FR2956594A1 - Nouveau procede de preparation de liposomes, mettant en oeuvre un reacteur membranaire - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation de liposomes, et en particulier de liposomes de diamètre inférieur à 1000nm, à partir : d'une première phase A liquide comportant un lipide amphiphile ou un mélange de lipides amphiphiles, en solution dans un solvant miscible à l'eau en toute proportion, et d'une deuxième phase B liquide aqueuse, dans laquelle le(s) lipide(s) amphiphile(s) sont insoluble(s), toutes deux maintenues à qui est maintenue à une température supérieure à la température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé, caractérisé en ce que ledit procédé met en œuvre un réacteur membranaire comportant une membrane poreuse, dans lequel la deuxième phase B, circule tangentiellement à la membrane entre son entrée et sa sortie, et la première phase A traverse, par application d'une pression, les pores de la membrane, pour former des liposomes de taille contrôlée qui se forment au contact de la deuxième phase B.

Description

La présente invention est relative à un nouveau procédé mettant en oeuvre un réacteur membranaire, qui permet de préparer des liposomes, et en particulier des liposomes de taille submicronique. Depuis quelques années, les systèmes colloïdaux sont de plus en plus utilisés en agrochimie, en cosmétologie et surtout en pharmacie. Dans ce domaine, les systèmes dont la taille est inférieure au micron sont utilisés comme systèmes thérapeutiques, tels que les liposomes, les microémulsions et les nanoparticules. Ces différentes formes ont été développées pour améliorer les performances des médicaments et véhiculer les principes actifs dans l'organisme vers des cellules cibles afin d'améliorer l'effet thérapeutique et/ou de diminuer l'effet toxique. Les liposomes sont des vésicules de quelques dizaines à quelques milliers de nanomètres de diamètre. Ces vésicules de forme essentiellement sphérique sont composées d'une enveloppe constituée d'une ou plusieurs bicouches phospholipidiques, formées autour d'un coeur aqueux, éventuellement compartimenté. Les liposomes ont longtemps été considérés comme des modèles membranaires synthétiques des cellules vivantes, avant d'être élaborés pour la première fois à des fins thérapeutiques. Les liposomes sont classés en fonction de leur taille (petit, moyen, géant) et du nombre de bicouches lipidiques qui les composent : ils sont nommés uni-lamellaires lorsque leur enveloppe est constituée d'une seule bicouche lipidique et multi-lamellaires lorsque leur enveloppe est constituée de plusieurs bicouches lipidiques. On décrit ainsi quatre classes : - les liposomes multi-lamellaires (nommés MLV de l'anglais 25 « multilamellar large vesicles ») - les liposomes uni-lamellaires de petite taille (nommés SUV de l'anglais « small unilamellar vesicles ») qui présentent notamment un diamètre de 20 à 100 nm, - les liposomes uni-lamellaires de grande taille (nommés LUV de 30 l'anglais « large unilamellar vesicles ») qui présentent notamment un diamètre de 100 à 1000 nm, - les liposomes géants (nommés GUV de l'anglais « giant unilamel/ar vesic/es ») qui présentent notamment un diamètre de 1000 à 50000 nm. Les liposomes sont composés le plus souvent de phospholipides qui comportent une tête hydrophile (polaire) et une queue hydrophobe reliée par une chaine aliphatique. A titre d'exemples de phospholipides, on peut citer les glycérophospholipides (phosphatidylcholine, phosphatidylsérine, phosphatidyléthanolamine, phosphatidylinositol) et les sphingophospholipides (sphingomyéline) qui peuvent être d'origine naturelle (oeuf, soja) ou synthétique. La structure vésiculaire et l'épaisseur de la bicouche sont fixées par la géométrie de la molécule phospholipidique dont les têtes polaires sont séparées d'une distance maximale égale à deux fois l'extension des chaînes aliphatiques qui la composent. Le cholestérol est fréquemment utilisé pour améliorer la stabilité des enveloppes des liposomes. L'avantage de la structure vésiculaire, par rapport notamment à des véhicules de type émulsion ou nanoparticules, est qu'elle permet l'encapsulation de tous les types de molécules actives : les molécules hydrophiles se trouvent piégées dans la cavité aqueuse intraliposomale, alors que les substances lipophiles viennent s'intégrer au niveau des bicouches phospholipidiques. Un composé de nature amphiphile, est localisé au niveau de l'interface tête hydrophile/queue hydrophobe des phospholipides. La présente invention a trait à la préparation de liposomes et, en particulier, de liposomes de diamètre inférieur à 1000 nm. Plusieurs méthodes de préparation des liposomes ont été décrites dans la littérature, dont certaines sont discutées ci-après.

F. Oison et al. dans Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 557, 9-23 décrivent une méthode basée sur l'extrusion d'une suspension de liposomes à travers une membrane de taille de pore uniforme qui permet de préparer des liposomes uni-lamellaires avec un diamètre moyen compris entre 100 et 400 nm et une distribution de taille étroite. De façon préférentielle, des membranes de polycarbonate de taille de pores entre 50 et 200 nm sont utilisées. Le choix de la taille des pores de la membrane dépend de la taille souhaitée pour les liposomes. Pour obtenir des liposomes de taille très homogène, la suspension de liposomes peut être extrudée plusieurs fois à travers la membrane, comme décrit dans la demande W086/00238. La polydispersion de la suspension de liposomes diminue en augmentant le nombre de cycles d'extrusion. Pour obtenir une distribution de taille étroite de la suspension liposomale et réduire le nombre d'étapes extrusion, plusieurs variations de la méthode d'extrusion ont été proposées. Par exemple, la demande de brevet EP1920765 décrit la préparation d'une suspension de liposomes par extrusion d'une suspension liposomale formée d'un mélange de lipides et de phospholipides à travers un milieu poreux suivi par le passage de la solution ou suspension liposomale à travers un orifice. Au cours de cette dernière étape, il est possible. d'obtenir une suspension sous forme de gouttelettes qui peut être séchée ultérieurement par atomisation.

S. Batzri et E D. Korn décrivent dans Biochimica et Biophysica Acta, 1973, 298, 1015-1019 une méthode d'injection au moyen d'une seringue d'une solution d'éthanol et de phospholipides dans une solution aqueuse pour la préparation de liposomes uni-lamellaires (Batzri et Korn 1973). Le diamètre des liposomes dépend de différents paramètres, par exemple la concentration en phospholipides, le système d'injection (par exemple, une seringue comme décrit par S. Batzri et E D. Korn ou un système de microfluidique comme décrit dans J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 2674-2675) et la vitesse d'injection. Plusieurs modifications de cette méthode d'injection d'une solution à base d'éthanol ont été proposées. Par exemple, la demande de brevet W003/075890 décrit l'encapsulation de principes actifs dans des liposomes par infusion d'un mélange de lipide et d'éthanol dans une solution aqueuse ou d'éthanol du principe actif à une température inférieure à la température de transition de phase d'au moins un des composés lipidiques. L'ensemble de ces méthodes ne donnent pas entière satisfaction car, notamment, elles sont difficilement transposables à l'échelle industrielle et/ou nécessitent une multitude d'étapes pour parvenir à un contrôle de la taille des liposomes obtenus. Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de liposomes, qui soit aisé et rentable à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle. Un objectif de la présente invention est de proposer une nouvelle méthode de préparation de liposomes qui mette en oeuvre une étape principale et qui soit plus simple que les méthodes de l'art antérieur. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de liposomes, qui soit industrialisable, et qui permette un contrôle de la taille des liposomes, et en particulier qui permette l'obtention de liposomes d'un diamètre inférieur à 1000 nm, préférentiellement à 500 nm, et de préférence compris entre 50 et 200 nm. Dans ce contexte, l'invention concerne un procédé de préparation de liposomes, et en particulier de liposomes de diamètre inférieur à 1000 nm, à partir : d'une première phase A liquide comportant un lipide amphiphile ou un mélange de lipides amphiphiles, en solution dans un solvant ou un mélange de solvants miscible à l'eau en toute proportion, et d'une deuxième phase B liquide aqueuse, dans laquelle le(s) lipide(s) amphiphile(s) sont insoluble(s), les deux phases A et B étant maintenues à une température supérieure à la température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé, caractérisé en ce que ledit procédé met en oeuvre un réacteur membranaire comportant une membrane poreuse, dans lequel la deuxième phase B circule tangentiellement à la membrane entre son entrée et sa sortie, et la première phase A située de l'autre côté de la membrane traverse, par application d'une pression, les pores de la membrane, pour former des liposomes de taille contrôlée qui se forment au contact de la deuxième phase B. Selon des modes de réalisation préférés, le lipide amphiphile ou le mélange de lipides amphiphiles est un phospholipide ou respectivement un mélange de phopholipides et/ou le solvant miscible à l'eau en toute proportion est de l'éthanol. Dans le procédé selon l'invention, les températures de la phase A et de la phase B sont supérieures à la température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé. Toutefois, les températures de la phase A et de la phase B ne sont pas obligatoirement égales. La température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé est définie comme la température caractéristique de transition entre l'état de gel et l'état liquide du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé. Certains lipides amphiphiles de température de transition de phase inférieure à la température ambiante, comme la dioleoyl-phosphatidylcholine (T9=-22°C), permettent de réaliser l'invention à température ambiante. D'autres lipides amphiphiles comme la dipalmitoyl-phosphatidylsérine et la stéaroyl- phosphatidylcholine (Tg environ 52°C -55°C) nécessitent de réaliser l'invention à une température supérieure à la température ambiante. Dans ce dernier cas, la phase A et la phase B sont maintenues, par chauffage, à une température supérieure à la température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé.

Dans le cadre de l'invention, la phase A et la Phase B sont situées de part et d'autre de la membrane. La phase B circule le long de la membrane alors qu'une pression est appliquée sur la phase A pour qu'elle traverse la membrane et vienne au contact de la phase B. En arrivant dans la phase B par les pores de la membrane, il y a formation de liposomes dont la taille est 3o contrôlée par les pores de la membrane et les conditions du procédé que sont notamment la vitesse de circulation de la phase B et la pression appliquée sur la phase A. Selon un tel procédé, il est possible de préparer aussi bien des liposomes uni-lamellaires que multi-lamellaires. Selon un mode de réalisation particulier, la phase A contient une substance active S soluble ou dispersible dans la phase A, de préférence choisie parmi un principe actif de médicament, un produit de contraste, un réactif biologique, un pigment, une encre, un lubrifiant, un agent de traitement de surface. Le procédé selon l'invention permet donc de préparer des liposomes qui pourront servir de véhicule de substance active S, pour différentes applications. Selon un mode de réalisation avantageux, la substance active S est hydrophobe, ce qui permet d'atteindre des rendements élevés d'encapsulation au sein des liposomes. Selon un autre mode de réalisation particulier qui peut être combiné au précédent, le contrôle de la taille des liposomes est obtenu par un passage unique au travers de la membrane. La suspension de liposomes obtenue après un seul passage au travers de la membrane de la première phase A qui ne contient pas des liposomes déjà formés, mais uniquement un ou plusieurs lipides amphiphiles en solution, n'est pas soumise à un nouveau passage au travers d'une membrane ou d'un quelconque orifice qui permettrait d'ajuster le diamètre des liposomes. En effet, dans la cadre de l'invention, il a été démontré que le seul passage de la phase A au travers d'une membrane poreuse pour déboucher dans la phase B qui circule tangentiellement à la membrane permettait d'obtenir une suspension de liposomes de taille contrôlée. Cette simplicité de mise en oeuvre présente un avantage majeur, par rapport aux techniques antérieures qui n'arrivaient à contrôler la taille des liposomes obtenus que par différentes extrusions successives. Selon un autre mode de réalisation particulier qui peut être combiné aux précédents, la deuxième phase B circule en circuit ouvert, de sorte que la suspension de liposomes obtenue en sortie de la membrane n'est pas réinjectée dans la deuxième phase B, en amont de l'entrée de la membrane, mais est récupérée après la sortie de la membrane. En effet, les inventeurs ont constaté que la circulation de la phase B en circuit fermé pouvait nuire au contrôle de la taille et de la structure des liposomes. La description qui suit, en référence aux figures annexées, va permettre de mieux comprendre l'invention et détaille certains de ses aspects.

La Figure 1. illustre, schématiquement, le procédé selon l'invention au niveau de la membrane poreuse. La Figure 2 représente un dispositif de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. Les liposomes obtenus grâce au procédé selon l'invention peuvent être définis comme des vésicules de forme essentiellement sphérique qui sont composées d'une enveloppe constituée d'une ou plusieurs bicouches phospholipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments aqueux, et formées autour d'un coeur aqueux, éventuellement compartimenté. Les liposomes obtenus dans le cadre de l'invention peuvent comprendre un seul lipide amphiphile ou un mélange de lipides amphiphiles. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre avec une grande variété de phospholipides, ou plus généralement de lipides amphiphiles. A titre d'exemples de lipides amphiphiles, on peut citer les glycolipides, les phosphoaminolipides et notamment les phospholipides, et notamment des sphyngolipides, des glycérophopholipides, par exemple des lécithines. Les phospholipides sont des lipides qui possèdent un groupe phosphate. Ce sont des assemblages de deux acides gras, de glycérol et de phosphate. Les phospholipides ont une affinité pour les composés polaires grâce à leurs têtes hydrophiles (groupe phosphate, groupe glycérol, ou plus généralement tous groupes hydrophiles), et pour les composés apolaires grâce à leurs queues hydrophobes (acides gras). Dans l'eau, les phospholipides peuvent s'organiser en bicouches lipidiques concentriques de manière à minimiser les contacts entre l'eau et leurs queues hydrophobes. Des exemples de phospholipides sont : la cardiolipine, la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, le phosphatidylinositol, la phosphatidylsérine et les plasmalogènes. La lécithine d'oeuf ou de soja qui peut être utilisé dans le cadre de l'invention comporte un mélange de phospholipides. Selon la nature des phospholipides utilisés, les liposomes obtenus dans le cadre de l'invention peuvent avoir une charge de surface neutre, positive ou négative, qui peut être mise en évidence par la mesure du potentiel zêta de la suspension de liposomes obtenue. Le principe de l'invention est le suivant. Une première phase A comprenant un lipide amphiphile ou un mélange de lipides amphiphiles en solution dans un solvant ou un mélange de solvants miscible à l'eau en toute proportion tel que de l'éthanol, auquel est ajoutée, éventuellement une substance d'intérêt S et/ou un ou plusieurs additifs, est mise sous pression pour passer à travers les pores d'une membrane poreuse, comme cela est illustré Figure 1. Une deuxième phase B circule tangentiellement à la membrane, de sorte que la phase A qui traverse la membrane débouche dans la phase B. Les conditions de mélange créées entre les deux phases A et B conduisent à la formation de liposomes dans des conditions de mélange contrôlé. Une suspension de liposomes de taille contrôlée est, ainsi, directement obtenue. Au cours de la préparation, les liposomes formés ont une structure identique. La structure des liposomes peut néanmoins varier d'une préparation à l'autre.

Le procédé de fabrication de liposomes selon l'invention, utilise une membrane poreuse pour l'introduction sous l'action d'une pression d'une phase A, comprenant un ou plusieurs solvants miscibles à l'eau en toute proportion tel que l'éthanol, un ou plusieurs lipide amphiphiles et éventuellement une substance S, dans une phase aqueuse B qui circule de l'autre côté de la membrane, le long de cette dernière comme illustrée Figure 1. Par membrane, on entend de préférence un élément poreux homogène sur toute son épaisseur. C'est notamment le cas des membranes de nature polymérique et des supports céramiques. Il pourrait également être envisagé d'utiliser une membrane céramique non homogène sur son épaisseur, constituée d'un support et d'une couche séparatrice. Le diamètre moyen maximum de pores adapté pour la préparation de liposomes conformes à l'invention est, de préférence, compris entre 1 nm et 10 pm, et préférentiellement compris entre 10 nm et 1 pm. Dans le cas d'une membrane comportant un support et une couche séparatrice, c'est le diamètre de pore de la couche séparatrice qui est déterminant. Cette couche séparatrice se trouvera en contact avec la deuxième phase B qui circulera tangentiellement à la surface de cette dernière. Toute forme de membrane peut être envisagée : des membranes planes, des membranes fibres creuses, des membranes tubulaires comportant un ou plusieurs canaux de circulation, le long desquels circule la deuxième phase B. Le lipide amphiphile ou le mélange de lipides amphiphiles utilisé est soluble dans la phase organique A qui comprend un ou plusieurs solvants miscibles à l'eau en toute proportion tel que le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (DMSO), le tétrahydrofurane (THF) ou un alcool tel que de préférence l'éthanol. La phase organique A est, par exemple, placée dans un récipient ou conteneur sous pression assurant son passage au travers des pores de la membrane à la pression désirée. La température de .la phase organique A doit être supérieure à la température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipide amphiphiles utilisé. Cette température est, de préférence, inférieure à 70°C, et appartient préférentiellement à la gamme 10°C - 50°C, et de façon avantageuse à la gamme 10°C - 37°C. La concentration des lipides amphiphiles dans la phase A peut, par exemple, être de 0,1 à 10 % (m/m), de préférence 1 à 5 % (m/m), ce pourcentage en masse étant exprimé par rapport à la masse totale de la phase A. De façon avantageuse, la deuxième phase B, destinée à constituer la phase continue de la suspension de liposomes préparée selon la présente invention, est essentiellement constituée d'eau, ou d'un mélange d'eau et d'un ou plusieurs non-solvants du ou des lipides amphiphiles utilisés. Comme exemple de non-solvant du ou des lipides amphiphiles utilisés, on peut citer l'acétonitrile et le cyclohexane. Le non-solvant du ou des lipides amphiphiles utilisés pourra constituer de 10 à 70 % du volume de la phase B, de préférence de 10 à 30 %. La notion de solubilité à laquelle on se réfère est, par exemple, définie dans la PHARMACOPEE EUROPEENNE 5ème édition.

La température de la phase aqueuse B doit être supérieure à la température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé. Cette température est, de préférence, inférieure à 70°C, et appartient préférentiellement à la gamme 10°C - 50°C, et de façon avantageuse à la gamme 10°C - 37°C. La température de la phase aqueuse B peut être identique ou différente de la température de la phase A. La phase A contient, avantageusement, une substance S en solution ou en suspension dans la solution constituée d'un ou plusieurs solvants miscibles à l'eau en toute proportion tel que l'éthanol et d'un lipide amphiphile ou d'un mélange de lipides amphiphiles. La substance à incorporer S peut être n'importe quelle substance soluble ou dispersible dans la phase organique A comprenant le solvant miscible à l'eau en toute proportion tel que l'éthanol et le(s) lipide(s) amphiphile(s). La substance S peut être une substance biologiquement active, par exemple une molécule utilisable en tant que principe actif d'un médicament ou comme précurseur d'un principe actif de médicament, ou encore un produit de contraste ou un réactif biologique. La substance S peut également être un pigment, une encre, un lubrifiant, un agent de traitement de surface. On peut également utiliser en tant que substance S un mélange des substances ci-dessus. La quantité de substance S est, par exemple, fonction de sa solubilité dans la phase organique A. En tant que substances pouvant être incorporées à la phase organique A, on peut citer comme exemple les principes actifs antimicrobiens, antifongiques, antiviraux, cytostatiques et cytotoxiques, comme la doxorubicine, la mitoxanthrone et l'amphotéricine B. On peut citer comme exemple d'agent-anti-inflammatoire, l'indométhacine ; comme exemple de glucocortico de, la béclométhasone dipropionate. On peut également citer les protéines, les peptides, les acides nucléiques, parmi lesquels l'ADN et les oligonucléotides. Les liposomes préparés dans le cadre de la présente invention sont particulièrement adaptés à l'encapsulation de principes actifs hydrophobes. Dans ce cas le rendement d'encapsulation peut être élevé, notamment compris entre 60 et 99%, de préférence supérieur à 90%, en fonction de la formulation et des propriétés physico-chimiques de la substance active. Comme exemple de principes actifs, on peut citer les taxanes, les camptothecines, la doxorubicine, la michellamine B, et la vincristine, et plus particulièrement comme exemple de principes actifs hydrophobes, le paclitaxel, le docétaxel, les camptothecines, le béclométhasone dipropionate et l'indométacine qui ont une faible solubilité dans l'eau. Des principes actifs de nature hydrophile peuvent être également encapsulés mais avec un rendement d'encapsulation plus faible. Comme exemple de principes actifs hydrophiles, on peut citer les analogues des nucléosides, comme par exemple la cytarabine.

Il est également possible d'utiliser dans la phase A et/ou la phase B, un ou plusieurs additifs conférant aux liposomes des propriétés particulières. Par exemple, il est possible d'utiliser du cholestérol, notamment à une concentration représentant de 30 à 50 % en masse de la masse de lipide amphiphile(s), pour stabiliser la membrane des liposomes et/ou maîtriser la libération d'une substance S éventuellement présente. De manière avantageuse, le cholestérol sera présent dans la phase A. Il est également possible d'utiliser de la stérylamine, notamment à une concentration de 30 à 50 % en masse par rapport à la masse de lipides amphiphiles pour conférer une charge positive aux liposomes obtenus. De manière avantageuse, la stérylamine sera présente dans la phase A. L'homme du métier sera à même de choisir, d'une part, le matériau de la membrane mis en oeuvre et, d'autre part, sa porosité et son diamètre de pores. Différents types de membranes peuvent être utilisées : des membranes céramiques, membranes minérales, membranes métalliques ou organiques par exemple. Egalement, une large gamme de diamètre de pores peut être utilisée : des membranes de nanofiltration qui présentent un diamètre de pores inférieur à 1nm, des membranes d'ultrafiltration qui présentent un diamètre de pores compris entre 1 et 100 nm ou des membranes de microfiltration qui présentent un diamètre de pores compris entre 0,1 et 10 dam. Le choix des membranes mises en oeuvre va jouer sur le flux (J) de la phase organique A. La taille des liposomes obtenus est contrôlée par un choix approprié des paramètres du procédé qui sont la pression (P) de la phase A et la vitesse tangentielle (U) de la phase aqueuse B. Une large gamme de pression et de vitesse tangentielle peut être envisagée. Typiquement, une pression de 0,1 bar à 50 bar, de préférence de 0,3 à 15 bar, pour la phase lipidique A sera utilisée. En général, une vitesse tangentielle de 0,001 à 20 m.s"1, de préférence de 0,01 à 10 m.s-1, pour la phase aqueuse B sera utilisée. Quelles que soient les conditions mises en oeuvre, compte tenu du procédé et du fait que le(s) lipide(s) amphiphile(s) sont insoluble(s) dans la phase B, le mélange des phases A et B obtenu est un non-solvant du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé. Par ailleurs, il est possible de jouer sur la longueur de la membrane, ou plus généralement sur la surface membranaire traversée par la phase A, pour augmenter le rendement de production.

Au final, la concentration en liposomes de la suspension liposomale obtenue en sortie de la membrane, selon le procédé de l'invention, est, par exemple, comprise entre 0,01 et 80%, de façon préférentielle entre 5 et 45%, plus préférentiellement entre 10 et 30°/o (pourcentage massique des liposomes par rapport à la masse totale liposomes + phase continue). Si cela est souhaité, il est ensuite possible d'éliminer tout ou partie des solvants présents (eau, éthanol ou autre), de manière à ajuster la concentration en liposomes de la suspension colloïdale obtenue. La distribution en taille des liposomes obtenus en sortie de la membrane selon le procédé de l'invention, pourra être caractérisée par un indice de polydispersion. Cet indice est classiquement obtenu par des appareils de mesure utilisant la diffraction laser. Selon le procédé de l'invention, l'indice de polydispersion sera compris entre 0,01 et 0,8, de façon préférentielle entre 0,01 et 0,5, plus préférentiellement entre 0,01 et 0,3. Au vu de ce qui précède, il apparaît que le procédé selon l'invention, malgré sa simplicité, est adapté à la préparation de différents types de liposomes. De plus, il permet de préparer des volumes importants en continu et il est donc parfaitement adapté à une industrialisation. Le procédé selon l'invention présente une très bonne adaptabilité, il permet d'ajuster la taille des liposomes. Par exemple, pour changer la taille des liposomes obtenus, on pourra modifier la formulation, et/ou changer la pression à appliquer sur la phase A, et/ou changer la vitesse tangentielle de circulation de la phase B. Les exemples qui suivent permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif.

Exemple 1 Le montage expérimental utilisé dans cet exemple est représenté sur la Figure 2. Il comprend : un premier récipient pressurisé 1 contenant la phase phospholipidique A, relié à une bouteille 2 d'azote et équipé d'un manomètre 3 ; dans les exemples réalisés, ce récipient 1 est à température ambiante, mais il aurait pu être chauffé à une température supérieure à la température de transition de phase du phospholipide ou du mélange de phospholipides utilisé si celle-ci avait été supérieure à la température ambiante, par exemple grâce à un bain dont la température aurait été régulée par un thermostat, un deuxième récipient 4, contenant la phase aqueuse B, équipé d'un agitateur 5 (permettant d'homogénéiser la température, en cas de chauffage) et relié à une pompe 6 ; dans les exemples réalisés, ce deuxième récipient 4 est à température ambiante, mais il aurait pu être chauffé à une température supérieure à la température de transition de phase du phospholipide ou du mélange de phospholipides utilisé, si celle-ci avait été supérieure à la température ambiante, par exemple grâce à un bain dont la température aurait été régulée par un thermostat, - un module de filtration de tangentielle 7 équipé de deux manomètres 8 et 9 et d'une vanne, relié au premier et au deuxième récipient de façon à ce que la phase B s'écoule tangentiellement à la membrane et la phase A traverse la membrane pour rejoindre la phase B. Le montage est réalisé en circuit ouvert, c'est-à-dire qu'en sortie de la membrane, la suspension de liposomes n'est pas re-mélangée à la phase B. En sortie de la membrane, un circuit 10 permet l'évacuation vers un autre récipient 11. Les membranes utilisées sont des membranes SPG (SPG Technology, Miyazaki, Japan). Trois membranes SPG hydrophiles ont été testées de diamètre de pores 0,4 pm, 0,9 pm et 10,2 pm. La surface membranaire utile est de 3,9 10"3 m2. La phase phospholipidique A est constituée de 250 ml d'une solution d'éthanol, 20 ou 60 mg/ml de phospholipides (lécithine de jaune d'oeuf = 80% de phosphatidylcholine et 9% de phosphatidylethanolamine), et 20% (m/m par rapport à la masse de phospholipide) de cholestérol. La phase aqueuse B est constituée de 500 ml d'eau. Les paramètres opératoires (concentration en phospholipides, débit de la phase aqueuse B et pression de la phase phospholipidique A) sont indiqués dans le Tableau 1. Pour toutes les expériences, le débit de la phase aqueuse, Qc, et le débit de la phase dispersée, Qd, sont tels que (Qd=QcJ2), sauf pour l'expérience N°7 où Qd=QcJ1,6. Un échantillon de la suspension de liposomes obtenue est caractérisé par son diamètre moyen en nombre mesuré sur un Malvern Zetasizer Nano- series (Malvern Instruments Zen 3600, Malvern, UK). Les résultats (diamètre 3o moyen en nombre, indice de polydispersion et durée de la préparation) sont reportés dans le Tableau 1. Les temps de préparation sont très courts (entre 30 et 105 s pour 750 ml de suspension de liposomes), ce qui confirme les potentialités de ce procédé pour une application industrielle. Les diamètres moyens en nombre sont compris entre 60 et 200 nm, et les indices de polydispersion sont compris entre 0,17 et 0,32. Le diamètre moyen des vésicules peut être modifié par le choix de la concentration en phospholipide et les paramètres opératoires : la pression de la phase dispersée, et le rapport entre le débit de la phase aqueuse et le débit de la phase dispersée. Tableau 1 N° de Concentration en phospholipides (mg/ml) Membrane Pression de la phase l'expérience dispersée (bar) 1 20 SPG 0,4 pm 5,5 2 60 3 20 SPG 0,9 pm 3 4 60 5 20 SPG 10,2 pm 0,5 6 60 7 20 SPG0,9pm 3 8 20 5 Tableau 1 bis N° de (mi/min) Diamètre moyen en Indice de Durée expérience nombre (nm) polydispersion (-) (t) 1 290 66 0,284 105 2 98 0,317 3 700 61 0,171 45 4 100 0,264 1000 70 0,207 30 6 101 0,192 7 400 203 0,213 60 8 1200 96 0,167 25 Exemple 2 Deux principes actifs modèles ont été encapsulés en utilisant le procédé 5 de l'invention : le béclométhasone dipropionate et l'indométacine, qui sont deux principes actifs hydrophobes. Le montage expérimental est représenté sur la Figure 2. La membrane utilisée est une membrane SPG hydrophile (SPG Technology, Miyazaki, Japan) de diamètre moyen de pores 0,9 pm. La surface membranaire utile est de 3,9 10-3 m2. Le débit de la phase aqueuse, Qc, est égal à 400 ml/min et le débit de la phase dispersée, Qd, est tel que (Qd=Qc/2). La pression de la phase phospholipidique A est égale à 3 bar. La surface membranaire utile est de 3,9 10-3 m2. La phase phospholipidique A est constituée de 250 ml d'éthanol, 60 mg/ml de phospholipide (lécithine de jaune d'ceuf= 80% de phosphatidylcholine et 9% de phosphatidylethanolamine), 20% (w/w en phospholipide) de cholestérol, et du principe actif. La phase aqueuse B est constituée de 500 ml d'eau. 16 Les résultats obtenus sont reportés dans le Tableau 2. Les temps de préparation sont de nouveau très courts (50 s pour 750 ml de suspension de liposomes). Les diamètres moyens en nombre sont compris ente 85 et 105 nm avec un indice de polydispersion compris entre 0,25 et 0,30. L'efficacité d'encapsulation est très élevée pour le béclométhasone dipropionate (98,6 %). L'efficacité d'encapsulation est moins importante dans le cas de l'indométacine (63,4 %).

Tableau 2 Principes actifs Efficacité Diamètre moyen Indice de Durée (m9/ml) d'encapsulation en nombre (nm) polydispersion ( ) (t) (°) BDP (400 ug/ml) 98,6 1,04 87 0,307 50 IMC (10 mg/ml) 63,4 1,98 103 0,247 50 D'autres essais ont également été réalisés avec succès en utilisant un module de membranes fibres creuses : MiniModule 1x5.5 fourni par Liqui-Cel (Alternative Marketing, Hoerdt, France), contenant 2300 fibres d'un rayon 15 intérieur de 110 x 10-6 m, d'une longueur effective de 0,115 m, de surface 0,18 m2 et de taille de pores 0,03 mm. Des essais analogues à ceux de l'exemple 2 avec le module de membranes à fibres creuses ont également été réalisés avec la spironolactone, principe actif hydrophobe. Un taux d'encapsulation compris 20 entre 90 et 95 % a été obtenu avec une taille moyenne des liposomes entre 100 et 200 nm suivant les conditions opératoires (pression de la phase A et débit de la phase B). Des temps de préparation très rapide entre 40s et 1min30s pour 750 ml de suspension de liposomes on été mis en oeuvre.10

Claims (4)

1. REVENDICATIONS1- Procédé de préparation de liposomes, et en particulier de liposomes de diamètre inférieur à 1000nm, à partir : d'une première phase A liquide comportant un lipide amphiphile ou un mélange de lipides amphiphiles, en solution dans un solvant ou un mélange de solvants miscible à l'eau en toute proportion, et - d'une deuxième phase B liquide aqueuse, dans laquelle le(s) lipide(s) amphiphile(s) sont insoluble(s), les deux phases A et B étant maintenues à une température supérieure à la température de transition de phase du lipide amphiphile ou du mélange de lipides amphiphiles utilisé, caractérisé en ce que ledit procédé met en oeuvre un réacteur membranaire comportant une membrane poreuse, dans lequel la deuxième phase B circule tangentiellement à la membrane entre son entrée et sa sortie, et la première phase A située de l'autre côté de la membrane traverse, par application d'une pression, les pores de la membrane, pour former des liposomes de taille contrôlée qui se forment au contact de la deuxième phase B.
2. 2 - Procédé de préparation selon la revendication 1 caractérisé en ce que la phase A contient une substance active S soluble ou dispersible dans la phase A, de préférence choisie parmi un principe actif de médicament, un produit de contraste, un réactif biologique, un pigment, une encre, un lubrifiant, un agent de traitement de surface.
3. 3 - Procédé de préparation selon la revendication 2 caractérisé en ce que la substance active S est hydrophobe.
4. 4 - Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le contrôle de la taille des liposomes est obtenu par un passage unique au travers de la membrane, la suspension de liposomes obtenue après un seul passage de la première phase A au travers de la membrane n'étant pas soumis à un nouveau passage au travers d'unemembrane ou d'un quelconque orifice qui serait destiné à ajuster le diamètre des liposomes. - Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la deuxième phase B circule en circuit ouvert, de sorte 5 que la suspension de liposomes obtenue en sortie de la membrane n'est pas réinjectée dans la deuxième phase B, en amont de l'entrée de la membrane, mais est récupérée après la sortie de la membrane. 6 - Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la phase A comporte, en tant que lipide amphiphile ou mélange de lipides amphiphiles, un phospholipide ou un mélange de phospholipides. 7 - Procédé de préparation selon la revendication 6 caractérisé en ce que le phospholipide ou les phospholipides de la phase A sont choisis parmi la cardiolipine, la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, le phosphatidylinositol, la phosphatidylsérine, les plasmalogènes et la lécithine d'aeuf ou de soja. 8 - Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le solvant miscible à l'eau en toute proportion est un alcool, et de préférence l'éthanol. 9 - Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la deuxième phase B est essentiellement constituée d'eau, ou d'un mélange d'eau et d'un ou plusieurs non solvants du ou des phopholipide(s). 10 - Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la phase A contient du cholestérol, à raison de 30 à 50% de la masse totale de lipide(s) amphiphile(s) présent(s) au sein de la phase A. 11 - Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les liposomes formés présentent un diamètre inférieur à 1000 nm, préférentiellement à 500 nm, et de préférence compris entre 50 et 200 nm.