FR2941239A1 - Determining susceptibility for contracting nosocomial infection in patient comprises collecting biological sample, extracting biological material, taking specific reagent from expression product of target gene S100A9 and determining - Google Patents

Determining susceptibility for contracting nosocomial infection in patient comprises collecting biological sample, extracting biological material, taking specific reagent from expression product of target gene S100A9 and determining Download PDF

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Abstract

Determining susceptibility for contracting nosocomial infection in a patient having a systemic inflammatory response (non)associated with an infection, comprises collecting a biological sample from the patient and extracting biological material from biological sample; taking at least one specific reagent from an expression product of the target gene S100A9; and determining the expression of the target gene S100A9. Independent claims are included for: (1) establishing an early prognosis of survival in a patient having a systemic inflammatory response (non)associated with infection, or for determining the etiology of a systemic inflammatory response (non)associated with infection in patient, comprising (a) collecting biological sample from the patient and extracting from biological material from the biological sample, (b) collecting at least one reagent specific for an expression product of the target gene S100A9 and (c) determining the expression of the S100A9 target gene; (2) a first kit for determining susceptibility in contracting nosocomial infection in a patient having a systemic inflammatory response (non)associated with an infection comprising one reagent specific for S100A9 gene expression product; (3) use of at least one reagent for determining, in vitro, the susceptibility for contracting a nosocomial infection in a patient having systemic inflammatory response (non)associated with an infection; (4) a second kit for establishing an early prognosis for survival in a patient having a systemic inflammatory response (non)associated with an infection comprising at least one reagent specific for an expression product of S100A9 gene; and (5) use of at least one reagent for establishing, in vitro, a prognosis for survival in a patient having a systemic inflammatory response (non)associated with an infection.

Description

La présente invention concerne un procédé et un kit pour déterminer la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection. L'invention a aussi pour objet un procédé et un kit pour l'établissement d'un pronostic précoce de survie chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection et un procédé pour la détermination de l'étiologie d'une réponse systémique inflammatoire. The present invention relates to a method and a kit for determining the susceptibility to acquiring a nosocomial infection in a patient having an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection. The subject of the invention is also a method and a kit for establishing an early survival prognosis in a patient presenting an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection, and a method for determining the etiology of an infection. inflammatory systemic response.

Les infections nosocomiales constituent un réel problème de santé publique. En France, on estime entre 500 000 et 800 000 le nombre de patients qui contractent chaque année une infection nosocomiale. L'apparition des infections nosocomiales est liée à différents facteurs, tels que les techniques médicales utilisées, mais aussi à la susceptibilité du patient à contracter une telle infection nosocomiale. Ainsi, les patients ayant un système immunitaire déficient, les personnes dénutries, les nouveaux-nés, les personnes âgées, les personnes en syndrome septique, les grands brûlés, les personnes en état traumatique peuvent être plus prédisposées que d'autres à contracter une infection nosocomiale. Le syndrome septique, réponse systémique à l'infection, représente l'une des premières causes de mortalité dans les services de réanimation. Il peut résulter d'une infection bactérienne, virale, mycosique ou parasitaire. Parmi ce syndrome septique, on distingue par ordre croissant de gravité le SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome), le sepsis, le sepsis sévère et le choc septique. Un groupe d'experts a ainsi proposé en 2001 des critères de définitions de ces quatre syndromes cliniques (M.M. Levy, M.P. Fink, J.C. Marshall, E. Abraham, D. Angus, D. Cook, J. Cohen, S.M. Opal, J.L. Vincent and G. Ramsay, 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference, Crit. Care Med. 31 (2003), pp. 1250-1256) . • le SIRS, est une réponse systémique inflammatoire déclenchée par une variété de causes infectieuses ou non. Parmi les états de SIRS déclenchés par des causes non infectieuses, on peut citer les états traumatiques, les brûlures, les pancréatites, les syndromes respiratoires aiguës. Une réponse systémique inflammatoire se manifestant par au moins deux des signes suivants a) température supérieure à 38°C ou inférieure à 36°C ; b) rythme cardiaque supérieur à 90 battements par minute ; c) rythme respiratoire supérieur à 20 respirations par minute ; d) nombre de leucocytes supérieur à 12000/mm3 ou inférieur à 4000/mm3, • le sepsis est un syndrome de réponse systémique inflammatoire en relation avec une infection, • un sepsis sévère est un sepsis associé à une hypotension artérielle et/ou hypoperfusion et/ou dysfonctionnement d'au moins un organe, • le choc septique est un sepsis sévère associé à une hypotension persistante et peut être qualifié par : • la présence d'un site infectieux identifié, • une hypotension persistante malgré des remplissages adéquats et des traitements vasopresseurs. Nosocomial infections are a real public health problem. In France, between 500,000 and 800,000 patients are estimated to have nosocomial infections each year. The occurrence of nosocomial infections is related to various factors, such as the medical techniques used, but also to the susceptibility of the patient to contracting such a nosocomial infection. Thus, patients with a deficient immune system, malnourished people, newborns, the elderly, people with septic syndrome, burn victims, people in a traumatic state may be more susceptible than others to contracting an infection. nosocomial. Septic syndrome, a systemic response to infection, is one of the leading causes of death in intensive care units. It can result from a bacterial, viral, mycotic or parasitic infection. Among this septic syndrome, SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome), sepsis, severe sepsis and septic shock can be distinguished in ascending order of severity. In 2001, a group of experts proposed defining criteria for these four clinical syndromes (MM Levy, MP Fink, JC Marshall, E. Abraham, D. Angus, Cook D., Cohen J., SM Opal, JL Vincent and G. Ramsay, 2001 SCCM / ESICM / ACCP / ATS / SIS International Sepsis Definitions Conference, Crit Care Med 31 (2003), pp. 1250-1256). • SIRS, is an inflammatory systemic response triggered by a variety of infectious or non-infectious causes. SIRS conditions triggered by non-infectious causes include traumatic conditions, burns, pancreatitis, acute respiratory syndromes. An inflammatory systemic response manifested by at least two of the following signs: a) temperature greater than 38 ° C or less than 36 ° C; b) heart rate greater than 90 beats per minute; c) respiratory rate greater than 20 breaths per minute; d) number of leukocytes greater than 12000 / mm3 or less than 4000 / mm3, • sepsis is an inflammatory systemic response syndrome related to infection, • severe sepsis is sepsis associated with hypotension and / or hypoperfusion and / or dysfunction of at least one organ, • septic shock is a severe sepsis associated with persistent hypotension and may be qualified by: • the presence of an identified infectious site, • persistent hypotension despite adequate fills and treatments vasopressors.

D'une manière générale, les signes d'un sepsis, d'un sepsis sévère et d'un choc septique sont proches, et la différence entre ces trois situations réside principalement dans l'importance de la perturbation de toutes les fonctions vitales. Lors d'un choc septique, on observe principalement une chute de pression artérielle, tachycardie, polypnée, marbrures cutanées, hypo- ou hyperthermie, frissons. Ces signes s'accompagnent également d'un dysfonctionnement d'organes "cibles" avec une altération de fonction d'organes à distance du foyer infectieux (reins, poumons, système nerveux central, appareil digestif et les systèmes de la coagulation du sang le plus souvent atteints) se traduisant par une oligurie (<0,5 ml/kg/h), insuffisance rénale, hypoxémie, thrombopénie, agitation, confusion. Les patients en syndrome septique sont également plus ou moins sensibles aux infections nosocomiales, c'est à dire les infections en relation avec un séjour dans un établissement de santé. Cette sensibilité a un impact considérable sur la survie et le bon rétablissement de ces patients. L'évolution d'un syndrome septique depuis le stade de sepsis vers un stade de sepsis sévère, puis de choc septique n'est pas systématique puisque environ 64% des patients septiques développent un sepsis sévère, et 23% des patients en sepsis sévère évoluent en choc septique. Avant cette étape ultime de choc septique, des traitements doivent être prescrits au patient afin d'interrompre et d'inverser le processus physiopathologique. Il faut ainsi restaurer un état hémodynamique satisfaisant et assurer une ventilation efficace. Il faut également mener de front le traitement symptomatique du choc et un traitement antibiotique adapté dès que possible en fonction des données bactériologiques. In general, the signs of sepsis, severe sepsis and septic shock are close, and the difference between these three situations lies mainly in the importance of the disruption of all vital functions. During a septic shock, we mainly observe a drop in blood pressure, tachycardia, polypnea, skin marbling, hypo- or hyperthermia, chills. These signs are also accompanied by a dysfunction of "target" organs with impaired function of organs away from the infectious focus (kidneys, lungs, central nervous system, digestive tract and most blood coagulation systems). often affected) resulting in oliguria (<0.5 ml / kg / h), renal failure, hypoxemia, thrombocytopenia, agitation, confusion. Patients with septic syndrome are also more or less susceptible to nosocomial infections, ie infections related to a stay in a health facility. This sensitivity has a significant impact on the survival and recovery of these patients. The evolution of a septic syndrome from the stage of sepsis to a stage of severe sepsis and septic shock is not systematic since about 64% of septic patients develop severe sepsis, and 23% of patients with severe sepsis develop in septic shock. Before this final stage of septic shock, treatments must be prescribed to the patient in order to interrupt and reverse the physiopathological process. It is thus necessary to restore a satisfactory hemodynamic state and to ensure an effective ventilation. The symptomatic treatment of shock and appropriate antibiotic treatment should also be tackled as soon as possible based on bacteriological data.

Il apparaît que si certains patients développant un syndrome septique, et notamment un choc septique, peuvent être réanimés par une prise en charge standard, telle qu'un traitement antibiotique de large spectre mis en place avant les résultats des analyses bactériologiques indiquant la source infectieuse, d'autres patients, développant un syndrome septique beaucoup plus grave, nécessitent une mise en place de thérapeutiques lourdes, comme la protéine C activée. Au delà du coût très élevé, ce genre de thérapeutique expose les patients à des risques d'effets indésirables très importants (troubles de la coagulation...). Il est donc très important de cibler de manière efficace les patients susceptibles de bénéficier d'un tel traitement. De ce fait, la connaissance de l'étiologie de la réponse systémique inflammatoire et la détermination de la susceptibilité du patient présentant une réponse systémique inflammatoire à contracter une infection nosocomiale sont essentiels pour proposer un traitement adapté au patient. Une autre donnée importante pour le patient est de pouvoir établir un pronostic le plus précoce possible de sa survie. It appears that if certain patients developing a septic syndrome, including septic shock, can be resuscitated by standard management, such as a broad-spectrum antibiotic treatment set up before the results of bacteriological tests indicating the infectious source, other patients, developing a much more serious septic syndrome, require the implementation of heavy therapies, such as activated protein C. Beyond the very high cost, this kind of therapy exposes patients to the risk of very significant adverse effects (coagulation disorders ...). It is therefore very important to effectively target patients who may benefit from such treatment. Therefore, knowledge of the etiology of the inflammatory systemic response and determination of the susceptibility of the patient with an inflammatory systemic response to acquiring a nosocomial infection are essential to provide appropriate treatment to the patient. Another important data for the patient is to be able to establish the earliest possible prognosis of his survival.

A ce jour, il n'existe pas de test qui permette de déterminer la susceptibilité d'un patient présentant une réponse systémique inflammatoire à développer une infection nosocomiale. To date, there is no test that makes it possible to determine the susceptibility of a patient with an inflammatory systemic response to developing a nosocomial infection.

Les inventeurs ont mis en évidence, de manière inattendue, que l'analyse de l'expression du gène S100A9 est particulièrement adaptée pour la détermination d'une telle susceptibilité et que de plus elle est appropriée pour déterminer l'étiologie de la réponse systémique inflammatoire et pour l'établissement d'un diagnostic précoce de survie. The inventors have unexpectedly demonstrated that the analysis of the expression of the S100A9 gene is particularly suitable for the determination of such susceptibility and that, moreover, it is appropriate for determining the etiology of the inflammatory systemic response. and for establishing an early diagnosis of survival.

Avant d'aller plus avant, les définitions suivantes sont données afin de mieux comprendre l'invention. On entend par syndrome septique, une réponse systémique à l'infection. Ce syndrome septique peut être à un stade de SIRS, sepsis, sepsis sévère ou de choc septique. Préférentiellement, le syndrome septique est un choc septique. On entend par infection nosocomiale, toute infection contractée dans un établissement de santé 48 heures après l'admission et qui n'était pas présente à l'admission du patient dans cet établissement. On entend par gène cible le gène S100A9, en particulier le gène S100A9 référencé dans GenBank sous le numéro d'accession NM 002965.3. Before going further, the following definitions are given to better understand the invention. Septic syndrome is a systemic response to infection. This septic syndrome may be at a stage of SIRS, sepsis, severe sepsis or septic shock. Preferably, the septic syndrome is septic shock. Nosocomial infection means any infection contracted in a health facility 48 hours after admission and which was not present at the admission of the patient to that institution. The term "target gene" refers to the S100A9 gene, in particular the S100A9 gene referenced in GenBank under the accession number NM 002965.3.

On entend par produit d'expression du gène S100A9, l'ARN messager ou un fragment d'ARNm, l'ADNc ou un fragment d'ADNc, une protéine ou un fragment de protéine. On entend par échantillon biologique, tout matériel issu du patient, susceptible de contenir un matériel biologique permettant de détecter l'expression d'un gène, et peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive ou de tissu ou de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier, tel que notamment une prise de sang. On entend par matériel biologique tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène, comme notamment un acide nucléique ou une protéine, ou sa séquence codante. L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique) tel qu'un ARNm (ARN messager). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est un acide nucléique, et encore plus préférentiellement un ARNm. L'extraction du matériel biologique de l'échantillon biologique peut être réalisée par tous les protocoles d'extraction d'acides nucléiques ou de protéines bien connus de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut notamment être réalisée par : • une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des microorganismes (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la Demanderesse : o WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et o WO-A-99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US-A-5,234,809). • une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par la Demanderesse sous les références suivantes : WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSil'M Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-BindTM). Une telle étape d'extraction peut être faite en automates. L'automate easyMAG est particulièrement adapté. By expression product of the S100A9 gene is meant messenger RNA or an mRNA fragment, cDNA or cDNA fragment, protein or protein fragment. Biological sample means any material derived from the patient, which may contain biological material for detecting the expression of a gene, and may especially be a sample of blood, serum, saliva or tissue or circulating cells. of the patient. This biological sample is available by any type of sample known to those skilled in the art, such as in particular a blood test. By biological material is meant any material for detecting the expression of a gene, such as in particular a nucleic acid or a protein, or its coding sequence. The nucleic acid may in particular be an RNA (ribonucleic acid) such as an mRNA (messenger RNA). According to a preferred embodiment of the invention, the biological material is a nucleic acid, and even more preferably an mRNA. The extraction of the biological material from the biological sample can be carried out by all the nucleic acid or protein extraction protocols well known to those skilled in the art. As an indication, the extraction of nucleic acids can in particular be carried out by: a step of lysis of the cells present in the biological sample, in order to release the nucleic acids contained in the protein and / or lipid envelopes of the microorganisms (as cellular debris that disrupts subsequent reactions). By way of example, it is possible to use the lysis methods as described in the Applicants' patent applications: o WO-A-00/05338 on magnetic and mechanical mixed lysis, o WO-A-99/53304 on electrical lysis, and WO-A-99/15321 on mechanical lysis. Those skilled in the art may use other well-known lysis methods, such as thermal or osmotic shocks or chemical lyses by chaotropic agents such as guanidium salts (US-A-5,234,809). A purification step, allowing separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step. This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids. For example, magnetic particles optionally coated with oligonucleotides, by adsorption or covalence (see US Pat. are fixed on these magnetic particles, by a washing step. This nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids. A particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in the patent applications filed by the Applicant under the following references: WO-A-97/45202 and WO-A-99/35500. Another interesting example of a method for purifying nucleic acids is the use of silica either in the form of a column or in the form of inert particles (Boom R. et al., J. Clin Microbiol., 1990, No. 28 ( 3), pp. 495-503) or magnetic (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSil'M Paramagnetic particles). Other widely used methods rely on columnar or paramagnetic particulate ion exchange resins (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, pp. 337-344). Another method that is very relevant but not exclusive to the invention is that of adsorption on a metal oxide support (Xtrana company: Xtra-BindTM matrix). Such an extraction step can be done in automata. The easyMAG is particularly suitable.

On entend par réactif spécifique un réactif qui réagit avec le matériel biologique afin de mettre en évidence, d'une manière directe ou indirecte l'expression d'un gène cible, qui peut être déterminé par l'analyse des ARNm issus de ce gène, ou par l'analyse de la protéine codée par ce gène. 7 A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse de la protéine codée par ce gène, ce réactif spécifique comprend au moins un anticorps spécifique de la protéine codée par ce gène cible. By specific reagent is meant a reagent that reacts with the biological material in order to directly or indirectly highlight the expression of a target gene, which can be determined by the analysis of the mRNAs derived from this gene, or by the analysis of the protein encoded by this gene. As an indication, when it is desired to determine the expression of a target gene by the analysis of the protein encoded by this gene, this specific reagent comprises at least one antibody specific for the protein encoded by this target gene.

A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse des ARNm transcrits à partir de ce gène, ce réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification spécifique de l'ADN complémentaire de cet ARNm (on parle alors d'amorce d'amplification spécifique d'un gène cible). L'ADN complémentaire d'un ARNm peut être obtenu selon un protocole bien connu de l'homme du métier. A titre indicatif, on extrait les ARN totaux (comprenant les ARN ribosomaux, les ARN de transfert, les ARNm) de l'échantillon biologique. On réalise ensuite une réaction de transcription inverse à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment complémentaire d'ADN (ADNc). La réalisation d'une telle étape est bien connue de l'homme du métier. Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADN complémentaires des ARN messagers, on réalise cette étape enzymatique en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des différents ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription inverse réalisée par l'enzyme transcriptase inverse. On obtient alors différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique. Dans la suite de l'exposé, on désigne par ADNc, un ADN complémentaire d'un ARN messager. As an indication, when it is desired to determine the expression of a target gene by the analysis of mRNAs transcribed from this gene, this specific reagent comprises at least one amplification primer specific for the complementary DNA of this gene. MRNA (this is called a specific amplification primer of a target gene). The DNA complementary to an mRNA can be obtained according to a protocol well known to those skilled in the art. As an indication, the total RNAs (including the ribosomal RNAs, the transfer RNAs, the mRNAs) are extracted from the biological sample. A reverse transcription reaction is then carried out using a reverse transcriptase enzyme which makes it possible to obtain, from an RNA fragment, a complementary DNA fragment (cDNA). The realization of such a step is well known to those skilled in the art. When it is more particularly desired to obtain the complementary DNAs of the messenger RNAs, this enzymatic step is carried out in the presence of nucleotide fragments comprising only thymine bases (polyT), which hybridize by complementarity on the polyA sequence of the different mRNAs in order to forming a polyT-polyA complex which then serves as a starting point for the reverse transcription reaction carried out by the enzyme reverse transcriptase. We then obtain different DNA complementary to the different messenger RNAs initially present in the biological sample. In the rest of the description, cDNA refers to a DNA complementary to a messenger RNA.

Par amorce d'amplification, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction 8 d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible à l'aide d'amorces d'amplification spécifiques par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), RCR (Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A- 90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), et TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491. On parle alors d'amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique. By "amplification primer" is meant a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleotide units, preferably from 15 to 25 nucleotide units and having hybridization specificity under determined conditions for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an enzymatic amplification reaction. By enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies of a target nucleotide fragment using specific amplification primers by the action of at least one enzyme. Such amplification reactions are well known to those skilled in the art and may be mentioned in particular the following PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), RCR (Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Sequence Replication) ) with patent application WO-A-90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), and TMA (Transcription Mediated Amplification) with US-A-5,399,491. We then speak of amplicons to designate the polynucleotides generated by an enzymatic amplification technique.

Préférentiellement, lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification spécifiques afin d'amplifier une région particulière de l'ADN complémentaire de l'ARNm issu du gène cible. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription inverse, on parle de RT-PCR. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 6 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique cible. Dans la présente invention, le fragment nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager. Preferably, when the enzymatic amplification is a PCR, the specific reagent comprises at least 2 specific amplification primers in order to amplify a particular region of the DNA complementary to the mRNA derived from the target gene. When the enzymatic amplification is a PCR carried out after a reverse transcription reaction, it is called RT-PCR. By hybridization probe is meant a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleotide units, in particular from 6 to 35 nucleotide units, having hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide fragment. In the present invention, the target nucleotide fragment can be a nucleotide sequence included in a messenger RNA or a nucleotide sequence included in a complementary DNA obtained by reverse transcription of said messenger RNA.

Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 1251 Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA. Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de capture. Dans ce cas, le fragment nucléotidique cible peut être préalablement marqué au moyen d'un marqueur. La sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de détection et le fragment nucléotidique cible marqué. La sonde d'hybridation peut également être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde d'hybridation peut être marquée au moyen d'un marqueur. On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de capture et le fragment nucléotidique cible. Que l'on utilise une sonde dite de capture ou une sonde dite de détection, la réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO- A-94/12670, d'une particule ou d'une biopuce. Dans la présente invention, la détermination de l'expression du gène S100A9 peut être analysée par l'expression des ARNm qui sont transcrits à un temps donné. Dans ce cas, le matériel biologique est un acide nucléique, et le réactif spécifique peut être indifféremment une amorce d'amplification ou une sonde d'hybridation telles que définies précédemment. On peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique, on réalise une étape de transcription inverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc) 2) on amplifie spécifiquement les ADNc . Dans ce cas, le réactif spécifique utilisé comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible, telle que définie précédemment. Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification appropriée. 3) on détermine l'expression du gène cible en quantifiant les ADNc. Les ADNc peuvent être quantifiés notamment par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription inverse, PCR...), on peut normaliser l'expression du gène cible des différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401. On peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique, on réalise une étape de transcription inverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc) 2) on immobilise les ADNc sur une membrane 3) on détermine l'expression du gène cible en hybridant les ADNc à des sondes d'hybridation spécifiques du gène cible préalablement marquées. De telles techniques d'hybridation sont bien connues de l'homme du métier, et on peut citer notamment la technique du Northern blot. Cette réaction d'hybridation peut être réalisée après une étape d'amplification spécifique des ADN complémentaires des ARN messagers d'un gène cible lorsque notamment le gène est faiblement exprimé. L'expression d'un gène cible peut être également analysée par l'expression des protéines codées par le gène cible. Dans ce cas, le matériel biologique est une protéine et plusieurs techniques de détection avec ou sans ligand peuvent être utilisées. La spectrométrie de masse peut être utilisée comme technique de détection sans ligand. Le réactif spécifique peut être un anticorps spécifique de la protéine codée par le gène cible pour un système de détection avec ligand. Les anticorps recombinants, spécifiques de la protéine traduite du gène cible peuvent être obtenus selon des procédés classiques connus de l'homme du métier, à partir d'organismes procaryotes, tels que bactéries, ou à partir d'organismes eucaryotes, tels que levures, cellules de mammifères, de plantes, d'insectes ou d'animaux, ou par des systèmes de production extra-cellulaire. Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés selon les techniques classiques connues de l'homme du métier telles que la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec un antigène cible d'intérêt, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité. Des fragments d'anticorps peuvent par exemple être obtenus par protéolyse. Ainsi, ils peuvent être enzymatique, résultant en des fragments à la papaïne ; Porter RR, 1959, Biochem. type F(ab)'2 (traitement à la pepsine 1960, Science, 132 1770-1771). Ils préparés par voie recombinante (Skerra Immunol., 5 256-262). Un autre fragment d'anticorps qui convient aux fins de l'invention comprend un fragment Fv qui est un dimère constitué de l'association non covalente du domaine variable léger (VL) et du domaine variable lourd (VH) du fragment Fab, donc de l'association de deux chaînes polypeptidiques. Afin d'améliorer la stabilité du fragment Fv due à la dissociation des deux chaînes polypeptidiques, ce fragment Fv peut être modifié par génie génétique en insérant un lien peptidique adapté entre le domaine VL et le domaine VH (Huston P. et al., 1988, Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 85 : 5879-5883). On parle alors de fragment scFv ( single chain Fragment variable ) car il est constitué d'une seule chaîne polypeptidique. L'utilisation d'un lien peptidique composé préférentiellement de 15 à 25 acides aminés permet de relier l'extrémité C-terminale d'un domaine à l'extrémité N-terminale de l'autre domaine, constituant ainsi une molécule monomérique dotée de propriétés de liaison similaires à celles de l'anticorps sous sa forme complète. Les deux orientations des domaines VL et VH conviennent (VL-lien-VH et VH-lien-VL) car elles présentent des propriétés fonctionnelles identiques. Bien entendu, tout fragment connu de l'homme du métier et présentant les caractéristiques immunologiques définies ci-dessus convient obtenus par digestion de type Fab (traitement J., 73 : 119-126) ou de ; Nisonoff A. et al., peuvent également être A., 1993, Curr. Opin. aux fins de l'invention. Lorsque le matériel biologique est une protéine issue de l'expression d'un gène, on peut déterminer l'expression de ce dernier, en détectant et ou quantifiant la dite protéine par Western Blot ou ELISA, ou toute autre méthode connue de l'homme du métier, telle qu'une méthode de chimiluminescence à partir du matériel biologique. La technique ELISA ( Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ) est un dosage immunoenzymatique sur support solide. Ce test entre dans le cadre plus général des EIA ( Enzyme Immunoassays ) dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme. La technique utilise un ou deux anticorps. L'anticorps de détection de la formation de complexes immuns (antigène / anticorps) est couplé à l'enzyme et peut générer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorogène. La technique Western Blot est un test pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon à l'aide d'un anticorps spécifique de cette protéine comprenant les étapes suivantes telle que décrites ci après. Hybridization is understood to mean the process in which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, such as, for example, a hybridization probe and a target nucleotide fragment, having sufficiently complementary sequences are capable of forming a double-strand with bonds. stable and specific hydrogens. A nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment capable of hybridizing with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in a known manner. The hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor of the operating conditions. Hybridization is all the more specific as it is carried out with higher stringency. The stringency is defined in particular according to the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids. The stringency may also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature. The stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be performed will depend primarily on the hybridization probes used. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art. In general, depending on the length of the hybridization probes used, the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 70 ° C, in particular between 35 and 65 ° C in a saline solution at a concentration of about 0. , 5 to 1 M. A step of detecting the hybridization reaction is then carried out. By detection is meant either a direct detection by a physical method or a detection method using a marker. Many detection methods exist for the detection of nucleic acids. [See, for example, Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, No. 45 (4), p.453-458 or Keller GH et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 and 6, p.173-249]. By marker is meant a tracer capable of generating a signal. A nonlimiting list of these tracers includes the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, betagalactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, contact angle variation or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunneling effect, etc. ; Thus, the polynucleotide may be labeled during the enzymatic amplification step, for example using a labeled nucleotide triphosphate for the amplification reaction. The labeled nucleotide will be a deoxyribonucleotide in amplification systems generating DNA, such as PCR, or a ribonucleotide in amplification techniques generating RNA, such as TMA or NASBA techniques. The polynucleotide may also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a labeled probe according to the sandwich hybridization technique described in WO-A-91/19812. For the purposes of the present invention, the hybridization probe may be a so-called capture probe. In this case, the target nucleotide fragment may be previously labeled with a marker. The so-called capture probe is immobilized or immobilizable on a solid support by any appropriate means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or adsorption. A hybridization reaction is then carried out between said detection probe and the labeled target nucleotide fragment. The hybridization probe may also be a so-called detection probe. In this case, the hybridization probe can be labeled with a marker. A hybridization reaction is then carried out between said capture probe and the target nucleotide fragment. Whether using a so-called capture probe or a so-called detection probe, the hybridization reaction can be carried out on a solid support that includes all the materials on which a nucleic acid can be immobilized. Synthetic materials or natural materials, optionally chemically modified, can be used as a solid support, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and cellulose. nitrocellulose or dextran, polymers, copolymers, especially based on styrene-type monomers, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels etc. The solid support may be in the form of a microtiter plate, a membrane as described in WO-A-94/12670, a particle or a biochip. In the present invention, the determination of S100A9 gene expression can be analyzed by the expression of mRNAs that are transcribed at a given time. In this case, the biological material is a nucleic acid, and the specific reagent can be indifferently an amplification primer or a hybridization probe as defined above. The expression of a target gene can be determined in the following manner: 1) after extracting the total RNAs from a biological sample, a reverse transcription step is performed as described above in order to obtain the different complementary DNAs of the different messenger RNA initially present in the biological sample (or cDNA) 2) the cDNAs are specifically amplified. In this case, the specific reagent used comprises at least one amplification primer specific for the target gene, as defined above. This step can be carried out in particular by a PCR type amplification reaction or by any other appropriate amplification technique. 3) the expression of the target gene is determined by quantifying the cDNAs. The cDNAs can be quantified in particular by the use of a quantization range obtained by an amplification reaction conducted until saturation. In order to take into account the variability of enzymatic efficiency that can be observed during the various steps (reverse transcription, PCR, etc.), the expression of the target gene of the different groups of patients can be standardized by simultaneously determining the expression of a so-called household gene, the expression of which is similar in the different groups of patients. By realizing a relationship between the expression of the target gene and the expression of the household gene, this corrects any variability between the different experiments. Those skilled in the art may refer in particular to the following publications: Bustin SA Journal of Molecular Endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giulietti A Methods, 2001, 25: 386-401. The expression of a target gene can also be determined as follows: 1) after extracting the total RNAs from a biological sample, a reverse transcription step, as described above, is carried out in order to obtain the different DNAs complementary to the different messenger RNAs initially present in the biological sample (or cDNA) 2) the cDNAs are immobilized on a membrane 3) the expression of the target gene is determined by hybridizing the cDNAs to hybridization probes specific for the target gene previously marked. Such hybridization techniques are well known to those skilled in the art, and mention may in particular be made of the Northern blot technique. This hybridization reaction can be carried out after a step of specific amplification of the complementary DNAs of the messenger RNAs of a target gene when, in particular, the gene is weakly expressed. The expression of a target gene can also be analyzed by the expression of the proteins encoded by the target gene. In this case, the biological material is a protein and several detection techniques with or without ligand can be used. Mass spectrometry can be used as a ligand-free detection technique. The specific reagent may be an antibody specific for the protein encoded by the target gene for a ligand detection system. The recombinant antibodies specific for the translated protein of the target gene can be obtained according to conventional methods known to those skilled in the art, from prokaryotic organisms, such as bacteria, or from eukaryotic organisms, such as yeasts, cells of mammals, plants, insects or animals, or by extracellular production systems. The monoclonal antibodies can be prepared according to conventional techniques known to those skilled in the art, such as the hybridoma technique, the general principle of which is recalled below. Firstly, an animal, usually a mouse (or cells cultured in the context of in vitro immunizations) is immunized with a target antigen of interest, whose B lymphocytes are then capable of producing antibodies against the said antigen. antigen. These antibody-producing lymphocytes are then fused with "immortal" myeloma cells (murine in the example) to give rise to hybridomas. From the heterogeneous mixture of cells thus obtained, the cells capable of producing a particular antibody and of multiplying indefinitely are then selected. Each hybridoma is multiplied in the clone form, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties with respect to the antigen of interest can be tested, for example by ELISA, by immunoblotting in one or two-dimensional, in immunofluorescence, or with a biosensor. The monoclonal antibodies thus selected are subsequently purified, in particular according to the affinity chromatography technique. For example, antibody fragments can be obtained by proteolysis. Thus, they can be enzymatic, resulting in fragments with papain; Porter RR, 1959, Biochem. type F (ab) '2 (pepsin treatment 1960, Science, 132 1770-1771). They prepared recombinantly (Skerra Immunol., 256-262). Another antibody fragment which is suitable for the purposes of the invention comprises a fragment Fv which is a dimer consisting of the non-covalent association of the light variable domain (VL) and the heavy variable domain (VH) of the Fab fragment, therefore of the association of two polypeptide chains. In order to improve the stability of the Fv fragment due to the dissociation of the two polypeptide chains, this Fv fragment can be modified by genetic engineering by inserting a suitable peptide link between the VL domain and the VH domain (Huston P. et al., 1988 Proc Natl.Acad Sci.USA 85: 5879-5883). We then speak of fragment scFv (single chain Fragment variable) because it consists of a single polypeptide chain. The use of a peptide bond preferably composed of 15 to 25 amino acids makes it possible to connect the C-terminal end of one domain to the N-terminus of the other domain, thus constituting a monomeric molecule with properties similar to those of the antibody in its complete form. The two orientations of the VL and VH domains are suitable (VL-link-VH and VH-link-VL) because they have identical functional properties. Of course, any fragment known to those skilled in the art and having the immunological characteristics defined above is suitable obtained by Fab digestion (treatment J., 73: 119-126) or; Nisonoff A. et al., Can also be A., 1993, Curr. Opin. for the purposes of the invention. When the biological material is a protein resulting from the expression of a gene, one can determine the expression of the latter, by detecting and or quantifying said protein by Western Blot or ELISA, or any other method known to man of the art, such as a chemiluminescent method from biological material. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) is a solid enzyme immunoassay. This test is part of the more general EIA (Enzyme Immunoassays) in which the assay is coupled to an enzyme catalyzed reaction. The technique uses one or two antibodies. Antibody for the formation of immune complexes (antigen / antibody) is coupled to the enzyme and can generate the emission of a signal by a chromogenic or fluorogenic substrate. The Western Blot technique is a test for detecting a specific protein in a sample using an antibody specific for this protein comprising the following steps as described below.

La première étape est une électrophorèse sur gel, qui permet de séparer les protéines de l'échantillon selon leur taille. Les protéines dans le gel sont alors transférées sur une membrane (nitrocellulose, PVDF...) par pression ou par application d'un courant électrique, les protéines se fixant à la membrane grâce à des interactions hydrophobes et ioniques. Après saturation des sites d'interaction non spécifique, un premier anticorps, spécifique de la protéine à étudier (anticorps primaire) est incubé avec la membrane. La membrane est ensuite rincée afin d'enlever les anticorps primaires non liés, puis incubée avec des anticorps dits secondaires, qui vont se lier aux anticorps primaires. Cet anticorps secondaire est habituellement lié à une enzyme qui 15 permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane. L'ajout d'un substrat marqué de l'enzyme engendre une réaction colorée qui est visible sur la membrane. The first step is gel electrophoresis, which separates the proteins from the sample according to their size. The proteins in the gel are then transferred to a membrane (nitrocellulose, PVDF, etc.) by pressure or by application of an electric current, the proteins being attached to the membrane by means of hydrophobic and ionic interactions. After saturation of the nonspecific interaction sites, a first antibody specific for the protein to be studied (primary antibody) is incubated with the membrane. The membrane is then rinsed to remove unbound primary antibodies and incubated with so-called secondary antibodies, which will bind to the primary antibodies. This secondary antibody is usually linked to an enzyme which allows the visual identification of the protein studied on the membrane. The addition of a substrate labeled with the enzyme generates a colored reaction that is visible on the membrane.

L'analyse de l'expression du gène S100A9 permet de déterminer la susceptibilité d'un patient présentant une réponse systémique inflammatoire à contracter une infection nosocomiale. On peut par exemple analyser l'expression du gène cible chez un patient dont on ne connaît pas la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale, et en comparant avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients sensibles et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients non sensibles, déterminer si le patient est susceptible de contracter une infection nosocomiale. The analysis of the expression of the S100A9 gene makes it possible to determine the susceptibility of a patient presenting an inflammatory systemic response to contracting a nosocomial infection. For example, the expression of the target gene can be analyzed in a patient whose susceptibility to nosocomial infection is unknown, and by comparison with known average expression values of the target gene of susceptible patients and expression values. known average of the target gene of nonsusceptible patients, determine if the patient is likely to contract a nosocomial infection.

L'invention a donc pour objet un procédé pour déterminer la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9 25 L'échantillon biologique peut être un échantillon de sang et le matériel biologique extrait peut être, entre autres, un acide nucléique. De préférence, on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique et la détermination de l'expression du 30 gène cible est effectuée par l'analyse de l'expression des ARNm. Dans un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification ou au moins une sonde d'hybridation spécifique du produit d'expression du gène cible S100A9 ou au moins un 17 anticorps spécifique du produit d'expression du gène cible S100A9. The subject of the invention is therefore a method for determining the susceptibility to contracting a nosocomial infection in a patient presenting an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection, according to which: a. a biological sample of the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. at least one reagent specific for an expression product of the target gene S100A9 c is available. The expression of the target gene S100A9 is determined. The biological sample may be a blood sample and the biological material extracted may be, inter alia, a nucleic acid. Preferably, the total RNAs are extracted from the biological sample and the determination of the expression of the target gene is performed by analyzing the expression of the mRNAs. In a preferred embodiment of the method of the invention, the specific reagent comprises at least one amplification primer or at least one hybridization probe specific for the expression product of the target gene S100A9 or at least one product-specific antibody. of expression of the target gene S100A9.

L'invention a aussi pour objet un kit pour déterminer la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection comprenant au moins un réactif spécifique d'un produite d'expression du gène S100A9, ainsi que l'utilisation du réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 pour déterminer ladite susceptibilité. Dans des modes de réalisation préférés le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification ou au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9 ou au moins un anticorps spécifique du produit d'expression du gène cible S100A9. The subject of the invention is also a kit for determining the susceptibility to contracting a nosocomial infection in a patient presenting an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection, comprising at least one reagent specific for an expression product of the S100A9 gene, and than using the specific reagent of the S100A9 gene expression product to determine said susceptibility. In preferred embodiments, the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one amplification primer or at least one specific hybridization probe for the target gene S100A9 or at least one antibody specific for the expression product of the S100A9 gene. target gene S100A9.

Le procédé et le kit sont notamment appropriés pour déterminer la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale chez un patient en syndrome septique, c'est à dire présentant une réponse systémique inflammatoire à une infection, tel que SIRS, sepsis, sepsis sévère et choc septique. The method and kit are particularly suitable for determining the susceptibility to acquiring a nosocomial infection in a patient with septic syndrome, ie presenting an inflammatory systemic response to an infection, such as SIRS, sepsis, severe sepsis and septic shock.

L'analyse de l'expression du gène S100A9 permet aussi de déterminer l'étiologie d'une réponse systémique inflammatoire. 25 L'invention a donc aussi pour objet un procédé pour la détermination de l'étiologie d'une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection chez un patient selon lequel : 30 a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène cible S100A9 18 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9. The analysis of the expression of the S100A9 gene also makes it possible to determine the etiology of an inflammatory systemic response. The invention therefore also relates to a method for determining the etiology of an inflammatory systemic response associated or not with an infection in a patient according to which: a. a biological sample of the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. at least one reagent specific for an expression product of the target gene S100A9 18 c is available. the expression of the target gene S100A9 is determined.

L'analyse de l'expression du gène S100A9 permet également d'établir un pronostic précoce de survie chez un patient 5 présentant une réponse systémique inflammatoire. The analysis of the expression of the S100A9 gene also makes it possible to establish an early prognosis of survival in a patient with an inflammatory systemic response.

Et l'invention propose un procédé et un kit pour l'établissement d'un diagnostic précoce de survie chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée 10 ou non à une infection. Selon le procédé : a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique 15 b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9. on détermine l'expression du gène cible S100A9. Le kit comprend au moins un réactif spécifique d'un produit 20 d'expression du gène S100A9 et le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 est utilisé pour l'établissement du diagnostic précoce de survie d'un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection. And the invention provides a method and kit for establishing an early diagnosis of survival in a patient with an inflammatory systemic response associated or not with infection. According to the method: a. a biological sample of the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. at least one reagent specific for an expression product of the target gene S100A9 c is available. the expression of the target gene S100A9 is determined. the expression of the target gene S100A9 is determined. The kit comprises at least one specific reagent of an S100A9 gene expression product and the S100A9 gene expression product-specific reagent is used for establishing the early diagnosis of survival of a patient with a systemic response. inflammatory associated or not with an infection.

25 EXEMPLES Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 ù Etude de l'expression du gène S100A9 Echantillons Un groupe de 44 volontaires sains (S) et un groupe de 148 patients atteints d'un syndrome septique (SEP) et prélevés à J1, 30 J2 ou J 3 après le choc septique (HO étant l'injection du traitement vasopresseur) ont également été utilisés, afin de comparer l'expression du gène S100A9 dans le sang périphérique. On distinguait alors un groupe de 44 patients sains (S), et un groupe de 148 patients développant un choc septique (SEP). Extraction des ARN et synthèse des ADNc Pour chaque patient, l'échantillon biologique était un prélèvement sanguin, été régulièrement obtenu pendant les 10 premiers jours suivant le début du syndrome septique développé par les patients SEP. Un prélèvement a également été effectué selon un même protocole chez les patients sains (S). Ces prélèvements ont été collecté directement dans des tubes PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA). Après l'étape de prélèvement sanguin et afin d'obtenir une lyse totale des cellules, les tubes ont été laissés à température ambiante pendant 4 h puis conservés à -20°C jusqu'à l'extraction du matériel biologique. Plus précisément, dans ce protocole, les ARN totaux ont été extraits à l'aide des kits PAXgene Blood RNA (PreAnalytiX) en respectant les recommandations du fabriquant. EXAMPLES The following examples are given for illustrative purposes and are not limiting in nature. They will help to better understand the invention. EXAMPLE 1 Study of the Expression of the S100A9 Gene Samples A group of 44 healthy volunteers (S) and a group of 148 patients with septic syndrome (SEP) taken on D1, D2 or D3 after the septic shock (HO being the injection of vasopressor treatment) were also used, in order to compare the expression of the S100A9 gene in the peripheral blood. A group of 44 healthy patients (S) and a group of 148 patients developing septic shock (SEP) were distinguished. RNA extraction and cDNA synthesis For each patient, the biological sample was a blood sample, obtained regularly during the first 10 days after the onset of septic syndrome developed by MS patients. Sampling was also performed according to the same protocol in healthy patients (S). These samples were collected directly into PAXgeneTM Blood RNA tubes (PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA). After the blood sampling step and in order to obtain a total lysis of the cells, the tubes were left at ambient temperature for 4 h and then stored at -20 ° C. until the biological material was extracted. Specifically, in this protocol, total RNAs were extracted using PAXgene Blood RNA kits (PreAnalytiX) according to the manufacturer's recommendations.

Brièvement, les tubes ont été centrifugés (10 min, 3000g) afin d'obtenir un culot d'acides nucléiques. Ce culot a été lavé et repris dans un tampon contenant de la protéinase K nécessaire à la digestion des protéines (10 min à 55°C). Une nouvelle centrifugation (5 min 19000g) a été effectuée pour éliminer les débris cellulaires et de l'éthanol a été ajouté afin d'optimiser les conditions de fixation des acides nucléiques. Les ARN totaux ont été spécifiquement fixés sur les colonnes PAXgene RNA spin column et, avant l'élution de ceux-ci, une digestion de l'ADN contaminant a été effectuée à l'aide du RNAse free DNAse setlM (Qiagen Ltd, Crawley, UK). Pour chaque extraction, la qualité des ARN totaux a été vérifiée par électrophorèse capillaire en utilisant le kit RNA 6000 Nana ChipTM (Agilent technologies). L'instrument utilisé est le bioanalyser 2100. Une réaction de transcription inverse (RT) a été réalisée dans un volume final de 20 jl. L'ARN total (0,5 pg) a été mélangé avec 1 pl de polyT à 50 pM et 1 pl de d'oligo (dT) 50pM et 1 pL d'annealing buffer puis incubé 5 min. à 65°C. Après refroidissement dans la glace, la solution a été mélangée avec 10 pl de 2x First Strand Reaction Mix et 2 pL de SuperScript III/RNaseTM out enzyme Mix RT (15 U/pl), tous ces produits étant issus du SuperScript First Strand Synthesis Super Mix TM RT-PCR system (Invitrogen). La transcription inverse a été effectuée pendant 50 min. à 50°C puis stoppée par une incubation de 5 min. à 85°C. Pour finir, chaque solution d'ADNc a été diluée au 1/10ème dans de l'eau DEPC. Préparation de gammes étalon de quantification A partir d'un pool d'ADNc provenant de sujets sains, l'amplification de la région 153-179 du gène cible S100A9 (GenBank n° NM8002965.3) a été réalisée par PCR (Polymerase Chain Reaction), conduite jusqu'à saturation, en utilisant le couple d'amorces suivant : Amorce sens : 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' (SEQ ID NO : 1) Amorce anti-sens : 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3' (SEQ ID NO : 2) Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel Les ARNm du gène cible S100A9 retranscrits en ADNc, comme décrit ci-dessus, ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel en utilisant le LightCyclerTM (Roche). Les réactions PCR ont été effectuées à l'aide du Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I real- time PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Chaque PCR a été effectuée dans un volume final de 20 pl contenant 3,6 pl d'eau, 2,4 pl de MgC12, 2 pl de SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA polymerase) et 1pl de chaque amorce (10 pM) et 10 pl de solution d'ADNc. Les amorces utilisées sont celles décrites précédemment. Après une étape de dénaturation de 10 min. à 95°C, l'amplification est effectuée à l'aide de 40 cycles d'un protocole de "touch-down" PCR (10 s à 95°C, 10 s d'hybridation à 68-58°C, suivi d'une extension de 16 s à 72°C). A la fin de chaque cycle, la fluorescence émise par le SYBR Green a été mesurée. Pour confirmer la spécificité de l'amplification, les produits PCR ont systématiquement fait l'objet d'une analyse de courbe de fusion (LightCyclerTM - Roche). Pour cela, les produits PCR ont été traités par une température croissante de 58 à 98°C avec une augmentation de 0,1°C/s. Pour chaque produit PCR, un seul pic a été obtenu lors de l'analyse de la courbe, caractérisé par une température de fusion spécifique. Briefly, the tubes were centrifuged (10 min, 3000g) to obtain a nucleic acid pellet. This pellet was washed and taken up in a buffer containing proteinase K necessary for protein digestion (10 min at 55 ° C.). Further centrifugation (5 min 19000g) was performed to remove cell debris and ethanol was added to optimize the nucleic acid binding conditions. Total RNAs were specifically fixed on PAXgene RNA spin column columns and, prior to elution thereof, digestion of the contaminating DNA was performed using RNAse free DNAse setlM (Qiagen Ltd, Crawley, UK). For each extraction, the quality of the total RNAs was verified by capillary electrophoresis using the Nana ChipTM 6000 RNA Kit (Agilent Technologies). The instrument used is bioanalyser 2100. A reverse transcription reaction (RT) was performed in a final volume of 20 μl. Total RNA (0.5 μg) was mixed with 1 μl of 50 μM polyT and 1 μl of 50 μM oligo (dT) and 1 μL of annealing buffer and incubated for 5 min. at 65 ° C. After cooling in ice, the solution was mixed with 10 μl of 2x First Strand Reaction Mix and 2 μl of SuperScript III / RNaseTM out Mix RT enzyme (15 U / μl), all these products being derived from SuperScript First Strand Synthesis Super Mix TM RT-PCR system (Invitrogen). Reverse transcription was performed for 50 min. at 50 ° C and then stopped by incubation for 5 min. at 85 ° C. Finally, each cDNA solution was diluted 1/10 in DEPC water. Quantification Standard Range Preparation From a cDNA pool from healthy subjects, amplification of the 153-179 region of the S100A9 target gene (GenBank # NM8002965.3) was performed by PCR (Polymerase Chain Reaction). ), conducted to saturation, using the following primer pair: sense primer: 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3 '(SEQ ID NO: 1) Antisense primer: 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3' (SEQ ID NO 2) Real-time PCR mRNA expression analysis The cDNA-tagged S100A9 target gene mRNAs, as described above, were quantitated by quantitative PCR in real time using LightCyclerTM (Roche). The PCR reactions were performed using the Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I real-time PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Each PCR was carried out in a final volume of 20 μl containing 3.6 μl of water, 2.4 μl of MgCl 2, 2 μl of SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA polymerase) and 1 μl of each. primer (10 μM) and 10 μl of cDNA solution. The primers used are those described above. After a denaturation step of 10 min. at 95 ° C, the amplification is carried out using 40 cycles of a "touch-down" PCR protocol (10 s at 95 ° C, 10 s of hybridization at 68-58 ° C, followed by an extension of 16 s at 72 ° C). At the end of each cycle, the fluorescence emitted by the SYBR Green was measured. To confirm the specificity of the amplification, the PCR products were systematically subjected to a fusion curve analysis (LightCyclerTM - Roche). For this, the PCR products were treated with an increasing temperature of 58 to 98 ° C with an increase of 0.1 ° C / s. For each PCR product, a single peak was obtained during the analysis of the curve, characterized by a specific melting temperature.

La combinaison d'amorces nécessaires à la quantification du gène de ménage CPB a été fournie par Search-LC (Heidelberg, Allemagne; référence 488116). La quantité d'ARNm cible relative à la quantité d'ARNm du gène de ménage cyclophilin B a été analysée par la technique de quantification relative avec le LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). La "Second Derivative Maximum Method" du logiciel LightCyclerTM (Roche) a été utilisée pour déterminer automatiquement le Crossing Point (Cp) pour chaque échantillon. La valeur du Cp a été définie comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence était significativement différente du bruit de fond. Cinq dilutions en séries au 1/10ème ont été réalisées en quadruplicate avec chaque standard afin de générer une courbe d'étalonnage exprimant le Cp en fonction du logarithme du nombre de copies. Les dilutions de standard ont été optimisées afin que la courbe d'étalonnage couvre le niveau d'expression attendu pour le gène cible et le gène de ménage. Les courbes standards relatives décrivant l'efficacité de PCR pour le gène cible et le gène de ménage ont été générées et utilisées pour réaliser une quantification avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). Résultats obtenus Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous. Tableau 1 Patients N Mediane Quartile Quartile inférieur supérieur S 44 1.46 1.065 1.87 SEP 148 16.62 11.87 25.835 La p value du test de Mann-Whitney entre les sains et les patients atteints d'un choc septique est < 0,0001. The combination of primers necessary for the quantification of the CPB household gene was provided by Search-LC (Heidelberg, Germany, reference 488116). The amount of target mRNA relative to the amount of mRNA of the cyclophilin B household gene was analyzed by the relative quantization technique with the LightCycler Relative Quantification Software ™ (Roche Molecular Biochemicals). The Second Derivative Maximum Method of the LightCyclerTM software (Roche) was used to automatically determine the Crossing Point (Cp) for each sample. The Cp value was defined as the number of cycles for which the fluorescence was significantly different from the background. Five 1 / 10th series dilutions were performed in quadruplicate with each standard to generate a calibration curve expressing the Cp as a function of the logarithm of the number of copies. The standard dilutions were optimized so that the calibration curve covers the level of expression expected for the target gene and the housekeeping gene. The standard relative curves describing the PCR efficiency for the target gene and the housekeeping gene were generated and used to perform quantification with the LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). Results Obtained The results obtained are shown in Table 1 below. Table 1 Patients N Median Quartile Upper Quartile Lower S 44 1.46 1.065 1.87 SEP 148 16.62 11.87 25.835 The p value of the Mann-Whitney test between healthy and septic shock patients is <0.0001.

L'expression du marqueur S100A9 sur les 3 premiers jours du choc septique était significativement sur-exprimée par rapport aux donneurs sains. The expression of the S100A9 marker on the first 3 days of septic shock was significantly over-expressed compared to healthy donors.

Exemple 2 û Etude de l'expression du gène S100A9 pour déterminer 10 la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale de patients en syndrome septique Echantillons L'étude a été réalisée sur une cohorte de 93 patients ayant développé un choc septique, et admis dans un service de 15 réanimation Chirurgicale ou Médicale du centre hospitalier Lyon-Sud. Ces patients ont été prélevés à J7, J8, J9 ou J10 après le choc septique (HO étant le début du traitement vasopresseur). Parmi ces patients ayant développé un choc septique 27 patients ont contracté secondairement au choc une infection nosocomiale 20 et 66 n'ont pas contracté de infection nosocomiale dans les 53 jours d'observation de cette cohorte. Extraction des ARN et synthèse des ADNc Pour chaque patient, l'échantillon biologique est un prélèvement sanguin, qui a été régulièrement obtenu pendant les 10 premiers 25 jours suivant le début du syndrome septique (patients SEP). Un prélèvement a également été effectué selon un même protocole chez les sujets sains (S). Ces prélèvements ont été collecté directement dans des tubes PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA). 30 Après l'étape de prélèvement sanguin et afin d'obtenir une lyse 22 totale des cellules, les tubes ont été laissés à température ambiante pendant 4 heures puis conservés à -20°C jusqu'à l'extraction du matériel biologique. Plus précisément, dans ce protocole, les ARN totaux ont été extraits à l'aide des kits PAXgene Blood RNA (PreAnalytiX) en respectant les recommandations du fabriquant. Brièvement, les tubes ont été centrifugés (10 min. à 3000g) afin d'obtenir un culot d'acides nucléiques. Ce culot a été lavé et repris dans un tampon contenant de la protéinase K nécessaire à la digestion des protéines (10 min. à 55°C). Une nouvelle centrifugation (5 min. à 19000g) a été effectuée pour éliminer les débris cellulaires et de l'éthanol a été ajouté afin d'optimiser les conditions de fixation des acides nucléiques. Les ARN totaux ont été spécifiquement fixés sur les colonnes PAXgene RNA spin columnTM et, avant l'élution de ceux-ci, une digestion de l'ADN contaminant a été effectuée à l'aide du RNase free DNAse setTM (Qiagen Ltd, Crawley, UK). Pour chaque extraction, la qualité des ARN totaux a été vérifiée par électrophorèse capillaire en utilisant le kit RNA 6000 Nana ChipTM (Agilent technologies). L'instrument utilisé est le bioanalyser 2100TM. Une réaction de transcription inverse (RT) a été réalisée dans un volume final de 20 pl. L'ARN total (0,5 pg) a été mélangé avec 1 pl de polyT à 50 pM et 1 pl de d'oligo (dT) 50 pM et 1 pL d'annealing buffer puis incubé 5 min. à 65°C. EXAMPLE 2 Study of the Expression of the S100A9 Gene to Determine the Susceptibility to a Nosocomial Infection of Septic Syndrome Patients Samples The study was carried out on a cohort of 93 patients who developed septic shock and admitted to a department. of 15 surgical or medical resuscitation of the Lyon-Sud hospital center. These patients were collected on day 7, day 8, day 9 or day 10 after septic shock (HO being the beginning of vasopressor treatment). Among these patients who developed septic shock, 27 patients contracted a nosocomial infection secondarily to shock 20 and 66 did not contract a nosocomial infection within 53 days of observation of this cohort. RNA extraction and cDNA synthesis For each patient, the biological sample is a blood sample, which was regularly obtained during the first 10 days after the onset of septic syndrome (MS patients). Sampling was also performed according to the same protocol in healthy subjects (S). These samples were collected directly into PAXgeneTM Blood RNA tubes (PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA). After the blood collection step and in order to obtain total lysis of the cells, the tubes were left at room temperature for 4 hours and then stored at -20 ° C. until the biological material was extracted. Specifically, in this protocol, total RNAs were extracted using PAXgene Blood RNA kits (PreAnalytiX) according to the manufacturer's recommendations. Briefly, the tubes were centrifuged (10 min at 3000g) to obtain a nucleic acid pellet. This pellet was washed and taken up in a buffer containing proteinase K necessary for the digestion of the proteins (10 min at 55 ° C.). Further centrifugation (5 min at 19000g) was performed to remove cell debris and ethanol was added to optimize the nucleic acid binding conditions. The total RNAs were specifically fixed on the PAXgene RNA spin columnTM columns and, prior to elution thereof, a digestion of the contaminating DNA was performed using the RNase free DNAse setTM (Qiagen Ltd, Crawley, UK). For each extraction, the quality of the total RNAs was verified by capillary electrophoresis using the Nana ChipTM 6000 RNA Kit (Agilent Technologies). The instrument used is the 2100TM bioanalyser. A reverse transcription reaction (RT) was performed in a final volume of 20 μl. Total RNA (0.5 μg) was mixed with 1 μl of 50 μM polyT and 1 μl of 50 μM oligo (dT) and 1 μL of annealing buffer and incubated for 5 min. at 65 ° C.

Après refroidissement dans la glace, la solution a été mélangée avec 10 pl de 2x First Strand Reaction Mix et 2 pL de SuperScript III/RNase out enzyme Mix RT (15 U/pl), tous ces produits étant issus du SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR system (Invitrogen). La transcription inverse a été effectuée pendant 50 min. à 50°C puis stoppée par une incubation de 5 min. à 85°C. Pour finir, chaque solution d'ADNc a été diluée au 1/10ème dans de l'eau DEPC. Préparation de gammes étalon de quantification A partir d'un pool d'ADNc provenant de sujets sains, l'amplification de la région 153-179 du gène cible S100A9 (GenBank n° NM8002965.3) a été réalisée par PCR (Polymerase Chain Reaction), conduite jusqu'à saturation, en utilisant le couple d'amorces suivant : Amorce sens : 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' (SEQ ID NO : 1) Amorce anti-sens : 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3' (SEQ ID NO : 2) Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel Les ARNm du gène cible S100A9 retranscrits en ADNc, comme décrit ci-dessus, ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel en utilisant le LightCyclerTM (Roche). Les réactions PCR ont été effectuées à l'aide du Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I realtime PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Chaque PCR a été effectuée dans un volume final de 20 pl contenant 3,6 pl d'eau, 2,4 pl de MgC12, 2 pl de SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA polymerase) et 1pl de chaque amorce (10 pM) et 10 pl de solution d'ADNc. Les amorces utilisées sont celles décrites précédemment. Après une étape de dénaturation de 10 min. à 95°C, l'amplification est effectuée à l'aide de 40 cycles d'un protocole de "touch-down" PCR (10 s à 95 °C, 10 s d'hybridation à 68-58°C, suivi d'une extension de 16 s à 72°C). A la fin de chaque cycle, la fluorescence émise par le SYBR Green a été mesurée. Pour confirmer la spécificité de l'amplification, les produits PCR ont systématiquement fait l'objet d'une analyse de courbe de fusion (LightCyclerTM - Roche). Pour cela, les produits PCR ont été traités par une température croissante de 58 à 98°C avec une augmentation de 0,1°C/s. Pour chaque produit PCR, un seul pic a été obtenu lors de l'analyse de la courbe, caractérisé par une température de fusion spécifique. La combinaison d'amorces nécessaires à la quantification du gène de ménage CPB a été fournie par Search-LC (Heidelberg, Allemagne; référence 488116). La quantité d'ARNm cible relative à la quantité d'ARNm du gène de ménage cyclophilin B a été analysée par la technique de quantification relative avec le LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). La "Second Derivative Maximum Method" du logiciel LightCyclerTM (Roche) a été utilisée pour déterminer automatiquement le Crossing Point (Cp) pour chaque échantillon. La valeur du Cp a été définie comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence était significativement différente du bruit de fond. After cooling in ice, the solution was mixed with 10 μl of 2x First Strand Reaction Mix and 2 μl of SuperScript III / RNase out Mix RT enzyme (15 U / μl), all these products being derived from SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR system (Invitrogen). Reverse transcription was performed for 50 min. at 50 ° C and then stopped by incubation for 5 min. at 85 ° C. Finally, each cDNA solution was diluted 1/10 in DEPC water. Quantification Standard Range Preparation From a cDNA pool from healthy subjects, amplification of the 153-179 region of the S100A9 target gene (GenBank # NM8002965.3) was performed by PCR (Polymerase Chain Reaction). ), conducted to saturation, using the following primer pair: sense primer: 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3 '(SEQ ID NO: 1) Antisense primer: 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3' (SEQ ID NO 2) Real-time PCR mRNA expression analysis The cDNA-tagged S100A9 target gene mRNAs, as described above, were quantitated by quantitative PCR in real time using LightCyclerTM (Roche). PCR reactions were performed using Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I realtime PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Each PCR was carried out in a final volume of 20 μl containing 3.6 μl of water, 2.4 μl of MgCl 2, 2 μl of SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA polymerase) and 1 μl of each. primer (10 μM) and 10 μl of cDNA solution. The primers used are those described above. After a denaturation step of 10 min. at 95 ° C, the amplification is carried out using 40 cycles of a "touch-down" PCR protocol (10 s at 95 ° C, 10 s of hybridization at 68-58 ° C, followed by an extension of 16 s at 72 ° C). At the end of each cycle, the fluorescence emitted by the SYBR Green was measured. To confirm the specificity of the amplification, the PCR products were systematically subjected to a fusion curve analysis (LightCyclerTM - Roche). For this, the PCR products were treated with an increasing temperature of 58 to 98 ° C with an increase of 0.1 ° C / s. For each PCR product, a single peak was obtained during the analysis of the curve, characterized by a specific melting temperature. The combination of primers necessary for the quantification of the CPB household gene was provided by Search-LC (Heidelberg, Germany, reference 488116). The amount of target mRNA relative to the amount of mRNA of the cyclophilin B household gene was analyzed by the relative quantization technique with the LightCycler Relative Quantification Software ™ (Roche Molecular Biochemicals). The Second Derivative Maximum Method of the LightCyclerTM software (Roche) was used to automatically determine the Crossing Point (Cp) for each sample. The Cp value was defined as the number of cycles for which the fluorescence was significantly different from the background.

Cinq dilutions en séries au 1/10ème ont été réalisées en quadruplicate avec chaque standard afin de générer une courbe d'étalonnage exprimant le Cp en fonction du logarithme du nombre de copies. Les dilutions de standard ont été optimisées afin que la courbe d'étalonnage couvre le niveau d'expression attendu pour le gène cible et le gène de ménage. Les courbes standards relatives décrivant l'efficacité de PCR pour le gène cible et le gène de ménage ont été générées et utilisées pour réaliser une quantification avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). Five 1 / 10th series dilutions were performed in quadruplicate with each standard to generate a calibration curve expressing the Cp as a function of the logarithm of the number of copies. The standard dilutions were optimized so that the calibration curve covers the level of expression expected for the target gene and the housekeeping gene. The standard relative curves describing the PCR efficiency for the target gene and the housekeeping gene were generated and used to perform quantification with the LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).

Résultats des analyses univariée et multivariée Afin de déterminer les variables influant sur la survenue d'une infection nosocomiale, une analyse univariée puis une analyse multivariée sont réalisées. L'analyse univariée est réalisée en effectuant une régression logistique du statut atteint ou non atteint d'une infection nosocomiale en fonction de différentes variables et sur le marqueur S100A9 en ARNm sur les jours J7 à J10 après le début du choc septique. Ensuite une régression logistique multivariée est réalisée sur les variables présentant un niveau de significativité (p) <0,15 avec l'analyse univariée. Results of univariate and multivariate analyzes In order to determine the variables influencing the occurrence of a nosocomial infection, a univariate analysis and then a multivariate analysis are performed. Univariate analysis is performed by logistic regression of status with or without nosocomial infection as a function of different variables and on the S100A9 marker in mRNA on days D7 to D10 after the onset of septic shock. Then a multivariate logistic regression is carried out on the variables presenting a level of significance (p) <0.15 with the univariate analysis.

La méthode de sélection backward (au départ toutes les variables sont prises en compte dans le modèle, puis elles sont retirées une à une) est utilisée avec un seuil de significativité à 0,05. Les résultats sont présentés dans le 26 tableau 2 qui suit. L'odd ratio (O.R.) et son intervalle de confiance à 95% sont indiqués pour chaque résultat. The backward selection method (initially all the variables are taken into account in the model, then they are removed one by one) is used with a significance threshold of 0.05. The results are shown in Table 2 which follows. The odd ratio (O.R.) and its 95% confidence interval are given for each result.

Tableau 2 Analyse univariée (N=93) Analyse multivariée (N=93) OR 95% CI p OR 95% CI p Masculin 1 - - Féminin 1.6 0.641-3.997 0.3143 ns) > 65 1 - - - - - <_ 65 2.04 0.814-5.115 0.1285 - - 0.1186 I à > 51 1 - - ssion <_ 51 1.107 0.450-2.723 0.8246 ssion < 10 1 - - - - - >_ 10 3.036 1.132-8.144 0.0274 - - 0.1384 biditées 0 1 - - >_ 1 1.021 0.414-2.514 0.9645 ction Nosocomiale 1 - - Communautaire 1.144 0.467-2.803 0.7682 ction Pulmonaire 1 - - Abdominale 1.735 0.644-4.672 0.3268 Autres 1.172 0.299-4.597 0.8540 (mRNA) < 6.1 1 - - 1 - - >_ 6.1 6.27 1.718-22.891 0.0055 6.242 1.662-23.447 0.0067 dd Ratio ntervalle de confiance uil de significativité 28 Comme cela ressort du tableau 2 l'analyse multivariée révèle qu'une expression du marqueur S100A9 ? 6.1 sur les jours 7 à 10 après le début du choc septique augmentent significativement la probabilité de survenue d'une infection nosocomiale (odd ratio à 6.2). Table 2 Univariate analysis (N = 93) Multivariate analysis (N = 93) OR 95% CI p OR 95% CI p Male 1 - - Female 1.6 0.641-3.997 0.3143 ns)> 65 1 - - - - - <_ 65 2.04 0.814-5.115 0.1285 - - 0.1186 I to> 51 1 - - ssion <_ 51 1.107 0.450-2.723 0.8246 ssion <10 1 - - - - -> _ 10 3.036 1.132-8.144 0.0274 - - 0.1384 bidity 0 1 - -> _ 1 1.021 0.414-2.514 0.9645 nosocomial ction 1 - - Community 1.144 0.467-2.803 0.7682 Pulmonary ction 1 - - Abdominal 1.735 0.644-4.672 0.3268 Other 1.172 0.299-4.597 0.8540 (mRNA) <6.1 1 - - 1 - -> _ 6.1 6.27 1.718 -22,891 0.0055 6,242 1.662-23,447 0.0067 dd Confidence Ratio U il of Significance 28 As Table 2 shows, multivariate analysis reveals that an expression of the marker S100A9? 6.1 on days 7 to 10 after the onset of septic shock significantly increase the probability of occurrence of a nosocomial infection (odd ratio to 6.2).

Claims (18)

REVENDICATIONS1. Procédé pour déterminer la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9. REVENDICATIONS1. A method for determining the susceptibility to acquiring a nosocomial infection in a patient having an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection, wherein: a. a biological sample of the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. at least one reagent specific for an expression product of the target gene S100A9 c is available. the expression of the target gene S100A9 is determined. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon sanguin. The method of claim 1, wherein the biological sample is a blood sample. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le matériel biologique est un acide nucléique. The method of claim 1, wherein the biological material is a nucleic acid. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible S100A9. 4. Method according to any one of claims 1 to 3, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one amplification primer specific for the target gene S100A9. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9. 5. Method according to any one of claims 1 to 3, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one hybridization probe specific for the target gene S100A9. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins un anticorps. The method of claim 1, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one antibody. 7. Kit pour déterminer la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection comprenant au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9 7. Kit for determining the susceptibility to acquiring a nosocomial infection in a patient presenting an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection, comprising at least one reagent specific for an S100A9 gene expression product 8. Kit selon la revendication 7, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9. 8. Kit according to claim 7, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one hybridization probe specific for the target gene S100A9. 9. Kit selon la revendication 7, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible S100A9. 9. Kit according to claim 7, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one amplification primer specific for the target gene S100A9. 10. Kit selon la revendication 7, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins un anticorps. 10. Kit according to claim 7, wherein the specific reagent of the expression product of the S100A9 gene comprises at least one antibody. 11. Utilisation d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9 pour déterminer, in vitro, la susceptibilité à contracter une infection nosocomiale chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection. 11. Use of at least one reagent specific for an expression product of the S100A9 gene for determining, in vitro, the susceptibility to acquiring a nosocomial infection in a patient presenting an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection. 12. Utilisation selon la revendication 11, dans laquelle le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible S100A9. The use according to claim 11, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one specific hybridization probe of the S100A9 target gene. 13. Utilisation selon la revendication 11, dans laquelle le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible S100A9. The use according to claim 11, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one amplification primer specific for the S100A9 target gene. 14. Utilisation selon la revendication 11, dans lequel le réactif spécifique du produit d'expression du gène S100A9 comprend au moins un anticorps. The use according to claim 11, wherein the specific reagent of the S100A9 gene expression product comprises at least one antibody. 15. Procédé pour l'établissement d'un pronostic précoce de survie chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection, selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9. 15. A method for establishing an early survival prognosis in a patient with an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection, wherein: a. a biological sample of the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. at least one reagent specific for an expression product of the target gene S100A9 c is available. the expression of the target gene S100A9 is determined. 16. Kit pour l'établissement d'un pronostic précoce de survie chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection comprenant au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9. 16. Kit for establishing an early prognosis of survival in a patient with an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection, comprising at least one reagent specific for an S100A9 gene expression product. 17. Utilisation d'au moins un réactif spécifique d'un produit d'expression du gène S100A9 pour l'établissement, in vitro, d'un pronostic de survie chez un patient présentant une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection. 17. Use of at least one reagent specific for an S100A9 gene expression product for establishing, in vitro, a survival prognosis in a patient presenting an inflammatory systemic response, whether or not associated with an infection. 18. Procédé pour la détermination de l'étiologie d'une réponse systémique inflammatoire associée ou non à une infection chez un patient, selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'unproduit d'expression du gène cible S100A9 c. on détermine l'expression du gène cible S100A9. 18. A method for determining the etiology of an inflammatory systemic response associated or not with an infection in a patient, wherein: a. a biological sample of the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. at least one reagent specific for an expression product of the target gene S100A9 c is available. the expression of the target gene S100A9 is determined.
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