FR2924126A1

FR2924126A1 - Culturing heterotrophic microalgae comprises preparing inoculum by culturing strain of microalgae, inoculating the culture medium in photobioreactor with inoculum and culturing microalgae in autotrophic/mixotrophic culture conditions

Info

Publication number: FR2924126A1
Application number: FR0759400A
Authority: FR
Inventors: Didier Delobeau
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2007-11-28
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2009-05-29
Anticipated expiration: 2027-11-28
Also published as: DE102008059562B4; DE102008059562A1; KR20090055497A; FR2924126B1; KR101577820B1

Abstract

Process for culturing heterotrophic microalgae, comprises: preparing an inoculum by culturing at least one strain of heterotrophic microalgae in heterotrophic culture conditions; inoculating the culture medium in a photobioreactor with the inoculum; and culturing microalgae in the photobioreactor, in autotrophic (preferred) or mixotrophic culture conditions. An independent claim is included for a process for obtaining biomass of a heterotrophic microalgae comprising culturing the heterotrophic microalgae, where the process further comprises collecting biomass of the heterotrophic microalgae obtained from the culture according to the culturing of the microalgae.

Description

Nouveau procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe. New method of cultivating a heterotrophic microalgae

La présente invention a pour objet un nouveau procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe, et un procédé destiné à l'obtention de biomasse d'une microalgue hétérotrophe. The subject of the present invention is a novel process for cultivating a heterotrophic microalga, and a method for obtaining biomass of a heterotrophic microalga.

Les algues sont des organismes autotrophes, c'est-à-dire capables de synthétiser de la 10 matière organique à partir du dioxyde de carbone contenu dans l'air et de la lumière grâce à la photosynthèse. On distingue deux grands groupes d'algues : o Les phytobenthos ou macroalgues : espèces fixées au fond de l'eau par un thalle, o Le phytoplancton ou microalgues : espèces qui flottent ou nagent en pleine eau. Les principaux groupes de microalgues sont: • Les diatomées • Les dinophycées, • Les prymnésiophycées (haptophycées), • Les cyanophycées, • Les rhodophycées, • Les chlorophycées (ou chlorophytes). Ainsi, les microalgues représentent un large groupe potentiellement fournisseur de composés ayant des activités biologiques valorisables en cosmétique, dans l'industrie pharmaceutique voire dans l'industrie agro-alimentaire. Certaines microalgues, en particulier chez les chlorophytes, et par exemple Chlorella, 25 sont également des organismes hétérotrophes, c'est-à-dire qu'elles synthétisent de la matière organique à partir de matière organique préalablement fabriquée par d'autres organismes. Ces microalgues sont dites mixotrophes, c'est-à-dire capables de synthétiser de la matière organique à partir de matière inorganique comme le dioxyde de carbone et également capables de vivre comme des hétérotrophes en absence d'énergie lumineuse 30 ou chimique. Algae are autotrophic organisms, i.e. capable of synthesizing organic matter from carbon dioxide in the air and light through photosynthesis. There are two main groups of algae: o Phytobenthos or macroalgae: species attached to the bottom of the water by a thallus, o Phytoplankton or microalgae: species that float or swim in open water. The main groups of microalgae are: • Diatoms • Dinophyceae, • Prymnesiophyceae (haptophyceae), • Cyanophyceae, • Rhodophyceae, • Chlorophyceae (or chlorophytes). Thus, microalgae represent a large potential supplier group of compounds with biological activities that can be valorized in cosmetics, in the pharmaceutical industry and even in the food industry. Some microalgae, especially chlorophytes, and for example Chlorella, are also heterotrophic organisms, i.e. they synthesize organic matter from organic material previously made by other organisms. These microalgae are called mixotrophs, that is to say capable of synthesizing organic matter from inorganic material such as carbon dioxide and also capable of living as heterotrophs in the absence of light or chemical energy.

On sait cultiver certaines de ces algues, en particulier Chlorella, de manière totalement hétérotrophe c'est à dire dans des fermenteurs classiques en présence de sources de 15 20 carbone organique et de sources d'azote minéral ou organique, en présence d'oxygène. Dans ce cas on ensemence successivement des fermenteurs de plus en plus grands avec des cultures cultivées en hétérotrophie en présence de carbone organique (glucose par exemple), d'oxygène (air) et dans l'obscurité car dans ces conditions, la présence de lumière n'est pas nécessaire à la croissance de l'algue. It is known to cultivate some of these algae, in particular Chlorella, in a completely heterotrophic manner, ie in conventional fermenters in the presence of organic carbon sources and sources of inorganic or organic nitrogen, in the presence of oxygen. In this case successively larger fermentors are seeded with cultures grown in heterotrophy in the presence of organic carbon (glucose for example), oxygen (air) and in the dark because under these conditions, the presence of light is not necessary for the growth of the algae.

Ce type de procédé permet d'obtenir une croissance rapide des algues et surtout il permet d'obtenir des concentrations cellulaires extrêmement élevées, supérieures à 10 grammes de matière sèche par litre, allant même jusqu'à 50 grammes et plus par litre. This type of process makes it possible to obtain a rapid growth of algae and above all it makes it possible to obtain extremely high cell concentrations, greater than 10 grams of dry matter per liter, even up to 50 grams and more per liter.

Un inconvénient de ce procédé est qu'il nécessite une source coûteuse de carbone organique et une forte dépense énergétique pour l'aération et l'agitation des fermenteurs. En outre, la qualité biochimique des microalgues cultivées dans des conditions de culture hétérotrophe n'est pas très bonne, en particulier concernant la concentration en molécules à haute valeur ajoutée qu'elles contiennent (pigments tels que chlorophylle, phycoérythrine, phycocyanine, luteine et béta-carotène, lipides tels que l'acide linolénique, l'acide eicosapentaénoique, phospho-et sulfo lipides, acides aminés tels que la proline...). A disadvantage of this process is that it requires a costly source of organic carbon and a high energy expenditure for the aeration and stirring of the fermenters. In addition, the biochemical quality of microalgae cultivated under heterotrophic culture conditions is not very good, especially with regard to the concentration of high value-added molecules they contain (pigments such as chlorophyll, phycoerythrin, phycocyanin, lutein and beta -carotene, lipids such as linolenic acid, eicosapentaenoic acid, phospho-and sulfo lipids, amino acids such as proline ...).

On sait aussi cultiver les algues, en particulier Chlorella, de manière totalement autotrophe en présence de lumière et de carbonates (gaz carbonique) ainsi que d'azote (nitrates, ammonium) et d'autres minéraux. Une telle production est souvent obtenue en bassins circulaires légèrement agités et de faible profondeur. Là également, on ensemence successivement des bassins de plus en plus grands avec des cultures cultivées en autotrophie en présence de CO2, bicarbonates et carbonates et à la lumière car dans ces conditions, la croissance de l'algue est le résultat du phénomène de photosynthèse. Un inconvénient de ce procédé est qu'il ne permet pas d'obtenir une croissance rapide des algues à cause des phénomènes d'auto-ombrage des cultures, de l'alternance des jours et des nuits, de l'impossibilité de réguler aux valeurs optimales des paramètres tels que la température ou le pH des milieux de culture. La croissance des algues est donc lente dans ces conditions et elles sont donc sujettes à contamination par d'autres micro-organismes plus compétitifs, voire des protozoaires. It is also known to cultivate algae, especially Chlorella, in a totally autotrophic manner in the presence of light and carbonates (carbon dioxide) as well as nitrogen (nitrates, ammonium) and other minerals. Such production is often obtained in circular basins slightly agitated and shallow. Here again, successively larger basins are seeded with crops grown in autotrophy in the presence of CO2, bicarbonates and carbonates and in the light because under these conditions, the growth of the alga is the result of the phenomenon of photosynthesis. A disadvantage of this process is that it does not allow to obtain a rapid growth of algae because of the phenomena of self-shading crops, the alternation of days and nights, the impossibility of regulating values optimum parameters such as the temperature or pH of the culture media. The growth of algae is therefore slow under these conditions and they are therefore subject to contamination by other more competitive microorganisms, or even protozoa.

On sait cultiver Chlorella et d'autres algues ou microalgues dans des photobioréacteurs clos, généralement tubulaires, où l'on peut injecter du gaz carbonique en haute concentration et ainsi améliorer la performance des bassins en termes de concentration cellulaire finale et vitesse de croissance, tout en mettant les microalgues à l'abri des contaminations. Dans ce procédé de culture des algues en autotrophie et en milieu confiné, l'ensemencement des cultures finales est également le résultat de cultures successives dans des réacteurs éclairés de plus en plus grands. Dans de tels réacteurs et en fonction inverse du diamètre des tubes, la concentration cellulaire peut aller jusqu'à un maximum de 5 g/1 au terme de chaque subculture. It is known to cultivate Chlorella and other algae or microalgae in closed, generally tubular photobioreactors, where high concentration carbon dioxide can be injected and thus improve the performance of the basins in terms of final cell concentration and growth rate, all by protecting microalgae from contamination. In this autotrophic and confined seaweed cultivation process, the seeding of the final crops is also the result of successive cultures in increasingly large lit reactors. In such reactors and as a function of the diameter of the tubes, the cell concentration can be up to a maximum of 5 g / 1 at the end of each subculture.

Le principal intérêt de la culture de microalgues réside d'une part dans la production de biomasse en grande quantité, exploitée ensuite dans l'industrie agro-alimentaire, les cosmétiques ou l'agriculture et d'autre part dans la production des molécules à haute valeur ajoutée qu'elles contiennent. Dans ces deux cas le problème à résoudre actuellement est de mettre au point un procédé de culture de microalgues permettant d'obtenir une biomasse en quantité importante, c'est à dire supérieure à 1 g/1, tout en préservant la qualité biochimique des microalgues cultivées. The main interest of the microalgae culture resides on the one hand in the production of biomass in large quantity, exploited then in the agro-alimentary industry, cosmetics or agriculture and on the other hand in the production of molecules with high added value they contain. In both cases, the problem currently to be solved is to develop a microalgae culture process that makes it possible to obtain a biomass in a large quantity, ie greater than 1 g / 1, while preserving the biochemical quality of the microalgae. cultivated.

Il est connu dans l'art antérieur que certaines souches de microalgues hétérotrophes sont capables de changer de métabolisme, passant d'un mode hétérotrophe à un mode autotrophe, et vice versa (document Ogbonna et al: J.C. Ogbonna, H. Masui et H. Tanaka, in Journal of Applied Phycology, 1997, 9, pp 359-366). It is known in the prior art that certain heterotrophic microalgae strains are capable of changing metabolism from a heterotrophic mode to an autotrophic mode, and vice versa (Ogbonna et al., JC Ogbonna, H. Masui and H. Tanaka, in Journal of Applied Phycology, 1997, 9, pp 359-366).

Ainsi, ce document Ogbonna et al. décrit la culture séquentielle en mode hétérotrophe/autotrophe de microalgues hétérotrophes, en particulier de Chlorella. Ce document décrit en fait une culture de Chlorella en conditions de culture hétérotrophe dans laquelle, lorsque la concentration en glucose est réduite à zéro, le milieu de culture contenant les Chlorella est transféré dans un flacon à la lumière pour une photostimulation en conditions de culture autotrophe. Le passage de la phase en conditions de culture hétérotrophe à la phase en conditions de culture autotrophe se passe donc à volume constant. Thus, this document Ogbonna et al. describes the heterotrophic / autotrophic sequential culture of heterotrophic microalgae, in particular Chlorella. This document actually describes a Chlorella culture under heterotrophic culture conditions in which, when the glucose concentration is reduced to zero, the Chlorella-containing culture medium is transferred to a vial to light for photostimulation under autotrophic culture conditions. . The passage of the phase under heterotrophic culture conditions to the phase under autotrophic culture conditions therefore occurs at constant volume.

Toutefois, pour l'Homme du métier spécialiste de la culture des microalgues, le passage entre deux conditions de cultures totalement différentes, à savoir les conditions autotrophes et les conditions hétérotrophes ne peut que se manifester par une importante phase de réadaptation de l'algue à de nouvelles conditions, dont les plus brutales sont un passage d'un milieu saturé en oxygène à un milieu saturé en gaz carbonique, d'un milieu où le carbone est organique (glucose) à un milieu où il est inorganique (CO2) et de l'obscurité à la lumière. Cette phase de réadaptation se traduit notamment par une baisse de la concentration en microalgues. C'est ce que l'on observe dans le document Ogbonna et al. à la page 365 colonne gauche premier paragraphe : la concentration en microalgues diminue au bout de 24h en conditions autotrophes. On observe également une faible augmentation de la concentration en protéines. However, for a person skilled in the art of microalgae cultivation, the transition between two totally different culture conditions, namely the autotrophic conditions and the heterotrophic conditions, can only be manifested by an important phase of rehabilitation of the algae. new conditions, the most brutal of which are a transition from a medium saturated with oxygen to a medium saturated with carbon dioxide, from a medium in which carbon is organic (glucose) to a medium in which it is inorganic (CO2) and darkness in the light. This phase of rehabilitation is reflected in particular by a drop in the concentration of microalgae. This is observed in Ogbonna et al. on page 365 left column first paragraph: the microalgae concentration decreases after 24 hours under autotrophic conditions. There is also a slight increase in protein concentration.

Or, la Société Demanderesse a découvert de manière surprenante que malgré ce préjugé technique, il est possible d'obtenir une culture de microalgues en conditions hétérotrophes suivie d'une culture en conditions autotrophes sans phase de réadaptation ni diminution de la concentration en microalgues lors du changement des conditions de culture, et même avec une bonne croissance en phase autotrophe, tout en augmentant la concentration en chlorophylle et en protéines des microalgues. Ce nouveau procédé est basé sur la préparation d'un inoculum par culture d'une microalgue hétérotrophe en conditions de culture hétérotrophe, l'inoculation d'un milieu de culture dans un photobioréacteur par l'inoculum obtenu et culture du milieu de culture inoculé dans le photobioréacteur dans des conditions de culture autotrophe. De manière encore plus surprenante, ces améliorations sont les plus sensibles lorsque la phase de culture autotrophe est réalisée dans des photobioréacteurs clos. En outre, la concentration cellulaire beaucoup plus élevée de l'inoculum obtenu par culture en conditions de culture hétérotrophe (par rapport à des conditions de culture autotrophe) permet, à volume d'inoculum égal, de faire démarrer beaucoup plus vite la subculture et de gagner plusieurs générations de multiplication et donc plusieurs jours de culture en conditions de culture autotrophe. Now, the Applicant Company has surprisingly discovered that despite this technical prejudice, it is possible to obtain a culture of microalgae in heterotrophic conditions followed by a culture in autotrophic conditions without a rehabilitation phase or a decrease in the concentration of microalgae during the change in culture conditions, and even with good growth in the autotrophic phase, while increasing the concentration of chlorophyll and proteins of microalgae. This new method is based on the preparation of an inoculum by cultivation of a heterotrophic microalgae under heterotrophic culture conditions, the inoculation of a culture medium in a photobioreactor with the inoculum obtained and culture of the culture medium inoculated into the photobioreactor under autotrophic culture conditions. Even more surprisingly, these improvements are most sensitive when the autotrophic culture phase is carried out in closed photobioreactors. In addition, the much higher cell concentration of the inoculum obtained by cultivation in heterotrophic culture conditions (with respect to autotrophic culture conditions) makes it possible, at an equal inoculum volume, to start the subculture much faster and to to gain several generations of multiplication and thus several days of culture in conditions of autotrophic culture.

Ainsi, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe, comprenant les étapes suivantes : (a) Préparation d'un inoculum par la mise en culture d'au moins une souche de microalgue hétérotrophe dans des conditions de culture hétérotrophe, (b) Inoculation d'un milieu de culture dans un photobioréacteur, avec ledit inoculum, (c) Culture de ladite microalgue dans ledit photobioréacteur, dans des conditions de culture autotrophe ou mixotrophe, de préférence autotrophe. Thus, a first aspect of the present invention relates to a method of culturing a heterotrophic microalga, comprising the following steps: (a) Preparation of an inoculum by culturing at least one strain of heterotrophic microalgae under conditions heterotrophic culture, (b) Inoculation of a culture medium in a photobioreactor, with said inoculum, (c) Culture of said microalgae in said photobioreactor, under autotrophic or mixotrophic culture conditions, preferably autotrophic.

Selon un autre aspect de l'invention le procédé est un procédé de culture d'une microalgue hétérotrophe, comprenant les étapes suivantes : (a) Préparation d'une pré-culture d'au moins une souche de microalgue hétérotrophe par la mise en culture de ladite souche dans des conditions de culture hétérotrophes, avantageusement telle que l'on obtienne une concentration en ladite microalgue hétérotrophe supérieure à 5g/1 (b) Mise en culture de la pré-culture obtenue à l'étape a) dans un photobioréacteur dans des conditions de culture autotrophes ou mixotrophes, de préférence autotrophes, avantageusement telle que l'on obtienne une concentration en chlorophylle supérieure à 0.01 g/1, une concentration en protéines supérieure à 0.5 g/1, et/ou concentration en microalgue supérieure à 1 g/1. caractérisé en ce que à l'étape b) le volume de la pré-culture est inférieur à 1/5 du volume de culture According to another aspect of the invention, the method is a method of cultivating a heterotrophic microalga, comprising the following steps: (a) Preparation of a preculture of at least one strain of heterotrophic microalgae by culturing of said strain under heterotrophic culture conditions, advantageously such that a concentration of said heterotrophic microalgae greater than 5 g / l is obtained. (b) Culturing of the preculture obtained in step a) in a photobioreactor in autotrophic or mixotrophic culture conditions, preferably autotrophic, advantageously such that a chlorophyll concentration of greater than 0.01 g / l, a protein concentration higher than 0.5 g / l, and / or a microalgae concentration greater than 1 are obtained. g / 1. characterized in that in step b) the volume of the preculture is less than 1/5 of the culture volume

20 Par microalgue hétérotrophe, on désigne selon la présente invention une microalgue capable de synthétiser de la matière organique en présence de sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique, en présence d'oxygène et en absence de lumière. Heterotrophic microalgae means, according to the present invention, a microalga capable of synthesizing organic matter in the presence of organic carbon sources and / or inorganic or organic nitrogen sources, in the presence of oxygen and in the absence of light.

25 Par inoculum, on désigne selon la présente invention une culture pure ou quasiment pure de microalgue hétérotrophe, c'est-à-dire sans contamination de la culture, de volume réduit, c'est à dire inférieur à 1/5 du volume final souhaité de culture de microalgue hétérotrophe, en concentration importante de microalgue hétérotrophe avantageusement supérieure à 5 g/1 et de façon encore plus avantageuse supérieure à 30 10 g/1, et obtenue par culture de microalgue hétérotrophe en conditions de culture hétérotrophe. Le but de l'inoculum est d'être une pré-culture en conditions de culture hétérotrophe afin de faire démarrer rapidement la culture en conditions autotrophe, car elle permet d'obtenir la concentration en microalgue hétérotrophe désirée en un minimum de temps. 15 By inoculum is meant according to the present invention a pure or almost pure culture of heterotrophic microalgae, that is to say without contamination of the culture, reduced volume, ie less than 1/5 of the final volume desired heterotrophic microalgae culture, in high concentration of heterotrophic microalga advantageously greater than 5 g / 1 and even more advantageously greater than 10 g / 1, and obtained by cultivation of heterotrophic microalgae under heterotrophic culture conditions. The purpose of the inoculum is to be a pre-culture under heterotrophic culture conditions in order to rapidly start the culture under autotrophic conditions, since it makes it possible to obtain the desired heterotrophic microalgae concentration in a minimum of time. 15

Par inoculation, on désigne selon la présente invention la dilution de l'inoculum dans un milieu de culture adapté à la culture en conditions autotrophe, le volume de l'inoculum étant inférieur à 1/5 du volume dudit milieu de culture. Par conditions de culture hétérotrophe, on désigne selon la présente invention des conditions de culture avec - un milieu de culture comprenant une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique, 10 - un apport en oxygène, et - une absence de lumière. La température optimale pour la culture de microalgues en conditions de culture hétérotrophe est généralement comprise entre 20 et 40 °C. Le pH optimal pour la culture de microalgues en conditions de culture hétérotrophe est 15 généralement compris entre 5 et 8. Le milieu de culture en conditions de culture hétérotrophe est agité par introduction d'air et de façon complémentaire par un agitateur. Par milieu de culture pour conditions de culture hétérotrophe, on désigne un milieu comportant les éléments chimiques nécessaires à la croissance de la microalgue en 20 absence de lumière et en présence d'oxygène. Un tel milieu comprend généralement : • une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique, • Une source de potassium et de phosphore (K2HPO4 par exemple), 25 • Une source d'azote et de soufre ((NH4)2SO4 par exemple), • Une source de magnésium (MgCl2 par exemple), • Une source de calcium: (CaCl2 par exemple), • Une source de fer: (citrate de fer par exemple)), • Une source d'oligo-éléments: (sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti par exemple), 30 • De l'eau (par exemple de l'eau stérilisée), • Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct voire optimum: (KH2PO4 par exemple).5 On peut citer comme exemple de sources de carbone organique pour les microalgues le glucose, le corn steep, l'acide acétique, l'éthanol, l'urée... Certains produits tels le corn steep ont l'avantage d'être à la fois une source de carbone organique mais aussi d'azote organique, d' oligoéléments et de fer. Inoculation means, according to the present invention, the dilution of the inoculum in a culture medium suitable for culture under autotrophic conditions, the volume of the inoculum being less than 1/5 of the volume of said culture medium. By heterotrophic culture conditions, is meant according to the present invention culture conditions with - a culture medium comprising one or more sources of organic carbon and / or inorganic or organic nitrogen sources, - a supply of oxygen, and - an absence of light. The optimum temperature for the culture of microalgae under heterotrophic culture conditions is generally between 20 and 40 ° C. The optimum pH for the culture of microalgae under heterotrophic culture conditions is generally between 5 and 8. The culture medium under heterotrophic culture conditions is stirred by introduction of air and in a complementary manner by a stirrer. By culture medium for heterotrophic culture conditions, is meant a medium comprising the chemical elements necessary for the growth of the microalgae in the absence of light and in the presence of oxygen. Such a medium generally comprises: • one or more sources of organic carbon and / or mineral or organic nitrogen sources, • a source of potassium and phosphorus (K2HPO4 for example), 25 • A source of nitrogen and sulfur ((NH4) 2SO4 for example), • A source of magnesium (MgCl2 for example), • A source of calcium: (CaCl2 for example), • A source of iron: (iron citrate for example)), • A source trace elements: (salts of Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti for example), • Water (for example sterilized water), • pH buffer: it allows to maintain a pH correct or optimum: (KH2PO4 for example). 5 Examples of organic carbon sources for microalgae include glucose, corn steep, acetic acid, ethanol, urea ... Some products such as corn steep have the advantage of being both a source of organic carbon but also of organic nitrogen, trace elements and iron.

L'acide acétique et l'éthanol présentent l'avantage de ne pas pouvoir être utilisés comme sources de carbone par de nombreux microorganismes, ce qui limite donc les contaminations microbiennes de la culture de microalgues. Cependant toutes les microalgues hétérotrophes ne sont pas capables d'utiliser l'acide acétique ou l'éthanol comme source de carbone. S'ils peuvent être utilisés pour la culture de la Chlorella ou d'autres microalgues, le glucose peut être utilisé de manière plus générale. On peut citer comme exemple de sources d'azote minéral pour les microalgues les nitrates, nitrites et sels ammoniacaux. On peut citer comme exemple de sources d'azote organique pour les microalgues des extraits d'algues, de levures, le corn steep, l'urée... Acetic acid and ethanol have the advantage of not being able to be used as sources of carbon by many microorganisms, which therefore limits the microbial contamination of the microalgae culture. However, not all heterotrophic microalgae are able to use acetic acid or ethanol as a carbon source. If they can be used for the cultivation of Chlorella or other microalgae, glucose can be used more generally. Examples of mineral nitrogen sources for microalgae include nitrates, nitrites and ammoniacal salts. Examples of sources of organic nitrogen for microalgae include extracts of algae, yeasts, corn steep, urea ...

Un exemple de composition de milieu de culture pour des conditions de culture hétérotrophe est donné ci après : An example of a culture medium composition for heterotrophic culture conditions is given below:

Exemple de composition du milieu de culture : KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4.H2O 2g Corn steep 25g Glucose 25g Urée 5g Eau qsp 1 000 mL Example of composition of the culture medium: KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4.H2O 2g Corn steep 25g Glucose 25g Urea 5g Water qs 1 000 mL

Par photobioréacteur, ou PBR, on désigne selon la présente invention tout type de dispositif qui s'avère apte à la prolifération ordonnée et à une échelle commerciale de microorganismes photosynthétiques, en présence de lumière et de dioxyde de carbone. By photobioreactor, or PBR, is meant according to the present invention any type of device that proves suitable for the orderly proliferation and commercial scale of photosynthetic microorganisms in the presence of light and carbon dioxide.

Selon la présente invention, les PBR peuvent être ouverts ou clos. De manière préférée selon l'invention les PBR sont clos. Les PBR ouverts sont caractérisés en ce qu'ils sont à ciel ouvert, la lumière provenant du soleil et les gaz dissous dans ces PBR ouverts étant en équilibre avec ceux de l'atmosphère qui les surplombe. . Les PBR ouverts peuvent être de différents types, par exemple : - les lacs et étangs (les sels minéraux proviennent du sol, le gaz carbonique de l'air) - les bassins artificiels - les bassins circulaires à agitateur rotatif - les champs de courses (ou raceways) - les systèmes à plan incliné Pour éviter au maximum les problèmes d'auto-ombrage conduisant à une faible croissance des microalgues, la profondeur des PBR ouverts est de l'ordre de 10 à 30 cm. According to the present invention, the PBRs can be open or closed. In a preferred manner according to the invention, the PBRs are closed. Open PBRs are characterized by being open-air, with light from the sun and gases dissolved in these open PBRs being in equilibrium with those of the atmosphere above them. . The open PBRs can be of different types, for example: - lakes and ponds (mineral salts come from the soil, carbon dioxide from the air) - artificial ponds - circular tanks with rotary agitator - racetracks ( or raceways) - systems with inclined plane To avoid the problems of self-shading leading to low growth of microalgae, the depth of open PBR is of the order of 10 to 30 cm.

Toutes les installations de PBR ouverts peuvent être contaminées par des contaminations extérieures (poussières de toutes sortes, cadavres d'insectes, de petits animaux ou encore déjection d'oiseaux...). Pour limiter au maximum les échanges avec l'extérieur et de telles contaminations, il a été développé également des PBR clos qui limitent fortement les échanges des moûts de culture avec l'extérieur. All open PBR facilities may be contaminated by external contamination (dust of all kinds, corpses of insects, small animals or bird droppings ...). In order to minimize external exchanges and such contaminations, closed PBRs have also been developed which strongly limit the exchanges of musts with the outside world.

Dans les PBR clos, contrairement à ce qui se passe avec les PBR ouverts, la lumière doit passer au travers d'une paroi qui sert en même temps à confiner les gaz et les liquides. Dans ces PBR clos, la concentration en gaz carbonique des milieux de culture est alors beaucoup plus élevée que dans les PBR ouverts en raison du confinement. Les PBR clos offrent en outre l'avantage d'éliminer pratiquement le phénomène d'évaporation du milieu de culture ou encore de dilution par les pluies et permettent un contrôle facilité des paramètres de culture tels que la température, le pH, les concentrations en gaz dissous et en composés nutritifs. Ils offrent aussi la possibilité de travailler sous de faibles épaisseurs de culture et donc de limiter le phénomène d'auto-ombrage conduisant alors à une concentration en algues accrue, limitant ainsi l'énergie d'agitation et de pompage lors de la culture et l'énergie de centrifugation lors de la récupération de biomasse. In closed PBRs, unlike with open PBRs, the light must pass through a wall that serves to confine gases and liquids at the same time. In these closed PBRs, the carbon dioxide concentration of the culture media is then much higher than in open PBRs due to containment. Closed PBRs also offer the advantage of practically eliminating the phenomenon of evaporation from the culture medium or dilution by the rains and allow easy control of the culture parameters such as temperature, pH, gas concentrations dissolved and in nutritive compounds. They also offer the possibility of working under small thicknesses of culture and thus to limit the self-shading phenomenon leading then to an increased concentration of algae, thus limiting the stirring and pumping energy during the cultivation and the centrifugal energy during biomass recovery.

Les PBR clos sont classés en différents types, à la fois selon leur forme et leur principe de fonctionnement. Les combinaisons entre les différentes possibilités sont si nombreuses que seules quelques unes seront citées ci après : - photobioréacteurs tubulaires réacteur tubulaire horizontal en zigzag plat réacteur tubulaire horizontal en zigzag forme souple réacteur tubulaire horizontal en zigzag à superposition réacteur tubulaire horizontal à répartition réacteur tubulaire horizontal à répartiteur réacteur tubulaire spiralé réacteur tubulaire à circulation triangulaire réacteurs à couche mince panneaux alvéolaires plats à vitres à cadre rigide et à feuille souple à méandres à feuille suspendue à développement cylindrique à développement sphérique cylindres verticaux et manches réacteurs cylindriques verticaux manches verticales manches horizontales Closed PBRs are classified into different types, both in their form and in their operating principle. The combinations between the various possibilities are so numerous that only a few will be mentioned below: - tubular photobioreactors horizontal tubular reactor in flat zigzag horizontal tubular reactor in zigzag flexible form horizontal tubular reactor in zigzag with horizontal tubular reactor superposition horizontal tubular reactor distribution spiral tubular reactor manifold tubular reactor with triangular flow thin-film reactors flat-skinned rigid-leaf and spherical-wall flexible sheet panels cylindrical spherical cylindrical spherical cylindrical vertical cylindrical sleeve vertical sleeve horizontal sleeve

Par conditions de culture autotrophe, on désigne selon la présente invention des conditions de culture avec 20 - un apport en dioxyde de carbone (apporté par exemple par l'air naturel ou de l'air enrichi en CO2, par du CO2 pur, des carbonates ou des bicarbonates), et - une présence de lumière, naturelle ou artificielle. En particulier, la culture de microalgues doit être éclairée avec une intensité lumineuse suffisante, mais non létale pour les microalgues, et les paramètres physiques de la 25 culture (pH, CO2, salinité, température, absorbance...) doivent être contrôlés. La température optimale pour la culture de microalgues en conditions de culture autotrophe est généralement comprise entre 20 et 40 °C Le pH optimal pour la culture de microalgues en conditions de culture autotrophe est généralement compris entre 5 et 8. 30 Une agitation du milieu de culture est également préconisée en conditions de culture autotrophe. Le milieu de culture pour conditions de culture autotrophe comprend les éléments chimiques nécessaires à la croissance de la microalgue en présence de lumière et de dioxyde de carbone. 10 15 Un tel milieu peut comprendre : • Une source de potassium et de phosphore (K2HPO4 par exemple) • Une source d'azote et de soufre ((NH4)2SO4 par exemple) • Une source de magnésium (MgC12 par exemple) • Une source de calcium: (CaC12 par exemple) • Une source de fer: (sulfate de fer par exemple)) • Une source d'oligo-éléments: (sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti par exemple) • De l'eau (par exemple de l'eau stérilisée) • Un tampon pH : il permet de maintenir un pH correct voire optimum: (KH2PO4 par exemple) ou à tout le moins d'en atténuer les variations. The term "autotrophic culture conditions" denotes, according to the present invention, culture conditions with a contribution of carbon dioxide (brought for example by natural air or air enriched with CO2, by pure CO2, carbonates or bicarbonates), and - a presence of light, natural or artificial. In particular, the culture of microalgae must be illuminated with sufficient light intensity, but not lethal for microalgae, and the physical parameters of the culture (pH, CO2, salinity, temperature, absorbance ...) must be controlled. The optimum temperature for the cultivation of microalgae under autotrophic culture conditions is generally between 20 and 40 ° C. The optimal pH for the culture of microalgae under autotrophic culture conditions is generally between 5 and 8. An agitation of the culture medium is also recommended in autotrophic culture conditions. The culture medium for autotrophic culture conditions comprises the chemical elements necessary for the growth of the microalgae in the presence of light and carbon dioxide. Such a medium may comprise: • A source of potassium and phosphorus (K2HPO4 for example) • A source of nitrogen and sulfur ((NH4) 2SO4 for example) • A source of magnesium (MgCl2 for example) • A source of calcium: (CaCl2 for example) • A source of iron: (iron sulphate for example) • A source of trace elements: (salts of Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti for example) • Water (for example sterilized water) • A pH buffer: it allows to maintain a correct or even optimal pH: (KH2PO4 for example) or at least to attenuate the variations.

Un exemple de composition de milieu de culture pour conditions de culture autotrophe est donné ci après : Exemple de composition du milieu de culture : An example of a culture medium composition for autotrophic culture conditions is given below: Example of composition of the culture medium:

KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4- 7H2O 2g Extrait de levure 5g Urée 5g FeSO4 -7H2O 100 mg Solution d'oligoéléments # 5m1 Eau 1 000 mL 25 Composition de la solution d'oligoéléments # : H3B 03 2.86 g MnSO4-7H2O 2,5 g ZnSO4-7H2O 0,222 g 30 CuSO4-5H2O 79,0 mg Na2MO4 21,0 mg Eau distillée 1 000 ml En conditions de culture autotrophe, de même qu'en conditions de culture hétérotrophe, les microalgues présentent des temps de doublement sensiblement plus longs que les bactéries : il s'agit de 24h environ, au lieu de 20 min à 1h. KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4- 7H2O 2g Yeast extract 5g Urea 5g FeSO4 -7H2O 100mg Trace element solution # 5m1 Water 1000ml Composition of micronutrient solution #: H3B 03 2.86 g MnSO4-7H2O 2.5 g ZnSO4-7H2O 0.222 g CuSO4-5H2O 79.0 mg Na2MO4 21.0 mg Distilled water 1000 ml In autotrophic culture conditions, as well as in heterotrophic culture conditions, microalgae have significantly longer doubling times than the bacteria: it is about 24 hours, instead of 20 minutes to 1 hour.

Par conditions de culture mixotrophe, on désigne selon la présente invention des conditions de culture avec - un apport en oxygène, - un apport en dioxyde de carbone, - une présence de lumière, et - un milieu de culture comprenant une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique L'apport en dioxyde de carbone peut être supprimé si la source de carbone est l'acide acétique, car la décomposition oxydative de l'acide acétique conduit à la formation de dioxyde de carbone dans le milieu de culture. By mixotrophic culture conditions, according to the present invention is meant culture conditions with - a supply of oxygen, - a supply of carbon dioxide, - a presence of light, and - a culture medium comprising one or more carbon sources. Organic and / or mineral or organic nitrogen sources Carbon dioxide input can be suppressed if the carbon source is acetic acid, since the oxidative decomposition of acetic acid leads to the formation of carbon dioxide in the culture medium.

La température optimale pour la culture de microalgues en conditions de culture mixotrophe est généralement comprise entre 20 et 40 °C Le pH optimal pour la culture de microalgues en conditions de culture mixotrophe est généralement compris entre 5 et 8. The optimal temperature for the cultivation of microalgae under mixotrophic culture conditions is generally between 20 and 40 ° C. The optimal pH for the culture of microalgae under mixotrophic culture conditions is generally between 5 and 8.

Le milieu de culture pour conditions de culture mixotrophe peut être identique au milieu de culture en conditions de culture hétérotrophe décrit précédemment, mais les concentrations de tous les constituants peuvent être un peu augmentées et on peut y ajouter quelques grammes par litre de carbone organique pour supporter une concentration un peu supérieure de microalgues. The culture medium for mixotrophic culture conditions can be identical to the culture medium under heterotrophic culture conditions described above, but the concentrations of all the constituents can be increased a little and we can add a few grams per liter of organic carbon to support a slightly higher concentration of microalgae.

Une légère agitation du milieu de culture est également préconisée en conditions de culture mixotrophe. A slight agitation of the culture medium is also recommended in mixotrophic culture conditions.

Avantageusement l'étape a) du procédé selon la présente invention comprend plusieurs sous-étapes successives de culture dans des conditions de culture hétérotrophe. Advantageously, step a) of the process according to the present invention comprises several successive substeps of culture under heterotrophic culture conditions.

Préférentiellement, l'étape a) du procédé selon la présente invention comprend entre deux et quatre sous-étapes successives de culture dans des conditions de culture hétérotrophe. Lesdites sous-étapes de culture successives s'effectuent avantageusement avec des volumes de culture croissants. Preferentially, step a) of the process according to the present invention comprises between two and four successive substeps of culture under heterotrophic culture conditions. Said successive substeps of culture are advantageously carried out with growing culture volumes.

Avantageusement, le facteur de dilution entre chaque étape de culture successive est compris entre 1/5 à 1/50 ; de préférence 1/10 à 1/30. Avantageusement, la pré-culture de microalgues de départ nécessaire à la mise en oeuvre de l'étape a) du procédé est d'environ 1 litre. Advantageously, the dilution factor between each successive culture step is between 1/5 to 1/50; preferably 1/10 to 1/30. Advantageously, the preculture of starting microalgae necessary for the implementation of step a) of the process is about 1 liter.

Ainsi par exemple si l'étape a) du procédé selon la présente invention comprend trois sous-étapes successives de culture, le facteur de dilution entre chaque étape de culture successive étant de 1/10 alors l'étape a) peut être décrite comme : - pré-culture de microalgues d'environ 1 litre -dilution des environ 1 litre de pré-culture dans environ 9 litres de milieu de culture, - culture en conditions de culture hétérotrophe des environ 10 litres ainsi obtenus - dilution des environ 10 litres de culture dans environ 90 litres de milieu de culture - culture en conditions de culture hétérotrophe des environ 100 litres ainsi obtenus Thus, for example, if step a) of the process according to the present invention comprises three successive substeps of culture, the dilution factor between each successive culture step being 1/10, then step a) can be described as: - pre-culture of microalgae of about 1 liter -dilution of about 1 liter of pre-culture in about 9 liters of culture medium, - culture in heterotrophic culture conditions of about 10 liters thus obtained - dilution of about 10 liters of culture in about 90 liters of culture medium - culture under heterotrophic culture conditions of about 100 liters thus obtained

Il est à noter que le facteur de dilution entre les sous-étapes de culture successives n'est pas forcément identique. Ainsi il est possible d'avoir un facteur de dilution de 1/10 20 (dilution d'environ 1 litre de pré-culture de microalgues dans environ 9 litres de milieu de culture) puis de passer à un facteur de dilution de 1/20 pour la sous-étape de culture suivante (dilution des environ 10 litres obtenus dans environ 190 litres de milieu de culture) It should be noted that the dilution factor between successive substeps of culture is not necessarily identical. Thus it is possible to have a dilution factor of 1/10 (dilution of about 1 liter of microalgae preculture in about 9 liters of culture medium) and then to go to a dilution factor of 1/20 for the following substep culture (dilution of about 10 liters obtained in about 190 liters of culture medium)

25 De manière préférée, l'étape a) du procédé selon l'invention correspond à la mise en culture d'une microalgue hétérotrophe jusqu'à l'obtention d'une concentration supérieure à 1 g/l. Preferably, step a) of the process according to the invention corresponds to the cultivation of a heterotrophic microalga until a concentration of greater than 1 g / l is obtained.

Avantageusement, la source de carbone du milieu de culture hétérotrophe est introduite 30 lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, de manière semi-discontinue pendant lesdites sous-étapes de culture successives. Le mode de culture semi-discontinue, dite fed- batch , est réalisé par ajout de la source de carbone du milieu de culture hétérotrophe de manière linéaire ou contrôlée. Ainsi le milieu de culture de départ ne comprendra pas la totalité de la quantité de source de carbone prévue au départ dans la 15 composition du milieu de culture mais sera ajoutée progressivement au milieu de culture. Ceci a pour intérêt d'éviter les contaminations, notamment bactériennes. Advantageously, the carbon source of the heterotrophic culture medium is introduced during step a) of the process according to the invention, in a semi-discontinuous manner during said successive culture substeps. The semi-batch culture mode, known as fed-batch, is carried out by adding the carbon source of the heterotrophic culture medium in a linear or controlled manner. Thus the starting culture medium will not include all of the amount of carbon source initially provided in the composition of the culture medium but will be added gradually to the culture medium. This is to avoid contamination, especially bacterial.

De manière préférée l'inoculum préparé à l'étape a) du procédé selon l'invention est axénique. Par inoculum axénique on entend selon la présente invention, une culture pure d'une souche de microalgue exempte de tous micro-organismes étrangers ou parasites décelables, résultant d'une culture en bioréacteur stérile. Preferably, the inoculum prepared in step a) of the process according to the invention is axenic. By axenic inoculum is meant according to the present invention, a pure culture of a strain of microalgae free from all foreign microorganisms or detectable parasites, resulting from a sterile bioreactor culture.

Avantageusement, il pourra être prévu une étape A' ), préalable à l'étape a), l'étape A' ) étant une étape de pré-culture de la microalgue hétérotrophe en conditions de culture autotrophe. Cette étape A'), préalable à l'étape a), a pour but de favoriser l'apparition de l'appareil photosynthétique (chloroplastes ...) dans les microalgues afin de faciliter le passage des conditions de culture hétérotrophes de l'étape a) aux conditions de culture autotrophe de l'étape c). Advantageously, it may be provided a step A '), prior to step a), step A') being a preculture step of the heterotrophic microalga under autotrophic culture conditions. This step A '), prior to step a), aims to promote the appearance of the photosynthetic apparatus (chloroplasts ...) in the microalgae to facilitate the passage of the heterotrophic culture conditions of the step a) the conditions of autotrophic culture of step c).

Avantageusement à l'étape b) du procédé selon la présente invention, le volume de l'inoculum correspond à 1/5 à 1/50, de préférence 1/10 à 1/30 du volume de milieu de culture De manière préférée, l'étape c) du procédé selon l'invention correspond à la mise en culture d'une microalgue hétérotrophe jusqu'à l'obtention d'une concentration en chlorophylle supérieure à 0,01g/l et/ou une concentration en protéine supérieure à 0,5 g/1, et/ou une concentration en microalgue supérieure à 1 g/l. Advantageously in step b) of the process according to the present invention, the volume of the inoculum corresponds to 1/5 to 1/50, preferably 1/10 to 1/30 of the volume of culture medium. step c) of the process according to the invention corresponds to the cultivation of a heterotrophic microalga until a chlorophyll concentration of greater than 0.01 g / l and / or a concentration of protein greater than 0 is obtained. , 5 g / l, and / or a microalgae concentration greater than 1 g / l.

De manière préférée la microalgue hétérotrophe selon l'invention est choisie parmi les chlorophytes, en particulier Chlorella, Scenedesmus et Muriellopsis, encore plus préférentiellement Chlorella vulgaris ou encore parmi les diatomées comme Odontella aurita. Preferably, the heterotrophic microalga according to the invention is chosen from chlorophytes, in particular Chlorella, Scenedesmus and Muriellopsis, even more preferably Chlorella vulgaris, or else diatoms such as Odontella aurita.

Avantageusement les souches choisies sont riches en chlorophylle. Advantageously, the selected strains are rich in chlorophyll.

De manière préférée la souche de la microalgue hétérotrophe est une souche obtenue par adaptation à la croissance hétérotrophe. Par adaptation à la croissance hétérotrophe, on désigne selon la présente invention un procédé par lequel on opère une isolation sélective des souches les plus aptes à croître en conditions de culture hétérotrophe. Ce procédé d'adaptation comprend une première étape optionnelle de soumission des microalgues d'intérêt à un rayonnement UV ou a un agent mutagène, par exemple l'acriflamine ; on procède ensuite à la culture desdites microalgues en boite de Petri en absence de lumière sur milieu gélifié contenant une ou plusieurs sources de carbone organique et/ou de sources d'azote minéral ou organique ; on sélectionne les colonies de microalgues présentant la croissance la plus importante ; optionnellement on peut cultiver en milieu liquide dans des conditions de culture hétérotrophe et individuellement les colonies ainsi sélectionnées. Un tel procédé, sans l'étape optionnelle de soumission à un rayonnement UV est décrit par exemple page 2 du document de brevet GB 1,109,659. Un tel procédé, avec l'étape optionnelle de soumission à un rayonnement UV ou à un agent mutagène est décrit par exemple dans la demande de brevet WO 00/36084. In a preferred manner, the strain of the heterotrophic microalga is a strain obtained by adaptation to heterotrophic growth. By adaptation to heterotrophic growth is meant according to the present invention a method by which selective isolation of the strains most able to grow in conditions of heterotrophic culture is carried out. This adaptation method comprises a first optional step of subjecting the microalgae of interest to UV radiation or to a mutagenic agent, for example acriflamine; then culturing said microalgae in Petri dish in the absence of light on gelled medium containing one or more sources of organic carbon and / or inorganic or organic nitrogen sources; microalgae colonies with the highest growth are selected; optionally, the colonies thus selected can be cultured in liquid medium under heterotrophic culture conditions and individually. Such a method, without the optional step of submitting to UV radiation is described for example on page 2 of GB 1,109,659. Such a method, with the optional step of submitting to UV radiation or a mutagenic agent is described for example in the patent application WO 00/36084.

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé selon l'invention destiné à l'obtention de biomasse d'une microalgue hétérotrophe qui comprend en outre une étape d) de récolte de la biomasse de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de la culture selon l'étape c). Another aspect of the invention relates to a method according to the invention for obtaining biomass of a heterotrophic microalga which furthermore comprises a step d) of harvesting the biomass of the heterotrophic microalga obtained at the end of the invention. culture according to step c).

Par récolte de la biomasse de la microalgue hétérotrophe, on désigne selon la présente invention la séparation de la microalgue hétérotrophe de son milieu de culture, et récupération de la microalgue hétérotrophe ainsi obtenue, dite pâte algale . La pâte algale obtenue comprend alors généralement entre 15 et 30% de matière sèche By harvesting the biomass of the heterotrophic microalga, is meant according to the present invention the separation of the heterotrophic microalgae from its culture medium, and recovery of the heterotrophic microalgue thus obtained, called algal paste. The algal paste obtained then generally comprises between 15 and 30% of dry matter

De manière préférée, l'étape d) de récolte de la biomasse de la microalgue comprend une étape de centrifugation ou est réalisée par filtration de la culture de microalgue, de manière encore plus préférée est réalisée par centrifugation. Dans le cas où la filtration serait utilisée, on emploiera préférentiellement une filtration de type tangentielle. Preferably, step d) of harvesting the biomass of the microalga comprises a centrifugation step or is carried out by filtration of the microalgae culture, even more preferably is carried out by centrifugation. In the case where the filtration would be used, preferably a tangential type filtration will be used.

Avantageusement, le procédé destiné à l'obtention de biomasse selon l'invention comprend en outre une étape e) de séchage de la biomasse récoltée de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de l'étape d). De manière préférée, l'étape e) de séchage de la biomasse récoltée de la microalgue est réalisée par atomisation ou par lyophilisation. Advantageously, the process for obtaining biomass according to the invention also comprises a step e) of drying the biomass harvested from the heterotrophic microalga obtained at the end of step d). Preferably, step e) of drying the biomass harvested from the microalgae is carried out by atomization or freeze-drying.

Avantageusement le procédé selon l'invention comprend en outre une étape f) de congélation de la biomasse récoltée de la microalgue hétérotrophe obtenue à l'issue de l'étape d), cette étape de congélation pouvant être effectuée sous vide ou sous atmosphère contrôlée. Advantageously, the method according to the invention further comprises a step f) of freezing the biomass harvested from the heterotrophic microalga obtained at the end of step d), this freezing step can be carried out under vacuum or in a controlled atmosphere.

Les exemples ci-après décrivent des modes de réalisation préférentiels du procédé selon la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. The examples below describe preferred embodiments of the process according to the present invention, without however limiting the scope thereof.

Exemple 1 : Culture de Chlorella vulgaris selon le procédé de la présente invention Example 1 Culture of Chlorella vulgaris according to the process of the present invention

La culture de Chlorella vulgaris selon l'exemple 1 comprend - trois sous-étapes de culture en conditions de culture hétérotrophe à partir d'une pré-culture de 1 litre , avec un facteur de dilution de 1/25 entre la première sous-étape et la deuxième sous-étape et un facteur de dilution de 1/24 entre la seconde sous-étape et la troisième sous-étape, et 5 jours de culture à chaque sous-étape pour l'obtention d'un inoculum -l'inoculation d'un milieu de culture pour conditions de culture autotrophe avec 1'inoculum avec un facteur de dilution de 1/50 - culture pendant 2 jours en conditions de culture autotrophe. The cultivation of Chlorella vulgaris according to Example 1 comprises - three substeps of culture in heterotrophic culture conditions starting from a preculture of 1 liter, with a dilution factor of 1/25 between the first substep and the second substep and a dilution factor of 1/24 between the second substep and the third substep, and 5 days of culture at each substep to obtain an inoculum -inoculation of a culture medium for autotrophic culture conditions with the inoculum with a dilution factor of 1/50 - culture for 2 days under autotrophic culture conditions.

Ainsi, une pré-culture de microalgues Chlorella vulgaris de 1 litre est cultivée sous aération et agitation pendant 5 jours dans le milieu de culture A et à 35°C : Composition du milieu de culture A, pour 1 litre : KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4.H2O 2g Corn steep 25g Glucose 25g 16 Urée 5g Eau qsp 1 000 mL pH 6,5 La pré-culture de microalgues Chlorella vulgaris de 1 litre est diluée dans 24 litres de milieu de culture A Les 25 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 5 jours en conditions de culture hétérotrophe, c'est-à-dire en absence de lumière et en présence d'air dans un fermenteur classique de 25 litres, tel que ceux utilisés pour les fermentations bactériennes. Du glucose est ajouté de manière discontinue et automatisée au fur et à mesure de sa consommation par les microalgues Chlorella vulgaris en culture. Thus, a preculture of microalgae Chlorella vulgaris of 1 liter is cultured under aeration and stirring for 5 days in culture medium A and at 35 ° C: Composition of culture medium A, for 1 liter: KNO3 2g KH2PO4 2g MgSO4 .H2O 2g Corn steep 25g Glucose 25g 16 Urea 5g Water qs 1000 mL pH 6.5 Pre-culture of microalgae Chlorella vulgaris of 1 liter is diluted in 24 liters of culture medium A The 25 liters of culture medium comprising the microalgae Chlorella vulgaris thus obtained are cultured for 5 days under conditions of heterotrophic culture, that is to say in the absence of light and in the presence of air in a conventional fermentor 25 liters, such as those used for fermentations bacterial. Glucose is added discontinuously and automatically as it is consumed by Chlorella vulgaris microalgae in culture.

Les 25 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués dans 575 litres de milieu de culture A. The 25 liters of Chlorella vulgaris microalgae culture thus obtained are diluted in 575 liters of culture medium A.

Les 600 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 5 jours en absence de lumière et en présence d'air dans un fermenteur classique de 600 litres, tel que ceux utilisés pour les fermentations bactériennes. Du glucose est ajouté de manière discontinue et automatisée au fur et à mesure de sa consommation par les microalgues Chlorella vulgaris en culture. The 600 liters of culture medium comprising the microalgae Chlorella vulgaris thus obtained are cultured for 5 days in the absence of light and in the presence of air in a conventional fermentor of 600 liters, such as those used for bacterial fermentations. Glucose is added discontinuously and automatically as it is consumed by Chlorella vulgaris microalgae in culture.

Les 600 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus ont une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 15 g/1 et constituent l'inoculum de microalgues Chlorella vulgaris. The 600 liters of Chlorella vulgaris microalgae culture thus obtained have a microalgae concentration of Chlorella vulgaris of 15 g / 1 and constitute the microalgae inoculum Chlorella vulgaris.

L'inoculation d'un milieu de culture B dans un photobioréacteur clos tubulaire, avec ledit inoculum, est réalisée par dilution des 600 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus dans 29 400 litres de milieu de culture B. Composition du milieu de culture B, pour 1 litre : Urée 0,3 g/1 Nitrate d'ammonium 0,4 g/1 KH2PO4 0,35 g/130 17 Sulfate de magnésium 0,5 g/1 Sulfate ferreux 0,5 g/1 A cette solution de macroéléments, on ajoute 0,01 ml/l d'une solution de microéléments composée comme suit : 75 g/1 Sulfate de zinc Borax 6 g/1 Sulfate de cobalt 24 g/1 Sulfate de cuivre 24 g/1 Sulfate de manganèse 410 g/1 10 et 0,01 ml/l d'une solution de molybdate d'ammonium à 9,2 g/l. Le pH du milieu de culture sera réglé entre 6,5 et 7 par injection de gaz carbonique. The inoculation of a culture medium B in a closed tubular photobioreactor, with said inoculum, is carried out by dilution of the 600 liters of microalgae culture Chlorella vulgaris thus obtained in 29 400 liters of culture medium B. Composition of the culture medium B, for 1 liter: Urea 0.3 g / 1 Ammonium nitrate 0.4 g / 1 KH2PO4 0.35 g / 130 17 Magnesium sulphate 0.5 g / 1 Ferrous sulphate 0.5 g / 1 At this solution of macroelements, add 0.01 ml / l of a solution of microelements composed as follows: 75 g / 1 Zinc sulphate Borax 6 g / 1 Cobalt sulphate 24 g / 1 Copper sulphate 24 g / 1 Sulphate of 410 g / l manganese and 0.01 ml / l of a 9.2 g / l solution of ammonium molybdate. The pH of the culture medium will be adjusted between 6.5 and 7 by carbon dioxide injection.

Les 30 000 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 2 jours, en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur tubulaire de 30 000 litres (ou 30 m3). The 30,000 liters of culture medium comprising the microalgae Chlorella vulgaris thus obtained are cultured for 2 days, in the presence of light and in the presence of carbon dioxide in a tubular photobioreactor 30,000 liters (or 30 m3).

On obtient après 2 jours de culture une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 3 g/1, une concentration en chlorophylle 0,12 g/1 et une concentration en protéine de 1,5 g/l. After 2 days of culture, a chlorella vulgaris microalgae concentration of 3 g / l, a chlorophyll concentration of 0.12 g / l and a protein concentration of 1.5 g / l are obtained.

Exemple 2: Culture de Chlorella vulgaris uniquement en conditions de culture autotrophe Example 2 Culture of Chlorella vulgaris only under autotrophic culture conditions

L'exemple 2 est un exemple comparatif de l'exemple 1, la culture de Chlorella vulgaris étant réalisée uniquement en conditions de culture autotrophe. Example 2 is a comparative example of Example 1, the cultivation of Chlorella vulgaris being carried out only under autotrophic culture conditions.

La culture de Chlorella vulgaris selon l'exemple 2 comprend - cinq étapes de culture en conditions de culture autotrophes à partir d'une pré-culture de 1 litre , avec un facteur de dilution de 1/10 entre les quatre première étapes et un facteur de dilution de 1/30 entre la quatrième et la cinquième étape de culture, 7 jours de culture pour les quatre première étapes et 9 jours de culture pour la cinquième étape. 15 20 25 30 Ainsi, une pré-culture de microalgues Chlorella vulgaris de 1 litre est cultivée pendant 7 jours dans un photobioréacteur clos tubulaire de 1 litre. Cette pré-culture est diluée dans 9 litres de milieu de culture B Les 10 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 7 jours en conditions de culture autotrophe, c'est-à-dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 10 litres Les 10 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués dans 90 litres de milieu de culture B. The cultivation of Chlorella vulgaris according to Example 2 comprises: - five stages of culture under autotrophic culture conditions from a 1 liter preculture, with a dilution factor of 1/10 between the first four stages and a factor of 1/30 dilution between the fourth and the fifth culture step, 7 days of culture for the first four steps and 9 days of culture for the fifth step. Thus, a preculture of 1 liter Chlorella vulgaris microalgae is cultured for 7 days in a 1 liter closed tubular photobioreactor. This preculture is diluted in 9 liters of culture medium B The 10 liters of culture medium comprising the microalgae Chlorella vulgaris thus obtained are cultured for 7 days under autotrophic culture conditions, that is to say in the presence of light and in the presence of carbon dioxide in a 10-liter closed tubular photobioreactor The 10 liters of microalgae culture Chlorella vulgaris thus obtained are diluted in 90 liters of culture medium B.

Les 100 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 7 jours en conditions de culture autotrophe, c'est-à- dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 100 litres The 100 liters of culture medium comprising the microalgae Chlorella vulgaris thus obtained are cultured for 7 days under autotrophic culture conditions, that is to say in the presence of light and in the presence of carbon dioxide in a closed tubular photobioreactor. 100 liters

Les 100 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués dans 900 litres de milieu de culture B. Les 1000 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 7 jours en conditions de culture autotrophe, c'est-à-dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 1000 litres 25 Les 1000 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus ont une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 3 g/1. The 100 liters of Chlorella vulgaris microalgae culture thus obtained are diluted in 900 liters of culture medium B. The 1000 liters of culture medium comprising the Chlorella vulgaris microalgae thus obtained are cultured for 7 days under autotrophic culture conditions. That is, in the presence of light and in the presence of carbon dioxide in a closed 1000-liter tubular photobioreactor. The 1000 liters of Chlorella vulgaris microalgae culture thus obtained have a microalgae concentration of Chlorella vulgaris of 3 g / l.

Les 1000 litres de culture de microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont dilués 30 dans 29 000 litres de milieu de culture B. The 1000 liters of Chlorella vulgaris microalgae culture thus obtained are diluted in 29,000 liters of culture medium B.

Les 30 000 litres de milieu de culture comprenant les microalgues Chlorella vulgaris ainsi obtenus sont mis en culture pendant 9 jours en conditions de culture autotrophe,20 c'est-à-dire en présence de lumière et en présence de dioxyde de carbone dans un photobioréacteur clos tubulaire de 30 000 litres (ou 30 m3). The 30,000 liters of culture medium comprising the microalgae Chlorella vulgaris thus obtained are cultured for 9 days under autotrophic culture conditions, that is to say in the presence of light and in the presence of carbon dioxide in a photobioreactor. tubular enclosure of 30,000 liters (or 30 m3).

On obtient après un total de 30 jours de culture une concentration en microalgues Chlorella vulgaris de 3 g/1, une concentration en chlorophylle de 0,12 g/1 et une concentration en protéine de 1,5 g/l. After a total of 30 days of culture, a microalgae concentration of Chlorella vulgaris of 3 g / l, a chlorophyll concentration of 0.12 g / l and a protein concentration of 1.5 g / l are obtained.

Comparaison exemple 1/exemple 2 : Il apparait que pour obtenir une concentration en Chlorella vulgaris identique, ayant une qualité biochimique identique (quantité de chlorophylle, quantité en protéines), une culture en conditions de culture autotrophe uniquement nécessite 30 jours de culture (exemple 2) contre seulement 17 jours grâce au procédé selon l'invention (exemple 1) soit un gain de temps de 13 jours (44%).15 Comparison example 1 / example 2: It appears that to obtain a concentration of identical Chlorella vulgaris, having an identical biochemical quality (amount of chlorophyll, amount of protein), a culture in autotrophic culture conditions only requires 30 days of culture (Example 2 ) against only 17 days thanks to the method according to the invention (example 1) is a time saving of 13 days (44%).

Claims

claims

A method of culturing a heterotrophic microalga, comprising the steps of: (a) preparing an inoculum by culturing at least one strain of heterotrophic microalgae under heterotrophic culture conditions, (b) inoculation of a culture medium in a photobioreactor, with the inoculum, (c) Culture of the microalgae in the photobioreactor, under autotrophic or mixotrophic culture conditions, preferably autotrophic.

2. Method according to claim 1, characterized in that step a) comprises several successive substeps of culture under heterotrophic culture conditions.

3. Method according to claim 2, characterized in that said substeps of successive culture are carried out with growing culture volumes.

4. Method according to claim 3, characterized in that the dilution factor 20 between each successive culture step is between 1/5 to 1/50; preferably 1/10 to 1/30.

5. Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that step a) corresponds to the cultivation of a heterotrophic microalga until a concentration of greater than 5 g is obtained. 1, preferably greater than 10 g / l.

6. Process according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the carbon source of the heterotrophic culture medium is introduced during step a) semi-discontinuously during said successive culture substeps. .15

7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the inoculum is axenic.

8. Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that in step b), the volume of the inoculum corresponds to 1/5 to 1/50, preferably 1/10 to 1/30 the volume of culture.

9. Process according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the photobioreactor is chosen from closed photobioreactors and open photobioreactors, preferably from closed photobioreactor.

10. Process according to any one of claims 1 to 9, characterized in that step c) corresponds to the cultivation of a heterotrophic microalga until a chlorophyll concentration greater than 0 is obtained. 01 g / 1 and / or a protein concentration greater than 0.5 g / l, and / or a microalgae concentration greater than 1 g / l.

11. Process according to any one of Claims 1 to 10, characterized in that the heterotrophic microalga is chosen from chlorophytes, in particular Chlorella, Scenedesmus and Muriellopsis, or from diatoms, in particular Odontella aurita.

12. Method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the heterotrophic microalgae strain is obtained by adaptation to heterotrophic growth.

13. Process for obtaining biomass of a heterotrophic microalga comprising the steps of the process according to any one of claims 1 to 12, characterized in that it further comprises a step d) of harvesting the biomass of the microalgae. heterotrophic obtained at the end of the culture according to step c). 20 25 30

14. The method of claim 13, characterized in that the step d) for harvesting the biomass of the microalga comprises a step of centrifugation of the microalgae culture.

15. The method as claimed in claim 13, further comprising a step e) of drying the biomass harvested from the heterotrophic microalga obtained at the end of step d).

16. Method according to any one of claims 13 or 14, characterized in that it further comprises a step f) of freezing the biomass harvested from the heterotrophic microalgue obtained at the end of step d).