FR2942950A1

FR2942950A1 - Traitement d'une image de fluorescence par factorisation en matieres non negatives

Info

Publication number: FR2942950A1
Application number: FR0951505A
Authority: FR
Inventors: Anne Sophie Montcuquet; Lionel Herve; Jerome Mars
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2010-09-17
Anticipated expiration: 2029-03-11
Also published as: FR2942950B1; WO2010103026A1; US20120032094A1; EP2405800A1

Abstract

L'invention concerne un procédé de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant, dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur dans ce milieu, b) on réalise une image de fluorescence par une excitation infra rouge du milieu le long d'un premier axe, cette image comportant d'une part une composante de fluorescence due au marqueur, d'autre part une composante d'autofluorescence due à une partie du milieu autre que les marqueurs, c) on traite l'image par factorisation en deux matrices non négatives A et S, d) on détermine une image de la répartition du ou des marqueurs, sans la composante d'autofluorescence.

Description

1 TRAITEMENT D'UNE IMAGE DE FLUORESCENCE PAR FACTORISATION EN MATRICES NON NEGATIVES

DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTERIEUR L'invention concerne le domaine de l'imagerie optique appliquée au domaine médical. Cette technique offre la perspective de systèmes de diagnostic non invasifs grâce à l'utilisation de rayonnements non-ionisants, faciles d'utilisation et peu coûteux. Des marqueurs fluorescents sont injectés au sujet et se fixent sur certaines molécules spécifiques, par exemple des tumeurs cancéreuses. La zone d'intérêt est éclairée à la longueur d'onde d'excitation optimale du fluorophore (substance chimique d'une molécule capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation) et le signal fluorescent est détecté. L'imagerie optique de diffusion ûsans injection de marqueurs fluorescentsûest déjà utilisée en milieu clinique, notamment dans les domaines de la mammographie et de la neurologie.

L'imagerie optique de fluorescence (avec injection de fluorophore spécifique) est quant à elle concentrée à ce jour sur des applications petit animal en raison du manque de marqueurs adaptés et injectables à l'humain, et du problème d'autofluorescence des tissus qui se pose pour la détection en profondeur. En effet, pour appliquer cette méthode au diagnostic de cancers chez l'homme, il est primordial que le signal spécifique situé plus profondément sous la peau que chez le petit animal puisse être détecté. Mais le 2 signal spécifique à détecter faiblit avec la profondeur, principalement à cause de l'absorption et de la diffusion des tissus, et se confronte à un signal parasite qui perturbe la détection. Ce signal, appelé auto-fluorescence , décrit la fluorescence de tissus auxquels aucune substance chimique ou fluorophore spécifique n'a été injecté il s'agit de la fluorescence naturelle du tissu. Divers travaux sur l'autofluorescence des tissus semblent révéler la possibilité d'attribuer celle-ci à la présence de protoporphyrine IX dans les cellules vivantes. Cette molécule, qui est impliquée dans le transport de l'oxygène et entre notamment dans la composition de l'hémoglobine, a en effet la propriété de fluorescer dans les longueurs d'onde utilisées en imagerie optique médicales (entre 650 nm et 850 nm environ). L'autofluorescence est donc un phénomène connu, mais elle est à ce jour rarement perçue comme un signal parasite. En cancérologie notamment, l'autofluorescence est utilisée pour distinguer des tissus cancéreux de tissus sains. Il ne s'agit alors pas d'injecter de marqueur spécifique, mais simplement d'observer l'autofluorescence de zones spécifiques et de comparer différentes zones d'un même individu. La longueur d'onde d'excitation est alors proche des 400 nm, longueur d'onde pour laquelle l'intensité du signal d'autofluorescence est maximale. Par opposition, la spectroscopie optique de fluorescence utilise des longueurs d'onde d'excitation en proche infra rouge, qui assurent une absorption moindre, et permettent une meilleure pénétration des 3 tissus. L'autofluorescence des tissus est alors beaucoup plus faible et devient un signal à supprimer plutôt qu'à utiliser. D'une manière générale, il se pose donc le problème de trouver un nouveau procédé, permettant de différencier, dans une image, la contribution de l'autofluorescence de celle des sources de fluorescence associées à des marqueurs. Il se pose également le problème de trouver 10 un nouveau dispositif, permettant de mettre en oeuvre un tel procédé. EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention concerne d'abord un procédé de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un 15 milieu diffusant, dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur dans ce milieu, b) on réalise au moins une image ou une acquisition de fluorescence ou une série ou une 20 pluralité d'images ou d'acquisitions de fluorescence, par une excitation du milieu, chaque image ou acquisition pouvant comporter d'une part une composante de fluorescence due au marqueur ou aux marqueurs, d'autre part une composante d'autofluorescence due à 25 une partie du milieu autre que les marqueurs, les données mesurées de l'image ou de l'acquisition ou des images ou des acquisitions pouvant être stockées dans un tableau multidimensionnel X, c) on traite ces données ou ce tableau, par 30 factorisation de ce tableau en un produit de seulement deux tableaux multidimensionnels non négatifs, par 4 exemple deux matrices non négatives (si la dimension spatiale est égale à 1), A et S, d) on détermine une représentation graphique de la répartition de l'intensité ou des intensités d'une ou plusieurs sources de fluorescence, éventuellement de l'autofluorescence qui peut être considérée comme une source de fluorescence, à partir des données contenues dans les tableaux A et S. L'invention concerne également un procédé de traitement d'une image ou acquisition ou d'une série d'images ou d'acquisitions de fluorescence dans un milieu diffusant comportant au moins un marqueur fluorescent, chaque image ou acquisition étant obtenue par une excitation de ce milieu, cette image ou acquisition pouvant comporter, d'une part, au moins une composante de fluorescence due au marqueur, et, d'autre part, une composante d'autofluorescence due à une partie du milieu autre que les marqueurs, procédé dans lequel on traite ces données ou un tableau X de données issues de la série d'images ou d'acquisitions par factorisation de ce tableau X en un produit de seulement deux tableaux multidimensionnels non négatifs, par exemple deux matrices non négatives, A et S. Il est ensuite possible de déterminer une représentation graphique ou une image de la répartition de l'intensité d'une source de fluorescence ou des intensités des différentes sources de fluorescence, chaque source étant un marqueur fluorescent ou l'autofluorescence.

Dans l'un ou l'autre des procédés ci-dessus, le premier tableau A non négatif du produit AS est un tableau dont les éléments aq,p sont des coefficients de pondération, aq,p étant la contribution du spectre représenté par la p1eme ligne de S, au point de coordonnée q. Le second tableau non négatif S est

une matrice dont les lignes correspondent aux spectres d'émission des sources fluorescentes considérées, le nombre de lignes du tableau S et le nombre de colonnes du tableau A correspondant alors au nombre de sources de fluorescence considérées.

Le tableau X est formé en réalisant des acquisitions successives, une acquisition pouvant par exemple correspondre a une position donnée de la source et à une position donnée du détecteur. Chacune de ces positions peut être modifiée par une nouvelle

acquisition.

Le tableau S est, en général, une matrice, donc un tableau de dimension 2, quand bien même A et X peuvent être chacun de dimension strictement supérieure à 2.

Lors de l'étape de traitement du tableau X des données résultant de l'acquisition ou de la série d'acquisition (étape c) du procédé de localisation ou étape a) du procédé de traitement), on détermine A et S par minimisation d'une fonction de coût ou d'objectif,

cette fonction pouvant être la distance euclidienne OX û AS entre l'image X et le produit A.S. En outre, lors de cette étape c) ou a), au

moins une ligne du tableau S peut être initialisée, par un spectre de référence de la source de fluorescence

correspondante. Ce spectre de référence peut-être 6 obtenu de façon empirique ou à partir de valeurs tabulées. Le tableau X obtenu est traité de préférence selon un procédé itératif. Par exemple, on réalise k itérations, les tableaux Al+1 et 51+1, obtenus lors de l'itération d'ordre 1+1 étant déterminés à partir des tableaux Al et S1 obtenus lors de l'itération d'ordre 1. Le nombre d'itération peut être déterminé en fonction des fluctuations des tableaux A et S, ou de façon automatique, en fonction de fluctuations de la fonction de coût au cours de 2 ou plusieurs itérations successives. Ce nombre d'itérations peut également être déterminé empiriquement, en fonction de l'expérience de l'utilisateur.

Lors de l'étape de détermination de la représentation graphique de la répartition des intensités des différentes sources de fluorescence (dues au(x) marqueur(s), ou à l'autofluorescence), la position d'une des sources peut être obtenue en éliminant les contributions des autres sources dans le tableau S, puis en effectuant le produit de A avec le tableau S ainsi modifiée. Il est également possible de remplacer les coefficients des colonnes du tableau A ne correspondant pas à la source choisie par une valeur nulle. Il encore possible d'extraire la colonne de A et la ligne de S correspondant à la source recherchée et de réaliser le produit de cette colonne et de cette ligne. L'excitation du milieu peut être réalisée par une source d'excitation laser, qui peut être éventuellement focalisée à l'interface entre le milieu 7 diffusant et le milieu extérieur. La lumière d'excitation va ensuite pénétrer dans le milieu diffusant, et y exciter des marqueurs ou des sources dans ce milieu, par exemple à 3 cm ou 5 cm en profondeur, c'est-à-dire à distance de l'interface, dans le milieu diffusant. Le rayonnement de fluorescence provient donc d'une zone en profondeur, par exemple comprise entre l'interface et environ 3 cm ou 5 cm à distance de l'interface, ou comprise entre 1 cm à distance de l'interface et 5 cm à distance de l'interface. L'excitation peut avoir lieu dans l'infrarouge ou le proche infra rouge, par exemple à une longueur d'onde comprise environ entre 600 et 900 nm.

La fluorescence peut quant à elle être détectée à des longueurs d'onde supérieures à 700 nm ou à 750 nm. Une excitation à longueur d'onde supérieure à 750 nm ou à 800 nm est également possible, avec, par exemple, une fluorescence à longueur d'onde supérieure à 800 nm ou à 900 nm. Chaque acquisition peut être réalisée à l'aide d'un détecteur comportant une ligne de détecteurs élémentaires ; la ligne de détecteurs peut être déplacée, une acquisition de fluorescence étant réalisée pour chaque position de la ligne de détecteurs. L'excitation peut être réalisée à l'aide d'un laser, et on déplace la ligne d'excitation, une image (X) de fluorescence pouvant être réalisée pour chaque position de la ligne d'excitation. 8 L'invention concerne également un dispositif de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant, comportant : a) des moyens pour produire un faisceau d'excitation, et des moyens pour focaliser ce faisceau, b) des moyens pour réaliser une acquisition ou une image ou une série d'acquisitions ou d'images de fluorescence de points ou de sources du milieu, chaque acquisition pouvant comporter les composantes de fluorescence dues aux différentes sources fluorescentes présentes, par exemple d'une part un ou plusieurs marqueurs et d'autre part l'autofluorescence, c) des moyens pour traiter un tableau X des données obtenues par la série d'acquisitions par factorisation en deux tableaux non négatifs A et S, d) des moyens pour déterminer une représentation graphique de la répartition des intensités des différentes sources de fluorescence, ces différentes sources pouvant être un ou plusieurs marqueurs fluorescents et l'autofluorescence. La focalisation a lieu de préférence à l'interface du milieu avec le milieu ambiant. Les moyens pour produire un faisceau laser permettent de produire une zone, dite zone d'excitation, focalisée par exemple à l'interface de ce milieu avec le milieu ambiant. La lumière d'excitation pénètre alors dans le milieu, y diffuse, et va exciter les sources de fluorescence, marqueurs et autofluorescence. Cette zone d'excitation peut être une ligne d'excitation. Comme expliqué ci-dessus, les 9 sources de fluorescence peuvent être localisées en profondeur, à distance sous l'interface. Un dispositif selon l'invention peut comporter en outre des moyens pour modifier la position de cette zone d'excitation, une image de fluorescence étant réalisée pour chaque position de la zone d'excitation. Au moins une partie des moyens pour réaliser une détection du signal de fluorescence issu dudit milieu peuvent être disposés selon une ligne, dite ligne de détection. Un dispositif selon l'invention peut comporter en outre des moyens pour modifier la position de cette ligne le long de deux axes.

Les moyens pour traiter la matrice d'acquisitions (ou tableau multidimensionnel) par factorisation en deux tableaux non négatifs A et S, mettent en oeuvre un procédé selon l'invention, comme déjà décrit ci-dessus.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS - La figure 1 représente un dispositif pour mettre en oeuvre l'invention, - la figure 2 illustre comment est constituée une acquisition de fluorescence, - la figure 3 représente une acquisition de fluorescence obtenue, avec autofluorecence et fluorescence, - les figures 4A et 4B représente respectivement schématiquement une matrice S de spectres, à 2 sources fluorescentes et donc 2 lignes, 10

et un produit de deux tableaux, dont la matrice S, pour obtenir le tableau X, - les figures 5A et 5B représentent respectivement un modèle spectral d'autofluorecence et de fluorescence, pour initialiser une matrice S dans un procédé selon l'invention, - la figure 6 représente des spectres d'autofluorescence et de fluorescence détectés après traitement selon l'invention, et une comparaison avec des modèles initiaux, - les figures 7A et 7B représentent respectivement une image de l'autofluorescence, et une image de la fluorescence, obtenues après traitement selon l'invention de l'image de la figure 3, - la figure 8 représente des étapes d'un procédé selon l'invention, - les figures 9, 10A et 10B représentent des images de fluorescence (figures 9 et 10B), et une image de l'autofluorescence (figure 10A), obtenues après traitement, selon des méthodes de l'art antérieur, de l'image de la figure 3. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE REALISATIONS DE L'INVENTION La figure 1 est un exemple de système expérimental permettant de mettre en oeuvre l'invention.

L'illumination d'une zone d'un objet (non représenté sur la figure), est obtenue à l'aide d'un laser continu 2 dont le faisceau, qui émet par exemple un rayonnement dans l'infra rouge ou même le proche infra rouge, est focalisé avec des moyens de focalisation pour atteindre une certaine zone à la 11 surface du milieu diffusant, cette zone pouvant être une ligne. La lumière d'excitation diffuse ensuite dans une zone du milieu diffusant, différente de la zone précédente et va y exciter une ou plusieurs espèces fluorescentes. Des moyens 6 permettent de réaliser une dispersion spectrale du rayonnement de fluorescence émis par le milieu diffusant étudié dans le milieu extérieur. Ces moyens 6 sont couplés à des moyens 8, formant capteur d'image, pour produire une image qui donne, pour des points de la zone étudiée, la répartition spectrale du rayonnement de fluorescence provenant de ces points. Le capteur d'image de ces moyens 8 est une matrice linéaire (NÀ, NXd) , où NÀ est le nombre de canaux correspondant à la gamme de longueur d'onde considérée, et NXd est le nombre de pixels correspondant au nombre de points détectés sur la ligne. Les moyens 8 comportent des moyens pour numériser l'image. Des moyens 24 de traitement des données vont permettre de mettre en oeuvre un procédé de traitement pour analyser les données numériques ainsi obtenues, notamment en termes de répartition spatiale et/ou spectrale des marqueurs fluorescents. Ces moyens électroniques 24 comportent par exemple un micro ordinateur programmé pour mémoriser et traiter les données acquises par les moyens 8. Plus précisément une unité centrale 26 est programmée pour mettre en oeuvre un procédé de traitement selon l'invention. Des moyens 27 d'affichage ou de visualisation permettent, après traitement, de représenter le positionnement ou la 12 distribution spatiale des fluorophores dans le milieu examiné. Les moyens 24 permettent éventuellement de commander ou de contrôler d'autres parties du dispositif expérimental.

Le milieu étudié est un milieu diffusant, par exemple un tissu biologique. Dans ce type de milieu, un rayonnement incident peut pénétrer dans le milieu, la profondeur de pénétration dans le milieu pouvant atteindre quelques cm selon le coefficient d'atténuation de ce milieu, par exemple 3 cm ou 5 cm. Autrement dit, des fluorophores situés à une distance comprise entre 0 cm (donc situés très proches de la surface) et 3 cm ou 5 cm vont pouvoir être détectés. Les moyens de détection 6, 8 détectent donc un rayonnement qui provient de la zone du milieu diffusant excitée par le faisceau laser, qui traverse le milieu diffusant en direction de la frontière entre le milieu diffusant et le milieu extérieur, puis qui atteint les moyens 6 de détection et de dispersion spectrale. Les moyens de détection ne sont pas forcément focalisés sur la zone ou la ligne d'excitation, mais peuvent être décalés et viser une autre zone ou ligne, en particulier à la surface du milieu. Ce mode de réalisation est rendu possible du fait de la diffusion de la lumière dans le milieu. Typiquement, le milieu étudié peut être un milieu vivant. Il peut s'agir par exemple d'une zone du corps humain ou animal. L'enveloppe corporelle constitue l'interface du milieu diffusant avec le milieu extérieur. Une source d'excitation est donc focalisée sur cette interface, par exemple selon une 13 ligne. Des marqueurs injectés dans ce milieu diffusant permettent de localiser des zones telles des tumeurs. Comme on va le voir, il y a également excitation d'autres éléments du milieu, créant une fluorescence parasite, ou autofluorescence. Une image peut être visualisée sur des moyens de visualisation 27. Dans l'exemple illustré une source laser de longueur d'onde d'excitation égale à 690 nm est focalisée le long d'une ligne sur l'interface et permet de réaliser une excitation des fluorophores dans le milieu diffusant, à une profondeur pouvant atteindre quelques centimètres. La ligne peut être fixe, et dans ce cas on n'acquiert qu'une seule ligne de l'objet. Mais on peut aussi utiliser des platines de translation afin d'acquérir ligne par ligne l'image de fluorescence d'une portion d'un objet ou d'un objet entier. Ces platines peuvent être commandées par des moyens tels que les moyens 24, 26, 27 de la figure 1. En réalisant ainsi plusieurs images, on peut obtenir un signal en provenance de tout ou partie d'une zone située dans l'objet. Chaque image peut être traitée comme indiqué dans la présente description. La source 2 peut être couplée à une fibre laser 3. Une lentille 4 permet de focaliser le faisceau sous forme d'une ligne laser à l'interface du milieu étudié. L'excitation laser peut être positionnée au-dessus de l'objet, comme en figure 1, et on peut alors réaliser une observation en réflexion : le signal de fluorescence est détecté au-dessus de l'objet, ou encore du même côté de l'objet que la source de 14 rayonnement, par un spectromètre imageur 6 couplé à une caméra CCD 8. Un filtre d'excitation est utilisé, il permet d'épurer le signal Laser. Un système 10 permet un filtrage passe-haut, qui coupe les longueurs d'onde en-dessous de 700 nm, c'est par exemple un système de filtres RG9. Ce filtrage est positionné devant l'objectif, pour bloquer l'excitation parasite provenant du faisceau laser lui-même. L'image acquise est alors obtenue a l'aide d'un logiciel du constructeur Andor ou Labview, et on peut piloter le système et les platines de translation par une unique interface Labview. Sur la figure 1 est également mis en évidence un axe Xd qui décrit la position des Nxd détecteurs alignés le long d'une ligne de détection dans les moyens 8. On retrouve cet axe Xd sur la figure 2, qui donne un exemple schématique du type d'image que l'on peut acquérir avec un système tel que décrit ci-dessus et de l'information que l'on peut y trouver. La fluorescence le long de la ligne de détection est détectée, et un spectre en longueur d'onde (en abscisse) de points de la ligne (soit les points iXd de l'axe Xd des ordonnées de la figure 2) est réalisé. On désigne par (ixd, iyd) les coordonnées d'un détecteur ponctuel. On note (iXS, iys) les coordonnées d'une source ponctuelle, par exemple une source laser. Dans le cas d'une source laser en ligne, on peut considérer 15

que cette source contient NXS (2) sources élémentaires selon la ligne. Une seule source fluorescente est ici détectée le long de la ligne à la position ixd du point de positionnement de la source, dans la gamme de longueur d'onde comprise entre 850 et 900 nm. Une image réelle est beaucoup plus complexe, et mélange les contributions, à la fois de l'autofluorescence et d'une ou plusieurs sources de fluorescence, cette fluorescence provenant de fluorophores présents dans le milieu diffusant examiné. Un exemple d'une acquisition réalisée pour une excitation dans le proche infra rouge est illustré en figure 3. Expérimentalement, il correspond au cas d'un capillaire (tube de verre rempli de vert d'indocyanine ICG) placé, en position sous cutanée, au niveau du dos d'une souris. La source excite le fluorophore présent dans le capillaire ainsi que les tissus biologiques environnants, ce qui génère de l'autofluorescence.

On voit deux parties principales sur cette image: une première partie A qui est de l'autofluorescence visible tout le long de la ligne d'acquisition Xd dont le maximum d'intensité se situe autour de 700 nm. La seconde partie B est la fluorescence due au fluorophore (ICG - vert d'indocyanine) elle est spatialement plus localisée que l'autofluorescence et son spectre d'émission présente un pic autour de 860 nm. Sur une telle image, on appelle source un 30 ensemble de points ayant un même spectre d'émission. Une source fluorescente peut donc comporter plusieurs 16 zones d'émission, répartis à diverses positions dans le milieu diffusant. Une telle image peut être traitée par un procédé selon l'invention, en particulier afin de séparer la contribution de l'autofluorescence d'une part et celle de la ou des sources de fluorescence, d'autre part, cette dernière provenant de fluorophores présents dans le milieu examiné. Mais, en vue du traitement, l'autofluorescence est considérée comme une source fluorescente au même titre qu'un fluorophore. Une technique de traitement des données est décrite par Lee et Seung dans l'article Algorithms for Non Negative Matrix Factorisation , paru dans Advances in neural information processing systems, pages 556-562, 2001. Selon cette technique, étant donné une matrice non négative X, de taille NXd * NÀ (soit NXd lignes et NÀ colonnes) on cherche les matrices non négatives A et S, respectivement de tailles NXd * P et P * NÀ, qui satisfont à la condition : X A S (1) On entend par matrice non négative une matrice dont tous les éléments sont non négatifs. P correspond au nombre de sources de fluorescence considérées. La matrice X correspond à l'image numérisée qui a été obtenue par la mesure : X est l'expression matricielle de l'image. La matrice A est dite matrice de pondération et un élément aiXd,p (> 0) de cette matrice représente le poids de la source p en position 17 ixd de la ligne de mesure Xd. Elle est de taille NXd * P, le nombre de lignes NXd représentant le nombre de points sélectionnés le long de la ligne de fluorescence, le nombre de colonnes p représentant le nombre de sources susceptibles d'être présentes dans le milieu marqueurs fluorescents et éventuellement autofluorescence. S est dite matrice des spectres et sp,i1, (> 0) représente la iÀème valeur du spectre de la pème source. Elle est de taille P * N), le nombre de lignes P représentant le nombre de sources de fluorescence (incluant l'autofluorescence), le nombre de colonnes NÀ représentant le nombre de données du spectre de chaque source. Autrement dit, chaque ligne de la matrice S correspond au spectre d'émission d'une source fluorescente, ce spectre étant discrétisé selon NÀ canaux. En principe, chaque source, sauf l'autofluorescence, a un spectre proche de celui d'une source monochromatique; mais en pratique il y a une certaine dispersion autour d'une fréquence centrale. La ligne p de la matrice S peut donc comporter plusieurs éléments non nuls. On donne en figure 4A l'exemple imagé d'une matrice S pour une acquisition avec deux sources fluorescentes considérées : les deux lignes représentent les spectres d'émission des deux sources considérées. dont l'une, la première, a une répartition spectrale plus large que la deuxième. En première ligne de la matrice S, ce sont plutôt les premiers éléments de la suite s1i% (il=1,....NI) qui sont non nuls, tandis 18 qu'en deuxième ligne, ce sont plutôt les derniers éléments de la suite s2jX (il=1,....N1)) qui sont non nuls. Dans le cas de deux sources (P = 2) et de Nxd points le long de la ligne, ce qui correspond à Nxd détecteurs, on a donc : x11 x1,n a11 a12 xNxd 1 xNxd aNxd,1 aNxd,2 X= 1 21 On donne en figure 4B l'exemple imagé du produit d'une matrice S (pour une acquisition avec deux sources fluorescentes) avec un tableau afin d'obtenir le tableau X S contient des informations sur les spectres de fluorescence, tandis que A définit leur 15 pondération dans chacune des lignes de X. La solution de l'équation (1) ci-dessus est obtenue de manière approchée, par itérations. Pratiquement, on cherche à minimiser une fonction objectif. Dans cet exemple, on considère la 20 distance euclidienne entre le matrice X et le produit des deux matrices A et S. Autrement dit, on cherche à minimiser la quantité . XùAS 112 25 avec A>-0 et S>-0. 19 En d'autres termes, on définit une fonction de coût ou d'objectif, QFMN , qui s'écrit :

i r d=1 ,:À=1 où Xixd,ih est l'élément en ligne iXd et en colonne iN de la matrice X, et aiXd,p est l'élément en ligne iXd et en colonne p de la matrice A, et sp,i) est l'élément en ligne p et en colonne iN de la matrice S. Cette fonction a la valeur 0 pour borne inférieure et s'annule si et seulement si X = A S. L'algorithme débute par une initialisation des matrices A et S aux dimensions voulues, et en respectant les contraintes de positivité. Les colonnes de A sont initialisées de façon aléatoire, tandis que les lignes de S sont initialisées par des spectres de référence, représentant les spectres d'émission estimés des sources fluorescentes recherchées ou correspondant à ces spectres. Ces spectres sont déterminés de façon empirique ou selon des valeurs tabulées. Les matrices sont initialisées, mais évoluent ensuite pendant l'algorithme. La minimisation de la fonction QFMN se fait en deux étapes itératives. Tout d'abord, pour S fixée, la matrice A est recherchée. Ensuite, pour A fixée, la matrice S est calculée Les formules de mise à jour des matrices A et Ssont alors : p= 1 20 N À i =1 2..,'., = 1 St ,Y. p.,i tT gré: 1 I= Si'ç'~: i d,É~.`~~ti,y'., Ces lois, une fois simplifiées, équivalent à : ( T, ). ? i. % La fonction objectif converge vers un minimum local, et les lois de mise à jour assurent que la fonction objectif décroît. L'algorithme mis en oeuvre dans le cadre de l'invention est donc un algorithme itératif qui met à jour les matrices A et S recherchées selon les fonctions de mises à jour décrites ci-dessus qui minimisent au fur et à mesure des itérations la fonction objectif (distance euclidienne entre X et A.S). Le nombre d'itération est déterminé en fonction des fluctuations des matrices A et S, ou de façon automatique, en fonction des fluctuations de la fonction de coût, QFMN, au cours de 2 ou plusieurs itérations successives, ou de façon empirique. 21 L'initialisation de l'algorithme consiste en principe à créer deux matrices A et S aléatoires, puis à les mettre à jour au cours d'itérations. Dans le cas d'un spectre tel que celui de la figure 3, cette méthode a été testée mais seuls quelques cas sur des dizaines convergent vers un résultat physiquement raisonnable. Pour cette raison, selon l'invention, on choisit au moins les premières lignes, et de préférence toutes les lignes (pour plus de robustesse), de la matrice S lors de l'initialisation ce qui revient à donner la forme approximative des spectres des sources correspondantes. On choisit donc des spectres approximatifs, dont un pour l'autofluorescence, les autres étant ceux de la ou les sources de fluorescence due (s) au (x) marqueur(s). Par exemple, dans le cas d'un seul marqueur fluorescent, on choisit deux modèles de spectres, un pour l'autofluorescence et un pour la fluorescence du marqueur, comme illustré respectivement en figures 5A et 5B, en se basant sur une connaissance a priori de l'autofluorescence et de la fluorescence du marqueur. On initialise les colonnes de A de façon aléatoire, l'initialisation des lignes de S comme précédemment décrit s'avérant être suffisante pour l'étape d'initialisation pour un résultat final satisfaisant. En outre on applique des contraintes de positivité : on choisit des matrices d'initialisation à coefficients positifs, les lois de mises à jour conservant ensuite cette positivité. Une fois les 22 matrices d'initialisation A et S déterminées, l'algorithme permet de mettre à jour les matrices A et S selon les règles explicitées ci-dessus. Ainsi, selon l'invention : û On choisit des matrices d'initialisation A et S qui respectent les contraintes de positivité, û On minimise la fonction d'objectif en deux étapes itératives : û Pour S fixée, la matrice A est mise à jour, û Pour A fixée, la matrice S est mise à jour. Une fois les matrices A et S trouvées, il est possible de trouver la répartition spatiale : - de la première source fluorescente en effectuant le produit AS', la matrice S' étant alors la matrice S pour laquelle le spectre de la deuxième source est éteint (donc s2, À = 0 pour tout iÀ) ; - et/ou de la deuxième source fluorescente en effectuant le produit AS', la matrice S' étant alors la matrice S pour laquelle le spectre de la première source est éteint (donc s1, À = 0 pour tout iÀ). - et/ou de la pieme source fluorescente en effectuant le produit de la colonne p de A par la ligne p de S. - et/ou de la pierre source fluorescente en effectuant le produit A'S, la matrice A' étant alors la matrice A pour laquelle tous les coefficients des colonnes autres que la pième colonne sont mis à zéro.30 23 On peut donc représenter la répartition des intensités de chaque source de fluorescence (marqueurs ou autofluorescence) séparément de celle des autres sources.

Pratiquement cela signifie qu'il est possible d'obtenir la répartition spatiale de tout ou partie des sources de fluorescence constituées par les marqueurs et l'autofluorescence. Un procédé selon l'invention met en oeuvre un procédé de traitement de l'image qui, appliqué à l'image de la figure 3, conduit aux résultats des figures 5A, 5B, 6, 7A et 7B. Les figures 5A et 5B présentent l'allure des spectres choisis pour l'initialisation des deux sources, soit les deux lignes de la matrice S initiale. La figure 6 présente l'allure finale des spectres des deux sources principales détectées en trait plein (les spectres d'initialisation sont en trait pointillés), pour l'autofluorescence et la fluorescence (ICG). Les figures 7A et 7B représentent le résultat en images: la fluorescence (figure 7B) peut être séparée de l'autofluorescence (figure 7A). Un des avantages de cette méthode est la cohérence avec les données, puisqu'il s'agit ici de ne traiter et d'obtenir que des données positives. Des étapes d'un procédé selon l'invention sont représentées en figure 8 : - dans une étape S1, on réalise une ou plusieurs acquisitions par excitation du milieu 24 diffusant, par faisceau laser; il en résulte par exemple une ou plusieurs images, - dans une étape S2, on initialise les matrices A et S, - l'équation X A.S peut ensuite être résolue, de manière itérative comme expliqué ci-dessus (étape S 3), - on peut ensuite procéder à une représentation graphique d'une ou plusieurs sources de fluorescence, ou une visualisation d'une ou plusieurs sources (étape S4), par sélection de la source souhaitée, par exemple par la mise à zéro, dans la matrice S, des coefficients des autres sources. On construit donc une image correspondant aux photons produits par une ou plusieurs sources fluorescentes, par exemple en multipliant respectivement la(les) colonnes de la matrice A correspondant par la(les) ligne(s) de la matrice S correspondant à la ou les sources sélectionnées que l'on recherche. Une comparaison avec les résultats obtenus avec d'autres méthodes a été réalisée. Ainsi, la même image, celle de la figure 3, a d'abord été traitée par la méthode par simple soustraction, par exemple telle qu'expliquée dans US 7321791 ou dans WO 2005/040769. Le résultat obtenu est celui de la figure 9 : l'algorithme itératif utilisé permet d'isoler la fluorescence spécifique, mais des traînées restent visibles sur l'image obtenue, et l'intensité de fluorescence spécifique est plus faible que pour les 25 résultats obtenus en factorisation de matrices non négatives. De plus, il est possible d'obtenir des valeurs négatives, ce qui s'adapte mal aux données spectrales.

La même image a ensuite été traitée par la méthode dite de décomposition en valeurs singulières, exposée par exemple dans D.Kalman, A Singularly Valuable Decomposition : the svd of a Matrix , the College of Mathematics Journal, 27(1), 2- 23, 1996 ou par G.W.Stewart, On the Early History of the Singular Value Decomposition , SIAM Review, 35(4), 551-566, 1993. Le résultat obtenu est présenté respectivement en figure 10A, pour la partie d'auto fluorescence, et en figure 10B, pour la partie de fluorescence spécifique. On observe que cette dernière présente des défauts notables (par exemple des répartitions très tranchées qui ne correspondent pas à des réalités physiques). De plus cette méthode ne traite pas uniquement des valeurs positives, et peut retourner des valeurs négatives, ce qui est mal adapté encore une fois aux données spectrales que nous manipulons. Par conséquent des méthodes de traitement telles que la simple soustraction de modèle ou la décomposition en valeurs singulières (DVS) ne sont pas adaptées à la séparation de spectres. Selon l'invention, on traite des signaux positifs et on ne trouve ensuite que des matrices positives, contrairement à la technique DVS qui peut 26 aboutir à des matrices ayant des valeurs négatives, ce qui ne correspond pas à la réalité physique. Ce qui a été décrit ci-dessus met en oeuvre une géométrie de mesure en réflexion, comme on le voit sur la figure 1 ; dans cette géométrie la source excitatrice est située du même côté que le détecteur par rapport à l'objet diffusant. On peut également mettre en oeuvre une géométrie en transmission dans laquelle le détecteur est situé en face d'une autre face de l'objet diffusant, par exemple l'objet est disposé entre la source d'excitation et le détecteur. On a précédemment décrit l'acquisition et le traitement selon une ligne de NXd détecteurs iXd, pas forcément alignée sur la ligne Laser. On va à présent décrire comment l'invention peut être mise en oeuvre : - en déplaçant la ligne de détecteurs selon un axe Yd, de préférence perpendiculaire à l'axe Xd formé par les NXd détecteurs iXd. Ainsi, chaque détecteur aura 2 coordonnées (ixd, iyd) selon les axes Xd et Yd respectivement, avec 1 < ixd < NXd et 1 < iyd < Nyd. Dans ce cas, la ligne Laser reste de préférence fixe. Dans le cas préféré, chaque détecteur est aligné selon l'axe Xd et on se déplace selon l'axe Yd afin d'avoir une mesure pour l'ensemble des (ixd, iyd) coordonnées de détecteurs, -et/ou en déplaçant la ligne Laser selon un axe Ys de préférence perpendiculaire à l'axe Xs de cette ligne. Dans ce cas, la ligne de détecteurs reste préférentiellement fixe. Les coordonnées d'une source élémentaire sont alors iXS et lys. Dans le cas préféré, la source est linéaire selon un axe Xs et on la déplace 27 selon l'axe Ys. Dans ce cas, ixs reste constant et seul iys évolue. Selon un mode préféré de l'invention, on déplace soit la source en ligne, soit le détecteur.

Si on déplace seulement la source selon l'axe Ys, les coordonnées (ixs, iyd) ne sont pas utiles. Seules les coordonnées (ixd, iys,iX) sont utiles de telle sorte que X (et A) peuvent être considérés comme des tableaux à (seulement) trois dimensions. Si on déplace seulement le détecteur seules les coordonnées (ixd, iyd, iX..sont utiles. Et X (et A) peuvent être considérés comme des tableaux 3D. Dans le premier mode de réalisation décrit ci-dessus, on ne déplace ni la source, ni le détecteur. Seules les coordonnées (ixd, iX sont alors utiles. X (et A) pouvaient dans ce cas être considérés comme des tableaux 2D. Maintenant, on déplace la source et/ou le détecteur. Le dispositif peut alors encore être celui de la figure 1, par exemple. Des déplacements peuvent être obtenus par des moyens de déplacement du détecteur 8 de la figure 1 (par exemple par des platines de translation) et/ou de la position du faisceau laser de cette même figure (par exemple encore par des platines de translation). Ces moyens de déplacement sont par exemple commandés par les moyens de traitement informatique 24. Les repères Xd, Yd et Xs, Ys peuvent être respectivement associés respectivement à un plan de référence, pouvant être le plan de travail sur lequel 28 l'objet à analyser est disposé, ou le plan de déplacement de la source, ou le plan de déplacement du détecteur. On peut traiter une image ou un tableau de données obtenu dans chaque configuration indépendamment des images ou des tableaux obtenus dans d'autres configurations, une configuration désignant une acquisition avec le détecteur et la ligne Laser dans une position déterminée. On peut utiliser, alors, pour chaque image obtenue ou chaque tableau obtenu, un traitement comme précédemment décrit. Mais l'acquisition de fluorescence avec un déplacement de la ligne de détection et/ou de la position de la source offre de nouvelles possibilités qui vont à présent être décrites. On profite alors du fait que chaque source de fluorescence n'est pas purement ponctuelle mais présente une certaine extension spatiale. Aussi, plutôt que de traiter chaque acquisition indépendamment l'une de l'autre, il apparaît utile de faire un traitement d'une série d'acquisitions. Le traitement portera alors sur la factorisation d'un tableau X comportant l'ensemble des données mesurées au cours de cette série d'acquisitions.

Dans le cas où la ligne Laser est fixe et que les Nxd détecteurs sont déplacés, entre deux acquisitions successives, selon un axe Yd, on a :

X zA*S30 29 où X est un tableau de dimensions (ixdr 1yd, 1x) , et où ixd et iyd sont les coordonnées d'un détecteur élémentaire selon les axes Xd et Yd. Dans le cas où la ligne Laser est déplacée entre deux acquisitions successives et que les Nxd détecteurs sont fixes : X zA*S Où X est un tableau de dimensions (ixs, iys, , et où ixs et iys sont les coordonnées d'une source élémentaire selon les axes Xs et Ys. Si la ligne Laser et les détecteurs sont simultanément déplacés entre deux acquisitions successives, on a : X zA*S X étant alors un tableau de dimensions 1ydr ixsr iys iX) Chacun des trois cas précédents peut être écrit sous la forme X zA*S 25 X étant un tableau de dimensions (q,U), avec - q = (ixd, iyd) lorsque les détecteurs sont déplacés et que la ligne laser est fixe, - q = (ixs, iys) lorsque les détecteurs sont fixes et que la ligne laser est déplacée, 30 - q = (ixd, iyd, ixs, iys) lorsque les détecteurs et la ligne Laser sont déplacés.20 30 q peut être qualifié de super indice. On aura alors X q,i2, AgpSp i2,

A et S sont des tableaux multidimensionnels dont tous les éléments sont positifs. De même que précédemment décrit, A et S sont initialisés puis déterminés selon un algorithme de factorisation en matrices non négatives. Le terme matrice non négative peut être remplacé par tableau car A peut avoir une dimension supérieure à 2. S est dite matrice des spectres et sp,i1, (> 0) représente la iÀème valeur du spectre de la pème source de fluorescence. Elle est de taille P * NÀ, le nombre de lignes P représentant le nombre de sources de fluorescence (incluant l'autofluorescence), le nombre de colonnes NÀ représentant le nombre de données du spectre de chaque source. Autrement dit, chaque ligne de S correspond au spectre d'émission d'une source fluorescente, ce spectre étant discrétisé selon NÀ canaux. L'algorithme débute par une initialisation du tableau A et de la matrice S aux dimensions voulues, et en respectant les contraintes de positivité. Le tableau A est initialisé de façon aléatoire, tandis que les lignes de S sont initialisées par des spectres de référence, représentant les sources recherchées. Ces spectres sont déterminés de façon empirique ou selon des valeurs tabulées. 31 L'algorithme découle d'une minimisation d'une fonction de coût ou d'objectif QFMN Dans le cas où cette fonction est la distance euclidienne entre X et le produit tensoriel A * S, et en se plaçant dans la configuration dans laquelle la ligne Laser est fixe et les détecteurs sont déplacés selon Xd et Yd, les lois de mise à jour s'écrivent : Avantageusement, on peut considérer des contraintes spatiales supplémentaires, comme par exemple le lissage des coefficients de la matrice A. La 15 fonction à minimiser devient alors : Q2MN _ Q' +a2C2 = QFMN +î2(V xAixd,iyd,p 2 + V yAixd,iyd,p 2) FMN représentant alors la fonction d'objectif ou de coût précédemment décrite, pouvant par 20 exemple être la distance euclidienne entre X et le produit tensoriel A * S. î2 est un réel positif. De la même façon, on peut mettre en oeuvre un algorithme permettant un lissage de chaque spectre de S. La fonction à minimiser est alors : = (À, 1:ir `V Hd ( ir{=-1 .t rti Ë $ :. c i rd,S'LfY Q3 MN = QFMN +î3C'3 = QFMN +a3 V Â, p,i% 2 î3 est un réel positif. On peut également imposer à s une contrainte sur la distance de chaque spectre au spectre initial correspondant. La fonction à minimiser est alors : z Q4MN =QFMN+a4C4 =QFMN+a4 Sp%-Sp î4 est un réel positif On peut également minimiser une fonction 15 5L`N combinant les différentes contraintes explicitées ci-dessus. On obtient alors : Q5 FMN FMN +aiCi , Où ai est un réel positif, avec 2 <- i <- 4. 20 Selon un aspect de l'invention on introduit au moins un marqueur dans un milieu diffusant, de telle sorte que le milieu diffusant contienne p sources de fluorescence, l'autofluorescence du milieu pouvant être 25 considérée comme une source de fluorescence. On cherche à localiser ce ou ce(s) marqueur(s) fluorescent(s) dans ce milieu diffusant. Dans un tel procédé on réalise donc au moins une acquisition de fluorescence en excitant le 30 milieu par une source lumineuse laser S de coordonnées 10 33 (ixs, iys), le faisceau de cette source laser pouvant par exemple être focalisé sous la forme d'une ligne. On détecte la fluorescence par un détecteur D, pouvant comporter une pluralité de détecteurs (ixd, iyd) ayant une capacité de dispersion spectrale, ces détecteurs pouvant être par exemple alignés le long d'un axe Xd et ainsi former une ligne de NXd détecteurs élémentaires. On déplace la source et/ou la pluralité de détecteurs, par exemple en translation, les coordonnées de la source et de chaque détecteur étant respectivement notés (ixd, iyd) dans un repère (Xd, Yd) et (ixs, iys) dans un repère (Xs, Ys). Une configuration de mesure, ou acquisition, est déterminée par une position de la pluralité de détecteurs et une position de la source. A chaque configuration de mesure, le signal de fluorescence produit à l'intérieur du milieu diffusant est mesuré par chaque détecteur (xd, yd) placé en (ixd, iyd). Un tel signal est alors séparé selon NX longueur d'ondes, chaque détecteur (xd, yd) mesurant l'intensité à chaque longueur d'onde U. A chaque configuration de mesure, ou acquisition, l'intensité du signal mesuré à chaque longueur d'onde iX est indiquée dans un tableau Xixs,iys,ixd,iyd,ix. Le tableau X obtenu suite à des mesures dans chaque configuration, correspondant alors à une série d'acquisition, est ensuite traité par factorisation en produit de deux matrices non négatives A et S, telles que : 34 Xixs,iys,ixd,iyd,A, `4ixs,iys,ixd,iy,p

On peut donc déterminer une image de la répartition des intensités des différentes sources de fluorescence (marqueurs ou autofluorescence). Comme déjà expliqué ci-dessus, on peut éteindre une des sources et effectuer le calcul A.S qui donne la répartition des autres sources. Bien que, dans les exemples donnés dans la description la fonction objectif soit basée sur le calcul de la distance euclidienne entre le tableau de données X et le produit tensoriel A * S, d'autres types de fonctions objectifs peuvent être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention, en particulier une fonction objectif basée sur le calcul de la divergence, notamment la divergence de Kullback Leibler. Lee et Seung ont déterminé pour cette fonction des lois de mise à jour, qui assurent la décroissance de la fonction objectif dans le cas d'une matrice X en deux dimensions.

On obtient alors et25

Claims

REVENDICATIONS1. Procédé de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant, dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur dans ce milieu, b) on réalise au moins une acquisition (X) de fluorescence par une excitation du milieu, chaque acquisition comportant d'une part une ou plusieurs composantes de fluorescence due à un ou plusieurs marqueurs, d'autre part une composante d'autofluorescence due à une partie du milieu autre que les marqueurs, les données mesurées lors de la ou des acquisitions étant stockées dans un tableau multidimensionnel X, c) on traite les données dudit tableau X par factorisation de ce tableau en un produit de, seulement, deux tableaux multidimensionnels non négatifs A et S, d) on détermine une représentation graphique de la répartition des intensités d'une ou plusieurs composantes de fluorescence, à partir des données contenues dans les tableaux A et S.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel, lors de l'étape c), on détermine A et S par minimisation d'une fonction de coût.
3. Procédé selon la revendication 2 dans lequel, la fonction de cout est la distance OXùAS entre l'image X et le produit A.S.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel, lors de l'étape c), au moins une ligne du tableau S est initialisée par un spectre de référence de la source de fluorescence correspondante.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape c) est réalisée par k itérations, des tableaux Ai+1 et Si+l, obtenus lors de l'itération d'ordre 1+1 étant déterminées à partir des tableaux Al et SI obtenus lors de l'itération d'ordre 1. 15
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le nombre d'itération est déterminé en fonction des fluctuations des tableaux A et S, ou de façon automatique, en fonction de fluctuations de la fonction 20 de coût au cours de 2 ou plusieurs itérations successives.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel, lors de l'étape d), on détermine la 25 position d'une des sources en éliminant les contributions des autres sources dans le tableau S puis en effectuant le produit de A avec le tableau S ainsi modifié. 10 37
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le rayonnement d'excitation a un spectre dans l'infra rouge.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la fluorescence est détectée à des longueurs d'onde supérieures à 600 nm.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel l'image est réalisée à l'aide d'un détecteur comportant au moins une ligne de détecteurs élémentaires, et on déplace cette ligne de détecteurs, une acquisition (X) de fluorescence étant réalisée pour chaque position de la ligne de détecteurs.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel l'excitation est réalisée dans une zone, dite zone d'excitation, la lumière d'excitation diffusant ensuite dans une zone du milieu différente de la zone d'excitation.
12. Procédé selon la revendication 11, ladite zone d'excitation étant une ligne d'excitation.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel on déplace la ligne d'excitation, une acquisition de fluorescence étant réalisée pour chaque position de la ligne d'excitation. 38
14. Dispositif de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant, comportant : a) des moyens (2, 4) pour produire un faisceau d'excitation de la fluorescence, b) des moyens (6, 8) pour réaliser au moins une acquisition de fluorescence de points dudit milieu, cette acquisition comportant les composantes de fluorescence dues aux différentes sources présentes dans le milieu, y compris l'autofluorescence, c) des moyens (24, 27, 28) pour traiter les données d'acquisition par factorisation en deux tableaux non négatifs A et S, d) des moyens (24, 27, 28) pour déterminer 15 une représentation graphique de la répartition des intensités des différentes sources de fluorescence.
15. Dispositif selon la revendication 14, comportant en outre des moyens pour modifier la 20 position de la ligne d'excitation.
16. Dispositif selon la revendication 14 ou 15, au moins une partie des moyens pour réaliser une acquisition de fluorescence de points dudit milieu 25 peuvent être disposés selon une ligne, dite ligne de détection, le dispositif comportant en outre des moyens pour modifier la position de ladite ligne de détection. 30