADN de pSC9- BAC-Kana--Sv-Cre---032. Les cellules CEF transfectées ont été mises en suspension et remises en culture tous les 3 à 5 jours. Les plaques de MDV ont été vérifiées. Comme le promoteur SV40 de la cassette SV-cre est un promoteur eucaryotique, il active automatiquement l'expression du gène cre, et l'enzyme produit par le gène est capable de digérer deux sites loxP sur le génome viral et d'exciser le gène CMr et mini-F se trouvant entre les deux sites loxP, pour donner des virus SC9-2 à CMr supprimé, comme indiqué sur la figure 3. La majeure partie de la séquence d'ADN du squelette BAC contenant le gène CM', contenue dans la souche previously described (Zhao et al., Self-excision of the BAC sequences from the recombinant Marek's disease virus and genome increases replication and pathogenicity, Virology Journal, 2008, 5:19), a recombinant transgenic plasmid vector pPartial-F-Kan-Cre- US2-US3 was first built. It contains a kanr and SV-cre cassette flanked by a mini-F partial fragment from a BAC vector and a US2-US3 junction zone from MDV CX0101. E. coli strain 5.L250 was cotransformed with both pPar.tial.-F-Kan-Cre-US2-US3 and pSC9-BAC DNAs, and then plated on LB plates containing both kanamycin and chloramphenicol to find kanamycin resistant colonies. The plasmid from the screened colonies was called pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 and amplified on a large scale. PSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 DNA was prepared and purified with plasmid DNA purification columns. Monolayers of CEF cells were transfected with pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-032 DNA. The transfected CEF cells were suspended and resuspended every 3 to 5 days. The MDV plates have been checked. Since the SV40 promoter of the SV-cre cassette is a eukaryotic promoter, it automatically activates the expression of the cre gene, and the enzyme produced by the gene is capable of digesting two loxP sites on the viral genome and excising the gene CMr and mini-F located between the two loxP sites, to give suppressed CMr SC9-2 viruses, as shown in Figure 3. The bulk of the DNA sequence of the BAC skeleton containing the CM 'gene, contained in the strain
SC9-2 résultante, a été supprimée. Pour augmenter progressivement le taux de SC9-2 par rapport aux virus d'origine dans les cellules CEF après la transfection, des cellules CEF transfectées avec l'ADN plasmidique pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 présentant des plaques appropriées ont été soumises à des passages continus. Après 8 passages, il a été confirmé par analyse PCR que la majeure partie des plaques était induite par la souche SC9-2 à CM' supprimé, mais il existait encore certaines plaques virales contenant le vecteur BAC et le gène CM'. Selon un procédé par dilution limitée, des cellules CEF infectées par MDV et diluées ont été mises sur des plaques à 96 puits. Dans les puits, les cellules CEF formant seulement une plaque sous le microscope ont été digérées 7 jours après l'incubation et remises sur des plaques à 6 puits avec des monocouches normales de CEF une par une. Quand les plaques sont apparues, les cellules CEP ont été digérées et mises en suspension. Une partie a été utilisée pour effectuer une remise su.r plaque, et l'autre partie a été utilisée pour effectuer une analyse PCR enfin de confirmer la présence de la souche SC9-2 à CM" supprimé. Ce cycle a été répété une fois pour garantir la pureté du stock viral SC9-2. La souche SC9-2 a été déposée au centre général de collecte des cultures microbiologiques de Chine, dans le Bacterial reference lab, Institute of M.ic.r..ob.iology, Chinese Academy of Science, Pékin, le 24 novembre 2011, avec le numéro de dépôt CGMCC No. 5502.30 Caractéristiques différentielles des souches SC9--1 et SC9-2 dérivant de la souche sauvage de MDV GX0101 dans _ ai laquelle deux gènes meq sont supprimés Il existe 3 fragments spécifiques, au niveau de 3 5 sites spécifiques dans le génome viral, pouvant être utilisés comme marqueurs d'identification : (1) deux fragments de 34 pb possédant la séquence ID No. 5, résultant de la délétion du gène Meq des deux sites originaux contenant le gène Meq ; 10 (2) un fragment d'environ 539 pb de la répétition terminale longue du virus de la réticuloendothéliose (REV-LTR) possédant la séquence ID No. 6, inséré à environ 370 pb en amont du site de jonction US/TRS dans le génome viral. 15 Différence entre SC9-1. et SC9-2 : il existe un gène CMr et une séquence mini-F dans SC9-1, mais aucun de ces fragments n'existe dans SC9---2. Resulting SC9-2, was deleted. To gradually increase the level of SC9-2 compared to the original viruses in CEF cells after transfection, CEF cells transfected with plasmid DNA pSC9-BAC-Kana-Sv-Cre-US2 with appropriate plaques were subject to continuous passages. After 8 passages, it was confirmed by PCR that the majority of the plates were induced by SC9-2 to deleted CM ', but there were still some viral plaques containing the BAC vector and the CM' gene. In a limited dilution method, diluted MDV-infected CEF cells were plated on 96-well plates. In the wells, the CEF cells forming only one plate under the microscope were digested 7 days after incubation and put back on 6-well plates with normal CEF monolayers one by one. When the plaques appeared, the CEP cells were digested and suspended. One part was used to perform a plaque delivery, and the other part was used to perform a PCR run to finally confirm the presence of SC9-2 strain at deleted CM. This cycle was repeated once to ensure the purity of the SC9-2 viral stock The strain SC9-2 was deposited at the General Microbiological Collection Center of China, in the Bacterial reference lab, Institute of M.ic.r..ob.iology, Chinese Academy of Science, Beijing, November 24, 2011, with the deposit number CGMCC No. 5502.30 Differential characteristics of strains SC9-1 and SC9-2 derived from the wild strain of MDV GX0101 in which two meq genes are deleted. There are 3 specific fragments, at specific sites in the viral genome, which can be used as identifying markers: (1) two 34 bp fragments having the sequence ID No. 5, resulting from the deletion of the Meq gene from the two original sites containing the Meq gene; (2) a fragment of about 539 bp of the long terminal repeat of reticuloendotheliosis virus (REV-LTR) having the sequence ID No. 6, inserted at about 370 bp upstream of the junction site US / TRS in the viral genome. Difference between SC9-1. and SC9-2: There is a CMr gene and a mini-F sequence in SC9-1, but none of these fragments exist in SC9 --- 2.
Pathogens_cite et immunité protectrice de SC9-1 20 (SC9AMegAKan'') et de SC9-2 (SC9AMegAKanrâCM'') chez les poulets Dans des études précédemment publiées, il est indiqué que GX01010meq ne présente aucune pathogénicité et induit une protection efficace à 100 % contre une 25 provocation avec un vvMDV chez les poulets (Su S, Li Y, Sun A, Cui Z, Acta Mi.crologica Sinica, 2010, 50 : 380--386). Comme GX010lâmeq contient le gène kanr, son utilisation comme vaccin vivant est interdite. La présente innovation utilise la souche SC9-1 et la 30 souche SC9-2 en dérivant comme nouveau virus vaccinal candidat, dans lequel non seulement 2 gènes meq et également le gène kanr sont supprimés. Des expériences sur des oiseaux similaires à celles réalisées avec GX0101âmeq (Su S, Li Y, Sun A, Cui Z, Acta Micrologica Sinica, 2010, 50 : 380-386), avec le même procédé et les mêmes conditions, ont été effectuées avec la souche SC9-1 (SC9àMegAKanr) et la souche SC9-2 (SC9AMegàKanràCMI) sur des poulets SPF. Pathogens_cite and protective immunity of SC9-1 (SC9AMegAKan '') and SC9-2 (SC9AMegAKanrâCM '') in chickens In previously published studies, it is reported that GX01010meq shows no pathogenicity and induces 100% effective protection against challenge with vvMDV in chickens (Su S, Li Y, Sun A, Cui Z, Acta Mi.crologica Sinica, 2010, 50: 380--386). Since GX010lâmeq contains the kanr gene, its use as a live vaccine is prohibited. The present invention uses strain SC9-1 and strain SC9-2 as a new vaccine candidate virus, in which not only 2 meq genes but also the kanr gene are deleted. Experiments on birds similar to those carried out with GX0101âmeq (Su S, Li Y, Sun A, Cui Z, Acta Micrologica Sinica, 2010, 50: 380-386), with the same process and the same conditions, were carried out with strain SC9-1 (SC9 to Megakan) and strain SC9-2 (SC9AMega KanancCMI) on SPF chickens.
Exemple de test : 240 poulets SPF âgés de 1 jour ont été divisés en 8 groupes (30 oiseaux par groupe) et maintenus dans les isolateurs SPF avec une filtration d'air positive. Les groupes 1 à 4 ont reçu dans l'abdomen respectivement 2000 pfu/oiseau de GX0101àmeq, de SC9-1, de SC9-2 et de souche vaccinale CV1988/Rispens. Le groupe 5 a été utilisé comme témoin de provocation et le groupe 6 a été utilisé comme témoin d'oiseaux normaux en bonne santé. Les groupes 7 et 8 ont reçu 2000 pfu/oiseau de SC9-1. ou de SC9-2 pour effectuer une étude de pathogénicité. A l'âge de 6 jours, tous les oiseaux des groupes 1 à 5 ont été provoqués avec la souche Md5 de vvMDV avec 1000 pfu par oiseau. Les vitesses de croissance et les conditions cliniques ont été observées chaque semaine après la provocation. Pendant la période de l'expérience, chaque oiseau mort a été autopsié, et des échantillons de tissus d'organes présentant des lésions susceptibles d'avoir été provoquées par une MD ont été collectés pour obtenir des sections dans la paraffine, colorée par H.E. et observés au microscope pour réaliser une hist.opathologie. Quatre-vingt-dix jours après la Test Example: 240 day old SPF chickens were divided into 8 groups (30 birds per group) and maintained in SPF isolators with positive air filtration. Groups 1 to 4 received in the abdomen respectively 2000 pfu / bird of GX0101 to meq, SC9-1, SC9-2 and vaccine strain CV1988 / Rispens. Group 5 was used as a challenge control and Group 6 was used as a control for normal healthy birds. Groups 7 and 8 received 2000 pfu / bird from SC9-1. or SC9-2 to perform a pathogenicity study. At the age of 6 days, all birds from groups 1 to 5 were challenged with the Md5 strain of vvMDV with 1000 pfu per bird. Growth rates and clinical conditions were observed weekly after challenge. During the period of the experiment, each dead bird was autopsied, and organ tissue samples with lesions likely to have been caused by MD were collected to obtain paraffin sections, stained with HE and observed under a microscope to perform histopathology. Ninety days after the
provocation, tous les oiseaux ont été tués de manière humaine pour effectuer une autopsie, les lésions ont été vérifiées avec soin pour chaque oiseau et des échantillons de tissus de coeur, de rate et de foie de 5 oiseaux de chaque groupe ont été collectés et fixés avec une solution de formaline à 10 % pour effectuer des études d'histopathologie. Les échantillons ont été stockés à 4 °C, traités pour obtenir des sections dans la paraffine, colorés par H.E. et observés pour l' hi. stopatholog ie . Les résultats obtenus à partir des expériences réalisées sur les oiseaux ont montré que les souches SC9-1 et SC9-2 de MDV ne sont pas pathogènes pour les poulets SPF et qu'elles confèrent une bonne immunité protectrice contre la souche Md5 de vvMDV (tableau 1). Comme on peut le voir dans le tableau 1, la souche SC9-1 à gène kali' supprimé présente des caractéristiques biologiques pratiquement identiques à celles de son virus parent GX0101Ameq en ce qui. concerne leur pathogénicité et l'immunité protectrice chez les poulets. En outre, SC9-1 peut être un candidat pour élaborer un vaccin après la suppression du gène kan'. La souche SC9-2 ne contenant plus kanr et CM' est identique à SC9-1 en ce qui concerne toutes ces caractéristiques. provocation, all birds were killed in a humane manner to perform an autopsy, the lesions were carefully checked for each bird and samples of heart, spleen and liver tissue from 5 birds from each group were collected and fixed with a 10% formalin solution to perform histopathology studies. The samples were stored at 4 ° C, treated to obtain paraffin sections, stained by H.E. and observed for hi. stopathology. The results obtained from the experiments on birds have shown that strains SC9-1 and SC9-2 of MDV are not pathogenic for SPF chickens and that they confer a good protective immunity against vvMDV strain Md5 (table 1). As can be seen from Table 1, the deleted SC1-1 gene strain has biological characteristics substantially identical to those of its parent virus GX0101Ameq in that. their pathogenicity and protective immunity in chickens. In addition, SC9-1 may be a candidate for developing a vaccine after the deletion of the kan 'gene. Strain SC9-2 no longer containing kanr and CM 'is identical to SC9-1 with respect to all these characteristics.
Tableau 1. Comparaison des souches SC9--1 et SC9-2 de MDV à d'autres virus vaccinaux en ce qui concerne leur pathogénicité et l'immunité protectrice chez les 30 poulets SPF -- --- Taux Provocation indice de immunisation de avec (dans Mortalité protection (dans l'abdomen) tumeur l'abdomen) MD (%) Virus Dose Dose vvMDV (%) (%)* vaccinal (pfu) (pfu) 0/30 GX0101Lmeq 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) 0/30 SC9-1 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) 0/30 SC9-2 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) C V 19 0 0/ 2000 rMd5 --- ------ 4/30 87 1000 3/30 (10) Rispens (13) Témoin de 25/30 29/30 provo- - rMd5 1000 cation (83) (97) Témoin - - 0/30 (0) 0/30 négatif (0) 0/30 SC9-1 2000 - - 0/30 (0) - (0) ~ _ -- 0/30 SC9-2 2000 - - 0/30 (0) - (0) *Note : les poulets SPF de 1 jour des groupes 1 à 4 ont reçu dans l'abdomen pour la vaccination respectivement 2000 pfu de GX01018meq, de SC9-1, de SC9-2 et de CVI988/Rispens. A l'âge de 5 jours, les oiseaux ont reçu 1000 pfu de vvMDV rMd5. Tous les oiseaux ont été conservés et observés cliniquement pendant 13 semaines pour déterminer le taux de mortalité. Chaque oiseau mort a été autopsié, et des Table 1. Comparison of MDV strains SC9-1 and SC9-2 with other vaccine viruses with respect to their pathogenicity and protective immunity in SPF chickens. Rate Provocation immunization index of (in Mortality protection (in the abdomen) tumor abdomen) MD (%) Virus Dose Rate vvMDV (%) (%) * vaccine (pfu) (pfu) 0/30 GX0101Lmeq 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) 0/30 SC9-1 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) 0/30 SC9-2 2000 rMd5 1000 0/30 (0) 100 (0) CV 19 0 0/2000 rMd5 - - ------ 4/30 87 1000 3/30 (10) Rispens (13) 25/30 control 29/30 provo- MD5 1000 cation (83) (97) Control - - 0/30 ( 0) 0/30 negative (0) 0/30 SC9-1 2000 - - 0/30 (0) - (0) ~ _ - 0/30 SC9-2 2000 - - 0/30 (0) - (0 ) * Note: 1-day Group 1 to 4 SPF chickens received 2000 pfu of GX01018meq, SC9-1, SC9-2 and CVI988 / Rispens respectively in the abdomen for vaccination. At the age of 5 days, the birds received 1000 pfu of vvMDV rMd5. All birds were kept and observed clinically for 13 weeks to determine the mortality rate. Each dead bird was autopsied, and
sections de tissus ont été observées pour trouver des lésions cancéreuses. A la fin des 13 semaines après la provocation, tous les oiseaux ont été tués de manière humaine pour effectuer une autopsie, et les lésions cancéreuses ont été observées et enregistrées. Les taux de tumeur MD rapportés dans le tableau sont le nombre total d'oiseaux morts ayant des tumeurs, ou d'oiseaux ayant des signes cliniques ou d'oiseaux présentant des tumeurs denses lors de l'autopsie réalisée à la fin des expériences. L'indice de protection a été calculé sur la base de la prévention des signes cliniques de MD et de décès. tissue sections were observed to find cancerous lesions. At the end of the 13 weeks post-challenge, all birds were killed in a humane manner to perform an autopsy, and the cancerous lesions were observed and recorded. The MD tumor rates reported in the table are the total number of dead birds with tumors, or birds with clinical signs or birds with dense tumors at the autopsy performed at the end of the experiments. The protection index was calculated based on the prevention of clinical signs of MD and death.
Les souches SC9-1 et SC9-2 ne présentent pas d'effet tumorigène ou immunosuppresseur sur les poulets Des expériences réalisées sur des poulets SPF ont montré que le virus d'origine cloné par BAC bac-GX01.01 induit un retard de croissance et une atrophie du thymus et des bourses de Fabricius. Les poids corporels et les proportions entre le thymus ou les bourses et le poids corporel étaient bien inférieurs chez les oiseaux provoqués par bac-GX0101 que chez les témoins (p < 0,01). Cependant, ni SC9-1 ni SC9-2 n'ont induit de tumeurs (tableau 1) ou d'immunosuppression. Il n'y avait aucune différence significative entre les poulets SPF témoins et les poulets SPF ayant reçu SC9-1 ou SC9-2 à l'âge de 1 jour (tableau 2). Ceci est une caractéristique importante pour un virus vaccinal candidat. Contrairement à SC9-1 ou à SC9-2, rMd5âmeq rapporté aux USA s'est avéré avoir certains effets immunosuppresseurs quand il a été testé en faibles passages. Il ne répond donc pas aux normes des vaccins candidats. Tableau 2. Comparaison entre les poids corporels et les proportions entre les bourses ou le thymus et le poids corporel de poulets SPF ayant reçu MDV bac-GX0101, es. se. SC9-1 et SC9-2 (n = 20) Thymus par Bourses par Poulets ayant reçu les virus Poids rapport au rapport au corporel (g) poids poids corporel (%) corporel (%) bac-GX0101 91,9 1 9,1 e 0, 21 ± 0, 06 0,2 -1 0,07 a a SC9-1 116,6 ± 11,9 0,42 ± 0,08 0,38 ± 0,08 b b b SC9-2 115,8 ± 11,2 0,41 f 0,08 0,38 1 0,08 b b b Aucun virus --125,9 ± 16,7 0, 4 8 ? 0,09 ,45 W 0,12 b b b Les poulets SPF ont reçu dans l'abdomen 1000 pfu de MDV bac-GX0101, de SC9-1 ou de SC9-2. Les poids corporels, les poids des bourses et les poids des thymus ont été mesurés à l'âge de 6 semaines. Les nombres représentent la moyenne l'écart type. Des lettres différentes à droite des nombres indiquent que les différences sont statistiquement significatives (p < 0,01), tandis que des lettres identiques indiquent que les différences ne sont pas statistiquement significatives (P > 0,05). Strains SC9-1 and SC9-2 do not show a tumorigenic or immunosuppressive effect on chickens Experiments carried out on SPF chickens have shown that the original virus cloned by bac bac-GX01.01 induces a growth retardation and atrophy of the thymus and Fabricius bursae. Body weights and proportions between thymus or bursa and body weight were much lower in bac-GX0101-challenged birds than in controls (p <0.01). However, neither SC9-1 nor SC9-2 induced tumors (Table 1) or immunosuppression. There was no significant difference between the control SPF chickens and the SPF chickens who received SC9-1 or SC9-2 at the age of 1 day (Table 2). This is an important feature for a candidate vaccine virus. Unlike SC9-1 or SC9-2, rMd5âmeq reported in the US has been shown to have some immunosuppressive effects when tested in weak passages. It does not meet the standards of candidate vaccines. Table 2. Comparison between body weights and proportions between bursae or thymus and body weight of SPF chickens that received MDV bac-GX0101, es. is. SC9-1 and SC9-2 (n = 20) Thymus by Fellowships by Chickens Having Received Viruses Weight to Body Ratio (g) Weight Body Weight (%) Body (%) bac-GX0101 91.9 1 9.1 e 0, 21 ± 0, 06 0.2 -1 0.07 aa SC9-1 116.6 ± 11.9 0.42 ± 0.08 0.38 ± 0.08 bbb SC9-2 115.8 ± 11 , 2 0.41 f 0.08 0.38 1 0.08 bbb No virus --125.9 ± 16.7 0, 4 8? 0.09, 45 W 0.12 b b b SPF chickens received in the abdomen 1000 pfu of MDV bac-GX0101, SC9-1 or SC9-2. Body weights, bursa weights and thymus weights were measured at 6 weeks of age. The numbers represent the mean standard deviation. Different letters to the right of the numbers indicate that the differences are statistically significant (p <0.01), while identical letters indicate that the differences are not statistically significant (P> 0.05).
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. Of course, the invention is not limited to the embodiments described above and shown, from which we can provide other modes and other embodiments, without departing from the scope of the invention. .
Claims (10)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105876771A CN102154224A (en) | 2010-12-14 | 2010-12-14 | Construction of recombinant chicken marek's disease vaccine virus SC9-1 strain and application thereof |
| CN2011103936522A CN102628053B (en) | 2010-12-14 | 2011-12-02 | Construction and application of recombinant Chicken Marek's Disease Virus SC9-1 strain and SC9-2 strain |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2968672A1 true FR2968672A1 (en) | 2012-06-15 |
| FR2968672B1 FR2968672B1 (en) | 2015-10-16 |
Family
ID=46150548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1161641A Active FR2968672B1 (en) | 2010-12-14 | 2011-12-14 | CONSTRUCTION OF RECOMBINANT MAREK DISEASE VIRAL SC9-1 AND SC9-2 VIRAL STRAINS AND USE THEREOF |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102628053B (en) |
| FR (1) | FR2968672B1 (en) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103382460B (en) * | 2013-06-17 | 2014-07-30 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | Strain of Marek's disease virus vaccine strain, and separation and identification and application thereof |
| CN106397602B (en) * | 2016-08-02 | 2019-06-18 | 青岛明勤生物科技有限公司 | A kind of reinforced chicken Marek's disease protein engineering vaccine of molecule adjuvant |
| CN106754761B (en) * | 2017-01-20 | 2021-01-12 | 北京邦卓生物科技有限公司 | Construction and application of recombinant marek's disease virus meq and vIL-8 double-gene deletion strain |
| CN108342367B (en) * | 2018-02-01 | 2021-07-20 | 山东农业大学 | Recombinant Marek's virus strain SCA13 strain and application thereof |
| CN110343671A (en) * | 2019-06-24 | 2019-10-18 | 青岛易邦生物工程有限公司 | A kind of I type Marek's disease virus vaccine strain of recombination for expressing VP2 gene |
| CN113667648B (en) * | 2021-08-23 | 2023-02-24 | 山东农业大学 | Construction and application of recombinant Marek's virus MDLV21 strain |
| CN114470160B (en) * | 2022-03-18 | 2023-08-25 | 山东农业大学 | Virus replication inhibitor and application thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004100640A2 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Marek’s disease virus vaccine |
| WO2006005934A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-19 | Imperial Innovations Ltd. | Recombinant marek’s disease virus |
| WO2010008528A2 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | The Texas A&M University System | Marek's disease virus vaccine compositions and methods of using thereof |
-
2011
- 2011-12-02 CN CN2011103936522A patent/CN102628053B/en active Active
- 2011-12-14 FR FR1161641A patent/FR2968672B1/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004100640A2 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Marek’s disease virus vaccine |
| WO2006005934A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-19 | Imperial Innovations Ltd. | Recombinant marek’s disease virus |
| WO2010008528A2 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | The Texas A&M University System | Marek's disease virus vaccine compositions and methods of using thereof |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| K. W. JAROSINSKI ET AL: "Attenuation of Marek's Disease Virus by Deletion of Open Reading Frame RLORF4 but Not RLORF5a", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 79, no. 18, 15 September 2005 (2005-09-15), pages 11647 - 11659, XP055094128, ISSN: 0022-538X, DOI: 10.1128/JVI.79.18.11647-11659.2005 * |
| LEE ET AL: "Recombinant Marek's disease virus (MDV) lacking the Meq oncogene confers protection against challenge with a very virulent plus strain of MDV", VACCINE, ELSEVIER LTD, GB, vol. 26, no. 15, 13 February 2008 (2008-02-13), pages 1887 - 1892, XP022534499, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/J.VACCINE.2008.01.046 * |
| LEE L F ET AL: "Comparative evaluation of vaccine efficacy of recombinant Marek's disease virus vaccine lacking Meq oncogene in commercial chickens", VACCINE, ELSEVIER LTD, GB, 2010 FEB, vol. 28, no. 5, 24 November 2009 (2009-11-24), pages 1294 - 1299, XP026858366, ISSN: 0264-410X, [retrieved on 20091124] * |
| LI YANPENG ET AL: "Deletion of the meq gene significantly decreases immunosuppression in chickens caused by pathogenic marek's disease virus", VIROLOGY JOURNAL, BIOMED CENTRAL, LONDON, GB, vol. 8, no. 1, 5 January 2011 (2011-01-05), pages 2, XP021089794, ISSN: 1743-422X, DOI: 10.1186/1743-422X-8-2 * |
| LUPIANI B ET AL: "Marek's disease virus-encoded Meq gene is involved in transformation of lymphocytes but is dispensable for replication", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 101, no. 32, 10 August 2004 (2004-08-10), pages 11815 - 11820, XP002343202, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.0404508101 * |
| PETHERBRIDGE L ET AL: "Oncogenicity of virulent Marek's disease virus cloned as bacterial artificial chromosomes", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 78, no. 23, December 2004 (2004-12-01), pages 13376 - 13380, XP002343203, ISSN: 0022-538X, DOI: 10.1128/JVI.78.23.13376-13380.2004 * |
| SUN A J ET AL: "Functional evaluation of the role of reticuloendotheliosis virus long terminal repeat (LTR) integrated into the genome of a field strain of Marek's disease virus", VIROLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 397, no. 2, 20 February 2010 (2010-02-20), pages 270 - 276, XP026888063, ISSN: 0042-6822, [retrieved on 20091203], DOI: 10.1016/J.VIROL.2009.11.017 * |
| ZHIZHONG CUI ET AL: "Molecular and biological characterization of a Marek's disease virus field strain with reticuloendotheliosis virus LTR insert", VIRUS GENES, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 40, no. 2, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 236 - 243, XP019775262, ISSN: 1572-994X * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2968672B1 (en) | 2015-10-16 |
| CN102628053B (en) | 2013-10-09 |
| CN102628053A (en) | 2012-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2968672A1 (en) | New viral genome construction of a recombinant Marek's disease virus, comprising fragments as their identification markers of two fragments, useful for the preparation of vaccines against the Marek's disease virus | |
| US11220673B2 (en) | ORF7 deficient varicella virus, vaccine comprising the virus and use thereof | |
| EP0870046B1 (en) | Recombinant live vaccine containing feline herpes virus type 1, particularly for treating feline infectious peritonitis | |
| KR20200002834A (en) | Recombinant Gallide herpesvirus type 3 vaccine encoding a heterologous avian pathogen antigen | |
| CN109310750B (en) | Recombinant nonpathogenic Marek's disease virus constructs encoding infectious laryngotracheitis virus and infectious bursal disease virus antigens | |
| CN108728490A (en) | A kind of carp herpesviral II types DNA vaccination and its construction method and application based on baculovirus vector | |
| US20160122728A1 (en) | Ipn vaccine | |
| CN111542599A (en) | Recombinant non-pathogenic markholderia virus constructs encoding multiple heterologous antigens | |
| CN113226363B (en) | Recombinant avian herpesvirus containing multiple foreign genes | |
| CN107099513B (en) | Construction and application of HVT co-expressing NDV HN and IBDV VP2 genes | |
| EP0757722B1 (en) | HERPES VIRUS TRANSFORMED TO EXPRESS gD IN VITRO | |
| CN107771216B (en) | Recombinant MDV1 and uses thereof | |
| CN114703153B (en) | Serum type 2 avian adenovirus strain, vaccine and application | |
| CN110777122A (en) | Recombinant Marek's disease virus I for expressing VP2 protein of IBDV (infectious bursal disease Virus) | |
| CN113151193B (en) | Serum 4 type avian adenovirus reverse genetic vaccine strain rR188I, construction method and application thereof | |
| CN108220217B (en) | Attenuated listeria monocytogenes for delivering and expressing exogenous antigen and application thereof | |
| RU2777400C2 (en) | Recombinant non-pathogenic structures of marek's disease virus, encoding antigens of infectious laryngotracheitis virus and infectious bursitis virus | |
| CN118497144A (en) | Marek's disease virus gene editing deletion vaccine strain SD01 delta meq, construction and application | |
| CN118256452A (en) | Recombinant turkey herpesvirus expressing infectious bursal disease virus novel variant VP2 gene and application thereof | |
| CN118480516A (en) | Marek's disease virus gene editing deletion vaccine strain SQ01Δmeq, construction and application | |
| KR101560793B1 (en) | Avirulent infectious bursal disease variant virus and use as a vaccine | |
| CN117187196A (en) | Recombinant Marek's disease virus strain expressing newcastle disease virus F gene, construction method and application thereof | |
| CN118325854A (en) | Recombinant Meq gene deleted Marek's disease virus strain expressing varIBDV VP gene and construction method and application thereof | |
| Shchelkunov et al. | Vaccinia Virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 6 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 7 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 8 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 9 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 10 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 11 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 12 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 13 |