FR2956866A1 - Detecting the presence of enzyme e.g. cephalosporinases, comprises suspending the bacteria in a composition comprising a chromogenic or fluorogenic substrate, and detecting the possible release of the chromophore - Google Patents

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Abstract

Method for detecting the presence of an enzyme comprising cephalosporinases, extended spectrum beta -lactamases (ESBLs) and carbapenemases, comprises: (a) suspending the bacteria in a liquid composition comprising a chromogenic or fluorogenic substrate capable of releasing a chromophore or fluorophore after hydrolysis by the enzyme to detect; and (b) detecting the possible release of the chromophore or fluorophore, where the detecting the release of the chromophore or fluorophore in step (b) indicates the presence of an enzyme cephalosporinases, ESBLs and carbapenemases. An independent claim is included for method of in vitro detection of microorganisms resistant to cephalosporins of 3rd generation, implementing the method.

Description

Procédé de détection en milieu liquide de bactéries résistantes aux céphalosporines de troisième génération Method for the detection in liquid medium of third-generation cephalosporin-resistant bacteria

La présente invention concerne un procédé pour détecter, en milieu liquide, la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases, incluant les métallo-R-lactamases, la détection d'une telle enzyme étant indicatrice de la présence d'une bactérie résistante aux céphalosporines de troisième génération. The present invention relates to a method for detecting, in a liquid medium, the presence of an enzyme selected from the group consisting of cephalosporinases, extended-spectrum R-lactamases (ESBL) and carbapenemases, including metallo-R-lactamases, detection of such an enzyme being indicative of the presence of a bacterium resistant to third generation cephalosporins.

Les R-lactamines représentent la famille d'antibiotiques la plus importante du fait du grand nombre de molécules qui en font partie et du fait de ses propriétés pharmacologiques et des spectres associés qui permettent de combattre la plupart des espèces bactériennes. Les R-lactamines sont à juste titre les antibiotiques les plus prescrits en médecine générale. Leur spectre d'activité est variable en fonction de leur classe (pénicillines ou céphalosporines) et parfois en fonction des molécules dans chaque classe. Ainsi, les pénicillines G et V sont plutôt actives sur les cocci à Gram positif et les bactéries anaérobies, tandis que le spectre des aminopénicillines s'étend à quelques bacilles à Gram négatif. L'adjonction d'un inhibiteur de R-lactamases permet en outre d'observer une activité sur certaines bactéries produisant ces R-lactamases. Les céphalosporines étendent encore le spectre d'activité vers les bacilles à Gram négatif mais sont un peu moins actives sur les cocci à Gram positif. Parmi les R-lactamines, les céphalosporines représentent la catégorie d'antibiotiques la plus souvent prescrite. L'usage courant des céphalosporines a entraîné la diffusion de souches résistantes vis-à-vis de ces molécules. Ces souches parviennent notamment à survivre à la pression de sélection des céphalosporines de part une activité R-lactamase. La détection des résistances combinées vis-à-vis des céphalosporines de lère 2ème et de Sème génération (C3G) chez les entérobactéries devient d'une importance thérapeutique majeure. En effet, la résistance des entérobactéries aux antibiotiques connaît une évolution mondiale préoccupante avec un impact croissant des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) qui diffusent notamment dans le secteur communautaire. En 2002, moins de 1 % des souches d'entérobactéries avaient une BLSE. En 2006, elles représentaient 1 à 5 % des souches. La résistance aux C3G, qu'elle soit due aux BLSE ou à d'autres R-lactamases (céphalosporinase ou carbapénémase) est donc en augmentation et est devenue significative, notamment pour Escherichia coli et Kiebsiella pneumoniae. L'émergence de ces enzymes a récemment été rapportée chez des bacilles à Gram négatif non fermentants tels que Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia. Il est donc de plus en plus important de pouvoir détecter des bactéries possédant une BLSE. R-lactam antibiotics represent the most important family of antibiotics because of the large number of molecules that are part of it and because of its pharmacological properties and associated spectra that can fight most bacterial species. R-lactam antibiotics are rightly the most prescribed antibiotics in general practice. Their spectrum of activity varies according to their class (penicillins or cephalosporins) and sometimes according to the molecules in each class. Thus, penicillins G and V are rather active on Gram-positive cocci and anaerobic bacteria, while the spectrum of aminopenicillins extends to some gram-negative bacilli. The addition of an R-lactamase inhibitor also makes it possible to observe an activity on certain bacteria producing these R-lactamases. Cephalosporins further extend the spectrum of activity to Gram-negative bacilli but are somewhat less active on Gram-positive cocci. Of the R-lactams, cephalosporins are the most commonly prescribed class of antibiotics. The common use of cephalosporins has resulted in the diffusion of strains resistant to these molecules. These strains manage in particular to survive the pressure of selection of cephalosporins by R-lactamase activity. The detection of combined resistance to cephalosporins of the 1st 2nd and 3rd generation (C3G) in enterobacteria becomes of major therapeutic importance. Indeed, the resistance of enterobacteria to antibiotics is experiencing a worrisome global trend with an increasing impact of extended-spectrum lactamases (ESBL) that spread in particular in the community sector. In 2002, less than 1% of enterobacterial strains had ESBL. In 2006, they accounted for 1 to 5% of strains. The resistance to C3G, whether due to ESBL or other R-lactamases (cephalosporinase or carbapenemase) is therefore increasing and has become significant, especially for Escherichia coli and Kiebsiella pneumoniae. The emergence of these enzymes has recently been reported in non-fermenting Gram-negative bacilli such as Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia. It is therefore increasingly important to be able to detect bacteria with ESBL.

La détection des BLSE chez les entérobactéries est simple à mettre en oeuvre dans la plupart des cas : elle est objectivée par une synergie entre le mélange [amoxicilline + acide clavulanique (AMC)] et une C3G (la ceftazidime est la plus sensible) ou l'aztréonam. Néanmoins l'obtention d'un résultat demande beaucoup de temps. Le test de synergie est réalisé en disposant les disques d'AMC et de la C3G choisie (ou de l'aztréonam) à 30 mm de distance, centre à centre. La détection des BLSE est en revanche plus difficile chez les souches également hyperproductrices de céphalosporinase (AmpC) comme Enterobacter. Dans ce dernier cas, il est plus aisé de visualiser la synergie entre AMC et céfépime ou cefpirome. Enfin, chez certaines espèces telles que Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Morgane/la morganii, Pro videncia stuartii et Pro videncia rettgeri, les BLSE s'expriment faiblement et sont donc encore plus difficiles à détecter. Dans ces cas, le test de synergie est optimisé en plaçant les disques à une distance de 40-45 mm, au lieu de 30 mm, selon les recommandations du CA-SFM (Comité de l'antibiogramme de la Société française de microbiologie) en 2007. Des automates de bactériologie pour identification et antibiogramme sont de plus en plus utilisés (Mini-Api®, commercialisé par bioMérieux Clinical Diagnostics, Phoenix® commercialisé par BD Diagnostics , MicroScan® commercialisé par Siemens, Vitek®, Vitek-2® et Vitek Compact® commercialisés par bioMérieux). D'une manière générale, ces automates détectent relativement bien les BLSE chez les souches qui n'hyperproduisent pas habituellement de céphalosporinases (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca). Pour les autres espèces (Enterobacter, Citrobacter, Serratia, etc.), leur sensibilité et surtout leur spécificité sont un peu moins bonnes que celles des méthodes manuelles. Des tests complémentaires s'avèrent alors nécessaires. La détection des souches résistantes aux C3G peut donc être aisée pour certaines résistances reliées à certaines espèces mais, d'une manière générale, aucune procédure ne possède 100 % de sensibilité ni ne permet d'obtenir un résultat rapide. De nouvelles techniques de détection, plus rapides, de ces microorganismes ont donc été recherchées. Parmi elles, certaines utilisent un substrat chromogène. The detection of ESBL in enterobacteria is simple to implement in most cases: it is objectified by a synergy between the mixture [amoxicillin + clavulanic acid (AMC)] and a C3G (ceftazidime is the most sensitive) or the aztreonam. Nevertheless obtaining a result requires a lot of time. The synergy test is performed by placing the AMC disks and the selected C3G (or aztreonam) at 30 mm distance, center to center. On the other hand, detection of ESBLs is more difficult in strains that are also hyperproductive for cephalosporinase (AmpC), such as Enterobacter. In the latter case, it is easier to visualize the synergy between AMC and cefepime or cefpirome. Finally, in some species such as Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Morgana / morganii, Pro videncia stuartii and Pro videncia rettgeri, ESBLs are weakly expressed and are therefore even more difficult to detect. In these cases, the synergy test is optimized by placing the discs at a distance of 40-45 mm, instead of 30 mm, according to the recommendations of the CA-SFM (Committee of the antibiogram of the French Society of microbiology) in 2007. Automatics for bacteriology for identification and antibiogram are increasingly used (Mini-Api®, marketed by bioMérieux Clinical Diagnostics, Phoenix® marketed by BD Diagnostics, MicroScan® marketed by Siemens, Vitek®, Vitek-2® and Vitek Compact® marketed by bioMérieux). In general, these automata detect ESBL relatively well in strains that do not usually produce cephalosporinases (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca). For other species (Enterobacter, Citrobacter, Serratia, etc.), their sensitivity and especially their specificity are a little less good than those of manual methods. Further tests are then necessary. The detection of C3G-resistant strains can therefore be easy for certain resistances related to certain species, but, in general, no procedure has 100% sensitivity nor does it make it possible to obtain a rapid result. New, faster detection techniques for these microorganisms have therefore been sought. Some of them use a chromogenic substrate.

Actuellement, la détection des microorganismes producteurs de 3-lactamases à spectre étendu (BLSE) utilisant un substrat chromogène repose sur le principe suivant : - la ou les colonies suspectes sont déposées sur un disque ou sur une bandelette pré-imprégné(e) d'un substrat chromogène, - on observe le changement de coloration. L'utilisation combinée du chromogène avec des inhibiteurs spécifiques des différents types de 13-lactamase permet de différencier les souches productrices de BLSE, de céphalosporinase, et/ou de métallo-13-lactamase. Il existe un test appelé Cica-Beta-Test (Kanto Chemical Co., Inc) qui permet la détection rapide des BLSE, des carbapénémases dont les métallo-[3-Iactamases et aussi des céphalosporinases, si elles sont exprimées, sur la base d'une dégradation du composé chromogène HMRZ-86. La détection est effectuée au bout d'une durée maximale de 15 minutes, par détection d'un changement de coloration du jaune vers le rouge. Dans ce type de test, il est fortement conseillé d'induire la résistance par la prise de colonies situées autour d'un disque portant une C3G. Cette étape d'induction implique alors une attente de 16-24 heures supplémentaires avant d'obtenir un résultat. Currently, the detection of the microorganisms producing extended-spectrum 3-lactamases (ESBL) using a chromogenic substrate is based on the following principle: the suspicious colony or colonies are deposited on a disk or on a pre-impregnated strip of a chromogenic substrate, - the color change is observed. The combined use of the chromogen with specific inhibitors of the different types of β-lactamase makes it possible to differentiate strains producing ESBL, cephalosporinase, and / or metallo-13-lactamase. There is a test called Cica-Beta-Test (Kanto Chemical Co., Inc.) that allows the rapid detection of ESBLs, carbapenemases including metallo [3-lactamases and also cephalosporinases, if expressed, on the basis of degradation of the chromogenic compound HMRZ-86. The detection is carried out after a maximum duration of 15 minutes, by detecting a color change from yellow to red. In this type of test, it is strongly recommended to induce resistance by taking colonies around a disc carrying a C3G. This induction step then involves a wait of 16-24 hours before obtaining a result.

Le composé HMRZ-86 ((7R)-7-[2-(aminothiazol-4-yl)-(z)-2-(1-carboxy-l- methylethoxyimino)acetam ido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacetate, isomère E) a notamment été décrit dans la demande de brevet EP1325923 et par Hanaki et al. (2004 Journal of Antimicrobial Chemotherapy 53:888-889). Dans ces deux documents, il est proposé d'utiliser le substrat chromogène sur un disque, qui est généralement un disque de cellulose de couleur blanche ou pâle. Les brevets US 5,338,843, US 5,583,217, et US 5,514,561 ont par ailleurs décrit des substrats chromogènes de 8-Iactamases et leur utilisation pour détecter la présence de 8-Iactamases par absorption sur une membrane de nitrocellulose. Les 13-Iactamases peuvent être extracellulaires dans le cas des bactéries à Gram positif, ou être périplasmiques dans le cas des bactéries à Gram négatif. Pour les bactéries à Gram négatif, de manière à améliorer la sensibilité de ces tests sur disque ou bandelette, l'utilisateur est souvent obligé d'étaler la colonie en insistant (grattage), pour rendre l'enzyme accessible au substrat et ainsi observer un éventuel changement de coloration au niveau de la zone d'étalement. Cette étape peut introduire un biais lié à l'utilisateur qui réduit la fiabilité et la reproductibilité de la méthode, l'utilisateur ne grattant pas nécessairement les colonies de manière constante. En outre, lorsque l'on travaille sur des colonies colorées (par exemple des colonies isolées à partir d'un milieu chromogène), la coloration de la colonie, surtout si elle est rose ou rouge, peut rendre difficile la détection du changement de couleur induit par le clivage du substrat chromogène qui vire du jaune au rouge en cas de positivité. The compound HMRZ-86 ((7R) -7- [2- (aminothiazol-4-yl) - (z) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) ) -3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacetate, isomer E) has in particular been described in patent application EP1325923 and by Hanaki et al. (2004 Journal of Antimicrobial Chemotherapy 53: 888-889). In these two documents, it is proposed to use the chromogenic substrate on a disc, which is generally a white or pale cellulose disc. US Pat. Nos. 5,338,843, 5,583,217 and 5,514,561 have also described chromogenic substrates of 8-lactamases and their use for detecting the presence of 8-lactamases by absorption on a nitrocellulose membrane. The 13-lactamases can be extracellular in the case of Gram-positive bacteria, or periplasmic in the case of Gram-negative bacteria. For Gram-negative bacteria, in order to improve the sensitivity of these tests on disk or strip, the user is often obliged to spread the colony by insisting (scraping), to make the enzyme accessible to the substrate and thus observe a possible color change at the level of the spreading zone. This step can introduce a user-related bias that reduces the reliability and reproducibility of the method, since the user does not necessarily scratch the colonies steadily. In addition, when working on stained colonies (eg colonies isolated from a chromogenic medium), colony staining, especially if it is pink or red, may make it difficult to detect the color change. induced by the cleavage of the chromogenic substrate which turns from yellow to red in case of positivity.

La demande internationale WO 2009/051838 a décrit une méthode de détection de 13-lactamases dans un échantillon bactérien par mise en contact de l'échantillon bactérien avec des compositions comprenant une combinaison d'un substrat chromogène avec un ou plusieurs inhibiteur(s) de 8-lactamases, et détection de l'utilisation du substrat dans les compositions. La composition peut éventuellement comprendre, en outre, un agent de lyse et un agent additionnel améliorant la lyse bactérienne par l'agent de lyse. Les compositions utilisées pour la détection peuvent se présenter sous différentes formes : sous forme liquide, de boîte d'agar, de bandelette ou disque papier, de comprimé, sous formes sèches dans des tubes ou des puits. International application WO 2009/051838 has described a method for detecting 13-lactamases in a bacterial sample by contacting the bacterial sample with compositions comprising a combination of a chromogenic substrate with one or more inhibitor (s) of 8-lactamases, and detecting the use of the substrate in the compositions. The composition may optionally further comprise a lysing agent and an additional agent enhancing bacterial lysis by the lysing agent. The compositions used for the detection may be in various forms: in liquid form, agar box, strip or paper disk, tablet, in dry forms in tubes or wells.

Les inventeurs proposent un procédé de détection de BLSE, céphalosporinases et carbapénémases, incluant les métallo-13-lactamases, mettant en oeuvre un réactif liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène et éventuellement un agent de lyse de la paroi bactérienne. Ce procédé évite les problèmes associés aux tests précédents en format disque ou bandelette, en particulier le Cica-Beta-Test, tels que le biais lié à la mise en oeuvre d'une étape d'écrasement des colonies bactériennes sur le disque ou la bandelette et l'interférence possible des colonies bactériennes colorées avec la détection du virage de coloration induit par le clivage du substrat chromogène. De plus, ce procédé ne nécessite pas d'étape d'induction de la résistance, assurant ainsi un gain de temps considérable par rapport aux tests existants. The inventors propose a method for detecting ESBL, cephalosporinases and carbapenemases, including metallo-13-lactamases, using a liquid reagent comprising a chromogenic or fluorogenic substrate and optionally an agent for lysing the bacterial wall. This method avoids the problems associated with previous tests in disk or strip format, in particular the Cica-Beta-Test, such as the bias associated with the implementation of a step of crushing the bacterial colonies on the disk or the strip. and possible interference of the stained bacterial colonies with detection of the color shift induced by cleavage of the chromogenic substrate. In addition, this method does not require a step of inducing resistance, thus ensuring a considerable time saving compared to existing tests.

Procédé de détection d'une céphalosporinase, /3-lactamase à spectre étendu (BLSE) et carbapénémase L'invention concerne donc un procédé pour détecter la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu et des carbapénémases, ledit procédé comprenant les étapes consistant à: a) mettre en suspension des bactéries dans une composition liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter ; et b) détecter l'éventuelle libération du chromophore ou du fluorophore ; la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore à l'étape b) indiquant la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu et des carbapénémases.35 L'invention concerne également un procédé de détection in vitro de microorganismes résistants aux céphalosporines de Sème génération, mettant en oeuvre le procédé de détection de la présence d'enzyme défini ci-dessus. The invention thus relates to a method for detecting the presence of an enzyme selected from the group consisting of cephalosporinases, extended-spectrum R-lactamases, and a method for detecting a cephalosporinase, extended spectrum β-lactamase (ESBL) and carbapenemase. and carbapenemases, said method comprising the steps of: a) suspending bacteria in a liquid composition comprising a chromogenic or fluorogenic substrate capable of releasing a chromophore or a fluorophore after hydrolysis by the enzyme to be detected; and b) detecting the possible release of the chromophore or fluorophore; detecting the release of the chromophore or fluorophore in step b) indicating the presence of an enzyme selected from the group consisting of cephalosporinases, extended-spectrum R-lactamases and carbapenemases. in vitro detection of microorganisms resistant to cephalosporins of the 5th generation, implementing the method of detection of the presence of enzyme defined above.

Par "13-lactamase", on entend ici une enzyme qui hydrolyse les R-lactamines avec ouverture du noyau R-lactame et production de dérivés inactifs. Les [3-lactamases sont généralement sécrétées dans le milieu extérieur chez les bactéries à Gram positif, et dans l'espace périplasmique chez les bactéries à Gram négatif. Elles regroupent entre autres les céphalosporinases, les [3-lactamases à spectre étendu et les carbapénémases. Les [3- lactamases sont classées selon deux classifications principales: - la classification de Bush, élaborée en 1989 et réactualisée en 1995 puis en 2009, classe les [3-lactamases en fonction de leur substrat préférentiel parmi la pénicilline, l'oxacilline, la carbénicilline, la céfaloridine, le céfotaxime et l'imipénème, et en fonction de leur sensibilité à l'acide clavulanique, un inhibiteur des [3-lactamases; - la classification de Ambler, proposée en 1980, est basée sur la séquence protéique des [3-lactamases. Elle se compose de quatre classes d'enzymes : A, B, C et D. Les [3-lactamases des classes A, C et D comportent une sérine au niveau du site actif, qui forme une liaison covalente transitoire avec la R-lactamine, entraînant l'ouverture du cycle [3-lactame. Ces [3-lactamases sont aussi appelées sérine [3-lactamases. La classe B regroupe quant à elle des métallo-enzymes nécessitant un ion zinc pour hydrolyser le cycle R-lactame. Les 13-lactamases sont nombreuses et diversifiées, en fonction de leurs propriétés. Elles sont responsables de la résistance aux 13-lactamines comme les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames, les céphamycines, et les carbapénèmes. Elles inactivent ces antibiotiques par hydrolyse du noyau R-lactame. Parmi les [3-lactamases, la R-lactamase TEM-1 est très largement répandue dans les différentes espèces bactériennes. Elle hydrolyse très efficacement les pénicillines, mais pas les céphalosporines de troisième génération, et elle est sensible à l'inhibition par l'acide clavulanique. Les bactéries produisant des [3-lactamases de cette catégorie sont donc facilement traitées par des céphalosporines de Sème génération (C3G). En revanche, les BLSE, certaines céphalosporinases et carbapénémases, lorsqu'elles sont produites par les bactéries, les rendent résistantes aux céphalosporines de Sème génération (C3GR). Les séquences en acides aminés des [3-lactamases sont très proches les unes des autres au sein d'une même famille. Il a ainsi suffi de la substitution d'un petit nombre d'acides aminés pour permettre aux [3-lactamases de type TEM-1, initialement inactives, 6 d'hydrolyser les céphalosporines (13-lactamases de type BLSE par exemple), ou de devenir résistantes aux inhibiteurs. Le tableau 1 décrit les propriétés des différents types de R-lactamases, en particulier des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu et des 5 carbapénémases. By "13-lactamase" is meant herein an enzyme which hydrolyzes R-lactams with opening of the R-lactam ring and production of inactive derivatives. [3-Lactamases are generally secreted in the external environment in Gram-positive bacteria, and in the periplasmic space in Gram-negative bacteria. They include, among others, cephalosporinases, extended-spectrum [3-lactamases and carbapenemases. [3-lactamases are classified according to two main classifications: the Bush classification, developed in 1989 and updated in 1995 and again in 2009, classifies [3-lactamases according to their preferential substrate among penicillin, oxacillin, carbenicillin, cefaloridine, cefotaxime and imipenem, and depending on their sensitivity to clavulanic acid, a [3-lactamase inhibitor; - The Ambler classification, proposed in 1980, is based on the protein sequence of [3-lactamases. It consists of four classes of enzymes: A, B, C and D. [3-lactamases of Classes A, C and D contain a serine at the active site, which forms a transient covalent bond with R-lactam resulting in the opening of the β-lactam ring. These [3-lactamases are also called serine [3-lactamases. Class B groups metallo-enzymes requiring a zinc ion to hydrolyze the R-lactam ring. 13-lactamases are numerous and diverse, depending on their properties. They are responsible for resistance to 13-lactams such as penicillins, cephalosporins, monobactams, cephamycins, and carbapenems. They inactivate these antibiotics by hydrolysis of the R-lactam nucleus. Of the [3-lactamases, the R-lactamase TEM-1 is very widespread in the different bacterial species. It is highly effective in the hydrolysis of penicillins, but not in third-generation cephalosporins, and is sensitive to inhibition by clavulanic acid. Bacteria producing [3-lactamases of this class are thus easily treated with second-generation cephalosporins (C3G). In contrast, ESBLs, some cephalosporinases and carbapenemases, when produced by bacteria, make them resistant to second generation cephalosporins (C3GR). The amino acid sequences of [3-lactamases are very close to each other within the same family. It was thus sufficient to substitute a small number of amino acids to allow TEM-1 [3-lactamases, initially inactive, 6 to hydrolyze cephalosporins (ESBL-13-lactamases, for example), or to become resistant to inhibitors. Table 1 describes the properties of the different types of R-lactamases, in particular cephalosporinases, extended-spectrum R-lactamases and carbapenemases.

Tableau 1: Tableau synthétique et non exhaustif décrivant les propriétés des [3-lactamases majeures conférant (C3GR) ou non la résistance aux C3G. Exemples Inhibé par le Classe C3GR clavulanate par moléculaire (Ambler) R-lactamase à TEM-1, TEM-2, SHV-1 +++ A Non spectre large (pénicillinases) Famille OXA (OXA-1) + D Non R-lactamase à Familles TEM, SHV, CTX-M ++++ A Oui spectre étendu (BLSE) Famille OXA (OXA-11, -14,- + D Oui 15,-16,-17) céphalosporinases Chromosomiques 0 C Non ou AmpC Hyperproduites 0 C Oui Plasmidiques : ACC-1, famille CMY, DHA-1 carbapénémases Familles IMP, VIM (métallo- 0 B Oui R-lactamases) Famille KPC +++ A Oui Famille OXA (OXA 23-27, + D Oui OXA-40, OXA-48) 10 La libération du chromophore ou du fluorophore peut être détectée par un changement de coloration ou d'émission de fluorescence de la composition liquide dans laquelle les bactéries ont été mises en suspension. Les bactéries mises en suspension dans ladite composition liquide peuvent provenir d'une ou plusieurs colonies bactériennes. En particulier les colonies bactériennes 15 peuvent avoir été prélevées à partir d'un milieu gélosé, sélectif ou non, ensemencé directement avec un échantillon biologique, avec des bactéries préalablement cultivées issues d'un échantillon biologique ou avec toute souche bactérienne de collection. Dans le contexte de l'invention, un « échantillon biologique » fait référence à une substance d'origine biologique. L'échantillon biologique peut être un fluide (par exemple 20 sang, salive, pus, urine, sécrétions vaginales, sperme, selles, liquide céphalorachidien, liquide pleural, liquide amniotique), ou un tissu. Table 1: Synthetic and non-exhaustive table describing the properties of major [3-lactamases conferring (C3GR) or non-resistance to C3G. Examples Inhibited by Class C3GR Clavulanate by Molecular (Ambler) R-Lactamase at TEM-1, TEM-2, SHV-1 +++ A Non Wide Spectrum (Penicillinases) Family OXA (OXA-1) + D Non-R-Lactamase to Families TEM, SHV, CTX-M ++++ A Yes extended spectrum (ESBL) Family OXA (OXA-11, -14, - + D Yes 15, -16, -17) Chromosomal cephalosporinases 0 C No or AmpC Hyperproduced 0 C Yes Plasmids: ACC-1, CMY family, DHA-1 carbapenemases IMP families, VIM (metallo-B Yes R-lactamases) KPC family +++ A Yes Family OXA (OXA 23-27, + D Yes OXA- 40, OXA-48) The release of the chromophore or fluorophore can be detected by a change in staining or fluorescence emission of the liquid composition into which the bacteria have been suspended. The bacteria suspended in said liquid composition may come from one or more bacterial colonies. In particular bacterial colonies may have been taken from an agar medium, selective or not, inoculated directly with a biological sample, with previously cultured bacteria from a biological sample or with any bacterial strain of collection. In the context of the invention, a "biological sample" refers to a substance of biological origin. The biological sample may be a fluid (e.g. blood, saliva, pus, urine, vaginal secretions, sperm, stool, cerebrospinal fluid, pleural fluid, amniotic fluid), or tissue.

Les bactéries peuvent être des bactéries à Gram positif et/ou à Gram négatif, de préférence des bactéries à Gram négatif. Plus spécifiquement, il peut s'agir d'une bactérie sélectionnée dans le groupe constitué - des Enterobacteriaceae telles que les souches du genre Klebsiella, en particulier Klebsiella pneumoniae et Klebsiella oxytoca; les souches du genre Escherichia, en particulier Escherichia coli; les souches du genre Enterobacter, en particulier Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae et Enterobacter aerogenes; les souches du genre Citrobacter, en particulier Citrobacter freundii et Citrobacter koseri; les souches du genre Proteus, en particulier Proteus mirabilis, Proteus vulgaris et Proteus rettgeri; les souches du genre Serratia, en particulier Serratia marcescens; les souches du genre Salmonella; les souches du genre Providencia; les souches du genre Shigella; les souches du genre Kluyvera; Morganella morganii et Hafnia alvei; - d'autres microorganismes à Gram négatif tels que les espèces du genre Acinetobacter, en particulier Acinetobacter baumannii; les espèces du genre Pseudomonas, en particulier Pseudomonas aeruginosa et celles des genres Stenotrophomonas, Burkholderia, Haemophilus, Bordetella, Neisseria spp et Bacteroides fragilis. La détection d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases est indicatrice de la présence d'une bactérie résistante aux céphalosporines de Sème génération dans l'échantillon biologique dont sont issues les bactéries mises en suspension dans ladite composition liquide. Les différents aspects du procédé selon l'invention sont détaillés ci-dessous, toutes les caractéristiques divulguées pouvant être combinées les unes aux autres, sauf indication contraire. The bacteria may be Gram-positive and / or Gram-negative bacteria, preferably Gram-negative bacteria. More specifically, it may be a bacterium selected from the group consisting of - Enterobacteriaceae such as strains of the genus Klebsiella, in particular Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca; strains of the genus Escherichia, in particular Escherichia coli; strains of the genus Enterobacter, in particular Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae and Enterobacter aerogenes; strains of the genus Citrobacter, in particular Citrobacter freundii and Citrobacter koseri; strains of the genus Proteus, in particular Proteus mirabilis, Proteus vulgaris and Proteus rettgeri; strains of the genus Serratia, in particular Serratia marcescens; strains of the genus Salmonella; strains of the genus Providencia; strains of the genus Shigella; strains of the genus Kluyvera; Morganella morganii and Hafnia alvei; other gram-negative microorganisms such as the species of the genus Acinetobacter, in particular Acinetobacter baumannii; species of the genus Pseudomonas, in particular Pseudomonas aeruginosa and those of the genera Stenotrophomonas, Burkholderia, Haemophilus, Bordetella, Neisseria spp and Bacteroides fragilis. The detection of an enzyme selected from the group consisting of cephalosporinases, extended-spectrum R-lactamases (ESBL) and carbapenemases is indicative of the presence of a third generation cephalosporin-resistant bacterium in the biological sample from which bacteria suspended in said liquid composition. The various aspects of the method according to the invention are detailed below, all the disclosed features being combinable with each other unless otherwise indicated.

Agent de lyse bactérien Avantageusement, en particulier lorsque les bactéries sont des bactéries à Gram négatif, ladite composition liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter peut comprendre en outre au moins un agent de lyse bactérien. De préférence, l'agent de lyse bactérien lyse ou dérègle la fonction protectrice de la paroi bactérienne sans hydrolyser le substrat chromogène ou fluorogène. Ledit au moins un agent de lyse bactérien peut être sélectionné dans le groupe constitué d'un détergent, d'une enzyme qui dégrade la paroi bactérienne, d'un agent causant la formation de pores dans la paroi bactérienne ou la membrane cellulaire, et de combinaisons de ceux-ci. Un « détergent » est un composé chimique doté de propriétés tensioactives qui peut être en particulier un détergent zwitterionique, un détergent non-ionique, ou un détergent ionique, anionique ou cationique. Des exemples de détergent sont bien connus de l'homme du métier et comprennent en particulier : acide chénodésoxycholique; sel de sodium d'acide chénodésoxycholique; acide cholique; acide déhydrocholique; acide désoxycholique; ester de méthyle d'acide désoxycholique; digitonine; digitoxigenine; oxyde de N,N- diméthyldodécylamine; docusate de sodium; sel de sodium d'acide glycochénodésoxycholique; hydrate d'acide glycocholique; sel de sodium d'hydrate d'acide glycocholique; monohydrate d'acide glycodésoxycholique; sel de sodium d'acide glycodésoxycholique; sel disodium 3-sulfate d'acide glycolithocholique; ester d'éhyle d'acide glycolithocholique; sarkosyl; sel de sodium de N-lauroylsarcosine; N- lauroylsarcosine; dodécyl sulfate de lithium; solution delugol; Niaproof 4, Type 4 (i.e., sel de sodium de 7-éthyl-2-méthyl-4-undécyl sulfate); sel de sodium d'acide 1-octanesulfonique; sodium 1-butanesulfonate; sodium 1-décanesulfonate; sodium 1-dodécanesulfonate; sodium 1-heptanesulfonate anhydre; sodium 1-nonanesulfonate; monohydrate de sodium 1-propanesulfonate; sodium 2-bromoéthanesulfonate; hydrate de sodium cholate; sodium choléate; sodium désoxycholate; monohydrate de sodium désoxycholate; sodium dodécyl sulfate; sodium hexanesulfonate anhydre; sodium octyl sulfate; sodium pentanesulfonate anhydre; sodium taurocholate; sodium taurodésoxycholate; sel de sodium d'acide saurochénodésoxycholique; monohydrate de sel de sodium d'acide taurodésoxycholique; hydrate de sel de sodium d'acide taurodésoxycholique; sel de disodium d'acide 3-sulfate taurolithocholique; sel de sodium d'acide tauroursodésoxycholique; Trizma® dodécyl sulfate (i.e., tris(hydroxyméthyl)aminométhane lauryl sulfate); acide ursodésoxycholique, bromure d'alkyl triméthylammonium; chlorure de benzalkonium; chlorure de benzyl diméthylhexadécylammonium; chlorure de benzyl diméthyltétradécylammonium; bromure de benzyl dodécyldiméthylammonium; tétrachloroiodate de benzyl triméthylammonium; bromure de cétyl triméthylammonium; bromure de diméthyl dioctadécylammonium; bromure de dodécyl éthyldiméthylammonium; bromure de dodécyl triméthylammonium; bromure d'éthyl hexadécyldiméthylammonium; réactif T de Girard; bromure d'hexadécyl triméthylammonium; N,N',N'-polyoxyéthylène(10)--N-tallow-1,3-diaminopropane; bromure de thonzonium; bromure de triméthyl(tétradécyl)ammonium, BigCHAP (N,N-bis[3-(D-gluconamido)propyl]cholamide); bis(polyéthylène glycol bis[imidazoyl carbonyl]); alcools polyoxyéthylèniques, comme par exemple Brij® 30 (polyoxyéthylène(4) lauryl ether), Brij®35 (polyoxyéthylène(23) lauryl éther), Brij® 35P, Brij® 52 (polyoxyéthylène 2 cétyl éther), Brij® 56 (polyoxyéthylène 10 cétyl éther), Brij® 58 (polyoxyéthylène 20 cétyl éther), Brij® 72 (polyoxyéthylène 2 stéaryl éther), Brij® 76 (polyoxyéthylène 10 stéaryl éther), Brij® 78 (polyoxyéthylène 20 stéaryl éther), Brij® 78P, Brij® 92 (polyoxyéthylène 2 oléyl éther); Brij® 92V (polyoxyéthylène 2 oléyl éther), Brij® 96V, Brij® 97 (polyoxyéthylène 10 oléyl éther), Brij® 98 (polyoxyéthylène(20) oléyl éther), Brij® 58P, and Brij® 700 (polyoxyéthylène(100) stéaryl éther); Cremophor® EL (polyoxyéthylenglycéroltriricinoléat 35; huile de castor polyoxyl 35); monododécyl éther de décaéthylène glycol; mono héxadécyl éther de décaéthylène glycol; mono tridécyl éther de décaéthylene glycol; N- décanoyl-N-méthylglucamine; n-décyl alpha-D-glucopyranoside; décyl beta-D-maltopyranoside; digitonine; n-dodécanoyl-N-méthylglucamide; n-dodécyl alpha-D-maltoside; n-dodécyl beta-D-maltoside; monodécyl éther d'heptaéthylène glycol; monododécyl éther d'heptaéthylène glycol; monotétradécyl éther d'heptaéthylène glycol; n-hexadécyl beta-D-maltoside; monododécyl éther d'hexaéthylène glycol; monohexadécyl éther d'hexaéthylène glycol; monooctadécyl éther d'hexaéthylène glycol; monotétradécyl éther d'hexaéthylène glycol; Igepal® CA-630 (nonylphényl-polyéthylenglycol, (octylphénoxy)polyéthoxyéthanol, octylphényl-polyéthylène glycol); méthyl-6-O-(N- heptylcarbamoyl)-alpha-D-glucopyranoside; monododécyl éther de nonaéthylène glycol; N-nonanoyl-N-méthylglucamine; monodécyl éther d'octaéthylène glycol; monododécyl éther d'octaéthylene glycol; monohexadécyl éther d'octaéthylène glycol; monooctadécyl éther d'octaethylène glycol; monotétradécyl éther d'octaéthylène glycol; octyl-beta-D-glucopyranoside; monodécyl éther de pentaéthylène glycol; monododécyl éther de pentaéthylène glycol; monohexadécyl éther de pentaéthylène glycol; monohexyl éther de pentaéthylène glycol; monooctadécyl éther de pentaéthylène glycol; monooctyl éther de pentaéthylène glycol; diglycidyl éther de polyéthylène glycol; éther de polyéthylène glycol W-1; polyoxyéthylène 10 tridécyl éther; polyoxyéthylène 100 stéarate; polyoxyéthylène 20 isohexadécyl éther; polyoxyéthylène 20 oléyl éther; polyoxyéthylène 40 stéarate; polyoxyéthylène 50 stéarate; polyoxyéthylène 8 stéarate; polyoxyéthylène bis(imidazolyl carbonyl); polyoxyéthylène 25 propylène glycol stéarate; saponine d'écorce de quillaja; esters d'acide gras sorbitan, par exemple Span® 20 (sorbitan monolaurate), Span® 40 (sorbitane monopalmitate), Span® 60 (sorbitane monostéarate), Span® 65 (sorbitane tristéarate), Span® 80 (sorbitane monooléate), et Span® 85 (sorbitane trioléate); différents alkyl éthers de polyéthylène glycols, comme par exemple Tergitol® Type 15-S- 12, Tergitol® Type 15-S-30, Tergitol® Type 15-S-5, Tergitol® Type 15-S-7, Tergitol® Type 15-S-9, Tergitol® Type NP-10 (nonylphénol éthoxylate), Tergitol® Type NP-4, Tergitol® Type NP-40, Tergitol® Type NP-7, Tergitol® Type NP-9 (nonylphénol polyéthylène glycol éther), Tergitol® MIN FOAM lx, Tergitol® MIN FOAM 2x, Tergitol® Type TMN-10 (polyéthylène glycol triméthylnonyl éther), Tergitor Type TMN-6 (polyéthylène glycol triméthylnonyl éther), Triton@ 770, Triton@ CF-10 (benzyl- polyéthylène glycol tert-octylphényl éther), Triton@ CF-21, Triton@ CF-32, Triton@ DF-12, Triton@ DF-16, Triton@ GR-5M, Triton@ N-42, Triton@ N-57, Triton@ N-60, Triton@ N-101 (polyéthylène glycol nonyl phényl éther; polyoxyéthylène ramifié nonyl phényl éther), Triton@ QS-15, Triton@ QS-44, Triton@ RW-75 (polyéthylène glycol 260 mono(hexadécyl/octadécyl) éther et 1-octadécanol), Triton@ SP-135, Triton@ SP-190, Triton@ W-30, Triton@ X-15, Triton@ X-45 (polyéthylène glycol 4-tert-octylphényl éther; 4- (1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol), Triton@ X-100 (toctylphénoxypolyéthoxyéthanol; polyéthylène glycol tert-octylphényl éther; 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol), Triton@ X-102, Triton@ X-114 (polyéthylène glycol tert-octylphényl éther; (1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol), Triton@ X-165, Triton@ X-305, Triton@ X-405 (polyoxyéthylène(40) isooctylcyclohéxyl éther; polyéthylène glycol tert-octylphényl éther), Triton@ X-705-70, Triton@ X-151, Triton@ X-200, Triton@ X-207, Triton@ X-301, Triton@ XL-80N, and Triton@ XQS-20; tétradécyl-beta-D-maltoside; tetraéthylène glycol monodécyl éther; tetraethylene glycol monododécyl éther; tétraéthylène glycol monotétradécyl éther; triéthylène glycol monodécyl éther; triéthylène glycol monododécyl éther; triéthylène glycol monohexadécyl éther; triéthylène glycol monooctyl éther; triéthylène glycol monotétradécyl éther; esters d'acide gras polyoxyéthylène sorbitan, par exemple TWEEN@ 20 (polyéthylène glycol sorbitan monolaurate), TWEEN@ 20 (polyoxyéthylène (20) sorbitan monolaurate), TWEEN@ 21 (polyoxyéthylène (4) sorbitan monolaurate), TWEEN@ 40 (polyoxyéthylène (20) sorbitan monopalmitate), TWEEN@ 60 (polyéthylène glycol sorbitan monostearate; polyoxyéthylène (20) sorbitan monostéarate), TWEEN@ 61 (polyoxyéthylène (4) sorbitan monostéarate), TWEEN@ 65 (polyoxyéthyl ène (20) sorbitan tristéarate), TWEEN@ 80 (polyéthylène glycol sorbitan monooléate; polyoxyéthylène (20) sorbitan monooléate), TWEEN@ 81 (polyoxyéthylène (5) sorbitan monooléate), and TWEEN@ 85 (polyoxyéthylène (20) sorbitan trioléate); tyloxapol; n-undécyl beta-D-glucopyranoside, CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate); CHAPSO (3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate); N-dodécylmaltoside; Bacterial lysis agent Advantageously, in particular when the bacteria are gram-negative bacteria, said liquid composition comprising a chromogenic or fluorogenic substrate capable of releasing a chromophore or a fluorophore after hydrolysis by the enzyme to be detected may also comprise at least one bacterial lysing agent. Preferably, the bacterial lysing agent lyses or disrupts the protective function of the bacterial wall without hydrolyzing the chromogenic or fluorogenic substrate. The at least one bacterial lysing agent may be selected from the group consisting of a detergent, an enzyme that degrades the bacterial wall, an agent causing pore formation in the bacterial wall or cell membrane, and combinations of these. A "detergent" is a chemical compound with surfactant properties which may be in particular a zwitterionic detergent, a nonionic detergent, or an ionic, anionic or cationic detergent. Examples of detergents are well known to those skilled in the art and include in particular: chenodeoxycholic acid; sodium salt of chenodeoxycholic acid; cholic acid; dehydrocholic acid; deoxycholic acid; deoxycholic acid methyl ester; digitonin; digitoxigenin; N, N-dimethyldodecylamine oxide; sodium docusate; sodium salt of glycochenodeoxycholic acid; glycocholic acid hydrate; sodium salt of glycocholic acid hydrate; glycodeoxycholic acid monohydrate; sodium salt of glycodeoxycholic acid; disodium salt 3-sulphate glycolithocholic acid; glycolithocholic acid ethyl ester; sarkosyl; sodium salt of N-lauroylsarcosine; N-lauroylsarcosine; lithium dodecyl sulfate; delugol solution; Niaproof 4, Type 4 (i.e., sodium salt of 7-ethyl-2-methyl-4-undecyl sulfate); sodium salt of 1-octanesulfonic acid; sodium 1-butanesulfonate; sodium 1-decanesulfonate; sodium 1-dodecane sulfonate; sodium 1-heptanesulfonate anhydrous; sodium 1-nonanesulfonate; sodium monohydrate 1-propanesulfonate; sodium 2-bromoethanesulfonate; sodium cholate hydrate; sodium cholate; sodium deoxycholate; deoxycholate sodium monohydrate; sodium dodecyl sulfate; sodium hexanesulfonate anhydrous; sodium octyl sulfate; sodium pentanesulfonate anhydrous; sodium taurocholate; sodium taurodeoxycholate; sodium salt of saurochenodeoxycholic acid; sodium salt monohydrate of taurodeoxycholic acid; sodium salt hydrate of taurodeoxycholic acid; disodium salt of taurolithocholic acid 3-sulphate; sodium salt of tauroursodeoxycholic acid; Trizma® dodecyl sulfate (i.e., tris (hydroxymethyl) aminomethane lauryl sulfate); ursodeoxycholic acid, alkyl trimethylammonium bromide; benzalkonium chloride; benzyl dimethylhexadecylammonium chloride; benzyl dimethyltetradecylammonium chloride; benzyl dodecyldimethylammonium bromide; benzyltrimethylammonium tetrachloroiodate; cetyl trimethylammonium bromide; dimethyl dioctadecylammonium bromide; dodecyl ethyldimethylammonium bromide; dodecyl trimethylammonium bromide; ethyl hexadecyldimethylammonium bromide; Girard's T reagent; hexadecyl trimethylammonium bromide; N, N ', N'-polyoxyethylene (10) - N-tallow-1,3-diaminopropane; thonzonium bromide; trimethyl (tetradecyl) ammonium bromide, BigCHAP (N, N-bis [3- (D-gluconamido) propyl] cholamide); bis (polyethylene glycol bis [imidazoyl carbonyl]); polyoxyethylene alcohols, such as Brij® (polyoxyethylene (4) lauryl ether), Brij®35 (polyoxyethylene (23) lauryl ether), Brij® 35P, Brij® 52 (polyoxyethylene 2 cetyl ether), Brij® 56 (polyoxyethylene) cetyl ether), Brij® 58 (polyoxyethylene cetyl ether), Brij® 72 (polyoxyethylene 2 stearyl ether), Brij® 76 (polyoxyethylene 10 stearyl ether), Brij® 78 (polyoxyethylene 20 stearyl ether), Brij® 78P, Brij® 92 (polyoxyethylene 2 oleyl ether); Brij® 92V (polyoxyethylene 2 oleyl ether), Brij® 96V, Brij® 97 (polyoxyethylene 10 oleyl ether), Brij® 98 (polyoxyethylene (20) oleyl ether), Brij® 58P, and Brij® 700 (polyoxyethylene (100) stearyl ether); Cremophor® EL (polyoxyethylenglyceroltriricinoleate 35, polyoxyl 35 castor oil); monododecyl ether of decaethylene glycol; mono hexadecyl ether of decaethylene glycol; mono tridecyl ether of decaethylene glycol; N-decanoyl-N-methylglucamine; n-decyl alpha-D-glucopyranoside; decyl beta-D-maltopyranoside; digitonin; n-dodecanoyl-N-methylglucamide; n-dodecyl alpha-D-maltoside; n-dodecyl beta-D-maltoside; monodecyl ether of heptaethylene glycol; monododecyl ether of heptaethylene glycol; monotetradecyl ether of heptaethylene glycol; n-hexadecyl beta-D-maltoside; monododecyl ether hexaethylene glycol; monohexadecyl ether hexaethylene glycol; monooctadecyl ether hexaethylene glycol; monotetradecyl ether hexaethylene glycol; Igepal® CA-630 (nonylphenyl-polyethylenglycol, (octylphenoxy) polyethoxyethanol, octylphenyl-polyethylene glycol); methyl-6-O- (N-heptylcarbamoyl) -alpha-D-glucopyranoside; monododecyl ether of nonaethylene glycol; N-nonanoyl-N-methylglucamine; monodecyl ether of octaethylene glycol; monododecyl ether of octaethylene glycol; monohexadecyl ether of octaethylene glycol; monooctadecyl ether of octaethylene glycol; monotetradecyl ether of octaethylene glycol; octyl-beta-D-glucopyranoside; monodecyl ether pentaethylene glycol; monododecyl ether of pentaethylene glycol; monohexadecyl ether of pentaethylene glycol; monohexyl ether pentaethylene glycol; monooctadecyl ether pentaethylene glycol; monooctyl ether of pentaethylene glycol; polyethylene glycol diglycidyl ether; polyethylene glycol ether W-1; polyoxyethylene tridecyl ether; polyoxyethylene 100 stearate; polyoxyethylene isohexadecyl ether; polyoxyethylene oleyl ether; polyoxyethylene 40 stearate; polyoxyethylene 50 stearate; polyoxyethylene 8 stearate; polyoxyethylene bis (imidazolyl carbonyl); polyoxyethylene propylene glycol stearate; quillaja bark saponin; sorbitan fatty acid esters, for example Span® 20 (sorbitan monolaurate), Span® 40 (sorbitan monopalmitate), Span® 60 (sorbitan monostearate), Span® 65 (sorbitan tristearate), Span® 80 (sorbitan monooleate), and Span® 85 (sorbitan trioleate); different alkyl ethers of polyethylene glycols, for example Tergitol® Type 15-S-12, Tergitol® Type 15-S-30, Tergitol® Type 15-S-5, Tergitol® Type 15-S-7, Tergitol® Type 15 -S-9, Tergitol® NP-10 type (nonylphenol ethoxylate), Tergitol® NP-4 type, Tergitol® NP-40 type, Tergitol® NP-7 type, Tergitol® NP-9 type (nonylphenol polyethylene glycol ether), Tergitol® MIN FOAM lx, Tergitol® MIN FOAM 2x, Tergitol® Type TMN-10 (polyethylene glycol trimethylnonyl ether), Tergitor Type TMN-6 (polyethylene glycol trimethylnonyl ether), Triton @ 770, Triton @ CF-10 (benzyl-polyethylene tert-octylphenyl ether glycol), Triton® CF-21, Triton® CF-32, Triton® DF-12, Triton® DF-16, Triton® GR-5M, Triton® N-42, Triton® N-57, Triton @ N-60, Triton @ N-101 (polyethylene glycol nonyl phenyl ether, polyoxyethylene branched nonyl phenyl ether), Triton @ QS-15, Triton @ QS-44, Triton @ RW-75 (polyethylene glycol 260 mono (hexadecyl / octadecyl) ether and 1-octadecanol), Triton® SP-135, Triton® SP-190, Triton® W-30, Triton® X-15, Triton® X-45 (polyethylene glycol 4-tert-octylphenyl ether; 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenylpolyethylene glycol), Triton @ X-100 (toctylphenoxypolyethoxyethanol, polyethylene glycol tert-octylphenyl ether, 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenylpolyethylene) glycol), Triton® X-102, Triton® X-114 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether, (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenylpolyethylene glycol), Triton® X-165, Triton® X-305 , Triton @ X-405 (polyoxyethylene (40) isooctylcyclohexyl ether, polyethylene glycol tert-octylphenyl ether), Triton @ X-705-70, Triton @ X-151, Triton @ X-200, Triton @ X-207, Triton @ X-301, Triton® XL-80N, and Triton® XQS-20; tetradecyl-beta-D-maltoside; tetraethylene glycol monodecyl ether; tetraethylene glycol monododecyl ether; tetraethylene glycol monotetradecyl ether; triethylene glycol monodecyl ether; triethylene glycol monododecyl ether; triethylene glycol monohexadecyl ether; triethylene glycol monooctyl ether; triethylene glycol monotetradecyl ether; polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, for example TWEEN® 20 (polyethylene glycol sorbitan monolaurate), TWEEN® 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), TWEEN® 21 (polyoxyethylene (4) sorbitan monolaurate), TWEEN® 40 (polyoxyethylene ( 20) sorbitan monopalmitate), TWEEN® 60 (polyethylene glycol sorbitan monostearate, polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate), TWEEN® 61 (polyoxyethylene (4) sorbitan monostearate), TWEEN® 65 (polyoxyethylene (20) sorbitan tristearate), TWEEN® 80 (polyethylene glycol sorbitan monooleate, polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate), TWEEN® 81 (polyoxyethylene (5) sorbitan monooleate), and TWEEN® 85 (polyoxyethylene (20) sorbitan trioleate); tyloxapol; n-undecyl beta-D-glucopyranoside, CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate); CHAPSO (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate); N-dodecyl;

alpha-dodécyl-maltoside; beta-dodécyl-maltoside; le sel interne de 3- (décyldiméthylammonio)propanesulfonate (SB3-10 le sel interne de 3- (décyldiméthylammonio)propanesulfonate (SB3-10), le sel interne de 3- (dodecyldiméthylammonio)propanesulfonate (SB3-12), le sel interne de 3-(N,N- diméthylmyristylammonio)propanesulfonate (SB3-14), le sel interne de 3-(N,N-diméthylpalmitylammonio)propanesulfonate (SB3-16), le sel interne de 3-(N,N-diméthyloctadécylammonio)propanesulfonate (SB3-18); MEGA-8; MEGA-9; MEGA-10; méthylheptylcarbamoyl glucopyranoside; N-nonanoyl N-méthylglucamine; octylglucoside; octyl-glucopyranoside; octyl-thioglucopyranoside; octyl-beta-thioglucopyranoside; 3-[N,N-diméthyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate ou amidosulfobétaine-14 (ASB-14); amidosulfobétaine-16 (ASB-16) ; EMPIGEN® BB ; Cymal-1, Cymal-2, Cymal-5, Cymal-6, c7bzo (ou (3-(4-heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl) dimethylammoniopropanesulfonate) et acide désoxycholatique. alpha-dodecyl-maltoside; beta-dodecyl-maltoside; the inner salt of 3- (decyldimethylammonio) propanesulfonate (SB3-10 the inner salt of 3- (decyldimethylammonio) propanesulfonate (SB3-10), the inner salt of 3- (dodecyldimethylammonio) propanesulfonate (SB3-12), the inner salt of 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate (SB3-14), the inner salt of 3- (N, N-dimethylpalmitylammonio) propanesulfonate (SB3-16), the inner salt of 3- (N, N-dimethyloctadecylammonio) propanesulfonate (SB3-18), MEGA-8, MEGA-9, MEGA-10, methylheptylcarbamoyl glucopyranoside, N-nonanoyl N-methylglucamine, octylglucoside, octyl-glucopyranoside, octyl-thioglucopyranoside, octyl-beta-thioglucopyranoside, 3- [N, N] dimethyl (3-myristoylaminopropyl) ammonio] propanesulfonate or amidosulfobetaine-14 (ASB-14), amidosulfobetaine-16 (ASB-16), EMPIGEN® BB, Cymal-1, Cymal-2, Cymal-5, Cymal-6, c7bzo (or (3- (4-heptyl) phenyl-3-hydroxypropyl) dimethylammonopropanesulfonate) and deoxycholic acid.

De préférence, dans le procédé selon l'invention, ladite composition liquide comprend au moins un détergent sélectionné dans le groupe constitué du CHAPS, du Tween 20, du Tween 80, du c7bzo, de l'octylglucoside, de l'octylthioglucopyranoside, de l'ASB-14, du SB3-10, du sodium dodécyl sulfate, de la digitonine, du sarkosyl, du tergitol, ou de combinaisons de ceux-ci. Preferably, in the process according to the invention, said liquid composition comprises at least one detergent selected from the group consisting of CHAPS, Tween 20, Tween 80, C7bzo, octylglucoside, octylthioglucopyranoside, ASB-14, SB3-10, sodium dodecyl sulfate, digitonin, sarkosyl, tergitol, or combinations thereof.

L'agent de lyse bactérien peut également être une enzyme qui dégrade la paroi bactérienne telle que le lysozyme, la lysostaphine, l'achromonopeptidase, la mutanolysine, la labiase, la chitinase, la glucanase, la glucosaminidase, la muramidase et la transglycosylase lytique, l'amidase et l'endopeptidase. L'agent de lyse bactérien peut être un agent causant la formation de pores dans la paroi bactérienne ou la membrane cellulaire comme par exemple une polymyxine, en particulier une polymyxine A, B, C, D, E (ou colistine), F, K, M, P, S ou T. Les polymyxines sont des antibiotiques peptidiques cycliques qui agissent comme des détergents cationiques et s'insèrent parmi les phospholipides de la paroi bactérienne. Il peut s'agir également de R-Iactames, de glycopeptides, de fosfomycine, de cyclosérine, de bacitracine, d'acide fusidique et de néomycine. De préférence, ledit au moins un agent de lyse de la paroi bactérienne est sélectionné dans le groupe constitué du CHAPS et de la polymyxine B, ou d'une combinaison de ceux-ci. De manière préférée, l'agent de lyse est utilisé en combinaison avec un moyen de lyse mécanique, tel que des billes ou des ultrasons. Alternativement, l'agent de lyse est remplacé par un tel moyen de lyse mécanique. The bacterial lysing agent may also be an enzyme that degrades the bacterial wall such as lysozyme, lysostaphin, achromonopeptidase, mutanolysine, labase, chitinase, glucanase, glucosaminidase, muramidase and lytic transglycosylase. amidase and endopeptidase. The bacterial lysing agent may be an agent causing the formation of pores in the bacterial wall or the cell membrane, for example a polymyxin, in particular a polymyxin A, B, C, D, E (or colistin), F, K , M, P, S or T. Polymyxins are cyclic peptide antibiotics that act as cationic detergents and fit among the phospholipids of the bacterial wall. It may also be R-lactams, glycopeptides, fosfomycin, cycloserine, bacitracin, fusidic acid and neomycin. Preferably, said at least one lysing agent of the bacterial wall is selected from the group consisting of CHAPS and polymyxin B, or a combination thereof. Preferably, the lysing agent is used in combination with a mechanical lysis means, such as beads or ultrasound. Alternatively, the lysing agent is replaced by such mechanical lysis means.

Substrat chromogène ou fluorogène Dans le contexte de l'invention, l'expression « substrat chromogène » fait référence à une molécule pouvant être clivée ou modifiée par une enzyme et qui comprend ou est couplé à un chromophore. Chromogenic or Fluorogenic Substrate In the context of the invention, the term "chromogenic substrate" refers to a molecule that can be cleaved or modified by an enzyme and that comprises or is coupled to a chromophore.

Par « chromophore », on entend ici un groupement d'atomes au sein d'une molécule qui est responsable des propriétés d'absorption et/ou d'émission de lumière dans le domaine de l'ultraviolet, du visible ou de l'infrarouge de cette molécule. Ces propriétés résultent d'une capacité à absorber l'énergie de photons dans une gamme du spectre visible tandis que les autres longueurs d'onde sont transmises ou diffusées. Le substrat chromogène selon l'invention peut être coloré ou incolore. Ce substrat chromogène libère son chromophore sous l'action d'une enzyme spécifique. Dans le contexte de l'invention, l'expression « substrat fluorogène » fait référence à une molécule pouvant être clivée ou modifiée par une enzyme et qui comprend ou est couplé à un fluorophore. Ce substrat fluorogène libère son fluorophore sous l'action d'une enzyme spécifique. Par « fluorophore », on entend ici un groupement d'atomes au sein d'une molécule qui est responsable de la capacité de cette molécule à émettre de la lumière de fluorescence après excitation. Ce sont généralement des substances composées de plusieurs noyaux aromatiques conjugués ou encore des molécules planes et cycliques qui possèdent une ou plusieurs liaisons 17. Des chromophores ou fluorophores sont bien connus de l'homme du métier et couramment utilisés en laboratoire depuis de nombreuses années (voir par exemple Vinazzer, 1975 Haemostasis. 4:101-9 et Orenga et al., 2009 J Microbiol Methods. 79 :139-155). Le chromophore peut par exemple correspondre à un dérivé de l'indoxyle (par exemple le 3-indolyl-R, le 5-bromo-3-indolyl-R, le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl, le 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl ou le 6-chloro-3-indoxyl), à un dérivé de l'indol (par exemple le 7-amido-5-bromoindole), au nitrophénol ou l'un de ses dérivés (par exemple le paranitrophénol, l'orthonitrophénol ou l'orthofluorophénol), au chlorophénol ou l'un de ses dérivés (par exemple le 4-amino-2,6-dichlorophénol), au naphthol ou l'un de ses dérivés (par exemple le 1-naphthol ou le 2-naphtylamide), au 5-(4-hydroxy-3- methoxyphenylmethylene)-2-thioxothiazolidin-4-one-3-ethanoate, la 3,4- cyclohexenoesculetine, la 2-alizarine ou la 7-amido-1-pentyl-phenoxazin-3-one. By "chromophore" is meant here a group of atoms within a molecule which is responsible for the absorption and / or light emission properties in the ultraviolet, visible or infrared range. of this molecule. These properties result from an ability to absorb photon energy in a range of the visible spectrum while other wavelengths are transmitted or scattered. The chromogenic substrate according to the invention may be colored or colorless. This chromogenic substrate releases its chromophore under the action of a specific enzyme. In the context of the invention, the term "fluorogenic substrate" refers to a molecule which can be cleaved or modified by an enzyme and which comprises or is coupled to a fluorophore. This fluorogenic substrate releases its fluorophore under the action of a specific enzyme. By "fluorophore" is meant here a group of atoms within a molecule that is responsible for the ability of this molecule to emit fluorescence light after excitation. These are generally substances composed of several conjugated aromatic nuclei or even planar and cyclic molecules which have one or more bonds 17. Chromophores or fluorophores are well known to those skilled in the art and have been commonly used in the laboratory for many years (see for example Vinazzer, 1975 Haemostasis, 4: 101-9 and Orenga et al., 2009 J Microbiol Methods, 79: 139-155). The chromophore may, for example, correspond to a derivative of indoxyl (for example 3-indolyl-R, 5-bromo-3-indolyl-R, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5- bromo-6-chloro-3-indoxyl or 6-chloro-3-indoxyl), an indol derivative (for example 7-amido-5-bromoindole), nitrophenol or a derivative thereof ( for example, paranitrophenol, orthonitrophenol or orthofluorophenol), chlorophenol or a derivative thereof (for example 4-amino-2,6-dichlorophenol), naphthol or a derivative thereof (for example 1-naphthol or 2-naphthylamide), 5- (4-hydroxy-3-methoxyphenylmethylene) -2-thioxothiazolidin-4-one-3-ethanoate, 3,4-cyclohexenoesculetin, 2-alizarin or 7-naphthylamide. amido-1-pentyl-phenoxazin-3-one.

Le fluorophore peut par exemple correspondre à la coumarine ou l'un de ses dérivés (par exemple l'hydroxycoumarine, l'aminocoumarine, la 7-amido-4-méthylcoumarine, la méthoxycoumarine, l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique), la phycoérythrine, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés (par exemple la 5-dodecanoylaminofluorescéine), la 4-méthyl-umbelliféryle, la résofurine, la rhodamine, l'allophycocyanine, la 2-(5'-chloro-2'-hydroxyphényl)-6-chloro-4-(3H)-quinazolinone. The fluorophore may, for example, correspond to coumarin or one of its derivatives (for example hydroxycoumarin, aminocoumarin, 7-amido-4-methylcoumarin, methoxycoumarin, 7-nitrocoumarin-3-carboxylic acid). phycoerythrin, fluorescein or a derivative thereof (eg 5-dodecanoylaminofluorescein), 4-methylumbelliferyl, resofurin, rhodamine, allophycocyanin, 2- (5'-chloro-2 ') hydroxyphenyl) -6-chloro-4- (3H) -quinazolinone.

Dans le contexte de l'invention, l'expression « substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter » fait référence à un substrat chromogène ou fluorogène tel que défini ci-dessus qui, lorsqu'il est mis en contact avec l'enzyme dont il est spécifique, libère le chromophore ou fluorophore qu'il comprend ou avec lequel il est couplé. La libération du chromophore ou fluorophore peut être due directement ou indirectement à l'hydrolyse du substrat par l'enzyme à détecter. Ainsi, l'enzyme à détecter peut hydrolyser la liaison couplant le substrat au chromophore ou fluorophore, libérant ainsi le chromophore ou fluorophore du substrat. Cette action directe de l'enzyme est typiquement observée avec les substrats couplés à un chromophore ou fluorophore. L'enzyme à détecter peut également hydrolyser un domaine du substrat n'impliquant pas le chromophore ou fluorophore. De préférence, la libération du chromophore ou du fluorophore entraîne un changement de couleur du substrat chromogène ou d'émission de fluorescence du substrat fluorogène. Par conséquent, la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore peut en particulier être mise en oeuvre en observant le changement de couleur du substrat chromogène ou d'émission de fluorescence du substrat fluorogène. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le substrat chromogène ou fluorogène comprend un noyau R-lactame. In the context of the invention, the expression "chromogenic or fluorogenic substrate capable of releasing a chromophore or fluorophore after hydrolysis by the enzyme to be detected" refers to a chromogenic or fluorogenic substrate as defined above which, when it is brought into contact with the enzyme of which it is specific, releases the chromophore or fluorophore that it comprises or with which it is coupled. The release of the chromophore or fluorophore may be directly or indirectly due to the hydrolysis of the substrate by the enzyme to be detected. Thus, the enzyme to be detected can hydrolyze the bond coupling the substrate to the chromophore or fluorophore, thereby releasing the chromophore or fluorophore from the substrate. This direct action of the enzyme is typically observed with substrates coupled to a chromophore or fluorophore. The enzyme to be detected may also hydrolyze a substrate domain that does not involve the chromophore or fluorophore. Preferably, the release of the chromophore or fluorophore causes a color change of the chromogenic substrate or fluorescence emission of the fluorogenic substrate. Therefore, the detection of the release of the chromophore or fluorophore can in particular be carried out by observing the color change of the chromogenic substrate or fluorescence emission of the fluorogenic substrate. In a preferred embodiment of the invention, the chromogenic or fluorogenic substrate comprises an R-lactam nucleus.

Par « noyau R-lactame », on entend ici une structure cyclique hétéroatomique, consistant en trois atomes de carbone et un d'azote. De préférence, le noyau R-lactame du substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est hydrolysé par l'enzyme à détecter. De manière davantage préférée, le substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est un dérivé de R-lactamine. Par « R-lactamine », on entend ici un antibiotique contenant un noyau 13-lactame dans sa structure moléculaire. Comme il est bien connu de l'homme du métier, les [3-lactamines englobent par exemple les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes. By "R-lactam ring" is meant here a heteroatomic ring structure consisting of three carbon atoms and one nitrogen. Preferably, the R-lactam nucleus of the chromogenic or fluorogenic substrate according to the invention is hydrolysed by the enzyme to be detected. More preferably, the chromogenic or fluorogenic substrate according to the invention is an R-lactam derivative. By "R-lactam" is meant herein an antibiotic containing a 13-lactam ring in its molecular structure. As is well known to those skilled in the art, β-lactams include, for example, penicillin derivatives, cephalosporins, monobactams and carbapenems.

De manière encore préférée, le substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est un dérivé de céphalosporine. Par « dérivé de céphalosporine », on entend ici une molécule composée, d'une part, d'un groupement issu d'une céphalosporine, ou d'une partie de céphalosporine, capable d'être hydrolysé par une R-lactamase, et, d'autre part, d'un groupement chromophore ou un fluorophore. De préférence, le dérivé de céphalosporine selon l'invention est une céphalosporine, ou une partie de céphalosporine, modifiée de manière à contenir ou à être couplée à un chromophore. Dans le contexte de l'invention, le terme « céphalosporine » fait référence à une [3-lactamine constituée d'un noyau R-lactame et d'un noyau dihydrothiazine. On distingue à l'heure actuelle quatre générations de céphalosporines selon leurs spectres d'action. Cette classification est bien connue de l'homme du métier (voir par exemple Thompson (1987) Mayo. Clin. Proc. 62:821-34; Gustaferro et Steckelberg (1991) Mayo. Clin. Proc. 66:1064-73 et Barber et al. (2004) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 88:179-215). Des exemples de céphalosporines de 1 ère génération sont bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier la céfazoline, la céfalotine, la céfapirine, la céfaloridine, la céfalexine Keforal®, la céfradine Zeefra®, et la céfadroxil Oracéfal®. Des exemples de céphalosporines de 2ème génération sont également bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier la céfamandole, la céfuroxime Zinnat®, la céfonicide, la céforanide, la céfatrizine, le céfotiam, le cefprozil, le loracarbef, le céfotétan, la céfoxitine et le céfaclor Alfatil®. Des exemples de céphalosporines de Sème génération sont bien connus de l'homme du métier et incluent typiquement le céfotiam hexetil Texodil®, la ceftriaxone Rhocéphine®, la céfotaxime Claforan®, la ceftizoxime, la ceftazidime, la céfopérazone, la cefsulodin, le ceftibuten, la céfixime Oroken®, le céfatamet, la latamoxef et la cefpodoxime proxetil Orelox®. Des exemples de céphalosporines de 4ème génération sont bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier la céfépime et la cefpirome. De manière préférée entre toutes, le substrat chromogène ou fluorogène selon l'invention est un dérivé de céphalosporine de Sème génération. Par « dérivé de céphalosporine de Sème génération », on entend ici une molécule composée d'une partie de céphalosporine capable d'être hydrolysée par les mêmes enzymes que les céphalosporines de Sème génération. De préférence, un dérivé de céphalosporine de Sème génération selon l'invention est une céphalosporine de Sème génération, ou une partie de céphalosporine de Sème génération, modifiée de manière à contenir ou à être couplée à un chromophore ou un fluorophore. De manière davantage préférée, le dérivé de céphalosporine de Sème génération selon l'invention est une céphalosporine de Sème génération, ou une partie de céphalosporine de Sème génération, modifiée de manière à contenir ou à être couplée à un chromophore. La céphalosporine de troisième génération à partir de laquelle le substrat chromogène selon l'invention est produit peut être sélectionnée dans le groupe constitué des composés dont les dénominations anglaises sont les suivantes : Cefcapene (Référence CAS: 135889-00-8), Cefcapene Pivoxil (Référence CAS: 105889-45-0), Cefcapene Pivoxil Hydrochloride (Référence CAS: 147816-23-7), Cefcapene Pivoxil Hydrochloride Monohydrate (Référence CAS: 147816-24-8), Cefdaloxime (Référence CAS: 80195-36-4), Cefdaloxime Pivoxil, Cefdinir (Référence CAS: 91832-40-5), Cefditoren (Référence CAS : 104146-53-4), Cefditoren Sodium (Référence CAS: 104146-53-4), Cefditoren Pivoxil (Référence CAS: 117467-28-4), Cefetamet Pivoxil Hydrochloride, Cefetamet Pivoxyl (Référence CAS: 65243-33-6), Cefetamet (Référence CAS: 65052-63-3), Cefixime (Référence CAS: 79350-37-1), Cefixime Trihydrate, Cefmenoxime Hydrochloride (Référence CAS: 75738-58-8), Cefmenoxime (Référence CAS: 65085-01-0), Cefodizime Sodium (Référence CAS: 86329-79-5), Cefodizime (Référence CAS: 69739-16-8), Cefoperazone Sodium (Référence CAS: 62893-20-3), Cefoperazone A, Cefoperazone (Référence CAS: 62893-19-0), Cefotaxime Sodium (Référence CAS: 64485-93-4), Cefotaxime S-oxide, Cefotaxime (Référence CAS: 63527-52-6), Benzathine Cefotaxime, Desacetylcefotaxime, Cefpimizole Sodium, Cefpimizole, Cefpiramide Sodium (Référence CAS: 74849-93-7), Cefpiramide (Référence CAS: 70797-11-4), Cefpodoxime Proxetil (Référence CAS: 87239-81-4), Cefpodoxime (Référence CAS: 80210-62-4), Cefpodoxime Hydrate, Cefsulodin Sodium, Cefsulodin, Ceftazidime Pentahydrate (Référence CAS: 78439-06-2), Ceftazidime (Référence CAS: 72558-82-8), Cefteram, Cefteram Pivaloyloxymethyl Ester, Ceftibuten, Trans-ceftibuten, Ceftiofur, Ceftiofur Sodium (Référence CAS: 80370-57-6), Ceftiofur Hydrochloride, Ceftiofur Sodium, Desfuroylceftiofur, Ceftiolene, Ceftizoxime Alapivoxil, Ceftizoxime Sodium, Ceftizoxime, Ceftriaxone Disodium (Référence CAS: 74578-69-1), Ceftriaxone Sodium, Ceftriaxone (Référence CAS: 73384-59-5) et les sels de ces composés. La structure et la dénomination IUPAC de ces composés peut par exemple être trouvée sur le site chemicalland2l.com. Dans un mode de réalisation particulier, la céphalosporine de Sème génération est choisie parmi le ceftriaxone (Rhocéphine®), le céfotaxime (Claforan®), le ceftazidime (Fortum®), le céfixime (Oroken®), le cefpodoxime proxetil (Orelox®), le céfotiam ou le céfotiam hexetil (Takétiam®), le Cefpirome (Cefrom®), le Céfépime (Axépim®), le Cefsulodine (Pyocéfal®), le céfatamet, le ceftizoxime, le céfopérazone, le ceftibuten et les sels de ces composés. More preferably, the chromogenic or fluorogenic substrate according to the invention is a cephalosporin derivative. By "cephalosporin derivative" is meant here a molecule composed, on the one hand, of a group derived from a cephalosporin, or a portion of cephalosporin, capable of being hydrolysed by an R-lactamase, and on the other hand, a chromophore group or a fluorophore. Preferably, the cephalosporin derivative according to the invention is a cephalosporin, or part of cephalosporin, modified to contain or to be coupled to a chromophore. In the context of the invention, the term "cephalosporin" refers to a β-lactam consisting of an R-lactam nucleus and a dihydrothiazine nucleus. There are currently four generations of cephalosporins according to their spectra of action. This classification is well known to those skilled in the art (see, for example, Thompson (1987) Mayo, Clin., Proc 62: 821-34, Gustaferro and Steckelberg (1991) Mayo Clin., Proc 66: 1064-73, and Barber et al (2004) Adv Biochem Eng Biotechnol 88: 179-215). Examples of 1st generation cephalosporins are well known to those skilled in the art and include in particular cefazolin, cefalotin, cefapirine, cefaloridine, cefalexin Keforal®, cefradine Zeefra®, and cefadroxil Oracefal®. Examples of 2nd generation cephalosporins are also well known to those skilled in the art and include in particular cefamandole, cefuroxime Zinnat®, cefonicide, ceforanide, cefatrizine, cefotiam, cefprozil, loracarbef, cefotetan, cefoxitin and cefaclor Alfatil®. Examples of 3rd generation cephalosporins are well known to those skilled in the art and typically include cefoxith hexetil Texodil®, ceftriaxone Rhoephine®, cefotaxime Claforan®, ceftizoxime, ceftazidime, cefoperazone, cefsulodin, ceftibuten, cefixime Oroken®, cefatamet, latamoxef and cefpodoxime proxetil Orelox®. Examples of 4th generation cephalosporins are well known to those skilled in the art and include in particular cefepime and cefpirome. Most preferably, the chromogenic or fluorogenic substrate according to the invention is a 5th generation cephalosporin derivative. By "5th generation cephalosporin derivative" is meant here a molecule composed of a portion of cephalosporin capable of being hydrolyzed by the same enzymes as the cephalosporins of the 5th generation. Preferably, a cephalosporin derivative of the fifth generation according to the invention is a 3rd generation cephalosporin, or part of a cephalosporin of the 5th generation, modified so as to contain or be coupled to a chromophore or a fluorophore. More preferably, the cephalosporin derivative of the fifth generation of the invention is a third generation cephalosporin, or part of a cephalosporin of the fifth generation, modified to contain or to be coupled to a chromophore. The third-generation cephalosporin from which the chromogenic substrate according to the invention is produced can be selected from the group consisting of compounds whose English names are the following: Cefcapene (CAS reference: 135889-00-8), Cefcapene Pivoxil ( CAS reference: 105889-45-0), Cefcapene Pivoxil Hydrochloride (CAS reference: 147816-23-7), Cefcapene Pivoxil Hydrochloride Monohydrate (CAS reference: 147816-24-8), Cefdaloxime (CAS reference: 80195-36-4) , Cefdaloxime Pivoxil, Cefdinir (CAS reference: 91832-40-5), Cefditoren (CAS reference: 104146-53-4), Cefditoren Sodium (CAS reference: 104146-53-4), Cefditoren Pivoxil (CAS reference: 117467-28 -4), Cefetamet Pivoxil Hydrochloride, Cefetamet Pivoxyl (CAS reference: 65243-33-6), Cefetamet (CAS reference: 65052-63-3), Cefixime (CAS reference: 79350-37-1), Cefixime Trihydrate, Cefmenoxime Hydrochloride (CAS reference: 75738-58-8), Cefmenoxime (CAS Reference: 65085 -01-0), Cefodizime Sodium (CAS reference: 86329-79-5), Cefodizime (CAS reference: 69739-16-8), Cefoperazone Sodium (CAS reference: 62893-20-3), Cefoperazone A, Cefoperazone (Reference CAS: 62893-19-0), Cefotaxime Sodium (CAS Reference: 64485-93-4), Cefotaxime S-oxide, Cefotaxime (CAS Reference: 63527-52-6), Benzathine Cefotaxime, Desacetylcefotaxime, Cefpimizole Sodium, Cefpimizole, Cefpiramide Sodium (CAS reference: 74849-93-7), Cefpiramide (CAS number: 70797-11-4), Cefpodoxime Proxetil (CAS number: 87239-81-4), Cefpodoxime (CAS number: 80210-62-4), Cefpodoxime Hydrate, Cefsulodin Sodium, Cefsulodin, Ceftazidime Pentahydrate (CAS reference: 78439-06-2), Ceftazidime (CAS reference: 72558-82-8), Cefteram, Cefteram Pivaloyloxymethyl Ester, Ceftibuten, Trans-Ceftibuten, Ceftiofur, Ceftiofur Sodium (Reference CAS: 80370-57-6), Ceftiofur Hydrochloride, Ceftiofur Sodium, Desfuroylceftiofur, Ceftiolene, Ceftizoxime Alapivoxil, Ceftizoxime Sodium, Ceftizoxime , Ceftriaxone Disodium (CAS No: 74578-69-1), Ceftriaxone Sodium, Ceftriaxone (CAS Reference: 73384-59-5) and the salts of these compounds. The structure and the IUPAC denomination of these compounds can for example be found on the site chemicalland2l.com. In a particular embodiment, the cephalosporin of the fifth generation is selected from ceftriaxone (Rhoephine®), cefotaxime (Claforan®), ceftazidime (Fortum®), cefixime (Oroken®), cefpodoxime proxetil (Orelox®) Cefpirome (Cefrom®), cefepime (Axépim®), Cefsulodine (Pyocéfal®), cefatamet, ceftizoxime, cefoperazone, ceftibuten and the salts of these compounds, cefotiam or cefotiam hexetil (Taketimam®) .

Dans un mode de réalisation de l'invention, le dérivé de céphalosporine de Sème génération contenant ou étant couplé à un chromophore est l'un des composés décrits dans la demande de brevet européen EP1325923. Ces composés sont représentés par la formule (I) : O ' CùCùNH X N r ÔR3 ON CH=CH où : COOH (I) R, et R2 peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement nitro ou cyano ; R3 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C6i éventuellement substitué par un groupement carboxyle; R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement amino ; X représente ùS- ou ùSO- ; et R, et R2 ne peuvent pas simultanément représenter un atome d'hydrogène, ou un sel de ceux-ci. Ainsi, le dérivé de céphalosporine de Sème génération contenant ou étant couplé à un chromophore peut par exemple être le composé : - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,4-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,6-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1-methylethoxy-imino)acetamido]-3- (2,4-dicyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(1-carboxy-l-methylethoxyimino)-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2, 4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 1 -oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-( 1 -carboxy-l-methylethoxyimino)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(4-nitrostyryl)-3- cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,6-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-am inothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,6- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(4- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dicyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(4- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(2- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-carboxymethoxyimino-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3- cephem-4-carboxylique ; ou - acide 1-oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2, 4-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique , ou un sel de ceux-ci, tels que décrits dans la demande de brevet européen n° EP1325923. In one embodiment of the invention, the 5th generation cephalosporin derivative containing or being coupled to a chromophore is one of the compounds described in European Patent Application EP1325923. These compounds are represented by the formula (I): ## STR5 ## where: COOH (I) R, and R 2 may be identical or different and each represents a hydrogen atom or a nitro or cyano group ; R3 represents a linear or branched C1-C6i alkyl group optionally substituted with a carboxyl group; R4 represents a hydrogen atom or an amino group; X represents ùS- or ùSO-; and R 1 and R 2 can not simultaneously represent a hydrogen atom, or a salt thereof. Thus, the 5th generation cephalosporin derivative containing or being coupled to a chromophore may for example be the compound: 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxy) acid; -imino) acetamido] -3- (2,4-dinitro-styryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-Aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,6-dinitrostyryl) -3-cephem-4- acid carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-Aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid ; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyiminino) acetamido] -3- (4-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) -2- (thiazol-4-yl) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 1-Oxide-7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-acid carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (2,6-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,6-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -4- (4-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -4- (2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2-carboxymethoxyimino-2- (thiazol-4-yl) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; or - 1-oxide-7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dinitro-styryl) -3-cephem-4-carboxylic acid, or a salt thereof, as described in European Patent Application No. EP1325923.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le substrat chromogène est le composé HMRZ-86 ((7R)-7-[2-(aminothiazol-4-yl)-(z)-2-(1-carboxy-1 - méthyléthoxyimino)acétamido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacétate, isomère E). Ce composé est représenté par la formule (Il) suivante : NO2 (II). O CO2H In a preferred embodiment of the invention, the chromogenic substrate is the compound HMRZ-86 ((7R) -7- [2- (aminothiazol-4-yl) - (z) -2- (1-carboxy-1) - Methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacetate, isomer E). This compound is represented by the following formula (II): NO2 (II). O CO2H

1 H H2N~S O O CO2H30 Les composés de formule (I) ci-dessus sont préférentiellement utilisés pour détecter une R-Iactamase conférant une résistance aux C3G aux microorganismes qui la produisent. Les composés de formule (I) ci-dessus sont plus préférentiellement utilisés pour détecter une BLSE, céphalosporinase ou carbapénémase. The compounds of formula (I) above are preferably used to detect a R-lactamase conferring resistance to C3G microorganisms that produce it. The compounds of formula (I) above are more preferably used to detect an ESBL, cephalosporinase or carbapenemase.

Avantageusement, lorsque le substrat chromogène est un composé de formule (I), ladite composition liquide comprend en outre du CHAPS et/ou de la polymyxine B. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé vise à détecter une BLSE à l'aide d'une composition liquide comprenant le substrat chromogène HMRZ-86 ainsi que du CHAPS et/ou de la polymyxine B. Advantageously, when the chromogenic substrate is a compound of formula (I), said liquid composition further comprises CHAPS and / or polymyxin B. According to a preferred embodiment of the invention, the method aims to detect an ESBL at using a liquid composition comprising the chromogenic substrate HMRZ-86 as well as CHAPS and / or polymyxin B.

L'invention sera illustrée plus en détail au vu des exemples suivants. The invention will be further illustrated by the following examples.

EXEMPLES Exemple 1 : Comparaison test sur bandelette et test en milieu liquide Les performances du substrat ont été évaluées à partir du Cica-beta-test sur 120 souches bactériennes caractérisées par des antibiogrammes. 59 souches étaient résistantes aux céphalosporines de troisième génération (souches « C3GR ») et 61 souches étaient sensibles aux céphalosporines de troisième génération (souches « C3GS »). Pour ce faire, une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (Mueller-Hinton agar). Les colonies ont alors été grattées sur la bandelette après y avoir déposé une goutte (environ 20 µL) du réactif du Cica-beta-test soit une solution de HMRZ-86 à 0,3 g/L. Une lecture de la coloration a été réalisée après un temps maximal d'incubation de 15 min, les bandelettes étant laissées à température ambiante. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. EXAMPLES Example 1 Comparison Test Strip and Test in a Liquid Medium The performance of the substrate was evaluated from the Cica-beta-test on 120 bacterial strains characterized by antibiograms. 59 strains were resistant to third generation cephalosporins ("C3GR" strains) and 61 strains were susceptible to third generation cephalosporins ("C3GS" strains). To do this, one to three colonies were removed after 18-24 hours of culture on an agar culture medium (Mueller-Hinton agar). The colonies were then scraped off the strip after depositing a drop (approximately 20 μl) of the reagent Cica-beta-test is a solution of HMRZ-86 to 0.3 g / l. A reading of the staining was performed after a maximum incubation time of 15 min, the strips being left at room temperature. The results are shown in Table 2.

Tableau 2 : performances du Cica-Beta-test Souches C3GR Souches C3GS Cica-beta-test positif 54 10 Cica-beta-test négatif 5 51 Sensibilité (Ss)/ Spécificité (Sp) Ss = 54/59 = 91,5% Sp = 51/61 = 83,6% Les résultats montrés dans le Tableau 2 indiquent que la spécificité du test est à améliorer. En outre, des intensités de coloration faibles ont été observées pour certaines souches C3GR pour lesquelles les résultats sont donc douteux. Table 2: Cica-Beta-test performance C3GR strains C3GS strains Cica-beta-test positive 54 10 Cica-beta-negative test 5 51 Sensitivity (Ss) / Specificity (Sp) Ss = 54/59 = 91.5% Sp = 51/61 = 83.6% The results shown in Table 2 indicate that the specificity of the test is to be improved. In addition, low staining intensities were observed for some C3GR strains for which the results are therefore doubtful.

Les données obtenues à l'aide du Cica-beta-test ont ensuite été comparées à celles obtenues avec une méthode de détection en microplaque permettant la croissance bactérienne (le temps nécessaire pour la mise en oeuvre de la méthode est alors d'environ 5 h). The data obtained using the Cica-beta-test were then compared with those obtained with a microplate detection method allowing bacterial growth (the time required for the implementation of the method is then about 5 h ).

Le test a été effectué sur un panel de 44 souches dites « difficiles », c'est à dire 32 souches C3GR faiblement positives ou négatives avec le Cica-beta-test, et 12 souches C3GS dont 10 donnant un résultat « faux positif » avec le Cica-beta-test. Pour ce faire, des colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (Mieller-Hinton agar) afin d'obtenir un inoculum équivalent à 0,5 McFarland. 20 µL de la suspension bactérienne ont été ajoutés à 180 µL d'une solution d'HMRZ-86 diluée avec du bouillon Trypto-Casein-Soja tamponné. La microplaque a été 20 placée en incubateur à 35-37°C, des lectures étant réalisées toutes les heures pendant 5 h. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. The test was performed on a panel of 44 so-called "difficult" strains, ie 32 C3GR strains that were weakly positive or negative with the Cica-beta-test, and 12 C3GS strains, 10 of which gave a "false positive" result with the Cica-beta-test. To do this, colonies were removed after 18-24 h of culture on an agar culture medium (Mieller-Hinton agar) to obtain an inoculum equivalent to 0.5 McFarland. 20 μl of the bacterial suspension were added to 180 μl of a solution of HMRZ-86 diluted with buffered Trypto-Casein-Soy broth. The microplate was placed in an incubator at 35-37 ° C with readings hourly for 5 h. The results are shown in Table 3.

Tableau 3 : performances comparées du substrat au format bandelette avec une 5 méthode de détection en microplaque N=44 Cica-beta test sur bandelette Test en microplaque Spécificité (%) 16,7 66,7 Sensibilité (%) 84,4 90,6 Les résultats montrés dans le Tableau 3 indiquent que le Cica-beta test peut être amélioré en termes de spécificité et de sensibilité. En particulier, le test en format liquide conduit à une amélioration très significative de la spécificité. 10 En outre, le format liquide permet d'obtenir de meilleures intensités de coloration. En revanche, la durée de la méthode sous format liquide en microplaque est trop longue pour une mise en oeuvre de routine. Table 3: Striped Substrate Compared Performance with a Microplate Detection Method N = 44 Cica-beta Strip Test Microplate Test Specificity (%) 16.7 66.7 Sensitivity (%) 84.4 90.6 The results shown in Table 3 indicate that the Cica-beta test can be improved in terms of specificity and sensitivity. In particular, the test in liquid format leads to a very significant improvement of the specificity. In addition, the liquid format makes it possible to obtain better color intensities. On the other hand, the duration of the method in liquid microplate format is too long for routine implementation.

Exemple 2 : Comparaison d'un test sur disque optimisé et de tests en milieu 15 liquide Les inventeurs ont tout d'abord démontré qu'ils obtenaient des résultats équivalents lorsqu'ils utilisaient un test sur disque optimisé (ou disque « home-made optimisé ») et un Cica-beta-test sur bandelette. En particulier, les mêmes problèmes de reproductibilité ont été observés avec les deux tests. 20 Ils ont ensuite comparé le format disque « home-made optimisé » avec le format en milieu liquide ET sans « agent(s) de lyse » en test rapide. Example 2: Comparison of Optimized Disk Testing and Liquid Assays The inventors first demonstrated that they obtained equivalent results when using an optimized disk test (or optimized home-made disk). And a Cica-beta-test on a strip. In particular, the same problems of reproducibility were observed with both tests. They then compared the "home-made optimized" disk format with the format in liquid medium AND without "lysis agent (s)" in rapid test.

La comparaison des résultats obtenus avec le format disque « home-made optimisé » contenant 0,6 g/L d'HMRZ-86 et le format liquide avec billes de verre 25 contenant 0,8 g/L d'HMRZ-86, a été effectuée sur 75 souches (47 « C3GR » et 28 « C3GS »). Pour ce faire, une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (TCS agar). Les colonies ont été dispersées dans un tube contenant 20 µL du substrat HMRZ-86 à 0,8 g/L et environ 30 µg de billes de verre (200 30 µm). En parallèle, une même quantité de colonies a été déposée et frottée sur un disque coton (type disque antibiotique) préalablement imprégné de 15 µL de solution d'HMRZ-86 à 0,6 g/L. Comparison of the results obtained with the "home-made optimized" disk format containing 0.6 g / L of HMRZ-86 and the liquid format with glass beads containing 0.8 g / L of HMRZ-86, was performed on 75 strains (47 "C3GR" and 28 "C3GS"). To do this, one to three colonies were removed after 18-24 hours of culture on an agar culture medium (TCS agar). The colonies were dispersed in a tube containing 20 μl of the 0.8 g / l HMRZ-86 substrate and about 30 μg of glass beads (200 μm). In parallel, the same amount of colonies was deposited and rubbed on a cotton disc (antibiotic disc type) previously impregnated with 15 .mu.l of HMRZ-86 solution at 0.6 g / l.

21 Après une agitation au vortex, le tube est placé à 37°C, une lecture étant réalisée après 10 min. Le disque est pour sa part laissé à température ambiante, la lecture étant réalisée après 15 min. Les résultats sont présentés dans le tableau 4. After vortexing, the tube is placed at 37 ° C, reading after 10 min. The disk is left at room temperature, the reading being performed after 15 min. The results are shown in Table 4.

Tableau 4 : performances comparées du test en format disque optimisé avec un test en format liquide et billes de verre Disque Liquide (billes de verre) C3GR (n=47) 36 / 76,6% 33 / 70,2% souches correctement identifiées / sensibilité C3GS (n=28) 19 / 67,9% 21 / 75% souches correctement identifiées / spécificité L'utilisation de billes de verre, qui permettent une lyse mécanique des bactéries, dans le test en format liquide, permet de réduire la durée du test par rapport à la méthode précédemment décrite en microplaque, qui dure environ 5 h. Le test est en effet réalisé ici en 10 min. Table 4: Compared performances of the optimized disk format test with a liquid format and glass beads test Liquid Disk (glass beads) C3GR (n = 47) 36 / 76.6% 33 / 70.2% correctly identified strains / C3GS sensitivity (n = 28) 19 / 67.9% 21/75% correctly identified strains / specificity The use of glass beads, which allow mechanical lysis of bacteria, in the liquid format test, reduces the duration of the test compared to the previously described microplate method, which lasts about 5 hours. The test is indeed carried out here in 10 min.

Les inventeurs ont ensuite comparé le format disque « home-made optimisé » avec le format en milieu liquide ET avec « agent(s) de lyse » en test rapide. The inventors then compared the "home-made optimized" disk format with the format in liquid medium AND with "lysis agent (s)" in rapid test.

Une comparaison a été effectuée sur 21 souches (11 C3GR et 10 C3GS) en utilisant le test en format disque optimisé ou en format liquide à l'aide d'un agent de lyse (CHAPS 5 ou 10 g/L et combinaison de CHAPS 5 g/L et polymyxine B (« PB ») 50 mg/L). Pour ce faire, une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur un milieu de culture gélosé (TCS agar). Les colonies ont été dispersées dans un tube contenant 20 µL du substrat HMRZ-86 et 20 µL de solution CHAPS et/ou PB. En parallèle, une même quantité de colonies a été déposée et frottée sur un disque de coton (type disque antibiotique) préalablement imprégné de 12 µL de solution CHAPS et/ou PB, séché puis ré-imprégné de 15 µL de solution d'HMRZ-86 à 0,6 g/L. Le tube et le disque ont été placés à température ambiante, une lecture étant 25 réalisée au bout de 10 min pour le tube, et au bout de 15 min pour le disque. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. A comparison was made on 21 strains (11 C3GR and 10 C3GS) using the optimized disk format or liquid format assay using a lysing agent (CHAPS 5 or 10 g / L and combination of CHAPS 5 g / L and polymyxin B ("PB") 50 mg / L). To do this, one to three colonies were removed after 18-24 hours of culture on an agar culture medium (TCS agar). The colonies were dispersed in a tube containing 20 μl of the HMRZ-86 substrate and 20 μl of CHAPS and / or PB solution. In parallel, the same quantity of colonies was deposited and rubbed on a cotton disk (antibiotic disk type) previously impregnated with 12 μL of CHAPS and / or PB solution, dried and then re-impregnated with 15 μL of HMRZ-1 solution. 86 to 0.6 g / L. The tube and the disc were placed at room temperature, a reading being made after 10 minutes for the tube, and after 15 minutes for the disc. The results are shown in Table 5.

Tableau 5 : performances comparées du test en format disque optimisé avec un test en format liquide et agent de lyse 30 C3GR détectées (n=11) C3GS inhibées (n=10) Réaction positive Absence de réaction positive Disque Liquide Disque Liquide Sans CHAPS ni PB 11 ND 3 ND CHAPS 5 g/L 11 10 3 6 CHAPS 10 q/L 11 11 3 7 PB 50 mg/1_ 11 ND 5 ND CHAPS 5 g/L + PB 50 11 10 4 3 mg/L Les résultats du Tableau 5 montrent que, pour le test sur disque, l'utilisation d'agent(s) de lyse tels que la polymyxine B (PB) conduit à une augmentation de la spécificité du test. Pour le test sous forme liquide, l'augmentation de la concentration en CHAPS utilisée permet non seulement d'accroître la sensibilité mais aussi la spécificité. En outre l'utilisation d'agent(s) de lyse est aussi associée à une augmentation de l'intensité de coloration pour certaines souches C3GR. Le test le plus performant apparaît comme étant le test en format liquide utilisant du CHAPS à 10 g/L. Table 5: Compared performances of the optimized disk format assay with a liquid format assay and C3GR lysing agent detected (n = 11) C3GS inhibited (n = 10) Positive reaction Absence of positive reaction Liquid Disc Liquid Disk Without CHAPS or PB 11 ND 3 ND CHAPS 5 g / L 11 10 3 6 CHAPS 10 q / L 11 11 3 7 PB 50 mg / 1 11 ND 5 ND CHAPS 5 g / L + PB 50 11 10 4 3 mg / L The results of the Table Show that, for the disk test, the use of lysing agent (s) such as polymyxin B (PB) leads to an increase in the specificity of the assay. For the test in liquid form, the increase in the CHAPS concentration used not only increases the sensitivity but also the specificity. In addition, the use of lysis agent (s) is also associated with an increase in the color intensity for some C3GR strains. The most effective test appears to be the liquid format test using CHAPS at 10 g / L.

Par rapport au test en format disque, le test en format liquide donne un meilleur contraste de colorations (gradation de couleurs avec trois couleurs bien déterminées : jaune, orange et rouge, alors que, pour le format disque, la gradation de couleurs va du jaune pour le négatif au rouge plus ou moins intense sans passer par l'orange). En outre, la lecture dans le tube est plus aisée que sur le disque. Compared to the disk format test, the liquid format test gives a better contrast of colorations (color gradation with three clearly defined colors: yellow, orange and red, whereas, for the disk format, the color gradation is yellow. for the negative to red more or less intense without going through the orange). In addition, reading in the tube is easier than on the disc.

Exemple 3 : Comparaison d'un test sur disque optimisé et de tests en milieu liquide pour des colonies colorées Example 3: Comparison of an optimized disk test and liquid tests for colored colonies

Les inventeurs ont comparé le format disque « home-made optimisé » avec le format en milieu liquide avec CHAPS comme « agent de lyse » par des tests rapides à partir de colonies colorées. Une à trois colonies ont été prélevées après 18-24 h de culture sur chacun des milieux de culture gélosé Drigalski, Mac Conkey cristal violet, UriSelect4 (Bio-Rad). Les colonies ont été dispersées dans un tube contenant 20 µL du substrat HMRZ-86 à 0,8 g/L et 20 µL de solution CHAPS. En parallèle, une même quantité de colonies a été déposée et frottée sur un disque de coton (type disque antibiotique) préalablement imprégné de 15 µL de solution CHAPS + HMRZ-86. The inventors have compared the "home-made optimized" disk format with the liquid format with CHAPS as "lysis agent" by rapid tests from colored colonies. One to three colonies were removed after 18-24 h of culture on each of the Drigalski agar plates, Mac Conkey crystal violet, UriSelect4 (Bio-Rad). The colonies were dispersed in a tube containing 20 μl of the HMRZ-86 substrate at 0.8 g / l and 20 μl of CHAPS solution. In parallel, the same amount of colonies was deposited and rubbed on a cotton disk (antibiotic disc type) previously impregnated with 15 μL of CHAPS + HMRZ-86 solution.

Le tube et le disque ont été placés à température ambiante, une lecture étant réalisée après 15 min. The tube and the disc were placed at room temperature, a reading being performed after 15 min.

Il a été observé que lors de la réalisation du test sur disque à partir de colonies colorées, dans certains cas (selon la souche et/ou le milieu d'isolement), la coloration des colonies pouvait interférer avec la lecture du résultat puisque le dépôt d'une colonie colorée sur le disque peut entraîner une coloration non spécifique. Dans le cas de test utilisant le HMRZ-86, ce problème est le plus gênant lorsque les colonies sont roses ou rouges (par exemple, ce peut être le cas de souches de E. coli isolées sur géloses UriSelect4, ou de souches lactose+ isolées sur géloses Mac Conkey). En effet, une fois écrasées sur le disque, la coloration de ces colonies peut interférer avec la coloration rose-rouge qui symbolise la positivité du test utilisant le HMRZ-86. De façon étonnante, la mise en oeuvre d'un test en format liquide permet, en partie, de lever ce problème puisqu'il est possible, par exemple à partir de gélose Mac Conkey au cristal violet, de tester des colonies colorées isolées, contrairement au format disque avec lequel toutes les entérobactéries, qu'elles soient C3GS ou C3GR, apparaissent positives. It was observed that when performing the disk test from colored colonies, in some cases (depending on the strain and / or the isolation medium), colony staining could interfere with the reading of the result since the deposit a colored colony on the disc may cause non-specific staining. In the case of tests using HMRZ-86, this problem is the most troublesome when the colonies are pink or red (for example, it may be the case of strains of E. coli isolated on UriSelect4 agar, or lactose + strains isolated on Mac Conkey agar). Indeed, once crushed on the disc, staining of these colonies may interfere with the pink-red staining that symbolizes the positivity of the test using the HMRZ-86. Surprisingly, the implementation of a test in liquid format allows, in part, to overcome this problem since it is possible, for example from Mac Conkey crystal violet agar, to test isolated colored colonies, unlike in disc format with which all enterobacteria, whether C3GS or C3GR, appear positive.

Les tableaux 6 et 7 montrent les résultats d'essais réalisés pour deux souches C3GS à partir du substrat chromogène HMRZ-86 à 0,4 g/L et à l'aide de CHAPS 10 g/L en solution dans du tampon phosphate 0,1 M pH 6. Tables 6 and 7 show the results of tests carried out for two C3GS strains from the chromogenic substrate HMRZ-86 at 0.4 g / L and using CHAPS 10 g / L in solution in phosphate buffer 0, 1 M pH 6.

Tableau 6 : Essai avec une souche K. pneumoniae C3GS. Souche C3GS Milieu de culture K. pneumoniae ATCC 13883 TCS* Drigalski Mac Conkey Uriselect 4 aspect des colonies blanc jaune rose fuschia bleu Disque HMRZ + blanc marron clair rose bleu CHAPS Résultat Disque négatif douteux faux positif négatif Liquide HMRZ + jaune jaune orange jaune/reflet CHAPS vert Résultat Liquide négatif négatif douteux négatif * milieu gélosé trypto-caséine-soja25 Tableau 7 : Essai avec une souche E. coli C3GS. Souche C3GS Milieu de culture E. coli ATCC 25922 TCS Drigalski Mac Conkey Uriselect 4 Aspect des colonies blanc jaune rose fuschia rose Disque HMRZ + CHAPS blanc jaune/marron rose gris clair Résultat Disque négatif douteux faux positif négatif Liquide HMRZ + CHAPS jaune jaune/orange orange jaune clair Résultat Liquide négatif négatif douteux négatif Table 6: Test with K. pneumoniae strain C3GS. C3GS strain Culture medium K. pneumoniae ATCC 13883 TCS * Drigalski Mac Conkey Uriselect 4 colony appearance white yellow pink blue fuschia Disk HMRZ + white light brown pink blue CHAPS Result Negative negative disc false positive negative liquid HMRZ + yellow yellow orange yellow / reflection CHAPS green Result Negative negative negative liquid negative * Trypto-casein-soy agar medium Table 7: E. coli C3GS strain assay. C3GS strain Culture medium E. coli ATCC 25922 TCS Drigalski Mac Conkey Uriselect 4 Appearance of colonies white yellow pink fuschia pink Disc HMRZ + CHAPS white yellow / brown pink light gray Result Negative negative disc false positive negative liquid HMRZ + CHAPS yellow yellow / orange light yellow orange Result Negative negative liquid negative negative

Claims (10)

REVENDICATIONS1. Procédé pour détecter la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en suspension des bactéries dans une composition liquide comprenant un substrat chromogène ou fluorogène susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par l'enzyme à détecter ; et b) détecter l'éventuelle libération du chromophore ou du fluorophore ; la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore à l'étape b) indiquant la présence d'une enzyme sélectionnée dans le groupe constitué des céphalosporinases, des R-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases. REVENDICATIONS1. A method for detecting the presence of an enzyme selected from the group consisting of cephalosporinases, extended-spectrum R-lactamases (ESBL) and carbapenemases, said method comprising the steps of: a) suspending bacteria in a liquid composition comprising a chromogenic or fluorogenic substrate capable of releasing a chromophore or a fluorophore after hydrolysis by the enzyme to be detected; and b) detecting the possible release of the chromophore or fluorophore; detecting release of the chromophore or fluorophore in step b) indicating the presence of an enzyme selected from the group consisting of cephalosporinases, extended-spectrum R-lactamases (ESBL) and carbapenemases. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite composition liquide comprend en outre au moins un agent de lyse bactérien. The method of claim 1, wherein said liquid composition further comprises at least one bacterial lysing agent. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel ledit au moins un agent de lyse bactérien est sélectionné dans le groupe constitué d'un détergent, d'une enzyme qui dégrade la paroi bactérienne, d'une polymyxine, et de combinaisons de ceux-ci. The method of claim 2, wherein said at least one bacterial lysing agent is selected from the group consisting of a detergent, an enzyme that degrades the bacterial wall, a polymyxin, and combinations thereof. this. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le chromophore est sélectionné dans le groupe constitué d'un dérivé de l'indoxyle, du nitrophénol, d'un dérivé de nitrophénol, du chlorophénol, d'un dérivé de chlorophénol, du naphthol, d'un dérivé du naphthol, du The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the chromophore is selected from the group consisting of an indoxyl derivative, nitrophenol, a nitrophenol derivative, chlorophenol, a derivative chlorophenol, naphthol, a derivative of naphthol, 5-(4-hydroxy-3-methoxyphenylmethylene)-2- thioxothiazolidin-4-one-3-ethanoate, de la 3,4-cyclohexenoesculetine, de la 2-alizarine ou de la 7-amido-1-pentyl-phenoxazin-3-one. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le substrat chromogène ou fluorogène comprend un noyau R-lactame. 5- (4-hydroxy-3-methoxyphenylmethylene) -2-thioxothiazolidin-4-one-3-ethanoate, 3,4-cyclohexenoesculetin, 2-alizarin or 7-amido-1-pentylphenoxazin 3-one. The method of any one of claims 1 to 4, wherein the chromogenic or fluorogenic substrate comprises an R-lactam ring. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le substrat chromogène est un composé de formule (I)30CH=CH (I) COOH où : R, et R2 peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement nitro ou cyano ; R3 représente un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C6i éventuellement substitué par un groupement carboxyle; R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement amino ; X représente ûS- ou ûSO- ; et R, et R2 ne peuvent pas simultanément représenter un atome d'hydrogène, ou un sel de ceux-ci. The process according to any one of claims 1 to 5, wherein the chromogenic substrate is a compound of formula (I) wherein: R 1 and R 2 may be the same or different and each represents an atom hydrogen or a nitro or cyano group; R3 represents a linear or branched C1-C6i alkyl group optionally substituted with a carboxyl group; R4 represents a hydrogen atom or an amino group; X represents ûS- or ûSO-; and R 1 and R 2 can not simultaneously represent a hydrogen atom, or a salt thereof. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le substrat chromogène est un composé sélectionné dans le groupe constitué de : - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1-methylethoxy-imino)acetamido]-3- (2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,6-din itrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1 -methylethoxy-imino)acetamido]-3-(4-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(1-carboxy-1-methylethoxy-imino)acetamido]-3- (2-cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(1-carboxy-1 -methylethoxyimino)-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; acide 1 -oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-( 1 -carboxy-l-methylethoxyimino)acetam ido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ;- acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2,6-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-am inothiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-(2-cyanostyryl)-3- cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,6- dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(4- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2- nitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2,4- dicyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(4- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; acide 7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-4-(2- cyanostyryl)-3-cephem-4-carboxylique ; - acide 7-[2-carboxymethoxyimino-2-(thiazol-4-yl)acetamido]-3-(2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylique ; et - acide 1-oxide-7-[2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-carboxymethoxyimino-acetamido]-3-(2, 4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylique, ou un sel de ceux-ci. The method of claim 6, wherein the chromogenic substrate is a compound selected from the group consisting of: 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxy) -imino) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-Aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,6-dinitrostyryl) -3-cephem-4- acid carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-Aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid ; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyiminino) acetamido] -3- (4-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) -2- (thiazol-4-yl) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 1-Oxide-7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2- (1-carboxy-1-methylethoxyimino) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-acid -carboxylic; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazole) acid; 4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (2,6-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-methoxyiminoacetamido] -3- (2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,6-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (4-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2-nitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dicyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -4- (4-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -4- (2-cyanostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; 7- [2-carboxymethoxyimino-2- (thiazol-4-yl) acetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid; and 1-oxide-7- [2- (2-aminothiazol-4-yl) -2-carboxymethoxyiminoacetamido] -3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid, or a salt thereof. of these. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel le substrat chromogène est le composé HMRZ-86 ((7R)-7-[2-(aminothiazol-4-yl)-(z)-2-(1-carboxy-l- méthyléthoxyimino)acétam ido]-3-(2,4-dinitrostyryl)-3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacétate, isomère E) ou un sel de celui-ci. The process according to claim 6 or 7, wherein the chromogenic substrate is HMRZ-86 ((7R) -7- [2- (aminothiazol-4-yl) - (z) -2- (1-carboxy) 1-methylethoxyimino) acetamido-3- (2,4-dinitrostyryl) -3-cephem-4-carboxylic acid trifluoroacetate, isomer E) or a salt thereof. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel ladite composition liquide comprend en outre du CHAPS et/ou de la polymyxine B. The method of any one of claims 1 to 8, wherein said liquid composition further comprises CHAPS and / or polymyxin B. 10. Procédé de détection in vitro de microorganismes résistants aux céphalosporines de Sème génération, mettant en oeuvre le procédé tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 9. 10. A method for the in vitro detection of microorganisms resistant to cephalosporins of the 5th generation, using the method as described in any one of claims 1 to 9.
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