FR2918388A1 - Enzyme cible dans le traitement de l'acne. - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'une enzyme comme outil de recherche dans l'acné. L'invention a également pour objet l'utilisation de cette enzyme pour l'identification d'un composé destiné au traitement de l'acné et/ou de tout désordre associé à une hyperséborrhée cutanée, ainsi qu'un procédé d'identification d'un tel composé.

Description

La présente invention a pour objet l'utilisation d'une enzyme à activité

déshydrogénaseréductase comme outil de recherche dans les désordres associés à l'hyperséborrhée, notamment l'acné.

L'invention a également pour objet l'utilisation de cette enzyme pour l'identification d'un composé destiné au traitement de l'acné, de la dermite séborrhéique et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, ainsi qu'un procédé d'identification d'un tel composé.

L'acné est une maladie multifactorielle caractérisée par une production anormale de sébum et une cornification ductale, suivies par une colonisation bactérienne et une inflammation. Aujourd'hui, le produit le plus efficace pour traiter cette pathologie est un rétinoïde synthétique, l'acide 13-cis rétinoïque ou isotrétinoïne (Roaccutane TM). Ce produit possède cependant des effets secondaires sévères, dont la tératogénicité.

Bien que l'acide 13-cis rétinoïque soit efficace contre l'acné par voie orale ( Diagnosis and treatment of acne , Feldman et al, Am Fam Physician, 2004 May 1 ;69(9) :2123-30), son mécanisme d'action reste encore méconnu. L'avantage principal de l'acide 13-cis rétinoïque est sa capacité à diminuer significativement la production de sébum ( Effect of oral 13-cis retinoic acid at three dose levels on sustainable rates of sebum secretion and on acne , Stewart ME et al, J Am Acad Dermatol, 1983 Apr ;8(4) :532-8 et Isotretinoin ù an explanation for its long-term benefit , Cunliffe WJ et al, Dermatologica, 1987 ;175 Suppl 1 :133-7). Au niveau moléculaire, l'acide 13-cis rétinoïque est beaucoup plus efficace par voie orale que d'autres rétinoïdes naturels ou synthétiques (Cunliffe WJ, Norris JF Isotretinoin--an explanation for its long-term benefit , Dermatologica, 1987;175 Suppl 1:133-7). Des propriétés pharmacocinétiques originales ont été proposées pour expliquer cette efficacité.

Certains auteurs ont suggéré que l'acide 13-cis rétinoïque, qui agit sur les récepteurs RAR (Retinoic Acid Receptors), réduirait également la production d'un métabolite dérivé de dihydroxytestostérone, le 3a-androstanediol glucuronide ( Effet of oral isotretinoin treatment on skin androgen receptor levels in male acneic patients , Boudou P et al, J Clin Endocrinol Metab, 1995 Apr ;80(4) :1158-61 et Isotretinoin, tetracycline and circulating hormones in acne , Palatsi R et al, Acta Derm Venerol, 1997 Sep ;77(5) :394-6). Plusieurs études suggèrent que la production de sébum est sous contrôle androgénique, et une réponse anormale de l'unité pilo-sébacée aux androgènes semble être impliquée dans la pathogénèse de l'acné. Ces observations concordent avec l'absence de sébum chez des patients totalement insensibles aux androgènes, et la production normale de sébum chez des mâles pseudohermaphrodites. Puisque les glandes sébacées expriment une série d'enzymes stéroïdogéniques, il a été supposé que la transformation locale de précurseurs androgéniques affecte le fonctionnement des glandes sébacées, plutôt que la concentration systémique en DHEA, en testostérone ou en dihydroxytestostérone (DHT).

Récemment, certaines études suggèrent que Roaccutane pourrait agir en modifiant la concentration androgénique intracellulaire à travers l'inhibition d'enzymes impliquées dans le catabolisme de l'androgène le plus efficace, la DHT ( Expression cioning and characterization of oxidative 17beta- and 3aipha-hydroxysteroid dehydrogenases from rat and human prostate , Biswas MG et al, J Biol Chem,1997 Jun 20 ;272(25) :15959-66 et Cloning of the human RoDH-reiated short chain dehydrogenase gene and anaiysis of its structure , Kedishvili NY et al, Chem Biol Interact, 2001 Jan 30 ;130-132(1-3) :457-67).

Aujourd'hui, au moins 6 membres d'une famille d'enzymes appartenant à la superfamille des déshydrogénase-réductases à courte chaîne (SDR), appelées Rétinol Déshydrogénases (RoDHs), ont été identifiés chez l'homme. Ces enzymes sont cytosoliques ou microsomales, fonctionnent avec le NAD ou le NADP comme co-facteur, et sont sensibles à différents rétinoïdes. Leur mécanisme d'action est multifonctionnel, puisqu'elles peuvent avoir une activité de rétinol déshydrogénase, mais aussi de 3a-hydroxy ou 17R-hydroxy stéroïde déshydrogénase.

Chez l'homme, ces enzymes incluent la RODH ou HSE (RoDH-like 3a-HSD ou 3-hydroxysteroid epimerase) ( Expression cioning and characterization of oxidative 17beta- and 3aipha- hydroxysteroid dehydrogenases from rat and human prostate , Biswas MG et al, J Biol Chem,1997 Jun 20 ;272(25) :15959-66 et Cloning of the human RoDH-reiated short chain dehydrogenase gene and anaiysis of its structure , Kedishvili NY et al, Chem Biol Interact, 2001 Jan 30 ;130-132(1-3) :457-67), la RoDH-4 ou Microsomal NAD±dependent retinol dehydrogenase 4 ("cDNA cioning and characterization of a new human microsomai NAD± dependent dehydrogenase that oxidizes all-trans-retinol and 3aipha-hydroxysteroids", Gough WH et al, J Biol Chem, 1998 Jul 31;273(31):19778-85; "Cloning and characterization of retinol dehydrogenase transcripts expressed in human epidermai keratinocytes", Jurukovski V et al, Mol Genet Metab, 1999 May;67(1):62-73; "Expression pattern and biochemicai characteristics of a major epidermal retinol dehydrogenase", Markova NG et al, Mol Genet Metab, 2003 Feb;78(2):119-35), la RoDH5 (Retinol dehydrogenase 5 (11-cis and 9-cis)) (Chetyrkin SV, Hu J, Gough WH, Dumaual N, Kedishvili NY, "Further characterization of human microsomal 3a/phahydroxysteroiddehydrogenase", Arch Biochem Biophys. 2001 Feb 1;386(1):1-10), la RDH-E2 (la retinal short chain dehydrogenase) (Expression pattern and biochemica/ characteristics of a major epidermal retino/ dehydrogenase Nedialka G. Markova, et al. Molecular Genetics and Metabolism 78 (2003) 119-135) la RoDH11 (dehydrogenase 11 (all-trans and 9-cis)) ( Prostate short-chain dehydrogenase reductase 1 (PSDR 1) : a new member of the short-chain steroid dehydrogenase/reductase family highly expressed in normal and neoplasic prostate epithelium , Lin B et al, Cancer Res, 2001 Feb 15;61(4):1611-8; "Evidence that the human gene for prostate short-chain dehydrogenase/reductase (PSDR1) encodes a nove/ retinal reducatse (ralR1)", Kedishvili NY et al, J Biol chem., 2002 Aug 9;277(32):28909-15) et la DHRS9 (dehydrogenase/reductase (SDR family) member 9) ("Characterization of a nove/ type of human microsomal 3a/pha-hydroxysteroid dehydrogenase: unique tissue distribution and cata/ytic properties", Chetyrkin SV et al, J Biol Chem, 2001 Jun 22;276(25):22278-86; "Characterization of a nove/ airway epithelial cell-specific short chain a/coho/ dehydrogenase/reductase gene whose expression is up-regu/ated by retinoids and is invo/ved in the metabolism of retino!', Soref CM et al, J Biol Chem, 2001 Jun 29;276(26):24194-202). RoDH-4 et DHRS9 sont les seules enzymes identifiées chez l'homme qui jouent un rôle dans la formation de DHT et d'androstanedione. En effet, la RODH4 a été décrite dans la publication de T. Karlsson et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003 Mar 28 ; 303(1) :273-278), comme une enzyme impliquée dans la stimulation de la sécrétion de sébum in vitro par la transformation de la 3-alphadihydrotestostérone et de l'androstérone en dihydrotestostérone (DHT) et androstanedione. L'acide 13-cis rétinoïque (isotrétinoine) bien connue pour son activité antiacnéique, serait supposé réduire la formation de DHT et d'androstandione in vitro par inhibition de l'enzyme RODH4.

Or, la Demanderesse a découvert que RoDH4 n'est pas exprimé (ARNm) dans les glandes sébacées et faiblement dans l'épiderme. Cette faible présence d'ARNm est confirmée en utilisant la RT-PCR conventionnelle sur des biopsies d'épiderme humain. Les deux autres sous- types RODH et RODH5 sont quant à eux indétectables dans ces deux compartiments de la peau. RDH11 est fortement exprimé dans beaucoup de tissus différents avec une proportion plus importante au niveau du cordon médullaire, prostate, cerveau foetal, foie, rein et testicule. Contrairement à RDH11, DHRS9 est retrouvé dans un nombre beaucoup plus restreint d'organes (testicule, coeur, moelle et colon) avec une forte expression dans la trachée.

La demanderesse a maintenant découvert que la DHRS9 (Dehydrogenase Reductase Member 9) est exprimée dans la peau humaine, et plus particulièrement dans les sébocytes et glandes sébacées. Cette observation est intéressante dans la mesure où elle permet précisément d'envisager l'activation ou l'inactivation sélective de cette enzyme au niveau des glandes sébacées contrairement aux autres sous-types de RoDH exprimés chez l'homme. Elle propose dès lors de cibler la protéine DHRS9 pour prévenir et/ou traiter l'acné, la dermite séborrhéique ou tout autre désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Par acné, il faut entendre toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. Par désordre cutané associé à une hyperséborrhée, on entend notamment l'aspect de peau grasse et/ou luisante, la présence de comédons, la dermite séborrhéique, la formation de pellicules.

La DHRS9 est exprimée dans différents compartiments du tissu cutané humain, mais de façon nettement plus importante dans les glandes sébacées que dans l'épiderme. Sauf indication contraire, par DHRS9 , on entend la DHRS9 humaine, dont la séquence est référencée dans Genbank (NCBI) sous le numéro d'accession NM_005771.

Cette enzyme pourrait agir comme oxydase et convertir in vitro le 3a-androstane-diol en DHT, l'androgène le plus efficace. Contrairement aux autres RoDHs, la DHRS9 n'a pas d'activité vis-à-vis des rétinoïdes, mais est régulé par eux ("Characterization of a nove/ airway epithelial cell-specific short chain a/coho/ dehydrogenase/reductase gene whose expression is up-regu/ated by retinoids and is invo/ved in the metabolism of retino/', Soref CM et al, J Biol Chem, 2001 Jun 29;276(26):24194-202). Des modulateurs d'une telle enzyme, et plus particulièrement des inhibiteurs, seraient utiles pour prévenir et/ou traiter l'acné, la dermite séborrhéique ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Par inhibiteur de la DHRS9 on entend au sens de l'invention toute substance, composé simple ou complexe, d'origine naturelle ou synthétique, capable d'inhiber ou de diminuer l'activité ou l'expression de l'enzyme DHRS9, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, et/ou capable d'inhiber, diminuer ou ralentir la réaction catalysée par cette enzyme. L'inhibiteur élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la DHRS9. Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement, il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés du type inhibiteur compétitif. On peut citer comme exemples d'inhibiteurs de la DHRS9, le Citral ou le Carbenoxolone. Le citral (ou lemonal) est le nom donné à deux isomères de formule brute C10H16O. 10 Les deux composants sont des diastéréoisomères : l'isomère trans est connu sous le nom de géranial ou citral A. L'isomère cis est connu sous le nom de néral ou citral B. Géranial Néral 15 Le citral est le constituant majeur de l'huile de citronnelle et d'autre plantes du genre Cymbopogon. II est également présent dans les huiles de verveine, d'orange ou de citron. Carbenoxolone est un dérivé synthétique de l'acide glycyrrizinique de formule ci-dessous : OH OY OH 20 La présente invention se rapporte ainsi à une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, de la dermite séborrhéique ou de tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur, de préférence un inhibiteur de l'enzyme humaine DHRS9, à un patient nécessitant un tel traitement. Un tel modulateur, de préférence inhibiteur, de l'enzyme DHRS9, est utile pour préparer un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'acné, de la dermite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. De préférence, le médicament est efficace dans le traitement de l'acné ou de la dermite séborrhéique. Ce médicament peut être administré par voie orale, parentérale, ou topique. De préférence, un tel médicament est destiné à une application par voie topique. Par voie topique, on entend une application sur la peau ou les muqueuses.

Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion.

La composition peut comprendre une teneur en modulateur de l'enzyme DHRS9 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.

La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que - des agents mouillants; -des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants; -des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.

La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'enzyme DHRS9 humaine comme outil de recherche dans l'acné, la dermite séborrhéique et/ou dans tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Cette enzyme est un nouvel outil d'identification, de sélection ou de caractérisation d'un composé destiné au traitement de l'acné, de la dermite séborrhéique et/ou de tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée.

L'invention se rapporte également à un procédé de diagnostic de l'acné ou de prédisposition à l'acné, comprenant une étape de mesure de l'activité de l'enzyme DHRS9 dans un échantillon biologique, notamment par mesure de la quantité de DHT dans ledit échantillon biologique. L'invention se rapporte également à un kit de diagnostic de l'acné comprenant l'enzyme DHRS9.

Selon la présente invention, un échantillon biologique correspond à tout prélèvement ou échantillon d'organisme vivant, de préférence un mammifère, en particulier un organisme humain, en quantité suffisante pour être caractérisé. On peut citer comme échantillon biologique, à titre d'exemple non limitatif, un échantillon de peau, de cuir chevelu, de muqueuse, ou cellulaire.

En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation de l'enzyme DHRS9 humaine pour l'identification, la sélection ou la caractérisation d'un composé destiné au traitement et/ou à la prévention de l'acné, de la dermite séborrhéique et/ou de tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation de l'enzyme DHRS9 humaine pour l'identification d'un composé destiné à prévenir et/ou améliorer les symptômes de l'acné, de la dermite séborrhéique et/ou de tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée.

De préférence, l'enzyme DHRS9 est utilisée dans la prévention et/ou le traitement de l'acné.

L'invention se rapporte également à une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif d'une pathologie choisie parmi l'acné, la dermite séborrhéique et les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à inhiber l'expression ou l'activité de l'enzyme DHRS9 humaine, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. De préférence, la méthode in vitro de criblage décrite ci-dessus comprend les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de l'expression ou de l'activité de l'enzyme DHRS9, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de l'expression ou de l'activité de l'enzyme DHRS9, ou une inhibition de l'expression de son gène ou une inhibition de l'activité d'au moins un de ses promoteurs est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b) par rapport à l'échantillon non traité.

Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour l'enzyme DHRS9, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.

Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour l'enzyme DHRS9, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. II peut s'agir d'une cellule exprimant le gène de l'enzyme DHRS9 de manière endogène.

Dans ces méthodes, l'expression du gène de l'enzyme DHRS9 ou du gène rapporteur peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité l'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine produite.

L'invention se rapporte également à une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution d'une acné, d'une dermite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de l'enzyme DHRS9, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.

L'invention se rapporte enfin à une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une acné, une dermite séborrhéique ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de l'enzyme DHRS9, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par expression de l'enzyme DHRS9 , on entend la quantité de cette enzyme ; Par activité de l'enzyme DHRS9 , on entend son activité biologique ; Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de l'enzyme DHRS9).

L'activité de l'enzyme DHRS9 peut être évaluée en mesurant la quantité de DHT produite, ou en mesurant la quantité de substrat, le 3alpha diol, qui doit disparaître, dans les échantillons.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à un outil de recherche comprenant l'enzyme DHRS9 humaine.

L'outil de recherche pourra en outre comprendre l'analyse des effets de certains traitements sur l'activité de la DHRS9. Par exemple, cet outil de recherche pourra être tel que l'activité de l'enzyme DHRS9 est mesurée par le taux de DHT produit.

L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur, de préférence un inhibiteur de l'enzyme humaine DHRS9, pour le traitement esthétique des peaux grasses.

La Demanderesse a démontré que l'enzyme DHRS9 humaine est exprimée dans différents tissus autres que la peau, tels que le côlon, la moelle osseuse ou encore la trachée, comme le montre l'exemple 1 et la Figure 1. Cependant, la DHRS-9 est très peu exprimée dans les autres tissus autres que la peau, ce qui représente un avantage important, qui permet d'éviter les effets secondaires systémiques connus liés à des modifications du métabolisme des androgènes. Cette faible expression est à opposer à une autre cible éventuelle : la RoDH11 qui est fortement exprimée dans beaucoup d'organes et qui est ubiquitaire.

Au sein du tissu cutané de patients sains, l'enzyme est exprimée majoritairement dans les glandes sébacées par rapport à l'épiderme, comme le montre l'exemple 2 et la Figure 2. La Figure 3 représente un schéma global de la pathogénèse de l'acné, qui inclut l'action de la DHRS9. Enfin, la Figure 4 représente l'activité de conversion du 3a-diol en DHT par le DHRS9 dans des 15 cellules transfectées ou non par la DHRS9. Les observations décrites ci-dessus indiquent également que l'enzyme DHRS9 est une cible thérapeutique potentielle pour le développement de nouvelles thérapies visant à traiter l'acné, la dermite séborrhéique ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.

EXEMPLE 1 - Mesure de l'expression de l'ARNm codant la DHRS9 dans différents tissus par PCR 25 La mesure a été effectuée par la PCR en temps réel. L'expression des gènes cibles : hRoDH, RoDH11, RoDH-4, RoDH-5 et DHRS9 a été conduite sur différents tissus humains à l'aide de 5 primers spécifiques, Les résultats obtenus sont donnés à la Figure 1 ; ils sont exprimés en nombre de cycles 30 nécessaires pour obtenir une fluorescence donnée (Ct : Cycle de PCR) Plus le nombre de Ct est important, moins la cible est présente dans le tissu correspondant. Ils montrent que des 5 enzymes choisies, la DHRS9 est majoritairement exprimée dans le côlon, la moelle épinière et la trachée. 20

EXEMPLE 2 - Mesure de l'expression de l'ARNm codant la DHRS9 dans les cilandes sébacées et l'épiderme Cette expérience a été réalisée à partir d'échantillons provenant de deux patients différents. Des dissections sous microscope binoculaire et ou par microdissection laser sur coupe de tissu congelé ont été réalisées, afin d'isoler l'épiderme et les des glandes sébacées. La quantité d'ARNm codant différentes enzymes, dont la DHRS9, a ensuite été mesurée dans chacun de ces compartiments.

Les résultats sont présentés Figure 2 ; ils sont exprimés soit en nombre de cycles nécessaires pour attendre un niveau de fluorescence seuil et identique pour tous les échantillons (Ct), soit en rapport d'induction. Ils montrent que la DHRS9 est exprimée au moins 20 fois plus dans les glandes sébacées que dans l'épiderme seul.

EXEMPLE 3 - Modèle cellulaire d'étude de l'oxydation de la 3a-diol par l'enzyme DHRS9 Le cDNA codant la DHRS9 humaine a été sous cloné dans un vecteur d'expression pcDNA3.1/zéo. Celui-ci est ensuite transfecté dans une lignée cellulaire nommée PALM pour PC-3 Androgen receptor Luciferase MMTV. Cette lignée cellulaire provient de cellules PC-3 qui ont été co-transfectées, de façon stable, par le vecteur d'expression codant le récepteur aux androgènes humain (pSG5-puro-h androgen receptor (AR)) et par le vecteur gène reporteur codant la luciférase (pMMTV-néo-Luc) dont le promoteur présente des éléments de réponse AR. L'activité de conversion du 3a-diol en DHT par le DHRS9 peut ainsi être suivie via la transactivation AR. La dose réponse du substrat 3a-diol donne une AC50 pour AR égale à 189nM pour les cellules non transfectées comparée à 19 nM pour les cellules transfectées par la DHRS9 (voir Figure 4, 0 Cellules transfectées DHRS9, + Cellules non transfectées). En utilisant un système gène reporter, nous avons montré que la DHRS9 est capable de déplacer l'AC50 de la 3a-Diol vers la gauche d'environ un log de magnitude autorisant ainsi l'évaluation d'inhibiteurs (voir Figure 4, 0 Cellules transfectées DHRS9, + Cellules non transfectées).

Dans les conditions de réalisation du test, nous avons obtenu 86% d'inhibition de la conversion du 3a-Diol en présence de Citral à la concentration de 100pM et 35% d'inhibition pour la Carbenoxolone à la même concentration.5

Claims (2)

REVENDICATIONS

1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif d'une pathologie choisie parmi l'acné, la dermite séborrhéique et les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à inhiber l'expression ou l'activité de l'enzyme DHRS9 humaine, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.

2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif 10 de l'acné, de la dermite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de l'expression ou de l'activité de l'enzyme DHRS9, de l'expression de son gène 15 ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de l'expression ou de l'activité de l'enzyme DHRS9, ou une inhibition de l'expression de son gène ou une inhibition de l'activité d'au moins un de ses promoteurs est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b) par rapport à l'échantillon non traité. 20