FR2956122A1

FR2956122A1 - Use of protein factor or nucleic acid encoding the protein factor, for suppressing the expression of genes encoding enzyme with alpha-1,6-fucosyltransferase activity, where the protein factor is e.g. transcription factor KLF15

Info

Publication number: FR2956122A1
Application number: FR1050867A
Authority: FR
Inventors: Sylvie Jorieux; Beatrice Catieau; Philippe Delannoy
Original assignee: LFB Biotechnologies SAS
Current assignee: LFB Biotechnologies SAS
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2011-08-12

Abstract

Use of a protein factor or a nucleic acid encoding the protein factor, for suppressing the expression of one or more genes encoding an enzyme with alpha -1,6 fucosyltransferase activity, where the protein factor is a transcription factor KLF15, particularly mammalian, or its variant having an amino acid identity of at least 80% with the transcription factor KLF15 and preserving the modulation properties of the transcription of the transcription factor KLF15 and a fragment of the transcription factor KLF15, is claimed. Use of a protein factor or a nucleic acid encoding the protein factor, for suppressing the expression of one or more genes encoding an enzyme with alpha -1,6 fucosyltransferase activity, where the protein factor is a transcription factor KLF15, particularly mammalian or its variant having an amino acid identity of at least 80% with the transcription factor KLF15 and preserving the modulation properties of the transcription of the transcription factor KLF15 and a fragment of the transcription factor KLF15, provided that such fragment contains the domain of DNA-binding of the transcription factor KLF15 and preserves the modulation properties of the transcription of the transcription factor KLF15, is claimed. Independent claims are included for: (1) transgenic cell transformed by a nucleic acid encoding the protein factor, provided that such fragment contains the field of DNA-binding of the transcription factor KLF15 and preserves the repression properties of the transcription of the transcription factor KLF15, where the cells express the antibodies, particularly monoclonal antibodies; (2) composition comprising a culture medium comprising: one or more transgenic cells; and antibodies having a rate of fucosylation lower than antibodies produced by the cell from which transgenic cell is obtained; (3) YB2/0 transgenic cell transformed by a transcription factor KLF15; and (4) preparing monoclonal antibodies comprising: transformation of a transgenic cell or a cell of a cell line, such as YB2/0 by at least one nucleic acid allowing the expression of an antibody, where the transgenic cell is transformed by a nucleic acid encoding the protein factor.

Description

UTILISATION D'UN REPRESSEUR D'UN GENE CODANT UNE ENZYME POSSEDANT UNE ACTIVITE GLYCOSYLTRANSFERASE La présente invention concerne la modulation de l'expression d'un gène codant pour une en- zyme à activité glycosyltransférase, en particulier l'utilisation d'un répresseur de la transcription pour la production d'anticorps monoclonaux. The present invention relates to the modulation of the expression of a gene encoding an enzyme with glycosyltransferase activity, in particular the use of a repressor of a gene which encodes a glycosyltransferase enzyme. transcription for the production of monoclonal antibodies.

Les anticorps monoclonaux appartiennent à une classe importante de produits biothérapeutiques et représentent un marché considérable. La production des anticorps monoclonaux est aujourd'hui réalisée dans des lignées cellulaires, principalement la lignée de hamster CHO, qui est devenue depuis les années 1980 un standard de production. Une partie non négligeable des anticorps monoclonaux actuellement sur le marché ou en cours de développement est destinée au traitement des cancers ou de certaines maladies anti-inflammatoires et agissent via un mécanisme de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendant des anticorps (Antibody dependent cell cytotoxicity - ADCC). Monoclonal antibodies belong to a large class of biotherapeutic products and represent a considerable market. The production of monoclonal antibodies is now carried out in cell lines, mainly the CHO hamster line, which has become since the 1980s a production standard. A significant portion of the monoclonal antibodies currently on the market or under development are intended for the treatment of cancers or certain anti-inflammatory diseases and act via an antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism (ADCC). .

L'activité biologique de certaines immunoglobulines G est dépendante de la structure des oligosaccharides présents sur la molécule, et notamment sur sa partie Fc. Ainsi, les molécules IgG de toutes les sous-classes humaines et murines possèdent un N-glycanne fixé au domaine CH2 de chaque chaîne lourde (par exemple sur le résidu Asn 297 pour les IgG humaines). L'influence de cette chaîne glycannique sur la capacité de l'anticorps à interagir avec des molécules effectrices (récepteurs Fc et complément) a été démontrée par des travaux antérieurs (pour revue: Jefferis R. Nat Rev Drug Discov 2009, 8:226-34). Notamment, il a été montré que la quantité de fucose lié en a1,6 sur le premier résidu de N- acétylglucosamine du point d'attache des glycannes présent sur les anticorps est inversement proportionnelle à l'activité ADCC de ces mêmes anticorps (Shields RL, et al. J Biol Chem 2002, 277:26733-26740; Shinkawa T, et al. J Biol Chem 2003, 278:3466-3473; Niwa et al., Clin Cancer Res 2004, 10:6248-6255). Aussi, il convient de fournir des méthodes permettant de réduire cette fucosylation en a1,6 afin de produire des anticorps plus actifs, donc des thérapies plus efficaces. Plusieurs tentatives de diminution de l'activité fucosyltransférase cellulaire ont été décrites dans l'art antérieur. The biological activity of certain immunoglobulins G is dependent on the structure of the oligosaccharides present on the molecule, and in particular on its part Fc. Thus, the IgG molecules of all the human and murine subclasses have an N-glycan attached to the CH2 domain of each heavy chain (for example, on the Asn 297 residue for human IgGs). The influence of this glycan chain on the ability of the antibody to interact with effector molecules (Fc receptors and complement) has been demonstrated by previous work (for review: Jefferis R. Nat Rev Drug Discov 2009, 8: 226- 34). In particular, it has been shown that the amount of fucose bound in a1,6 on the first residue of N-acetylglucosamine of the point of attachment of glycans present on the antibodies is inversely proportional to the ADCC activity of these same antibodies (Shields RL , et al., J Biol Chem 2002, 277: 26733-26740, Shinkawa T, et al J Bio Chem 2003, 278: 3466-3473, Niwa et al., Clin Cancer Res 2004, 10: 6248-6255). Also, it is necessary to provide methods to reduce this fucosylation to a1,6 to produce more active antibodies, thus more effective therapies. Several attempts to decrease cellular fucosyltransferase activity have been described in the prior art.

La demande internationale WO 09/009086 décrit des cellules comportant une séquence nucléotidique comprenant un gène codant pour une protéine de fusion constituée d'un domaine protéique à doigt de zinc (« Zinc Finger ») de liaison à l'ADN, capable de se lier à un site du gène fut8 codant l'al,6-fucosyltransférase, et d'un domaine de clivage permettant de cliver le gène fut8, le rendant ainsi inactif. International application WO 09/009086 discloses cells comprising a nucleotide sequence comprising a gene coding for a fusion protein consisting of a zinc finger protein domain ("Zinc Finger") of DNA binding, capable of binding at a site of the α8-encoding α1,6-fucosyltransferase gene, and a cleavage domain for cleaving the fut8 gene, thereby rendering it inactive.

Cependant, cette méthode visant à cliver l'ADN codant le gène de cette fucosyltransférase risque d'induire une instabilité génomique des cellules, et in fine conduire à la mort cellulaire. However, this method for cleaving the DNA coding for the fucosyltransferase gene risks inducing genomic instability of the cells, and ultimately lead to cell death.

Les demandes internationales WO 08/145138, WO 09/012173, WO 08/077547, WO 06/133148, WO 06/013964 et WO 05/035778 décrivent la production d'anticorps par des lignées cellulaires dans lesquelles l'activité enzymatique de l'al,6-fucosyltransférase est inhibée par des petits ARN interférants (small inhibiting RNA û siRNA). D'autres exemples, tels que les demandes internationales WO 05/035778, WO 06/013964 et WO 08/112092, décrivent l'introduction d'ARN interférents dans des cellules produisant des anticorps, afin de diminuer l'activité enzymatique de l'al,6-fucosyltransférase. Cependant, ces techniques d'inhibition utilisant des ARNs ne sont pas facilement manipulables, et présentent des inconvénients quant à la stabilité de la diminution de l'activité fucosyltransférase au cours du temps. International applications WO 08/145138, WO 09/012173, WO 08/077547, WO 06/133148, WO 06/013964 and WO 05/035778 describe the production of antibodies by cell lines in which the enzymatic activity of the al, 6-fucosyltransferase is inhibited by small interfering RNAs (small inhibiting RNA siRNA). Other examples, such as international applications WO 05/035778, WO 06/013964 and WO 08/112092, describe the introduction of interfering RNAs into cells producing antibodies, in order to reduce the enzymatic activity of the al, 6-fucosyltransferase. However, these inhibition techniques using RNAs are not easily manipulated, and have disadvantages as to the stability of the decrease in fucosyltransferase activity over time.

Aussi, il est nécessaire de trouver des moyens efficaces, ne présentant pas les inconvénients précités, pour inhiber l'expression et/ou l'activité de l'al,6-fucosyltransférase cellulaire lors de la production d'anticorps. Also, it is necessary to find effective means, not having the aforementioned drawbacks, for inhibiting the expression and / or the activity of cellular α1,6-fucosyltransferase during the production of antibodies.

L'un des buts de l'invention est donc de fournir un moyen efficace de réduction ou d'inhibition de l'activité de l'al,6-fucosyltransférase des cellules, tout en conservant une stabilité génétique. Un autre but de l'invention est de fournir des moyens permettant de contrôler la diminution de l'activité de 1' al,6-fucosyltransférase cellulaire. One of the aims of the invention is therefore to provide an effective means of reducing or inhibiting the activity of al, 6-fucosyltransferase cells, while maintaining a genetic stability. Another object of the invention is to provide means for controlling the decrease in cellular al, 6-fucosyltransferase activity.

Un autre but de l'invention est de fournir des cellules possédant, de manière stable au cours des divisions, une activité de l'al,6-fucosyltransférase diminuée et/ou contrôlée. Enfin, un autre but de l'invention est de fournir un procédé de production d'anticorps possédant une activité ADCC augmentée. Another object of the invention is to provide cells having, stably during divisions, decreased and / or controlled al, 6-fucosyltransferase activity. Finally, another object of the invention is to provide a method for producing antibodies having increased ADCC activity.

L'invention concerne l'utilisation • d'un facteur protéique • ou d'un un acide nucléique codant ledit facteur protéique pour la répression de l'expression d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme à activi- té a1,6 fucosyltransférase, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80 % avec ledit facteur de transcription KLF15, et conservant les propriétés de modulation de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de modulation de la transcription dudit facteur de transcription KLF15. The invention relates to the use of a protein factor or a nucleic acid encoding said protein factor for the repression of the expression of one or more genes coding for an enzyme having a 1,6 fucosyltransferase activity. said protein factor being selected from: • a KLF15 transcription factor, in particular a mammalian factor, • a variant of said KLF15 transcription factor, said variant having an amino acid identity of at least 80% with said KLF15 transcription factor, and retaining the transcriptional modulation properties of said KLF15 transcription factor, • a fragment of said KLF15 transcription factor, provided that said fragment contains the DNA binding domain of said KLF15 transcription factor and retains the transcriptional modulation properties said transcription factor KLF15.

L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que le facteur de transcription KLF15 est capable de moduler l'expression, et notamment d'inhiber 20 l'expression, d'un ou plusieurs gènes codant des enzymes possédant une activité a1,6 fucosyl- transférase. Le facteur de transcription KLF15 est un facteur de transcription possédant des propriétés à la fois d'activateur de la transcription de gènes, notamment le gène Glut4 (Gray S, et al., J Biol Chem 2002, 277:34322-34328), mais également de répresseur de la transcription notamment 25 le gène de l'adrénomodulline (Nagare T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2009, 379:98-103). A ce jour, aucun lien n'a été fait entre les gènes codant des protéines à activité fucosyltransférase et la régulation par le facteur KLF15. Le principe sur lequel repose l'invention est donc d'augmenter la quantité de facteur KLF15 30 afin d'augmenter son effet modulateur sur l'expression des gènes codant des a1,6 fucosyltransférases, et notamment d'augmenter la quantité de facteur KLF15 pour réprimer l'expression desdits gènes. 15 KLF15, également appelé KKLF, est un membre de la famille des facteurs de transcription de la famille KLF (Krüppel Like Factors) comprenant un motif (ou domaine) en doigt de zinc typique de la famille : 3 doigts de zinc très conservés. Ce motif en 3 doigts de zincs est responsable de la liaison à l'ADN du facteur. The invention is based on the surprising finding made by the inventors that the KLF15 transcription factor is capable of modulating the expression, and in particular of inhibiting the expression, of one or more genes encoding enzymes having a1 activity, Fucosyltransferase. The transcription factor KLF15 is a transcription factor possessing properties of both gene transcription activator, notably the Glut4 gene (Gray S, et al., J Biol Chem 2002, 277: 34322-34328), but also a transcription repressor including the adrenomodullin gene (Nagare T, et al., Biochem Biophys Res Commun 2009, 379: 98-103). To date, no link has been made between genes encoding fucosyltransferase-active proteins and regulation by the KLF15 factor. The principle on which the invention is based is therefore to increase the amount of KLF15 factor in order to increase its modulatory effect on the expression of genes encoding α1,6 fucosyltransferases, and in particular to increase the amount of KLF15 factor for suppress the expression of said genes. KLF15, also known as KKLF, is a member of the KLF (Krüppel Like Factors) family of transcription factors comprising a zinc finger motif (or domain) typical of the family: 3 highly conserved zinc fingers. This 3-finger zinc motif is responsible for the DNA binding of the factor.

La caractérisation de la formation du complexe entre l'ADN de fut8 et du facteur KLF15, ou d'un de ses variants, ou encore d'un de ses fragments comprenant au moins le domaine à doigts de zinc, se fait aisément par des techniques connues de l'homme de métier telles que la protection à la DNase (DNase Protection Assay - DPA), le retard sur gel (ElectroMobility Shift Assay - EMSA), les immunoprécipitations de chromatine (Chromatine ImmunoPrecipi- tation - ChIP), et d'autres. Dans l'invention le terme «réprimer l'expression » signifie diminuer ou réprimer la transcription, c'est-à-dire diminuer ou réprimer le taux de transcription du gène. Une telle diminution de l'expression d'un gène peut être aisément mesurée par des techniques quantitatives comme la technique Northern-blot, ou la transcription inverse couplée à la PCR quantitative (quanti- tative Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction - qRT-PCR). Par taux de transcription, l'homme de métier comprend qu'il s'agit du nombre de molécules d'ARN messager, sous contrôle de la machinerie de transcription, produit par un gène déterminé. Quand on parle de l'ADN de fut8 et du facteur KLF15, les termes « liaison », « fixation » et 20 « formation d'un complexe » sont équivalents. Par « d'un ou plusieurs gènes codant une enzyme à activité a1,6 fucosyltransférase », on en-tend dans l'invention le ou les gènes codant des enzymes capables de transférer un résidu de fucose, en position a1,6 du premier résidu de N-acétylglucosamine du noyau (core) pentasaccharidique des N-glycannes lié sur le résidu d'Asn de la chaîne polypeptidique. 25 Les fucosyltransférases sont codées par les gènes de la famille fut : fut] à fut13. Par convention dans l'invention, les gènes codant les fucosyltransférases seront indiqués en italique (fut), et les protéines produites de ces gènes seront notées en majuscule (FUT). La protéine FUT8 de vertébrés est une al,6-fucosyltransférase qui transfère un résidu de fucose en position a1,6 du premier résidu de N-acétyl-glucosamine du noyau (core) pentasac- 30 charidique des N-glycannes lié sur le résidu d'Asn de la chaîne polypeptidique. Le facteur KLF15 selon l'invention concerne un facteur KLF15 issu de n'importe laquelle des espèces animales l'exprimant, et notamment de mammifère d'oiseau, de batracien ou de pois-son. The characterization of the complex formation between the DNA of fut8 and of the KLF15 factor, or of one of its variants, or of one of its fragments comprising at least the zinc finger domain, is easily done by techniques Known to those skilled in the art such as DNase protection (DNase Protection Assay - DPA), gel delay (ElectroMobility Shift Assay - EMSA), immunoprecipitations of chromatin (Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP)), and other. In the invention the term "repress expression" means decrease or repress transcription, that is to say reduce or suppress the gene transcription rate. Such a decrease in gene expression can be readily measured by quantitative techniques such as the Northern blot technique, or reverse transcription coupled with quantitative quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). . By transcription rate, one skilled in the art understands that it is the number of messenger RNA molecules, under the control of the transcription machinery, produced by a specific gene. When speaking of fut8 DNA and KLF15 factor, the terms "binding", "binding" and "complexing" are equivalent. By "one or more genes coding for an enzyme having 1,6-fucosyltransferase activity", it is understood in the invention the gene (s) coding for enzymes capable of transferring a fucose residue, at position 1,6 of the first residue. of N-acetylglucosamine of the N-glycans pentasaccharide core (core) bound on the Asn residue of the polypeptide chain. The fucosyltransferases are encoded by the genes of the family: was] to fut13. By convention in the invention, the genes encoding fucosyltransferases will be indicated in italics (fut), and the proteins produced from these genes will be noted in capital letters (FUT). The vertebrate FUT8 protein is an α1,6-fucosyltransferase which transfers a fucose residue at the α1,6 position of the first N-acetylglucosamine residue of the N-glycans linked N-glycansamine core (pentasacharide). Asn of the polypeptide chain. The KLF15 factor according to the invention relates to a KLF15 factor derived from any of the animal species expressing it, and in particular from a bird, a batrachian or a pea-son mammal.

KLF15 peut être utilisé sous forme de protéine recombinante produite in vitro, dans une bactérie, une cellule de mammifère ou une cellule d'insecte, ou encore par synthèse chimique, ou synthèse biologique in vitro, tels que les lysats de réticulocytes de lapin ou des lysats de germe de blé. KLF15 can be used as a recombinant protein produced in vitro, in a bacterium, a mammalian cell or an insect cell, or by chemical synthesis, or in vitro biological synthesis, such as rabbit reticulocyte lysates or lysates of wheat germ.

KLF15 peut être utilisé sous forme de protéine peut bien évidemment être fusionné à une étiquette de purification courrament utilisée par l'homme de métier, notamment les étiquettes HA, Myc, 6His-Tag ou GST. Ces exemples sont bien entendu illustratifs et ne sauraient être pris en compte comme des limitations. KLF15 peut également être utilisé sous forme d'un acide nucléique contenant la séquence 10 codante dudit facteur KLF15, sous contrôle des éléments permettant son expression. Ce mode de réalisation sera détaillé ci-après. KLF15 can be used in the form of protein can obviously be fused to a purification label commonly used by those skilled in the art, including labels HA, Myc, 6His-Tag or GST. These examples are of course illustrative and can not be taken into account as limitations. KLF15 can also be used in the form of a nucleic acid containing the coding sequence of said KLF15 factor, under control of the elements allowing its expression. This embodiment will be detailed below.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation précédemment définie, où ledit facteur protéique réprime l'expression d'un ou plusieurs gènes codant 15 une enzyme à activité a1,6 fucosyltransférase en se liant à une séquence d'acide nucléique, en particulier une séquence d'acide nucléique intervenant dans la régulation du ou desdits gènes, ladite séquence d'acide nucléique étant plus particulièrement localisée en 5' du ou desdits gènes. In another advantageous embodiment, the invention relates to the previously defined use, wherein said protein factor represses the expression of one or more genes encoding an α1,6 fucosyltransferase enzyme by binding to a sequence of nucleic acid, in particular a nucleic acid sequence involved in the regulation of said gene (s), said nucleic acid sequence being more particularly localized at 5 'of said gene (s).

20 Selon l'invention, le facteur de transcription KLF15 est capable de réprimer l'expression des gènes codant des enzymes possédant une activité a1,6 fucosyltransférase en se fixant sur une séquence d'ADN déterminée, appelée séquence cible ou séquence de liaison, qui peut être comprise : - soit dans la partie promotrice du gène, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 1000 bases 25 en 5' du site d'initiation de la transcription, - soit dans des régions régulatrices qui peuvent se situer dans les introns, ou dans des séquences très éloignées sur le génome du gène à réguler. Ces régions éloignées sont appelées enhancer ou silencer en fonction de leur capacité à augmenter ou diminuer l'expression des gènes. 30 La présente invention concerne plus particulièrement une régulation, en particulier une inhibition, impliquant la fixation de KLF15 sur une séquence cible située dans le promoteur des gènes codant des enzymes possédant une activité a1,6 fucosyltransférase. According to the invention, transcription factor KLF15 is capable of repressing the expression of genes coding for enzymes having α1,6 fucosyltransferase activity by binding to a determined DNA sequence, called a target sequence or linker sequence, which can be included: either in the promoter part of the gene, that is to say from about 10 to about 1000 bases 5 'of the transcription initiation site, or in regulatory regions which can located in the introns, or in very distant sequences on the genome of the gene to be regulated. These remote areas are called enhancer or silencer based on their ability to increase or decrease gene expression. The present invention more particularly relates to regulation, in particular inhibition, involving the binding of KLF15 to a target sequence located in the promoter of genes encoding enzymes having α1,6 fucosyltransferase activity.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation selon la définition précédente, où ladite séquence d'acide nucléique comprend ou consiste en l'une quel-conque des séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO 10. In another advantageous embodiment, the invention relates to the use according to the preceding definition, wherein said nucleic acid sequence comprises or consists of any one of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO 10.

La séquence de fixation de KLF15 peut être constituée d'un motif consensus de séquence 5'-CNCCNCCCC-3' SEQ ID NO 1 ou de son complémentaire 5'- GGGGNGGNG -3' SEQ ID NO 2. The KLF15 binding sequence may consist of a consensus motif of sequence 5'-CNCCNCCCC-3 'SEQ ID NO 1 or its complement 5'-GGGGNGGNG -3' SEQ ID NO 2.

Les séquences susmentionnées correspondent, ou sont constituées de, aux séquences suivan-10 tes : - la séquence consensus 5'-CNCCNCCCC-3' SEQ ID NO 1 ou de son complémentaire 5'-GGGGNGGNG -3' SEQ ID NO 2, où N représente un A, un T, un G ou un C, - la séquence 5'-CACCC-3' SEQ ID NO : 3 et son complémentaire 5'- GGGTG -3' SEQ ID NO 4, 15 - la séquence 5'-cgggagGGGGcggcggg-3' SEQ ID NO 5 et son complémentaire 5'-ggtgctGGGGtggagga-3' SEQ ID NO 6, - la séquence 5'-gtgggaGGGGtgctggg-3' SEQ ID NO 7 et son complémentaire 5'-cccgccgccccctcccg-3' SEQ ID NO 8, - la séquence 5'-tcctccaccccagcacc-3' SEQ ID NO 9 et son complémentaire 20 5'-cccagcacccctcccac-3' SEQ ID NO 10. Chacune des séquences nucléotidiques susmentionnées est capable, notamment sous forme double brin, de lier le facteur KLF15 : il s'agit des séquences cibles de KLF15. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne l'utilisation définie précé-25 demment, où ladite enzyme à activité a1,6- est codée par le gène fut8. Plus particulièrement, l'invention concerne la répression de l'expression du gène fut8 par la fixation du facteur KLF15 sur sa séquence cible, ladite séquence cible étant notamment con-tenue dans le promoteur dudit gène fut8. The aforementioned sequences correspond to, or consist of, the following sequences: the consensus sequence 5'-CNCCNCCCC-3 'SEQ ID NO 1 or its complement 5'-GGGGNGGNG -3' SEQ ID NO 2, where N represents an A, a T, a G or a C, the sequence 5'-CACCC-3 'SEQ ID NO: 3 and its complement 5'-GGGTG -3' SEQ ID NO 4, the sequence 5'- cgggagGGGGcggcggg-3 'SEQ ID NO 5 and its complement 5'-ggtgctGGGGtggagga-3' SEQ ID NO 6, the sequence 5'-gtgggaGGGGtgctggg-3 'SEQ ID NO 7 and its complement 5'-cccgccgccccctcccg-3' SEQ ID NO 8, the sequence 5'-tcctcccccccccc-3 'SEQ ID NO 9 and its complement 5'-cccagcaccccccccac-3' SEQ ID NO 10. Each of the aforementioned nucleotide sequences is capable, particularly in double-stranded form, of binding the factor KLF15: These are the target sequences of KLF15. Another advantageous embodiment of the invention relates to the use defined above, where said enzyme with a1,6- activity is encoded by the gene fut8. More particularly, the invention relates to the repression of the expression of the fut8 gene by the binding of the KLF15 factor to its target sequence, said target sequence being in particular held in the promoter of said fut8 gene.

30 Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation mentionnée ci-dessus, où ledit facteur de transcription KLF15 comprend ou consiste en une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17, et notamment la séquence SEQ ID NO : 11. Les facteurs de transcription KLF15 objets de la présente invention sont les facteurs KLF15 humain (SEQ IDNO 11), - de rat (SEQ ID NO 12), de souris (SEQ ID NO 13), de chien (SEQ IDNO 14), aviaire, notamment de poule (SEQ ID NO 15), de xénope (SEQ ID NO 16), et - de poisson zèbre (SEQ ID NO 17). In another advantageous embodiment, the invention relates to the use mentioned above, wherein said KLF15 transcription factor comprises or consists of an amino acid sequence selected from the following sequences: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, and in particular the sequence SEQ ID NO: 11. Transcription Factors KLF15 Objects of the present invention are the human factors KLF15 (SEQ ID NO: 11), rat (SEQ ID NO: 12), mouse (SEQ ID NO: 13), dog (SEQ ID NO: 14), avian, in particular hen (SEQ ID NO. ID NO 15), Xenopus (SEQ ID NO: 16), and - Zebrafish (SEQ ID NO: 17).

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation définie précédemment, où ledit gène codant une enzyme à activité fucosyltransférase est contenu dans une cellule, ou une cellule d'une lignée cellulaire, notamment une cellule de mammifère ou de lignée cellulaire de mammifère, ledit gène étant en particulier contenu dans le génome de la-dite cellule ou cellule de lignée cellulaire. Le facteur KLF15, sous forme de protéine recombinante tel que défini ci-dessus, peut être introduit dans les cellules par les techniques connues de l'homme de métier : électroporation, utilisation de liposomes, de microsphères, de protéines de fusion avec un domaine de trans- duction des protéines (protein transduction domain û PTD) et des protéines d'origine virale, notamment la protéine TAT du VIH-1. Ces exemples sont bien connus de l'homme de métier et sont bien entendu non limitatifs. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le facteur KLF15 est introduit dans une cellule sous la forme d'un acide nucléique qui est transcrit et traduit et permet la synthèse 25 dudit facteur KLF15. Cet acide nucléique peut être notamment contenu dans un vecteur permettant son expression, peut être sous contrôle d'éléments de régulation non régulables, ou constitutifs, tels que les promoteurs forts du cytomégalovirus (CMV), le promoteur du gène EFla (EF1a), le promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur de l'Ubiquitine (Ub) ou tout autre 30 promoteur fort connu de l'homme de métier. Une alternative est l'utilisation de promoteurs régulables tels que les promoteurs régulés par la tétracycline (Tet ON ou Tet OFF), ou tout autre promoteur régulable connu de l'homme de métier. In another advantageous embodiment, the invention relates to the use defined above, in which said gene coding for an enzyme with fucosyltransferase activity is contained in a cell, or a cell of a cell line, in particular a mammalian or lineage cell. mammalian cell, said gene being in particular contained in the genome of said cell or cell line cell. The factor KLF15, in the form of a recombinant protein as defined above, can be introduced into the cells by the techniques known to those skilled in the art: electroporation, use of liposomes, microspheres, fusion proteins with a field of protein transduction domain (PTD) and proteins of viral origin, including the HIV-1 TAT protein. These examples are well known to those skilled in the art and are of course not limiting. In an advantageous embodiment of the invention, the KLF15 factor is introduced into a cell in the form of a nucleic acid which is transcribed and translated and allows the synthesis of said KLF15 factor. This nucleic acid may in particular be contained in a vector allowing its expression, may be under the control of non-regulatable or constitutive regulatory elements, such as the strong promoters of cytomegalovirus (CMV), the promoter of the EFla gene (EF1a), the Rous sarcoma virus (RSV) promoter, the Ubiquitin (Ub) promoter or any other promoter well known to those skilled in the art. An alternative is the use of regulatable promoters such as tetracycline-regulated promoters (Tet ON or Tet OFF), or any other regulatable promoter known to those skilled in the art.

Bien évidemment ledit vecteur contient toutes les séquences permettant une bonne transcription de l'acide nucléique, tel que des terminateurs de la transcription ou autres séquences bien connues de l'homme de métier Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le facteur KLF15, sous contrôle de son promo- teur fort, peut être intégré dans le génome de la cellule dans laquelle il a été introduit, de telle sorte qu'au cours des divisions cellulaires de ladite cellule, l'acide nucléique soit transmis de manière stable aux générations de cellules filles. Obviously, said vector contains all the sequences allowing a good transcription of the nucleic acid, such as transcription terminators or other sequences well known to those skilled in the art. More particularly, the nucleic acid coding for the KLF15 factor, under control of its strong promoter, can be integrated into the genome of the cell into which it has been introduced, so that during cellular divisions of said cell, the nucleic acid is stably transmitted to the cell generations girls.

Une alternative est un vecteur contenant l'acide nucléique codant le facteur KLF15, les sé- quences permettant son expression, et des séquences permettant la réplication dudit vecteur, afin de permettre une réplication autonome dudit vecteur, indépendamment de la réplication du génome de la cellule hôte. An alternative is a vector containing the nucleic acid encoding the KLF15 factor, the sequences allowing its expression, and sequences allowing the replication of said vector, in order to allow an autonomous replication of said vector, independently of the replication of the genome of the cell. host.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne l'utilisation précédente où ladite cellule, ou cellule de lignée cellulaire est choisie parmi, les cellules CHO, les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0, des lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NSO ou SP2/0-Ag14, les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, les cellules HEK293, les cellules BHK, des hybridomes, des cellules Jurkat, des cellules NIH3T3, des cellules COS, ou des cellules Hela ou des cellules aviaires, notamment les cellules EB66. Another advantageous embodiment of the invention relates to the preceding use in which said cell, or cell line cell, is chosen from CHO cells, rat myeloma cells, in particular the YB2 / 0 line, cell lines and mouse myeloma, including NSO or SP2 / 0-Ag14, PER.C6 human retinoblastoma cells, HEK293 cells, BHK cells, hybridomas, Jurkat cells, NIH3T3 cells, COS cells, or Hela cells or avian cells, especially EB66 cells.

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, où ledit facteur protéique est présent en une quantité au moins environ égale, notamment au moins environ supérieure à celle du facteur protéique exprimé de manière endogène par ladite cellule, ou cellule de lignée cellulaire, préférentiellement en une quantité au moins une fois supé- rieure, plus préférentiellement environ au moins deux fois supérieure, à celle du facteur de facteur protéique exprimé de manière endogène par ladite cellule, ou cellule de lignée cellulaire. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, lorsque ladite cellule ou cellule de lignée exprime le facteur KLF15 naturellement, le facteur KLF15 exogène est ajouté dans une quantité au moins environ égale à la quantité initialement présente dans la ladite cellule ou cellule de lignée. B De plus, lorsque ladite cellule ou cellule de lignée n'exprime pas naturellement de facteur KLF15 endogène, la simple introduction dudit facteur a un effet sur la régulation de l'expression du gène fut8. Advantageously, the invention relates to the use as defined above, wherein said protein factor is present in an amount at least approximately equal, in particular at least approximately greater than that of the protein factor expressed endogenously by said cell, or cell. of the cell line, preferably in an amount at least once greater, more preferably at least about two times greater, than that of the protein factor factor endogenously expressed by said cell, or cell line cell. Thus, in an advantageous embodiment of the invention, when said cell or cell line expresses the factor KLF15 naturally, the exogenous KLF15 factor is added in an amount at least approximately equal to the amount initially present in the said cell or cell lineage. In addition, when said cell or cell line does not naturally express endogenous KLF15 factor, the mere introduction of said factor has an effect on the regulation of the expression of gene fut8.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation défi-nie précédemment, pour la production d'anticorps monoclonaux, lesdits anticorps monoclonaux présentant un taux de fucosylation inférieur au taux de fucosylation des anticorps pro-duits par ladite cellule ou cellule de lignée cellulaire exprimant une quantité endogène de facteur protéique. In yet another advantageous embodiment, the invention relates to the use previously defined for the production of monoclonal antibodies, said monoclonal antibodies having a fucosylation rate lower than the fucosylation rate of the antibodies produced by said cell. or cell line cell expressing an endogenous amount of protein factor.

Le facteur de transcription KLF15 est capable d'inhiber l'expression du gène fut8 codant un enzyme possédant une activité 1,6 fucosyltransférase. Ainsi, la quantité de protéine FUT8 et l'activité globale a1,6 fucosyltransférase de la cellule seront diminuées. Il est donc intéressant d'utiliser le facteur KLF15 dans des cellules produisant des anticorps afin de réduire leur fucosylation par l'enzyme FUT8, et ainsi augmenter leur capacité à lier les récepteur Fcyl11, et donc leur ADCC. The KLF15 transcription factor is capable of inhibiting the expression of the fut8 gene encoding an enzyme having a 1,6 fucosyltransferase activity. Thus, the amount of FUT8 protein and the overall α1,6 fucosyltransferase activity of the cell will be decreased. It is therefore of interest to use the KLF15 factor in antibody-producing cells in order to reduce their fucosylation by the FUT8 enzyme, and thus increase their ability to bind Fcyl11 receptors, and hence their ADCC.

Un autre aspect de l'invention concerne une cellule transgénique transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, lesdites cellules exprimant des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux. Another aspect of the invention relates to a transgenic cell transformed with a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being chosen from: a transcription factor KLF15, in particular from a mammal, a variant of said transcription factor KLF15, said variant having an amino acid identity of at least 80% with said KLF15 transcription factor and retaining the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor, and • a fragment of said KLF15 transcription factor, provided that said fragment contains the DNA binding domain of said KLF15 transcription factor and retains the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor, said cells expressing antibodies, including monoclonal antibodies.

Dans l'invention, l'expression « cellules exprimant des anticorps » signifie que ladite cellule exprime au moins un anticorps, mais peu exprimer plusieurs anticorps différents. Ces cellules transgéniques sont appelées «cellules transformées par KLF15 ». In the invention, the expression "cells expressing antibodies" means that said cell expresses at least one antibody, but can express several different antibodies. These transgenic cells are called "KLF15 transformed cells".

Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule transformée par KLF15 où ladite cellule transgénique est issue de la transformation par un acide nucléique codant un facteur protéique d'une cellule choisie parmi les cellules suivantes : • les cellules CHO, • les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0 • les lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NS0 ou SP2/0-Ag14, • des hybridomes, produisant des anticorps, • les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, • les cellules HEK293, et • les cellules BHK • les cellules aviaires, notamment les cellules EB66 Toutes les cellules susmentionnées expriment, en plus du facteur KLF15 transgénique, au moins un anticorps, notamment un anticorps monoclonal, et éventuellement expriment des anticorps. In an advantageous embodiment, the invention relates to a cell transformed with KLF15 wherein said transgenic cell is derived from the transformation with a nucleic acid encoding a protein factor of a cell selected from the following cells: CHO cells, rat myeloma cells, especially the YB2 / 0 line; mouse myeloma cell lines, in particular NS0 or SP2 / 0-Ag14; hybridomas, producing antibodies; PER.C6 human retinoblastoma cells; HEK293 cells, and • BHK cells • avian cells, in particular EB66 cells All the aforementioned cells express, in addition to the transgenic KLF15 factor, at least one antibody, in particular a monoclonal antibody, and optionally express antibodies.

Par « expriment des anticorps », on entend dans l'invention que les cellules sont capables de synthétiser et éventuellement de sécréter dans le milieu de culture au moins un anticorps, c'est-à-dire un dimère de chaînes légères et chaînes lourdes bien connu de l'homme de métier. Comme mentionné précédemment, lesdites cellules peuvent le cas échéant exprimer plusieurs anticorps différents. By "expressing antibodies" is meant in the invention that the cells are capable of synthesizing and optionally secreting in the culture medium at least one antibody, that is to say a dimer of light and heavy chains well. known to those skilled in the art. As mentioned above, said cells may, where appropriate, express several different antibodies.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la cellule transgénique transformée par KLF15, notamment choisie parmi les cellules CHO, les cellules de myélome de rat, notamment la lignée YB2/0, les lignées cellulaires de myélome de souris, notamment NSO ou SP2/0-Ag14, les cellules de rétinoblastome humain PER.C6, les cellules HEK293, et les cel- Iules BHK, est également transformée par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps monoclonal. In an advantageous embodiment of the invention, the transgenic cell transformed with KLF15, in particular chosen from CHO cells, rat myeloma cells, in particular the YB2 / 0 line, and mouse myeloma cell lines, in particular NSOs or SP2 / 0-Ag14, PER.C6 human retinoblastoma cells, HEK293 cells, and BHK cells, is also transformed with at least one nucleic acid allowing the expression of a monoclonal antibody.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule transgénique issue de la lignée YB2/0, transformée par un facteur de transcription KLF15, notamment de 30 mammifère, et exprimant des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux. In another advantageous embodiment, the invention relates to a transgenic cell derived from the YB2 / 0 line, transformed by a transcription factor KLF15, in particular a mammalian, and expressing antibodies, in particular monoclonal antibodies.

L'invention concerne également une cellule transgénique YB2/0 transformée par un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère. The invention also relates to a transgenic cell YB2 / 0 transformed by a transcription factor KLF15, especially mammalian.

La cellule transgénique selon l'invention est une cellule YB2/0 transformée par un facteur de transcription KLF15 issu de vertébré, notamment de mammifère, notamment choisi parmi, l'homme, le rat, la souris, le chien, la poule, le Xénope et le poisson Zèbre, respectivement correspondant aux séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 17. The transgenic cell according to the invention is a YB2 / 0 cell transformed by a transcription factor KLF15 derived from vertebrate, in particular from a mammal, in particular chosen from the human, the rat, the mouse, the dog, the hen, the Xenopus and Zebrafish, respectively corresponding to amino acid sequences SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 17.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une cellule transgénique définie précédemment, ladite cellule transgénique étant avantageusement issue de la lignée YB2/0. La lignée cellulaire avantageuse de l'invention est la lignée YB2/0 disponible à 1'ATCC sous le numéro n° CRL 1662. In another embodiment, the invention relates to a transgenic cell defined above, said transgenic cell being advantageously derived from the YB2 / 0 line. The advantageous cell line of the invention is the YB2 / 0 line available from ATCC under number CRL 1662.

L'invention a également pour objet un animal transgénique constitué d'au moins une cellule transgénique, transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, ladite cellule transgénique produisant éventuellement en plus des anticorps monoclonaux. The subject of the invention is also a transgenic animal consisting of at least one transgenic cell, transformed with a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being chosen from: • a transcription factor KLF15, in particular a mammalian, • a variant said transcription factor KLF15, said variant having an amino acid identity of at least 80% with said KLF15 transcription factor and retaining the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor, and • a fragment of said KLF15 transcription factor provided that said fragment contains the DNA binding domain of said KLF15 transcription factor and retains the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor, said transgenic cell optionally further producing monoclonal antibodies.

Selon l'invention, ledit animal est capable de produire des anticorps monoclonaux dont le taux de fucosylation est inférieur comparativement à celui des anticorps produits par l'animal dont l'animal transgénique est issu. Les techniques de transgénèse animale sont bien connues de l'homme de métier. Pour ce faire, chez la souris notamment, il suffit par exemple, d'introduire dans une cellule embryonnaire ES de souris un acide nucléique codant le facteur KLF15 sous contrôle d'un promoteur permettant son expression de manière tissu-spécifique : par exemple un promoteur permettant son expression dans les cellules lymphocytaires B , un promoteur tel que le pro-moteur de la (3-caséine permettant une expression dans le lait des animaux femelles ou tout promoteur permettant une expression cellule ou tissus spécifique. Ces exemples ne sont pas limitatifs. Les techniques susmentionnées sont bien connues de l'homme de métier. Les cellules ES modifiées sont transférées directement dans la cavité d'un blastocyste ce qui donne un organisme chimère dont certaines cellules sont modifiées et pas d'autres. Cependant la répartition des cellules ES (migration) se faisant dans tous les types de tissus au cours du développement embryonnaire, l'ensemble des tissus de l'animal parait transgénique. Les souris transgéniques chimères sont croisées avec des souris sauvages afin de d'obtenir des souris hétérozygotes. Les croisements successifs entre hétérozygotes permettront d'obtenir une lignée pure de souris homozygote. According to the invention, said animal is capable of producing monoclonal antibodies whose fucosylation rate is lower compared to that of the antibodies produced by the animal from which the transgenic animal is derived. Animal transgenesis techniques are well known to those skilled in the art. To do this, in the mouse in particular, it is sufficient, for example, to introduce into a mouse ES embryonic cell a nucleic acid encoding the KLF15 factor under the control of a promoter allowing its expression in a tissue-specific manner: for example a promoter allowing its expression in B lymphocyte cells, a promoter such as the pro-motor of (3-casein allowing expression in the milk of female animals or any promoter allowing a specific cell or tissue expression These examples are not limiting. The aforementioned techniques are well known to those skilled in the art.The modified ES cells are transferred directly into the cavity of a blastocyst which gives a chimeric organism of which some cells are modified and not others. (migration) occurring in all types of tissues during embryonic development, all animal tissues appear to be The chimeric transgenic mice are crossed with wild-type mice to obtain heterozygous mice. Successive crosses between heterozygotes will make it possible to obtain a pure line of homozygous mice.

Un autre aspect de l'invention concerne une composition comprenant un milieu de culture comprenant : • une ou plusieurs cellules transgéniques définies précédemment, et • des anticorps présentant un taux de fucosylation inférieur à celui des anticorps produits par la cellule dont est issue ladite cellule transgénique. En d'autres termes, l'invention concerne également un milieu de culture comprenant : - une ou plusieurs cellules transgéniques exprimant le facteur de transcription KLF15, après que celui-ci a été introduit dans ladite cellule, ladite cellule transgénique produisant également des anticorps, de telle sorte que, - lesdits anticorps sont sécrétés dans le milieu de culture. Comme la cellule transgénique exprime le facteur de transcription KLF15, ce dernier réprime l'expression du gène fut8, et donc diminue l'activité a1,6 fucosyltransférase de la cellule. Ainsi, les anticorps produits auront un taux de fucosylation inférieur à celui d'anticorps pro-duits par la cellule dont est issue la cellule transgénique. Another aspect of the invention relates to a composition comprising a culture medium comprising: one or more transgenic cells defined above, and antibodies having a fucosylation rate lower than that of the antibodies produced by the cell from which said transgenic cell originates . In other words, the invention also relates to a culture medium comprising: one or more transgenic cells expressing the transcription factor KLF15, after it has been introduced into said cell, said transgenic cell also producing antibodies, such that - said antibodies are secreted in the culture medium. Since the transgenic cell expresses the transcription factor KLF15, the latter represses the expression of the fut8 gene, and thus decreases the α1, 6 fucosyltransferase activity of the cell. Thus, the antibodies produced will have a fucosylation rate lower than that of antibodies produced by the cell from which the transgenic cell is derived.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux comprenant une étape de transformation d'une cellule transgénique par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, ladite cellule transgénique étant transformée par un acide nucléique codant un facteur protéi- que, ledit facteur protéique étant choisi parmi : • un facteur de transcription KLF15, notamment de mammifère, • un variant dudit facteur de transcription KLF15, ledit variant présentant une identité en acides aminés d'au moins 80% avec ledit facteur de transcription KLF15 et conservant les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15, et • un fragment dudit facteur de transcription KLF15, sous réserve que ledit fragment contienne le domaine de liaison à l'ADN dudit facteur de transcription KLF15 et conserve les propriétés de répression de la transcription dudit facteur de transcription KLF15. Ainsi l'invention concerne un procédé de production d'anticorps monoclonaux comprenant l'utilisation d'une cellule transgénique selon l'invention. Par exemple, et sans être limitatif, le procédé selon l'invention peut-être le suivant : Des cellules transgéniques, notamment YB2/0, exprimant de manière stable une protéine KLF15 exogène, selon l'invention, sont transfectées par un ou plusieurs acides nucléiques permettant l'expression d'anticorps monoclonaux. Par «un ou plusieurs acides nucléiques permettant l'expression d'anticorps monoclonaux », on entend dans l'invention, par exemple : - un acide nucléique comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne lé-gère d'un anticorps, sous contrôle d'un premier promoteur, et sur le même acide nucléique, une seconde séquence comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne lourde d'un anticorps, sous contrôle d'un second promoteur préférentiellement différent du premier promoteur, ou - un premier acide nucléique comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne légère d'un anticorps, sous contrôle d'un premier promoteur et un second acide nucléique comportant une séquence permettant l'expression de la chaîne lourde d'un anticorps, sous contrôle d'un second promoteur préférentiellement différent du premier promoteur, le premier et le second acide nucléique étant deux molécules distinc- tes. Le ou les acides nucléiques permettant l'expression des anticorps monoclonaux sont introduits dans les cellules selon l'invention par des techniques classiques de transfection telles que l'électroporation, la nucléofection, l'utilisation de composés liposomiques, ou éventuellement des constructions virales. Ces exemples sont bien entendus non limitatifs. The invention also relates to a method for preparing monoclonal antibodies comprising a step of transforming a transgenic cell with at least one nucleic acid allowing the expression of an antibody, said transgenic cell being transformed by a nucleic acid encoding a factor. protein, said protein factor being selected from: • a KLF15 transcription factor, in particular a mammalian factor, • a variant of said KLF15 transcription factor, said variant having an amino acid identity of at least 80% with said transcription factor KLF15 and retaining the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor, and • a fragment of said KLF15 transcription factor, provided that said fragment contains the DNA binding domain of said KLF15 transcription factor and retains the properties of repressing transcription of said KLF15 transcription factor. Thus the invention relates to a method for producing monoclonal antibodies comprising the use of a transgenic cell according to the invention. For example, and without being limiting, the process according to the invention may be the following: Transgenic cells, in particular YB2 / 0, stably expressing an exogenous KLF15 protein, according to the invention, are transfected with one or more acids nucleic acids allowing the expression of monoclonal antibodies. By "one or more nucleic acids allowing the expression of monoclonal antibodies", is meant in the invention, for example: a nucleic acid comprising a sequence allowing the expression of the light chain of an antibody, under control of a first promoter, and on the same nucleic acid, a second sequence comprising a sequence allowing the expression of the heavy chain of an antibody, under control of a second promoter preferentially different from the first promoter, or - a first nucleic acid comprising a sequence allowing the expression of the light chain of an antibody, under the control of a first promoter and a second nucleic acid comprising a sequence allowing the expression of the heavy chain of an antibody, under the control of a second promoter preferentially different from the first promoter, the first and second nucleic acids being two distinct molecules. The nucleic acid (s) allowing expression of the monoclonal antibodies are introduced into the cells according to the invention by conventional transfection techniques such as electroporation, nucleofection, the use of liposomal compounds, or possibly viral constructs. These examples are of course nonlimiting.

Le ou les acides nucléiques permettant l'expression des anticorps monoclonaux comportent en outre un ou plusieurs gènes de sélection permettant de rendre les cellules hôtes contenant lesdits acides nucléiques sensibles ou résistants à des produits chimiques ou des antibiotiques. The nucleic acid (s) allowing expression of the monoclonal antibodies further comprises one or more selection genes making it possible to render the host cells containing said nucleic acids sensitive or resistant to chemicals or antibiotics.

Le ou les acides nucléiques permettant l'expression des anticorps monoclonaux peuvent être introduits de manière transitoire dans les cellules hôtes, ou de manière stable, c'est-à-dire intégrés dans le génome de la cellule hôte. Les méthodes d'amplification des cellules hôtes utilisées pour le procédé selon l'invention, ainsi que la purification des anticorps monoclonaux produits sont bien connues de l'homme de métier. The nucleic acid (s) allowing the expression of the monoclonal antibodies can be introduced transiently into the host cells, or stably, that is to say integrated into the genome of the host cell. The amplification methods of the host cells used for the process according to the invention, as well as the purification of the monoclonal antibodies produced, are well known to one skilled in the art.

10 Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne également un procédé défini précédemment, où ladite cellule transgénique est une cellule YB2/0 transformée par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15. In an advantageous embodiment, the invention also relates to a method defined above, wherein said transgenic cell is a YB2 / 0 cell transformed with a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being the transcription factor KLF15.

15 Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne également un procédé défini précédemment, comprenant en outre une étape de sélection des cellules transformées par ledit acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, notamment monoclonal In an advantageous embodiment, the invention also relates to a process defined above, further comprising a step of selecting the cells transformed by said nucleic acid for the expression of an antibody, in particular a monoclonal antibody.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux compre- 20 nant une étape de transformation d'une cellule, ou d'une cellule d'une lignée cellulaire, notamment la lignée YB2/0, par un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15. The invention also relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies comprising a step of transforming a cell, or a cell of a cell line, in particular the YB2 / 0 line, with a nucleic acid allowing expression of a protein factor, said protein factor being the KLF15 transcription factor.

L'invention concerne, dans un mode de réalisation avantageux, un procédé décrit précédem- 25 ment, ledit procédé comprenant une étape supplémentaire de transformation de ladite cellule transformée par un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, notamment monoclonal. The invention relates, in an advantageous embodiment, to a method described above, said method comprising a further step of transforming said transformed cell with a nucleic acid allowing the expression of a protein factor by at least one acid nucleic acid allowing the expression of an antibody, in particular a monoclonal antibody.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précé- 30 demment, ledit procédé comprenant simultanément à l'étape de transformation de ladite cellule un acide nucléique permettant l'expression d'un facteur protéique, la transformation de ladite cellule par au moins un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps.5 Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précédemment, comprenant • une étape de transformation d'une cellule ou d'une cellule de lignée cellulaire par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le facteur de transcription KLF15, • une étape de sélection des cellules transformées à l'étape précédente, et • une étape de transformation des cellules sélectionnées à l'étape précédente par un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps. L'étape de sélection correspond à l'étape permettant de n'isoler que les cellules ayant été 10 transformées par le facteur KLF15. La sélection peut être faite selon les méthodes susmentionnées. In another advantageous embodiment, the invention relates to a process defined above, said method comprising simultaneously at the stage of transformation of said cell a nucleic acid allowing the expression of a protein factor, the transformation of said The invention relates to a cell with at least one nucleic acid allowing the expression of an antibody. In another advantageous embodiment, the invention relates to a method defined above, comprising: a step of transforming a cell or a cell of cell line by a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being the transcription factor KLF15, a step of selecting the cells transformed in the preceding step, and a step of transforming the cells selected in the preceding step by a nucleic acid allowing the expression of an antibody. The selection step corresponds to the step of isolating only the cells that have been transformed by the KLF15 factor. The selection can be made according to the above methods.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précédemment, comprenant 15 • une étape de transformation d'une cellule ou d'une cellule de lignée cellulaire par un acide nucléique permettant l'expression d'un anticorps, • une étape de sélection des cellules transformées à l'étape précédente, et • une étape de transformation des cellules sélectionnées à l'étape précédente par un acide nucléique codant un facteur protéique, ledit facteur protéique étant le 20 facteur de transcription KLF15. L'étape de sélection correspond à l'étape permettant de n'isoler que les cellules ayant été transformées par les anticorps monoclonaux. La sélection peut être faite selon les méthodes susmentionnées. In another advantageous embodiment, the invention relates to a method defined above, comprising: a step of transforming a cell or cell line cell with a nucleic acid allowing the expression of an antibody; a step of selecting the cells transformed in the preceding step, and • a step of transforming the cells selected in the preceding step by a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being the transcription factor KLF15. The selection step corresponds to the step of isolating only the cells that have been transformed by the monoclonal antibodies. The selection can be made according to the above methods.

25 Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé défini précédemment, comprenant en outre • une étape de purification des anticorps, et • éventuellement, une étape de quantification du taux de fucose desdits anticorps. 30 Dans un autre aspect, il est également décrit une partie promoteur du gène fut8 de rat nouvellement caractérisé par les Inventeurs. Ce promoteur consiste en la séquence SEQ ID NO : 18. In yet another advantageous embodiment, the invention relates to a method defined above, further comprising: a step of purifying antibodies, and optionally, a step of quantifying the fucose level of said antibodies. In another aspect, there is also disclosed a promoter portion of the rat fut8 gene newly characterized by the inventors. This promoter consists of the sequence SEQ ID NO: 18.

La présente invention est illustrée par les figures et les exemples suivants. Les exemples illustrent, sans pour autant s'y limiter, les modes de réalisation préférés de l'invention décrite précédemment. The present invention is illustrated by the following figures and examples. The examples illustrate, without being limited thereto, the preferred embodiments of the invention described above.

Brève description des figures : La figure 1 représente l'analyse par la technique 5'RACE des extrémités 5' des transcrits gène fut8 de rat exprimés par la lignée YB2/0. Les produits de PCR nichée sont visualisés après migration sur gel d'agarose à 1,2 %. La piste 1 représente la migration d'un marqueur de poids moléculaire, la piste 2 représente un produit de PCR négatif, la piste 3 représente un contrôle négatif de PCR et la piste 4 représente la migration des produits de PCR nichée. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 represents the 5'RACE analysis of the 5 'ends of the rat fut8 gene transcripts expressed by the YB2 / 0 line. The nested PCR products are visualized after migration on 1.2% agarose gel. Lane 1 represents the migration of a molecular weight marker, Lane 2 represents a negative PCR product, Lane 3 represents a negative PCR control and Lane 4 represents the migration of nested PCR products.

La figure 2 correspond à une représentation schématique de la région 5' non traduite du gène fut8 de rat et des trois transcrits (Ti, T2 et T3) identifiés par l'analyse 5'-RACE. La taille en pb des introns est indiquée en pb en italique. FIG. 2 corresponds to a schematic representation of the 5 'untranslated region of the rat fut8 gene and of the three transcripts (Ti, T2 and T3) identified by the 5'-RACE analysis. The size in pb of the introns is indicated in italic pb.

La figure 3 correspond à un graphique représentant la quantification relative des transcrits T1 et T2 dans les lignées YB2/0 et Rat2 par l'analyse TagmanTM Q-PCR. Les données sont normalisées par rapport à l'expression du gène HPRT. La quantification a été réalisée selon la méthode du 2-°°cT (Livak et Schmittgen, 2001). La figure 4 représente les résultats obtenus lors de l'analyse de la région promotrice du transcrit Ti par tests luciférase réalisés dans les cellules Rat2. En (A) est présenté la région d'ADN génomique comprise entre les exons E-2 et E-3 ainsi que la localisation des sites de restriction utilisés pour les délétions. La numérotation a été effectuée à partir la position du site d'initiation de la transcription. (B) Sur la partie gauche sont représentées les différentes constructions testées. Les boîtes grises correspondent aux différentes régions tronquées de la zone comprise entre les exons E-3 et E-2, les boîtes noires représentent la partie 5' de l'exon -E2, et la boîte blanche représente la séquence codante de la luciférase De luciole (Firefly). Sur la partie droite, sont représentés les résultats du test luciférase correspondant à chaque construction La figure 5 représente les résultats obtenus pour l'analyse de la région promotrice du transcrit T2 lors du test luciférase réalisés dans les cellules Rat2. En (A) est présenté la région d'ADN génomique en amont de l'exon E-3 et le positionnement des sites de restriction utilisés pour réaliser les délétions. (B) Sur la partie gauche sont représentées les différentes constructions testées. Les boîtes grises correspondent aux différentes régions tronquées de la zone d'environ lkpb située en amont de l'exon E-3, les boîtes noires représentent la partie 5' de l'exon -E3, et la boîte blanche représente la séquence codante de la luciférase Firefly. Sur la partie droite, sont représentés les résultats du test luciférase correspondant à chaque construction. Figure 3 is a graph showing the relative quantitation of T1 and T2 transcripts in YB2 / 0 and Rat2 lines by TagmanTM Q-PCR analysis. The data are normalized to the expression of the HPRT gene. Quantification was carried out according to the 2 ° C method (Livak and Schmittgen, 2001). FIG. 4 represents the results obtained during the analysis of the promoter region of the transcript Ti by luciferase tests carried out in Rat2 cells. In (A) is presented the region of genomic DNA between exons E-2 and E-3 as well as the location of the restriction sites used for deletions. Numbering was done from the position of the transcription initiation site. (B) On the left side are represented the different constructions tested. The gray boxes correspond to the different truncated regions of the zone between the exons E-3 and E-2, the black boxes represent the 5 'part of the exon -E2, and the white box represents the coding sequence of the luciferase De firefly. On the right side are shown the results of the luciferase assay corresponding to each construct. FIG. 5 represents the results obtained for the analysis of the promoter region of the T2 transcript during the luciferase assay carried out in Rat2 cells. In (A) is presented the genomic DNA region upstream of the exon E-3 and the positioning of the restriction sites used to make the deletions. (B) On the left side are represented the different constructions tested. The gray boxes correspond to the different truncated regions of the approximately 1 kbp zone located upstream of exon E-3, the black boxes represent the 5 'part of exon -E3, and the white box represents the coding sequence of Firefly luciferase. On the right side are the results of the luciferase test corresponding to each construction.

La figure 6 représente la séquence de la région promotrice minimale permettant l'expression du transcrit Ti. Les sites de liaison potentiels des facteurs de transcription qui s'y fixent sont indiqués. Figure 6 shows the sequence of the minimal promoter region allowing expression of the Ti transcript. The potential binding sites of the transcription factors attached thereto are indicated.

Les figures 7A à 7D représentent les tests luciférases réalisés avec les facteurs de transcrip- tion indiqués. L'axe des abscisses représente la quantité de vecteur utilisée en ng/mL comme indiquée sur la figure. La figure 7A représente les résultats obtenus avec le facteur RMD 1. Les résultats ont représente sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. Figures 7A to 7D show the luciferase assays performed with the indicated transcription factors. The x-axis represents the amount of vector used in ng / mL as shown in the figure. Figure 7A shows the results obtained with the RMD factor 1. The results represented as a relative intensity of normalized luciferase activity compared to the control not transfected by the vector.

La figure 7B représente les résultats obtenus avec le facteur IRF3. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 7C représente les résultats obtenus avec le facteur PaxS. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 7D représente les résultats obtenus avec le facteur MZF1. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. La figure 7E représente les résultats obtenus avec le facteur KLF15. Les résultats sont repré- sentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. Figure 7B shows the results obtained with the IRF3 factor. The results are represented as a relative intensity of normalized luciferase activity relative to control not transfected by the vector. Figure 7C shows the results obtained with the PaxS factor. The results are represented as a relative intensity of normalized luciferase activity relative to control not transfected by the vector. Figure 7D shows the results obtained with the factor MZF1. The results are represented as a relative intensity of normalized luciferase activity relative to control not transfected by the vector. Figure 7E shows the results obtained with the KLF15 factor. The results are shown as a relative intensity of normalized luciferase activity compared to control not transfected with the vector.

La figure 8 A représente l'immunodétection de KLF15 dans les fractions cytoplasmiques (C) et nucléaires (N) de cellules non transfectées (contrôle ou « mock ») ou de cellules transfectées avec des doses croissantes de KLF15. Figure 8A shows the immunodetection of KLF15 in the cytoplasmic (C) and nuclear (N) fractions of untransfected cells (control or "mock") or cells transfected with increasing doses of KLF15.

La figure 8 B représente l'activité luciférase correspondant aux quantités de facteur KLF15 indiquées. L'axe des abscisses représente la quantité de vecteur pcDNA3.1-hKLF15 transfectée en ng/mL comme indiqué sur le graphique. Les résultats sont représentés sous forme d'intensité relative d'activité luciférase normalisée par rapport au contrôle n'ayant pas été transfecté par le vecteur. Figure 8B shows the luciferase activity corresponding to the indicated amounts of KLF15 factor. The x-axis represents the amount of pcDNA3.1-hKLF15 vector transfected in ng / mL as shown in the graph. The results are represented as a relative intensity of normalized luciferase activity relative to control not transfected by the vector.

EXEMPLES : EXAMPLES

Matériels et Méthodes Cultures cellulaires La lignée de cellules de rat YB2/0 a été obtenue de la collection nationale de culture de cellules des USA (ATCC) (Manassas, VA, http://www.atcc.org; catalogue n° CRL-1662) et cultivée dans un milieu EMS (milieu de culture propriété du LFB) supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé à la chaleur (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) à 37°C sous 5% de CO2. Les lignées cellulaires Rat2 (ATCC n° CRL-1764) et COS-7 (ATCC n° CRL-1651) ont été cultivées en DMEM, (BioWittaker, Lonza, Belgique) supplémenté avec 10% de SVF inactivé à la chaleur et 2mM de L-glutamine (Lonza, Belgique) à 37°C sous 5% CO2. Purification des ARN et synthèse des ADNc Les cellules YB2/0 ont été utilisées comme source d'ARN. Les ARN totaux sont extraits en utilisant le kit Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne) selon le protocole fourni par le fabricant. Les ADNc ont été obtenus à partir des ARN totaux (2 µg) par transcription inverse en utilisant le kit de synthèse ADNc premier brin (Amersham Biosciences, Freiburg, Allemagne). Clonage moléculaire de l'ADNc de l'a 1,6-fucosyltransférase de rat. Materials and Methods Cell cultures The YB2 / 0 rat cell line was obtained from the US National Cell Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, http://www.atcc.org, Catalog No. CRL- 1662) and cultured in EMS medium (LFB proprietary culture medium) supplemented with 5% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) at 37 ° C under 5% CO 2. . The Rat2 (ATCC # CRL-1764) and COS-7 (ATCC # CRL-1651) cell lines were grown in DMEM (BioWittaker, Lonza, Belgium) supplemented with 10% heat-inactivated FCS and 2mM L-glutamine (Lonza, Belgium) at 37 ° C under 5% CO2. RNA purification and cDNA synthesis YB2 / 0 cells were used as the source of RNA. Total RNAs are extracted using the Nucleospin RNA II kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany) according to the protocol provided by the manufacturer. The cDNAs were obtained from the total RNAs (2 μg) by reverse transcription using the first-stranded cDNA synthesis kit (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany). Molecular cloning of rat α-1,6-fucosyltransferase cDNA.

Le cadre ouvert de lecture isolé de l'op, 1,6-fucosyltransférase de rat n'était pas connu jusqu'à présent. La séquence codante a été amplifiée à partir de 1 tl de ADNc de cellules YB2/0 avec le couple d'amorces 5F8r2: 5'-agtcgccacaggattacc-3' (SEQ ID NO: 23) et 3F8r2: 5'-atctgcttagccgagatg-3' (SEQ ID NO : 24) à 94°C durant 2 minutes, suivi par 30 cycles (94°C, durant 30 secondes ; 50°C durant 45 secondes ; 68°C durant 2 minutes et 10 secondes) et une étape d'extension de 10 minutes à 68°C. Le produit de PCR a été cloné dans le vecteur pCR II-Blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et séquencée. La séquence codante a ensuite été isolée par digestion du vecteur en utilisant les sites de restriction Hind III et Xba I. Le fragment purifié a été sous-cloné dans un vecteur pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) digéré par Hind III et Xba I. Le plasmide résultant est nommé pcDNA-Fut8. Des cellules COS-7 ont été transfectées de manière transitoire avec pcDNA-Fut8 ou le plasmide vide en utilisant la lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. Les cellules ont été récoltées 48 heures après transfection. Préparation du substrat asialo-agalacto-apotransferrine comme accepteur Après dialyse contre une solution tampon d'acétate de sodium (50 mM, pH 7,5), 5 mg d' apotransferrine humaine (Sigma-Aldrich, Lyon, France) ont été incubés avec 120 mU de neuraminidase d'Arthrobacter ureafasciens (Sigma-Aldrich, Lyon, France) et 50 mU de 13-galactosidase d'Escherichia Coli (Sigma-Aldrich, Lyon, France) à 37°C durant 24 heures dans un volume final de 10 mL. Après 4 heures de dialyse contre de l'eau, l'asialo-agalactoapotransferrine a été lyophilisée. L'absence de résidus galactose et d'acide sialique a été contrôlée par GC-MS. The open reading frame isolated from op, rat 1,6-fucosyltransferase was not known until now. The coding sequence was amplified from 1 μl of YB2 / 0 cell cDNA with primer pair 5F8r2: 5'-agtcgccacaggattacc-3 '(SEQ ID NO: 23) and 3F8r2: 5'-atctgcttagccgagatg-3' (SEQ ID NO: 24) at 94 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles (94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 45 seconds, 68 ° C for 2 minutes and 10 seconds) and a step of 10 minutes extension at 68 ° C. The PCR product was cloned into pCR II-Blunt TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and sequenced. The coding sequence was then isolated by digestion of the vector using Hind III and Xba I restriction sites. The purified fragment was subcloned into a Hind III digested vector pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). and Xba I. The resulting plasmid is named pcDNA-Fut8. COS-7 cells were transiently transfected with pcDNA-Fut8 or the empty plasmid using lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the protocol provided by the manufacturer. The cells were harvested 48 hours after transfection. Preparation of the substrate asialo-agalacto-apotransferrin as acceptor After dialysis against a sodium acetate buffer solution (50 mM, pH 7.5), 5 mg of human apotransferrin (Sigma-Aldrich, Lyon, France) were incubated with 120 mU of Arthrobacter ureafasciens neuraminidase (Sigma-Aldrich, Lyon, France) and 50 mU of Escherichia coli 13-galactosidase (Sigma-Aldrich, Lyon, France) at 37 ° C for 24 hours in a final volume of 10 mL. After 4 hours of dialysis against water, the asialo-agalactoapotransferrin was lyophilized. The absence of galactose and sialic acid residues was monitored by GC-MS.

Dosage de l'a 1,6-fucosyltransférase Les cellules COS-7, transfectées transitoirement avec pcDNA-Fut8 ou le plasmide vide, ont été récoltées par grattage dans une solution d'EDTA 4mM, culottées par centrifugation à vitesse réduite et re-suspendues dans un tampon de lyse (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HC1, pH 7.5, 1 % Triton X-100), contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Roche, Bale, Suisse). Après centrifugation, la concentration en protéines du surnageant de lyse cellulaire a été déterminée avec le kit de dosage de protéine Micro BCArlm (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA). Les dosages d'enzymes ont été réalisés avec 20 µL de surnageant de lyse cellulaire (140 µg/mL), 70 mM de tampon cacodylate (pH 7,2) 10 mM de L-fucose, 6 µM GDP-[14C]-L- fucose (299 mCi/mmol, Amersham Biosciences, Pantin, France), 10 mM GDP-fucose et 100 µg d'asialo-agalacto-apotransferrine humaine comme substrat accepteur, dans un volume final de 50 µL. Après 4 heures d'incubation à 30 °C, la réaction a été arrêtée par addition 150 µL d'eau à température ambiante puis le produit de réaction a été précipitée avec 1 mL d'acide phosphotungstique à 5 %, et analysé par comptage à scintillation. Le transfert de [14C]-fucose est exprimé en cpm. Assay for 1,6-fucosyltransferase COS-7 cells, transiently transfected with pcDNA-Fut8 or the empty plasmid, were scraped into a 4mM EDTA solution, pelleted by low speed centrifugation and re-suspended. in lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% Triton X-100), containing a cocktail of protease and phosphatase inhibitors (Roche, Basel, Switzerland). After centrifugation, the protein concentration of the cell lysing supernatant was determined with the Micro BCArlm Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA). Enzyme assays were performed with 20 μl of cell lysing supernatant (140 μg / ml), 70 mM cacodylate buffer (pH 7.2) 10 mM L-fucose, 6 μM GDP- [14 C] -L fucose (299 mCi / mmol, Amersham Biosciences, Pantin, France), 10 mM GDP-fucose and 100 μg of human asialo-agalacto-apotransferrin as acceptor substrate, in a final volume of 50 μl. After 4 hours of incubation at 30 ° C., the reaction was stopped by adding 150 μl of water at room temperature, then the reaction product was precipitated with 1 ml of phosphotungstic acid at 5%, and analyzed by counting. scintillation. The transfer of [14C] -fucose is expressed in cpm.

Amplification de l'extrémité 5' des ADNc par la technique 5' RACE Les amplifications 5'RACE ont été réalisées en utilisant un kit GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. La transcription inverse initiale a été réalisée avec l'amorce oligo-dT en utilisant 5 µg d'ARN total. Après synthèse du premier brin d'ADNc, des PCR ont été réalisées avec l'amorce GeneRacer5' du kit, et une amorce spécifique du gène 3F8Race3 5'-cttcccgtagccgtcccctggtcaa-3' (SEQ ID NO : 25) à 94°C durant 2 minutes, puis 38 cycles (94°C, durant 45 secondes ; 57°C durant 45 secondes ; 68°C durant 1 minute et 45 secondes) et une étape d'extension de 10 minutes à 68°C. Des PCR nichées ont été réalisées en utilisant l'amorce nichée GeneRacer5' fournie avec le kit et une amorce spécifique du gène 3F8Race4 5'-actcagccattcgcctcaagtcttc-3' (SEQ ID NO : 26), en utilisant 2 µL de la première amplification par PCR et les mêmes conditions que la première PCR. Les amplifications par PCR ont été réalisées avec Taq AccuPrime (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. Les produits de PCR nichées ont été séparés par taille par électrophorèse sur un gel d'agarose par électrophorèse, sous clonés dans un vecteur pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et séquencés par Genoscreen (Lille, France). Amplification of the 5 'End of the cDNAs by the 5' RACE Technique The 5'RACE amplifications were performed using a GeneRacer kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the protocol provided by the manufacturer. Initial reverse transcription was performed with the oligo-dT primer using 5 μg of total RNA. After synthesis of the first strand of cDNA, PCRs were performed with the GeneRacer5 'primer of the kit, and a primer specific for the 3F8Race3 gene 5'-cttcccgtagccgtcccctggtcaa-3' (SEQ ID NO: 25) at 94 ° C for 2 hours. minutes, then 38 cycles (94 ° C, for 45 seconds, 57 ° C for 45 seconds, 68 ° C for 1 minute and 45 seconds) and a 10-minute extension step at 68 ° C. Nested PCRs were performed using the GeneRacer5 'nested primer supplied with the kit and a primer specific for the 3F8Race4 5'-actcagccattcgcctcaagtcttc-3' gene (SEQ ID NO: 26), using 2 μL of the first PCR amplification. and the same conditions as the first PCR. PCR amplifications were performed with Taq AccuPrime (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the protocol provided by the manufacturer. The nested PCR products were separated by size by electrophoresis on an agarose gel by electrophoresis, subcloned into a pCR4-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and sequenced by Genoscreen (Lille, France).

Transcription inverse et PCR quantitative (RT-QPCR) L'expression des transcrits Ti et T2 a été analysée par PCR quantitative en temps réel. Les ADNc ont été obtenus par transcription inverse à partir de 2µg d'ARN total avec des oligonu- cléotides poly-T en utilisant le kit de synthèse d'ADNc Affinity script QPCR (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant. Des réactions parallèles, sans SuperScript ont été réalisées pour vérifier la non contamination de la réaction par de l'ADN génomique. Les Q-PCR Duplex TagmanTM et leurs analyses ont été réalisées en utilisant l'appareil de PCR-Q Mx-4000 et son logiciel d'analyse (Stratagene, Amsterdam, Pays-Bas). Les amorces et les sondes ont été conçues en utilisant le logiciel Primer Express (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Les sondes sont des sondes TagmanTM MGB synthétisées par Applied Biosystems. Les sondes spécifiques des transcrits1 (Ti) ou 2 (T2) sont marquées avec FAMTM et la sonde spécifique du gène de référence HPRT a été marquée avec VIC®. Les réactions de PCR ont été réalisées avec 12,5 µL du kit Quantitect Multiplex PCR kit (Qiagen, Courtaboeuf, France), 0,4 µM de chaque amorce, 0,2 µM de sonde HPRT TagmanTM, 0,2 µM de sonde Ti et T2 TagmanTM et 2 µL d'ADNc dans un volume final de 25µL. Après 15 minu- tes à 95°C, 40 cycles de PCR ont été réalisés comme suit : 95°C durant 1 minute, 60°C durant 1 minute. La réaction de PCR en temps réel a été répétée au moins trois fois pour chaque échantillon. Les quantités relatives de chaque transcrit ont été évaluées grâce à une courbe d'étalonnage préparée à partir d'une série de dilutions d'ADNc contrôle issu de cellules YB2/0. Inverse Transcription and Quantitative PCR (RT-QPCR) The expression of the transcripts Ti and T2 was analyzed by quantitative PCR in real time. The cDNAs were obtained by reverse transcription from 2 μg of total RNA with poly-T oligonucleotides using the Affinity script QPCR cDNA synthesis kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) according to the protocol. supplied by the manufacturer. Parallel reactions without SuperScript were performed to verify non-contamination of the reaction with genomic DNA. Q-PCR Duplex TagmanTM and their assays were performed using the PCR-Q Mx-4000 and its analysis software (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands). The primers and probes were designed using Primer Express software (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). The probes are TagmanTM MGB probes synthesized by Applied Biosystems. Probes specific for transcripts1 (Ti) or 2 (T2) are labeled with FAMTM and the specific probe of the reference gene HPRT was labeled with VIC®. The PCR reactions were carried out with 12.5 μl of the Quantitect Multiplex PCR kit (Qiagen, Courtaboeuf, France), 0.4 μM of each primer, 0.2 μM of HPRT TagmanTM probe, 0.2 μM of Ti probe. and T2 TagmanTM and 2 μL of cDNA in a final volume of 25 μL. After 15 minutes at 95 ° C, 40 cycles of PCR were performed as follows: 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute. The real-time PCR reaction was repeated at least three times for each sample. The relative amounts of each transcript were evaluated using a calibration curve prepared from a series of control cDNA dilutions derived from YB2 / 0 cells.

Construction de plasmide rapporteur pour dosage par la luciférase L'ADN génomique des cellules YB2/0 a été extrait grâce au kit Nucleospin Extract II (Macherey Nagel, Düren, Allemagne) selon le protocole fourni par le fabricant. Pour analyser la région promotrice du transcrit Ti, la séquence génomique située entre les positions -1438 pb et -411 pb en amont de l'ATG a été amplifiée par PCR en utilisant la paire d'amorces: FP1.8 : 5'-cgtggcaagcttccctaacgcccccttacccg-3' (SEQ ID NO: 19) et FP1.7 : 5'-ctccctggtacctccgtactcaataaacttccgcc-3' (SEQ ID NO : 20) introduisant respectivement les sites de restriction Hind III et Kpn I (soulignés dans la séquence de nucléotides). Le produit de PCR a été cloné dans un vecteur pGL3-basic (Promega, Madison, USA) en amont du gène de la luciférase De luciole (Firefly) au site Hind III / Kpn I. Le plasmide résultant est nommé pGL3-1438/-411. Ce fragment de PCR a été soumis à une série de délétions en 5' et en 3' en utilisant les enzymes des sites de restriction naturellement présents dans la séquence, puis, les sous-fragments ainsi obtenus ont été clonés dans un vecteur PGL3-basique pour générer des vecteurs variés. Pour analyser la région promotrice du transcrit T2, la séquence génomique de 1000 pb située en amont de l'exon E-3 a été amplifiée à partir de l'ADN génomique de cellules YB2/0 en utilisant les amorces FKO11 5'-ccgggctagcacattccacccctgactcctaa-3' (SEQ ID NO : 21) et FKO12 5'-ccggctcgaggtttcctacccgctcgcactcg-3' (SEQ ID NO : 22) introduisant les sites de restriction Nhe I et Xho I respectivement (soulignés dans la séquence de nucléotides). Le fragment amplifié a été cloné dans un vecteur pGL3-basic. Le plasmide obtenu a été appelé pGL31uc-1399/-404. Suivant la même stratégie, les fragments de PCR nichée ont été clonés dans un vecteur pGL3-basique en amont du gène de luciférase De luciole (Firefly), aux sites Nhe I / Xho I. Les différentes constructions ont été séquencées pour s'assurer de l'absence de mutations. Construction of reporter plasmid for luciferase assay The genomic DNA of YB2 / 0 cells was extracted using the Nucleospin Extract II kit (Macherey Nagel, Düren, Germany) according to the protocol provided by the manufacturer. To analyze the promoter region of the Ti transcript, the genomic sequence between the -1438 bp and -411 bp positions upstream of the ATG was amplified by PCR using the primer pair: FP1.8: 5'-cgtggcaagcttccctaacgccccttacccg -3 '(SEQ ID NO: 19) and FP1.7: 5'-ctccctggtacctccgtactcaataaacttccgcc-3' (SEQ ID NO: 20) respectively introducing the Hind III and Kpn I restriction sites (underlined in the nucleotide sequence). The PCR product was cloned into a pGL3-basic vector (Promega, Madison, USA) upstream of the firefly luciferase (Firefly) gene at the Hind III / Kpn I site. The resulting plasmid is named pGL3-1438 / - 411. This PCR fragment was subjected to a series of 5 'and 3' deletions using the restriction site enzymes naturally present in the sequence, and then the resulting subfragments were cloned into a PGL3-basic vector. to generate various vectors. To analyze the promoter region of T2 transcript, the 1000 bp genomic sequence located upstream of exon E-3 was amplified from genomic YB2 / 0 cell DNA using primers FKO11 5'-ccgggctagcacattccacccctgactcctaa- 3 '(SEQ ID NO: 21) and FKO12 5'-ccggctcgaggtttcctacccgctcgcactcg-3' (SEQ ID NO: 22) introducing the restriction sites Nhe I and Xho I respectively (underlined in the nucleotide sequence). The amplified fragment was cloned into a pGL3-basic vector. The resulting plasmid was named pGL31uc-1399 / -404. Following the same strategy, the nested PCR fragments were cloned in a pGL3-basic vector upstream of the firefly luciferase gene (Firefly), at the Nhe I / Xho I sites. The various constructs were sequenced to ensure that the absence of mutations.

Transfections transitoires et dosage à la luciférase Des cellules Rat2 ont été transfectées transitoirement en milieu OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en utilisant la lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole fourni par le fabricant, en utilisant 1 µg/mL de vecteur pGL3 varié et 10 ng/mL de plas- mide de contrôle de luciférase Renilla dans un milieu OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Après 6 heures, le milieu est remplacé par un milieu de culture neuf et les cellules sont incubées durant 48 heures à 37°C sous 5% CO2. Les cellules ont ensuite été lavées une fois au PBS et lysées dans 150 µL d'un tampon de lyse passive (PLB, Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega, Madison, USA). 20 µL de lysat ont été utilisés pour le test de lecture de la luciférase. La luminescence est mesurée avec un luminomètre Centro (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne). Les cellules YB2/0 ont été transfectées transitoirement avec le « Cell fine nucleofector kitV» (Amaxa Lonza, Verviers, Belgique) selon le protocole fourni par le fabricant. Des culots de 2x106 cellules ont été remis en suspension dans 100 µL de la une solution V du kit Nucleofec- tor°. La suspension cellulaire a ensuite été mélangée avec 2 µg de vecteur pGL3-varié et 20 ng de plasmide de luciférase Renilla qui sert de normalisateur. Les mélanges ont été transférés dans une cuve Amaxa et soumis à un choc électrique, en utilisant le programme T-020. Les cellules ont ensuite été transférées dans un puits de plaques six puits contenant 2 mL de mi-lieu de culture et incubées durant 24 heures à 37°C sous 5% de CO2. Les cellules ont finale- ment été centrifugées 5 minutes à 500 g, lavées une fois avec du PBS et utilisées dans un do-sage luciférase (LuciferaseReporter Assay) tel que décrit pour Rat2. Le vecteur d'expression pcDNA3.1 contenant la séquence codante du facteur de transcription humain KLF15 (pcDNA3.1-h KLF15) a été fourni par le Dr. Otteson (College of Optometry, University of Houston, USA). Pour la transfection des cellules Rat2, de 25 à 500 ng/mL de vecteur pcDNA3.1-h KLF15 ont été ajoutés au mélange de lipofection. Transient transfections and luciferase assay Rat2 cells were transiently transfected into OptiMEM medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) using lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the protocol provided by the manufacturer, using 1 μg / mL of varied pGL3 vector and 10 ng / mL of Renilla luciferase control plasmid in OptiMEM medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). After 6 hours, the medium is replaced by a new culture medium and the cells are incubated for 48 hours at 37 ° C. under 5% CO 2. The cells were then washed once with PBS and lysed in 150 μl of a passive lysis buffer (PLB, Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega, Madison, USA). 20 μl of lysate were used for the luciferase reading assay. Luminescence is measured with a Centro luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany). The YB2 / 0 cells were transiently transfected with the "Cell fine nucleofector kit V" (Amaxa Lonza, Verviers, Belgium) according to the protocol provided by the manufacturer. Pellets of 2x106 cells were resuspended in 100 μl of a solution V of the Nucleoforte® kit. The cell suspension was then mixed with 2 μg of pGL3-variegated vector and 20 ng of Renilla luciferase plasmid which serves as normalizer. The mixtures were transferred to an Amaxa tank and subjected to electric shock using the T-020 program. The cells were then transferred to a six-well plate well containing 2 ml of mid-culture and incubated for 24 hours at 37 ° C under 5% CO 2. The cells were finally centrifuged for 5 minutes at 500 g, washed once with PBS and used in a luciferase reporter (LuciferaseReporter Assay) as described for Rat2. The pcDNA3.1 expression vector containing the coding sequence of the human transcription factor KLF15 (pcDNA3.1-h KLF15) was provided by Dr. Otteson (College of Optometry, University of Houston, USA). For transfection of Rat2 cells, 25-500 ng / mL of pcDNA3.1-h KLF15 vector were added to the lipofection mixture.

Extraction des protéines nucléaires et cytoplasmiques, analyses par immunodétection 48 heures après la transfection avec le vecteur KLF15, les cellules Rat2 ont été lysées sur de la glace dans un tampon hypotonique (Hepes 10 mM, MgC12 1,5 mM, KC1 10 mM, pH 7,9) supplémenté avec du NP40 à 0,125% et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche, Meylan, France). Le lysat a été centrifugé 5 minutes à 10000 g et la fraction cytosolique a été récupérée dans le surnageant. Le culot correspondant à la fraction nucléaire est lysé avec un tampon hypertonique (Hepes 20 mM, MgC12 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, NaCl 0,5 M, glycérol 25 %, pH 7,9) supplémenté avec un cocktail d'inhibiteurs de protéases, sur de la glace durant 2 heures. La concentration en protéines des deux fractions a été déterminée avec le kit de do-sage de protéines Micro BCATm (Pierce, Rockford, IL, USA). 20 µg de protéines totales ont été bouillis pendant 10 minutes dans du tampon de Laemmli (reducing Laemmli sample buf- fer) et séparés par SDS-PAGE sur mini-gel 8 % (Bio-Rad, Richmond, USA). Après transfert sur une membrane de nitrocellulose (80 mA, une nuit), une étape de saturation a été réalisée par une incubation en TBS (Tampon Tris Salin) contenant 0,05 % de Tween 20 et 5 % (p/v) de lait écrémé lyophilisé, une heure à température ambiante (TA). Puis la membrane de nitro-cellulose est incubée pendant 1 heure à température ambiante avec 2,5 µg/mL d'anti-KLF15 mAb (AbCam, Cambridge, Royaume-Uni) ou 0,04 µg/mL d'anti-actine mAb (Santa Cruz Biotechnology Inc., Europe) diluées dans du TBS, 0,05 % Tween 20 et 5 % de lait. Après lavage, la membrane est incubée une heure à température ambiante avec une anti- IgG de chèvre couplée à la peroxydase pour le KLF15, ou d'une anti- IgG de lapin pour l'actine, diluée à 1/15000 en tampon de dilution. Extraction of Nuclear and Cytoplasmic Proteins, Immunodetection Assays 48 hours after transfection with KLF15 vector, Rat2 cells were lysed on ice in hypotonic buffer (10 mM Hepes, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, pH 7.9) supplemented with 0.125% NP40 and a cocktail of protease inhibitors (Roche, Meylan, France). The lysate was centrifuged for 5 minutes at 10,000 g and the cytosolic fraction was recovered in the supernatant. The pellet corresponding to the nuclear fraction is lysed with a hypertonic buffer (20 mM Hepes, 1.5 mM MgC12, 0.2 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 25% glycerol, pH 7.9) supplemented with a cocktail of protease inhibitors, on ice for 2 hours. Protein concentration of both fractions was determined with the Micro BCAT ™ Protein Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). 20 μg total proteins were boiled for 10 minutes in Laemmli buffer (reducing Laemmli sample buffer) and separated by SDS-PAGE on 8% mini-gel (Bio-Rad, Richmond, USA). After transfer to a nitrocellulose membrane (80 mA, overnight), a saturation step was performed by incubation in TBS (Tris Saline Buffer) containing 0.05% Tween 20 and 5% (w / v) milk. skimmed lyophilized, one hour at room temperature (RT). Then the nitrocellulose membrane is incubated for 1 hour at room temperature with 2.5 μg / ml of anti-KLF15 mAb (AbCam, Cambridge, UK) or 0.04 μg / mL of anti-actin mAb (Santa Cruz Biotechnology Inc., Europe) diluted in TBS, 0.05% Tween 20 and 5% milk. After washing, the membrane is incubated for one hour at room temperature with a peroxidase-coupled goat anti-IgG for KLF15, or anti-rabbit IgG for actin, diluted to 1/15000 in dilution buffer. .

Les membranes ont ensuite été lavées trois fois durant 10 minutes dans du TBS, Tween 20 0,05% et la détection a été réalisée en utilisant le kit de détection ECL +® (advanceWestern blotting detection reagents, Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buks, Royaume-Uni). The membranes were then washed three times for 10 minutes in TBS, 0.05% Tween 20 and the detection was carried out using the Advance Western Blotting Detection Kit, Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buks, UK).

Exemple 1 : Clonage du gène Fut8 de rat. Afin de cloner le gène fut8 de rat, les Inventeurs ont utilisé les données bioinformatiques disponibles, et notamment les EST CB548120.1, CB 730213.1 et CB730572.1 correspondant à la région 5' du gène fut8 et les séquences FM069692.1, DV727207.1 et CB742993.1 correspondant à la région 3' non traduite. Une amplification spécifique des l'ADNc synthétisés à partir d'ARN totaux de cellules YB2/0, a permis le clonage et le séquençage d'une séquence de 1942 paires de bases (pb). La séquence amplifiée contient un cadre ouverte de lecture de 1725 pb. La position du codon initiateur a été localisée par analyse de la position de la séquence consensus de Kozak. Afin de confirmer que cette séquence code bien une al,6-fucosyltransférase fonctionnelle, ladite séquence a été clonée dans un vecteur d'expression pCDNA3.1, et la protéine a été pro-duite par transfection des cellules COS-7. Les lysats des cellules transfectées ont ensuite été testés en mesurant l'activité fucosyltransférase sur le substrat asialo-agalacto- apotransferrine. Les lysats des cellules transfectées pré- sentaient une activité al,6-fucosyltransférase 4 fois supérieure à celle des cellules non transfectées démontrant que la séquence clonée code bien pour une enzyme active à activité a1,6 fucosyltransférase. Exemple 2 : Identification des sites d'initiation de la transcription du gène fut8. Example 1 Cloning of the rat Fut8 gene. In order to clone the rat fut8 gene, the inventors used the available bioinformatic data, and in particular the EST CB548120.1, CB 730213.1 and CB730572.1 corresponding to the 5 'region of the fut8 gene and the sequences FM069692.1, DV727207. 1 and CB742993.1 corresponding to the 3 'untranslated region. Specific amplification of cDNAs synthesized from total YB2 / 0 RNAs allowed cloning and sequencing of a 1942 base pair (bp) sequence. The amplified sequence contains an open reading frame of 1725 bp. The position of the initiator codon was localized by analysis of the position of the Kozak consensus sequence. In order to confirm that this sequence encodes a functional al, 6-fucosyltransferase, said sequence was cloned into a pCDNA3.1 expression vector, and the protein was pro-duced by transfection of COS-7 cells. The lysates of the transfected cells were then tested by measuring the fucosyltransferase activity on the asialo-agalacto-apotransferrin substrate. The lysates of the transfected cells exhibited a 4-fold higher al, 6-fucosyltransferase activity than untransfected cells demonstrating that the cloned sequence encodes an active enzyme with 1,6-fucosyltransferase activity. Example 2 Identification of transcription initiation sites of the fut8 gene.

Afin d'identifier les sites d'initiation de la transcription du gène fut8 de rat, les extrémités 5'non traduites des ARN messagers de fut8 ont été amplifiées par la technique 5'RACE. Cette approche permet de sélectionner uniquement les ARN messagers coiffés, supposés correspondre aux transcrits complets entraits de la lignée YB2/0. Pour cela, les ARN totaux de YB2/0 ont été traités à la phosphatase alcaline pour déphosphoryler les ARN non-coiffés, puis décoiffés par action de la pyrophosphatase acide de tabac. Un oligonucléotide ARN (gene-RACER RNA) a alors été greffé sur l'extrémité 5' des ARN préalablement décoiffés. Les ARN hybrides formés ont ainsi été retrotranscrits puis amplifiés par PCR en utilisant comme couple d'amorce des oligonucléotides complémentaires d'une séquence dans l'exon 2 (antisens) et de la séquence geneRACER (sens). In order to identify the transcription initiation sites of the rat fut8 gene, the untranslated 5 'ends of the messenger mRNAs of fut8 were amplified by the 5'RACE technique. This approach makes it possible to select only the capped messenger RNAs, which are supposed to correspond to the complete transcripts entered from the YB2 / 0 line. For this purpose, the total YB2 / 0 RNAs were treated with alkaline phosphatase to dephosphorylate the uncapped RNAs and then dechilted by the action of tobacco acid pyrophosphatase. An RNA oligonucleotide (RACER-RNA gene) was then grafted onto the 5 'end of the previously disrupted RNAs. The hybrid RNAs formed were thus retranscribed and then amplified by PCR using, as primer pair, oligonucleotides complementary to a sequence in exon 2 (antisense) and the geneRACER (sense) sequence.

Comme le montre la figure 1, au moins 4 produits d'amplification indépendants d'environ 250, 450, 600 et 750 pb ont été obtenus. Les bandes majoritaires ont été sous clonées et séquencées, et seulement 3 transcrits différents ont été identifiés, signifiant l'existence de 3 isoformes d'expression du gène fut8. Le transcrit de 600 pb (Ti) contient une extension de 508 pb en 5' de l'ATG, constituée de 4 exons, respectivement dans le sens 3' vers 5' El, E0, E-1 et E-2. Le transcrit de 750 pb (T2) contient une extension de 508 pb en 5' de l'ATG, constituée de 4 exons, respectivement dans le sens 3' vers 5' El, E0, E-1 et un exon différent du premier transcrit, l'exon E-3. Le transcrit de 200 pb (T3) ne contient que l'exon 1, en 5' du codon ATG. As shown in Figure 1, at least 4 independent amplification products of about 250, 450, 600 and 750 bp were obtained. The majority bands were subcloned and sequenced, and only 3 different transcripts were identified, indicating the existence of 3 expression isoforms of the fut8 gene. The 600 bp (Ti) transcript contains a 508 bp extension 5 'of the ATG, consisting of 4 exons, respectively in the 3' to 5 'direction El, E0, E-1 and E-2. The 750 bp (T2) transcript contains a 508 bp extension 5 'of the ATG, consisting of 4 exons, respectively in the 3' to 5 'direction E1, E0, E-1 and an exon different from the first transcript Exon E-3. The 200 bp (T3) transcript contains only exon 1, 5 'of the ATG codon.

Les représentations schématiques de chacun des trois transcrits sont présentées dans la figure 2. Les transcrits Ti et T2 ont également été retrouvés dans des banques d'ADNc de cellules Rat2. Schematic representations of each of the three transcripts are shown in Figure 2. Transcripts Ti and T2 were also found in Rat2 cell cDNA libraries.

Exemple 3 : Etude de l'expression des transcrits du gène fut8 de rat. L'expression relative des transcrits spécifiques de fut8 de rat a été mesurée par la technique du Q-PCR TagmanTM en duplex en utilisant le gène HPRT comme gène normalisateur. Example 3 Study of the expression of the transcripts of the rat fut8 gene. Relative expression of rat-specific transcripts was measured by the Q-PCR TagmanTM duplex technique using the HPRT gene as the normalizing gene.

Pour le transcrit Ti, un oligonucléotide sens hybridant avec la jonction exon-exon E-1/E-2 et un oligonucléotide en antisens en 5' de l'Exon E-2 ont été utilisés. Pour le transcrit T2, un oligonucléotide sens hybridant avec l'exon E-3 et un oligonucléotide en antisens en 5' de l'Exon E-1 ont été utilisés. For the Ti transcript, a sense oligonucleotide hybridizing with the exon-exon E-1 / E-2 junction and a 5 'antisense oligonucleotide of Exon E-2 were used. For the T2 transcript, a sense oligonucleotide hybridizing with exon E-3 and a 5 'antisense oligonucleotide of Exon E-1 were used.

Les sondes Taqman ont été conçues dans les exons E-1 et E-3, respectivement. Pour le gène HPRT des oligonucléotides ont été conçus pour s'hybrider sur les exons 7 et 8. L'expression relative a été mesurée pour les lignées cellulaires YB2/0 et Rat2. Comme le montre la figure 3, l'expression du transcrit T2 est 1,6 fois plus élevée que celle du transcrit Ti. Taqman probes were designed in exons E-1 and E-3, respectively. For the HPRT gene, oligonucleotides were designed to hybridize to exons 7 and 8. Relative expression was measured for YB2 / 0 and Rat2 cell lines. As shown in FIG. 3, the T2 transcript expression is 1.6 times higher than that of the Ti transcript.

La quantification directe du transcrit T3 n'est pas possible car la totalité de la région 5'UTR est commune aux séquences des transcrits Ti et T2. Cependant, il semble que l'expression de ce transcrit soit minoritaire. Direct quantification of the T3 transcript is not possible because the entire 5'UTR region is common to the T1 and T2 transcript sequences. However, it seems that the expression of this transcript is a minority.

Exemple 4 : Activité des promoteurs des transcrits Tl et T2 du gène fut8 de rat. Example 4: Activity of the promoters of the transcripts T1 and T2 of the rat fut8 gene.

Afin de déterminer la région minimale promotrice du transcrit Ti, la région génomique de 1 kb (1000 pb) comprise entre les exons E-3 et E-2 a été clonée dans le vecteur pGL3 en amont d'un gène rapporteur, le gène de la luciférase De luciole (Firefly). Cette région a été tronquée en 5' et en 3' et les différents vecteurs obtenus sont les suivants : pGL3-1418/-598, pGL3-1418/-451, pGL3-598/-411, pGL3-892/-411, pGL3-892/-451, pGL3-892/-598, pGL3-1004/-411 et pGL3-1205/-411. Les vecteurs ont été transfectés dans des cellules YB2/0 et Rat2 pour effectuer des dosages d'activité de la luciférase. Les résultats obtenus avec les cellules Rat2 sont présentés dans la figure 4. In order to determine the minimal promoter region of the Ti transcript, the 1 kb (1000 bp) genomic region between exons E-3 and E-2 was cloned into the pGL3 vector upstream of a reporter gene, the gene of firefly luciferase (Firefly). This region was truncated at 5 'and at 3' and the different vectors obtained are as follows: pGL3-1418 / -598, pGL3-1418 / -451, pGL3-598 / -411, pGL3-892 / -411, pGL3 -892 / -451, pGL3-892 / -598, pGL3-1004 / -411 and pGL3-1205 / -411. Vectors were transfected into YB2 / 0 and Rat2 cells for assays for luciferase activity. The results obtained with Rat2 cells are presented in FIG.

Les résultats montrent que l'activité luciférase pour la région pleine longueur est 13 fois supérieure à celle sans insert, alors qu'elle est de 30 à 38 fois supérieure pour les régions -1418/-451 et -1205/-411, respectivement. De plus, l'activité luciférase des régions -892/-411 et -598/-411 est de 3 à 4 fois supérieure à celle sans insert. Ces résultats montrent l'existence d'un promoteur minimal P1 dans la région -892 /-451 et l'existence de séquences inhibitrices dans les régions -451 /-411 et -1438 /-1205. La région de 1 kb en 5' de l'exon E-3 a également été étudiée, afin de déterminer les éléments minimaux de régulation du transcrit T2. La région a été amplifiée et sous clonée dans le vec- teur pGL3 en amont d'un gène rapporteur : le gène luciférase (pGL3b-1399/-404). Cette région a été tronquée en 5' et en 3' et les différents vecteurs ont été obtenus (pGL3b-1399/-537, pGL3b-998/-537 et pGL3b-720/-537). Les vecteurs ont été transfectés dans des cellules YB2/0 et Rat2 pour effectuer des dosages d'activité de la luciférase. Les résultats obtenus avec les cellules Rat2 sont présentés dans la figure 5. The results show that the luciferase activity for the full-length region is 13 times greater than that without insert, while it is 30-38 fold higher for the -1418 / -451 and -1205 / -411 regions, respectively. In addition, the luciferase activity of the -892 / -411 and -598 / -411 regions is 3 to 4 times greater than that without the insert. These results show the existence of a minimal promoter P1 in the region -892 / -451 and the existence of inhibitory sequences in the regions -451 / -411 and -1438 / -1205. The 1 kb 5 'region of exon E-3 has also been studied, in order to determine the minimal elements of T2 transcript regulation. The region was amplified and subcloned into the vector pGL3 upstream of a reporter gene: the luciferase gene (pGL3b-1399 / -404). This region was truncated at 5 'and at 3' and the different vectors were obtained (pGL3b-1399 / -537, pGL3b-998 / -537 and pGL3b-720 / -537). Vectors were transfected into YB2 / 0 and Rat2 cells for assays for luciferase activity. The results obtained with Rat2 cells are shown in FIG.

Les résultats montrent l'existence d'un promoteur minimal dans la région -720/-537 contrôlant l'expression de T2. The results show the existence of a minimal promoter in the -720 / -537 region controlling T2 expression.

Exemple 5 : Analyse des promoteurs minimaux Pl et P2 du gène fut8 de rat. Les promoteurs minimaux en amont (5') des exons ûE2 et ûE3 ont été étudiés avec le logiciel Matinspector 2.2 (www.genomatix.de) en utilisant TRANSAC matrices 4.0 (Quandt et al., 1995). Des filtres spécifiques pour isoler les facteurs spécifiques des cellules lymphoïdes et myéloïdes ont été utilisés. Les résultats obtenus pour le promoteur minimal P1 sont représentés dans la figure 6. Aucune séquence CAAT ou TATA n'a été identifiée, mais plusieurs sites putatifs de liaison à des facteurs de transcription possédant une activité répressive ont été identifiés. La région -892 /-451 contrôlant l'expression du transcrit Ti contient des sites putatifs pour les facteurs suivants : MZF1 (Myeloid Zinc Finger 1), PAX5 (Paired Box 5), KLF15 (Krüppellike Factor 15), IRF3 (Interferon Regulatory Factor 3) et PRDM1 (Positive Regulatory Do-main containing 1). Example 5: Analysis of the minimal promoters P1 and P2 of the rat fut8 gene. The minimal upstream promoters (5 ') of the exons ûE2 and ûE3 were studied with the Matinspector 2.2 software (www.genomatix.de) using TRANSAC matrices 4.0 (Quandt et al., 1995). Specific filters for isolating specific factors of lymphoid and myeloid cells were used. The results obtained for the minimal promoter P1 are shown in FIG. 6. No CAAT or TATA sequence has been identified, but several putative transcription factor binding sites possessing repressive activity have been identified. The region -892 / -451 controlling the expression of the transcript Ti contains putative sites for the following factors: MZF1 (Myeloid Zinc Finger 1), PAX5 (Paired Box 5), KLF15 (Krüppellike Factor 15), IRF3 (Interferon Regulatory Factor 3) and PRDM1 (Positive Regulatory Do-main containing 1).

Exemple 6 : Effet de la surexpression de KLF15 sur l'expression du transcrit Ti du gène fut8 de rat. Example 6 Effect of the overexpression of KLF15 on the expression of the transcript Ti of the rat fut8 gene.

Afin de déterminer si les sites putatifs décrits précédemment jouent un rôle dans la régulation du transcrit Ti, des cellules Rat2 ont été transfectées avec chacun des facteurs MZF1, PAX5, KLF15, IRF3 ou PRDM1 avec le vecteur pGL3b-892/-451 contenant le promoteur minimal pour Ti en amont de la luciférase. 48h après la transfection, les résultats (figures 7A-E) ont montré que seul KLF15 est capable de réduire l'activité du promoteur Ti de 50%, pour chacune des concentrations en facteur testées. Les résultats sont montrés dans la figure 7E. Ces résultats sont statistiquement significatifs (p<0,0005) et montrent que KLF15 possède une activité de répression. In order to determine whether the putative sites described previously play a role in the regulation of the Ti transcript, Rat2 cells were transfected with each of the MZF1, PAX5, KLF15, IRF3 or PRDM1 factors with the pGL3b-892 / -451 vector containing the promoter. minimum for Ti upstream of luciferase. 48 hours after transfection, the results (FIGS. 7A-E) showed that only KLF15 was able to reduce the Ti promoter activity by 50%, for each of the factor concentrations tested. The results are shown in Figure 7E. These results are statistically significant (p <0.0005) and show that KLF15 has repressive activity.

La surexpression de KLF15 a été étudiée par immunodétection dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques. La figure 8A montre deux bandes d'environ 55 kDa correspondant à KLF15, en accord avec la taille observée par SDS-PAGE (Uchida et al., 2000). KLF15 endogène est majoritairement présent dans la fraction cytosolique, comme l'indique la 15 piste 1 de la figure 8, alors que la quantité de KLF15 augmente dans les deux fractions en fonction de la quantité de KLF15 exprimée de manière exogène. A faible concentration, KLF15 est principalement surexprimé dans la fraction nucléaire. La concentration en facteur ne change pas le niveau de répression de la luciférase (figure 8B), indiquant qu'une faible quantité de facteur KLF15 suffit pour efficacement exercer son effet 20 répresseur. Overexpression of KLF15 was studied by immunodetection in nuclear and cytoplasmic fractions. Figure 8A shows two bands of approximately 55 kDa corresponding to KLF15, consistent with the size observed by SDS-PAGE (Uchida et al., 2000). Endogenous KLF15 is predominantly present in the cytosolic fraction, as shown in lane 1 of Figure 8, while the amount of KLF15 increases in both fractions as a function of the exogenously expressed amount of KLF15. At low concentration, KLF15 is mainly overexpressed in the nuclear fraction. The factor concentration does not change the level of luciferase repression (Fig. 8B), indicating that a small amount of KLF15 factor is sufficient to effectively exert its repressor effect.

Claims

Revendications1. Use of a protein factor or a nucleic acid encoding said protein factor, for the repression of the expression of one or more genes coding for an enzyme having a 1,6-fucosyltransferase activity, said protein factor being chosen from: A transcription factor KLF15, in particular a mammal, a variant of said transcription factor KLF15, said variant having an amino acid identity of at least 80% with said transcription factor KLF15 and retaining the modulation properties of the transcription of said KLF15 transcription factor, and • a fragment of said KLF15 transcription factor, provided that said fragment contains the DNA binding domain of said KLF15 transcription factor and retains transcriptional properties of said KLF15 transcription factor .

2. Use according to claim 1, wherein said protein factor represses the expression of one or more genes encoding an enzyme with 1,6-fucosyltransferase activity by binding to a nucleic acid sequence, in particular a nucleic acid sequence. involved in the regulation of said gene (s), said nucleic acid sequence being more particularly located in 5 'of said gene (s).

The use according to claim 1 or claim 2, wherein said nucleic acid sequence comprises or consists of any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10.

4. Use according to any one of claims 1 to 3, wherein said al, 6-fucosyltransferase enzyme is encoded by the fut8 gene.

Use according to any one of claims 1 to 4, wherein said KLF15 transcription factor comprises or consists of an amino acid sequence selected from the following sequences: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17.

The use according to any one of claims 1 to 5, wherein said gene encoding an enzyme with fucosyltransferase activity is contained in a cell, or a cell of a cell line, in particular a mammalian cell or mammalian cell line, said gene being in particular contained in the genome of said cell or cell line cell.

7. Use according to claim 6, wherein said cell or cell line cell is selected from CHO cells, rat myeloma cells, especially the YB2 / 0 line, mouse myeloma cell lines, in particular NSO or SP2. / 0-Ag14, PER.C6 human retinoblastoma cells, HEK293 cells, BHK cells, hybridomas, Jurkat cells, NIH3T3 cells, COS cells, or Hela cells or avian cells, especially EB66 cells. .

8. Use according to any one of claims 1 to 7, for the production of monoclonal antibodies, said monoclonal antibodies having a fucosylation rate lower than the fucosylation rate of the antibodies produced by said cell or cell line cell expressing an endogenous amount of protein factor.

9. Transgenic cell transformed with a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being chosen from: a transcription factor KLF15, in particular a mammal, a variant of said transcription factor KLF15, said variant having an amino acid identity of at least 80% with said KLF15 transcription factor and retaining the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor, and • a fragment of said KLF15 transcription factor, provided that said fragment contains the binding domain DNA of said KLF15 transcription factor and retains the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor, said cells expressing antibodies, in particular monoclonal antibodies.

10. Transgenic cell according to claim 9, wherein said transgenic cell is derived from the transformation with a nucleic acid encoding a protein factor of a cell selected from the following cells: CHO cells, rat myeloma cells, in particular YB2 / 0 line • mouse myeloma cell lines, including NSO or SP2 / 0-Ag14, • hybridomas, producing antibodies, • PER.C6 human retinoblastoma cells, • HEK293 cells, and • cells. BHK • avian cells, especially EB66 cells

11. Transgenic cell according to claim 9 or claim 10, said cell being also transformed by at least one nucleic acid allowing the expression of a monoclonal antibody.

12. Transgenic cell according to claim 10, said transgenic cell being derived from the YB2 / 0 line.

13. YB2 / 0 Transgenic Cell Transformed by a KLF Transcription Factor 15.

A composition comprising a culture medium comprising: one or more transgenic cells according to any one of claims 9 to 12, and antibodies having a lower fucosylation rate than the antibodies produced by the cell from which said cell originates transgenic.

A composition comprising a culture medium comprising: one or more transgenic cells according to claim 12, and antibodies having a lower fucosylation rate than antibodies produced by the cell from which said transgenic cell originates.

16. A method for preparing monoclonal antibodies comprising a step of transforming a transgenic cell with at least one nucleic acid allowing the expression of an antibody, said transgenic cell being transformed by a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being selected from: • a KLF15 transcription factor, in particular a mammalian factor, • a variant of said KLF15 transcription factor, said variant having an amino acid identity of at least 80% with said KLF15 transcription factor and retaining the transcriptional repression properties of said KLF15 transcription factor; and • a fragment of said KLF15 transcription factor, provided that said fragment contains the DNA binding domain of said KLF15 transcription factor and retains the repressing properties of the KLF15 transcription factor. transcription of said KLF15 transcription factor.

The method of claim 16, wherein said transgenic cell is a YB2 / 0 cell transformed with a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being the transcription factor KLF15.

18. The method of claim 16 or claim 17, further comprising a step of selecting the cells transformed by said nucleic acid for the expression of an antibody.

19. Process for the preparation of monoclonal antibodies comprising a step of transforming a cell, or a cell of a cell line, in particular the YB2 / 0 line, with a nucleic acid allowing the expression of a protein factor, said protein factor being the KLF15 transcription factor.

20. The method of claim 19, said method comprising a further step of transforming said transformed cell with a nucleic acid allowing the expression of a protein factor by at least one nucleic acid allowing the expression of an antibody.

21. The method of claim 19, said method comprising simultaneously at the step of transforming said cell a nucleic acid allowing the expression of a protein factor, the transformation of said cell with at least one nucleic acid allowing the expression of a protein. an antibody.

The method of claim 19 comprising: a step of transforming a cell line cell or cell by a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being the KLF15 transcription factor, a selection step cells transformed in the previous step, and • a step of transforming the cells selected in the previous step by a nucleic acid allowing the expression of an antibody.

23. The method of claim 19 comprising: a step of transforming a cell or cell line cell with a nucleic acid allowing the expression of an antibody, a step of selecting the cells transformed to the previous step, and • a step of transforming the cells selected in the previous step by a nucleic acid encoding a protein factor, said protein factor being the KLF15 transcription factor.

24. The method according to any one of claims 16 to 23, further comprising: a step of purifying the antibodies, and possibly a step of quantifying the fucose level of said anti-bodies.