Procédé de production et utilisation de familles d'oligomères d'acideProcess for producing and using families of acid oligomers
galacturoniquegalacturonic
La présente invention se rapporte à un procédé de production d'une 5 famille d'oligomères d'acide galacturonique et à une utilisation d'une telle famille d'oligomères. Les oligosaccharides constituent une large famille de composés parmi laquelle de nombreuses molécules présentent des activités biologiques susceptibles d'être utilisées dans diverses applications. ~o Certains dérivés de ces oligosaccharides peuvent être élaborés dans le but d'inhiber le développement des processus infectieux, par exemple chez les végétaux. Les végétaux sont précisément une importante source d'oligosaccharides biologiquement actifs et la plupart d'entre eux sont 15 obtenus en fragmentant des pectines, des pectines issues du lin par exemple ou de tout autre végétal. Les pectines correspondent à un constituant majeur de la paroi des cellules végétales. Les pectines se composent essentiellement d'homogalacturonanes et de rhamnogalacturonanes de type RG I et de 20 type RG Il. Les homogalacturonanes sont constitués de 100% d'acide galacturonique partiellement méthylé en C6 et actétylé en C2 et/ou C3. Les rhamnogalacturonanes de type RG I sont constitués majoritairement de rhamnose, d'acide galacturonique et de galactose, d'arabinose et parfois de xylose. Quant aux rhamnogalacturonanes de type RG II, 25 présents en moins grande proportion dans les pectines, ils sont constitués d'acide galacturonique, d'acide glucuronique, de rhamnose, de galactose, d'arabinose, de fucose, d'apiose, de KDO, d'un dérivé de l'acide heptulosurique et de xylose. Des méthodes ont été mises en oeuvre'pour dégrader ces pectines 30 dans le but d'obtenir des oligomères d'acide galacturonique. Ces méthodes procèdent de la dégradation enzymatique de pectines puis de la purification des oligomères d'acide galacturonique. On citera notamment l'article de L. Bédouet et al. ( Methods for obtaining neutral and acid oligosaccharides from flax pectines , Biotechnology Letters (2005) 27 : 40), dans lequel il est décrit une méthode enzymatique pour obtenir des oligosaccharides neutres et acides à partir de pectines de lin partiellement substitués par des groupements methyl en C6 et/ou acétyl en C2/C3. La purification des familles d'oligosaccharides 100% neutres (oligogalactanes, oligoarabinogalactanes) ou 100% acides (oligogalacturonanes), ou partiellement anioniques, nécessitant une purification par chromatographie échangeuse d'anions. Io On pourra se référer également au document japonais JP 10 226 701 dans lequel il est décrit également une méthode de décomposition des pectines brutes pour obtenir des oligomères d'acide galacturonique. La méthode consistant à faire une extraction à chaud (60 à 100 C) de ladite pectine puis de soumettre l'extrait à une dégradation 15 enzymatique à l'aide de pectinase. Les enzymes utilisées permettent de couper les chaînes polymériques en oligomères. Ces chaînes polymériques présentent naturellement des substituants acétylés, la préparation en oligogalacturonane décrite dans le procédé est naturellement contaminée par des oligomères non 100% anioniques 20 puisque l'extraction à chaud entraîne obligatoirement des fractions d'oses neutres de masse moléculaire faible, on citera l'article de L. Bedouet (Changes in esterified pectins development in the flax stems and leaves Carbohydrate Polymers 65, (2006) 165-173) ; les oligomères qui résultent de cette dégradation enzymatique présentent une activité antibactérienne 25 Bien qu'intéressantes, les méthodes décrites dans ces documents sont relativement complexes à mettre en oeuvre, et par conséquent coûteuses. Par ailleurs, la structure des oligomères obtenus dépend fortement de l'origine des pectines, notamment la substitution notamment par les acétates qui varie d'une plante à une autre, mais aussi en fonction 30 du stade de croissance de la plante (L. Bedouet et al, 2006, Carbohydrate Polymers 65, 165-173). Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir un procédé moins coûteux de production d'oligomères, constitués uniquement d'acide galacturonique, non substitués ou acétylés. Un autre problème, que résout l'invention, est de fournir un procédé, qui permette d'obtenir des oligomères ayant la même structure (non contaminés par des oligomères contenant des oses neutres), quelle que soit l'origine des pectines utilisées, ces oligomères pouvant être non substitués ou acétylés selon un pourcentage déterminé. Dans ce but, la présente invention propose un procédé rapide et peu onéreux de production d'oligomères d'acide galacturonique acétylés ou non, ledit procédé étant du type selon lequel on fournit un mélange de polymères d'acide galacturonique; et selon l'invention ce procédé comprend en outre les étapes suivantes : a) on porte ledit mélange à une température et à une pression déterminées pour dégrader lesdits polymères d'acide galacturonique de façon à obtenir un mélange d'oligomères comprenant des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est compris essentiellement entre 2 et 40 ; et, b) on récupère lesdits oligomères d'acide galacturonique de dp essentiellement compris entre 2 et 40 ; de cette façon on obtient des oligomères qui seront acétylés selon un pourcentage déterminé et présentant un degré de polymérisation dp essentiellement compris entre 2 et 40. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise en oeuvre d'un mélange de polymères d'acide galacturonique que l'on dégrade thermiquement de manière contrôlée pour obtenir des oligomères d'un degré de polymérisation limité compris entre 2 et 40, par exemple entre 5 et 25. Avantageusement, et selon une étape c), après l'étape b), on fait réagir un composé acétique sur lesdits oligomères d'acide galacturonique récupérés de façon contrôlée pour greffer des groupements acétates selon un pourcentage déterminé sur lesdits oligomères d'acide galacturonique récupérés ; de cette façon on obtient des oligomères d'acide galacturonique acétylés sans modification du degré de polymérisation. De la sorte, les polymères d'acide galacturonique qui sont naturellement partiellement acétylés, mais selon un taux variable qui dépend de leur origine, sont d'abord entièrement débarrassés de leurs substituants pour ensuite être acétylés de manière totalement contrôlée. De cette façon on peut s'affranchir de l'origine des polymères. Par ailleurs, et selon encore un autre mode de mise en oeuvre, lesdits oligomères sont avantageusement substitués avec des groupements choisis parmi l'ensemble des, Alkyl, Aryle, Acyl, Phosphate, Sulfate, selon un pourcentage déterminé de manière à leur conférer des to propriétés particulières. Ces oligomères seront alors traités par un réactif d'acétylation, on choisira de préférence un réactif facile à éliminer au terme de la réaction, comme par exemple l'anhydride acétique. Dans le cas des oligomères d'acide galacturonique sulfatés, ils seront obtenus de préférence à l'aide d'un complexe S03-DMF. 15 Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, lesdits polymères d'acide galacturonique sont obtenus en hydrolysant des pectines issues de végétaux, de quelle que nature que ce soit. Une telle source d'approvisionnement est quasiment infinie, et par conséquent d'un coût très avantageux. Aussi, non seulement la matière 20 première est d'un faible coût, mais au surplus le procédé de mise en oeuvre, est relativement simple et ne fait pas appel à des méthodes coûteuses de dégradation enzymatique. Par ailleurs les procédés de préparation des oligogalacturonanes par voie enzymatique nécessitent l'élimination de la protéine afin que la fraction oligogalacturonane soit 25 pure. Le procédé objet de la présente invention s'affranchi de cette étape de déprotéinisation. Avantageusement, à l'étape a), on porte ledit mélange de polymères d'acide galacturonique à une température supérieure à 110 C, de manière à dégrader les polymères d'acide galacturonique. De préférence, on 30 applique une température inférieure à 130 C, par exemple 121 C et ce durant un laps de temps compris entre 30 et 60 minutes. Par exemple, le mélange est placé en autoclave durant 40 minutes. Dans ces conditions de température et de pression, on obtient essentiellement des oligomères d'acide galacturonique non substitués. De manière préférentielle, on abaisse le pH du mélange d'oligomères après l'étape a), pour provoquer la précipitation des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est supérieure à 40 ou de préférence supérieur à 25, de façon à récupérer à l'étape b) un surnageant contenant lesdits oligomères d'acide galacturonique de degré de polymérisation dp, compris entre 2 et 40 ou bien de préférence compris entre 2 et 25 et essentiellement compris entre to 5 et 25. Ensuite, ledit surnageant est traité de manière à récupérer des oligomères de dp essentiellement compris entre 5 et 25, soit par précipitation, soit par ultrafiltration; il pourra avantageusement être mélangé à un alcool pour faire précipiter lesdits oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est essentiellement ts compris entre 5 et 25. Dans le cas de la filtration on pourra avantageusement utiliser une membrane de seuil de coupure de 1 kDa, les oligomères de dp essentiellement compris entre 5 et 25 sont récupérés dans le rétentat, ce procédé de filtration permet en outre de concentrer la solution d'oligomères qui peut être lyophilisée. Et à l'étape 20 c), on fait réagir avantageusement de l'anhydride acétique sur les oligomères d'acide galacturonique récupérés pour greffer des groupements acétates. De la sorte, le procédé d'acétylation est relativement doux et il ne provoque ainsi pas de modification du degré de polymérisation. Il n'y a pas de dégradation supplémentaire des 25 oligomères. Selon un mode de réalisation particulier, à l'étape c), le composé acétique et lesdits oligomères d'acide galacturonique forment un mélange réactionnel, et on interrompt la réaction d'acétylation en ajoutant une quantité d'eau donnée audit mélange réactionnel. Ensuite, ledit mélange 30 réactionnel additionné de ladite quantité d'eau donnée est dialysé après réaction pour récupérer lesdits oligomères acétylés en solution dans l'eau. Avantageusement, lesdits oligomères acétylés en solution dans l'eau sont lyophilisés pour être isolés. De préférence, ils sont congelés avant lyophilisation. Selon un autre aspect, la présente invention propose l'utilisation d'oligomères acétylés selon le procédé décrit ci-dessus, pour une 5 utilisation comme agent antimicrobien. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après de modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : Io - la Figure 1 est un spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (1H RMN) d'un composé obtenu selon le procédé conforme à l'invention et présentant un premier degré de substitution ; et, - la Figure 2 est un spectre de ce même composé présentant un second degré de substitution. 15 Les séquences d'oses neutres sont sensibles aux acides contrairement aux séquences d'acide uroniques. En milieu acide, les oses neutres et les oligomères d'oses neutres sont solubles alors que les oligomères d'oses acides forment un précipité. Les séquences d'oses neutres seront donc éliminées par hydrolyse acide contrôlée, tandis que 20 les séquences d'oses acides resteront intactes ; on obtiendra alors des polymères d'acide galacturonique (PGA). La méthode utilisée pour dégrader les polymères d'acide galacturonique (PGA) en oligomères d'acide galacturonique (OGA) correspond à une auto-hydrolyse, en condition acide à un pH compris 25 entre 4 et 5 et de manière préférentielle à un pH de 4,4, de ces polymères d'acide galacturonique (PGA) provoquée par chauffage en autoclave à 121 C (1 atm) pendant 40 minutes. Méthode : Les oligomères de pectine sont obtenus par dégradation des 30 pectines brutes, lesquelles contiennent des oses acides (acide galacturonique) et des oses neutres. Le rapport oses acides/oses neutres varie selon l'origine des pectines. Il est respectivement de 75/25 pour le lin, de 80/20 pour la pomme, ou encore de 82/18 pour le citron. La méthode appliquée pour dégrader les pectines selon laquelle elles sont soumises à un traitement acide puis sont portées à au moins 120 C, permet d'éliminer tous les substituants présents sur le polymère et en particulier les groupements acétyl. Après purification, les oligomères d'acide galacturonique (OGA) ainsi obtenus, dont le degré de polymérisation DP est essentiellement compris entre 5 et 25 unités sont donc non acétylés. En revanche, d'autres méthodes que la dégradation thermique, ~o notamment la dégradation enzymatique par des pectinases commerciales peut conduire à l'obtention d'oligomères d'acide galacturonique (OGA) acétylés, puisque les polymères d'acide galacturonique sont naturellement acétylés et que la dégradation enzymatique consiste simplement au découpage du polymère en oligomères. Cependant l'exploitation d'un tel is procédé peut conduire à une hétérogénéité des échantillons puisque le taux de substitution des pectines varie en fonction du végétal, mais aussi en fonction de son stade de développement. Et surtout, ces méthodes sont plus coûteuses. De même, le rapport oses acides/oses neutres varie en fonction 20 des plantes et de leur stade de croissance et l'exploitation de pectines brutes entraînerait une variabilité de composition qui pourrait être préjudiciable à la reproductibilité des propriétés dans le cas de l'application de ces molécules. Pour s'assurer de la parfaite reproductibilité des lots on s'intéresse 25 plus particulièrement à la fraction ne contenant que les oses acides. On pourra extraire les polymères d'acide galacturonique (PGA) à partir de pectines isolées de plantes de quelle que nature que ce soit. On pourra aussi utiliser des polymères d'acide galacturonique vendus tels quels dans le commerce. Dans les deux cas, on vise à obtenir des oligomères d'acide 30 galacturonique (OGA). The present invention relates to a process for producing a family of galacturonic acid oligomers and to a use of such a family of oligomers. Oligosaccharides are a broad family of compounds among which many molecules have biological activities that can be used in a variety of applications. Some derivatives of these oligosaccharides can be developed in order to inhibit the development of infectious processes, for example in plants. Plants are precisely an important source of biologically active oligosaccharides and most of them are obtained by fragmenting pectins, pectins from flax for example or any other plant. Pectins correspond to a major constituent of the plant cell wall. The pectins consist essentially of homogalacturonans and rhamnogalacturonans of type RG I and type RG II. The homogalacturonans consist of 100% of partially methylated C6 and C2 and / or C3 acetylated galacturonic acid. The rhamnogalacturonans type RG I consist mainly of rhamnose, galacturonic acid and galactose, arabinose and sometimes xylose. As for rhamnogalacturonans of the RG II type, 25 present in a smaller proportion in the pectins, they consist of galacturonic acid, glucuronic acid, rhamnose, galactose, arabinose, fucose, apiose, KDO , a derivative of heptulosuric acid and xylose. Methods have been employed to degrade these pectins for the purpose of obtaining galacturonic acid oligomers. These methods proceed from the enzymatic degradation of pectins and then from the purification of galacturonic acid oligomers. The article by L. Bedouet et al. (Methods for obtaining neutral and acid oligosaccharides from flax pectins, Biotechnology Letters (2005) 27: 40), in which an enzymatic method is described for obtaining neutral and acidic oligosaccharides from linseed pectins partially substituted by methyl groups. C6 and / or C2 / C3 acetyl. The purification of 100% neutral oligosaccharide (oligogalactan, oligoarabinogalactan) or 100% oligosalacturonan (or partially anionic) oligosaccharide families requiring purification by anion exchange chromatography. Reference can also be made to Japanese patent application JP 10 226 701, which also describes a method for decomposing crude pectins to obtain galacturonic acid oligomers. The method of carrying out a hot extraction (60 to 100 C) of said pectin and then subjecting the extract to enzymatic degradation using pectinase. The enzymes used make it possible to cut the polymer chains into oligomers. These polymer chains naturally have acetyl substituents, the oligogalacturonan preparation described in the process is naturally contaminated by non-100% anionic oligomers since the hot extraction necessarily results in neutral oleic fractions of low molecular weight, article by L. Bedouet (Changes in esterified pectins in the flax stems and leaves Carbohydrate Polymers 65, (2006) 165-173); The oligomers that result from this enzymatic degradation exhibit antibacterial activity. Although interesting, the methods described in these documents are relatively complex to implement, and therefore expensive. Moreover, the structure of the oligomers obtained depends strongly on the origin of the pectins, in particular the substitution, in particular by the acetates, which varies from one plant to another, but also as a function of the stage of growth of the plant (L. Bedouet et al., 2006, Carbohydrate Polymers 65, 165-173). Also, a problem that arises and that the present invention aims to solve is to provide a less expensive method of producing oligomers, consisting solely of galacturonic acid, unsubstituted or acetylated. Another problem, which the invention solves, is to provide a process which makes it possible to obtain oligomers having the same structure (not contaminated with oligomers containing neutral oses), whatever the origin of the pectins used, these oligomers which may be unsubstituted or acetylated by a given percentage. For this purpose, the present invention provides a rapid and inexpensive method of producing acetylated or unsubstituted galacturonic acid oligomers, said process being of the type in which a mixture of galacturonic acid polymers is provided; and according to the invention this process further comprises the following steps: a) said mixture is brought to a temperature and a pressure determined to degrade said galacturonic acid polymers so as to obtain a mixture of oligomers comprising oligomers of galacturonic acid whose degree of polymerization dp is essentially between 2 and 40; and, b) recovering said galacturonic acid oligomers of dp substantially between 2 and 40; in this way oligomers are obtained which will be acetylated according to a given percentage and having a degree of polymerization dp substantially between 2 and 40. Thus, a characteristic of the invention lies in the use of a polymer mixture of galacturonic acid which is thermally degraded in a controlled manner to obtain oligomers with a limited degree of polymerization of between 2 and 40, for example between 5 and 25. Advantageously, and according to a step c), after step b) reacting an acetic compound on said recovered galacturonic acid oligomers in a controlled manner to graft acetate groups by a determined percentage onto said recovered galacturonic acid oligomers; in this way, acetylated galacturonic acid oligomers are obtained without modifying the degree of polymerization. In this way, the galacturonic acid polymers which are naturally partially acetylated, but according to a variable rate which depends on their origin, are first completely free of their substituents and then be acetylated in a totally controlled manner. In this way we can get rid of the origin of polymers. Moreover, and according to yet another embodiment, said oligomers are advantageously substituted with groups selected from the group consisting of, alkyl, aryl, acyl, phosphate and sulphate, according to a percentage determined so as to confer on them special properties. These oligomers will then be treated with an acetylation reagent, and preferably a reagent that is easy to eliminate at the end of the reaction, such as acetic anhydride, will be chosen. In the case of sulfated galacturonic acid oligomers, they will preferably be obtained using a SO 3 -DMF complex. According to a particularly advantageous embodiment of the invention, said galacturonic acid polymers are obtained by hydrolyzing pectins derived from plants of any nature whatsoever. Such a source of supply is almost infinite, and therefore very cost-effective. Also, not only is the raw material of low cost, but in addition the process of implementation, is relatively simple and does not involve expensive methods of enzymatic degradation. In addition, processes for the preparation of oligogalacturonans enzymatically require the removal of the protein so that the oligogalacturonan fraction is pure. The method which is the subject of the present invention is freed from this deproteinization step. Advantageously, in step a), said mixture of galacturonic acid polymers is brought to a temperature above 110 C, so as to degrade the galacturonic acid polymers. Preferably, a temperature of less than 130 ° C., for example 121 ° C., is applied for a period of time of between 30 and 60 minutes. For example, the mixture is placed in an autoclave for 40 minutes. Under these conditions of temperature and pressure, essentially unsubstituted galacturonic acid oligomers are obtained. Preferably, the pH of the oligomer mixture is lowered after step a) to precipitate galacturonic acid oligomers whose degree of polymerization dp is greater than 40 or preferably greater than 25, so that recovering in step b) a supernatant containing said oligomers of galacturonic acid of degree of polymerization dp, between 2 and 40 or preferably between 2 and 25 and essentially between between 5 and 25. Then, said supernatant is treated so as to recover oligomers of dp substantially between 5 and 25, either by precipitation or by ultrafiltration; it may advantageously be mixed with an alcohol to precipitate said oligomers of galacturonic acid whose degree of polymerization dp is essentially ts between 5 and 25. In the case of filtration, it is advantageous to use a membrane of cutoff threshold of 1 kDa, the oligomers of dp essentially between 5 and 25 are recovered in the retentate, this filtration method further allows to concentrate the oligomer solution which can be freeze-dried. And in step c), acetic anhydride is advantageously reacted with the recovered galacturonic acid oligomers to graft acetate groups. In this way, the acetylation process is relatively mild and thus does not cause a change in the degree of polymerization. There is no further degradation of the oligomers. According to a particular embodiment, in step c), the acetic compound and said oligomers of galacturonic acid form a reaction mixture, and the acetylation reaction is interrupted by adding a given amount of water to said reaction mixture. Then, said reaction mixture supplemented with said given amount of water is dialyzed after reaction to recover said acetylated oligomers in solution in water. Advantageously, said acetylated oligomers in solution in water are lyophilized to be isolated. Preferably, they are frozen before lyophilization. In another aspect, the present invention provides the use of acetyl oligomers according to the method described above for use as an antimicrobial agent. Other features and advantages of the invention will appear on reading the following description of particular embodiments of the invention, given by way of indication but not limitation, with reference to the accompanying drawings in which: Io - la FIG. 1 is a proton nuclear magnetic resonance spectrum (1H NMR) of a compound obtained according to the process according to the invention and having a first degree of substitution; and - Figure 2 is a spectrum of this same compound having a second degree of substitution. The neutral ose sequences are acid-sensitive in contrast to the uronic acid sequences. In acidic medium, the neutral oses and oligomers of neutral oses are soluble while the oligomers of acidic oses form a precipitate. Neutral ose sequences will therefore be removed by controlled acid hydrolysis, while the acidic acid sequences will remain intact; we will then obtain polymers of galacturonic acid (PGA). The method used to degrade galacturonic acid (PGA) polymers to galacturonic acid oligomers (OGA) corresponds to self-hydrolysis, under acidic conditions at a pH of between 4 and 5 and preferentially at a pH of 4.4, of these galacturonic acid polymers (PGA) caused by heating in an autoclave at 121 C (1 atm) for 40 minutes. Method: The oligomers of pectin are obtained by degradation of the crude pectins, which contain acidic oses (galacturonic acid) and neutral oses. The ratio of neutral to acidic acids varies according to the origin of the pectins. It is respectively 75/25 for flax, 80/20 for apple, or 82/18 for lemon. The method applied to degrade the pectins according to which they are subjected to an acid treatment and then are brought to at least 120 ° C., makes it possible to eliminate all the substituents present on the polymer and in particular the acetyl groups. After purification, the oligomers of galacturonic acid (OGA) thus obtained, whose degree of polymerization DP is essentially between 5 and 25 units are therefore nonacetylated. On the other hand, other methods than thermal degradation, in particular enzymatic degradation by commercial pectinases, can lead to the production of acetylated galacturonic acid oligomers (OGA), since the galacturonic acid polymers are naturally acetylated. and that the enzymatic degradation simply consists in cutting the polymer into oligomers. However the exploitation of such a process can lead to a heterogeneity of the samples since the substitution rate of the pectins varies according to the plant, but also according to its stage of development. And above all, these methods are more expensive. Likewise, the ratio of neutral to acidic acids varies according to the plants and their stage of growth and the exploitation of raw pectins would lead to a compositional variability which could be detrimental to the reproducibility of the properties in the case of application. of these molecules. To ensure the perfect reproducibility of the batches, we are particularly interested in the fraction containing only the acidic oses. The galacturonic acid (PGA) polymers can be extracted from pectins isolated from plants of any kind. It will also be possible to use galacturonic acid polymers sold as such commercially. In both cases, it is intended to obtain oligomers of galacturonic acid (OGA).
Exemple 1 Un procédé de préparation de polymères d'acide galacturonique à partir d'une quantité déterminée de pectine est décrit ci-après. On fournit tout d'abord 10 g de pectine que l'on met en solution dans de l'eau, et de manière avantageuse dans de l'eau ultra pure. Une telle qualité d'eau est susceptible d'être obtenue au moyen d'un dispositif du commerce, par exemple le système PURELAB UHQ. Ensuite, on ajoute à la solution de l'acide chlorhydrique quatre fois molaire, puis on porte le mélange à 50 C et on le met sous agitation pendant une durée de 2 à 4 to heures avantageusement on traitera la préparation trois heures à 50 C. De la sorte, les séquences d'oses neutres sont hydrolysées tandis que les liaisons entre les acides uroniques ne sont pas dégradées. Après cette phase d'agitation, le mélange est neutralisé par de la soude 12 fois molaire. Puis on additionne au mélange 2 volumes 15 d'isopropanol. Ainsi, seules les molécules de masse moyenne élevée précipitent avec l'isopropanol, tandis que les molécules de masse faible (mono et oligosaccharides) restent en solution. On introduit ensuite le mélange dans des tubes d'une centrifugeuse. On récupère alors le précipité dans le culot desdits tubes, après centrifugation du mélange 20 porté à 4 C et à 15.000 g pendant 30 minutes, tandis que le surnageant est éliminé. On obtient par là même, des polymères d'acide galacturonique. Exemple 2 Le précipité obtenu selon l'exemple 1 est ensuite remis en solution 25 dans de l'eau ultra pure UHQ. Le pH de la solution est alors ajusté à 4,4 avec de l'acide chlorhydrique 0,1 fois molaire. De la sorte, les fonctions carboxyliques du polymère d'acide galacturonique (PGA), sont majoritairement sous la forme ionisée COO" H+. Cela améliore l'auto-dégradation lorsque le mélange est porté à 121 C en autoclave pendant 30 40 minutes. Une diminution de la durée du traitement réduit la dégradation du polymère, alors qu'à l'inverse une augmentation de la durée du traitement à 121 C augmente la dégradation du polymère et conduit à des oligomères d'acide galacturonique dont les dp sont en moyenne, selon les cas majoritairement plus élevés ou plus petits que ceux obtenus par traitement pendant 40 minutes. Grâce à ce traitement thermique et aux conditions d'application, d'une part tous les substituants du polymère sont éliminés, notamment les substituants acétyl, et d'autre part, on obtient notamment des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est majoritairement compris entre 2 et 25 unités ose. D'ailleurs, lorsque l'on compare les profils d'élution en chromatographie échangeuse d'ions (DEAE-Sepharose), des polymères ~o d'acide galacturonique obtenus selon l'exemple 1 précité et des oligomères d'acide galacturonique obtenus grâce au traitement thermique décrit ci-dessus, on observe pour les seconds, une élution qui non seulement démarre plus tôt, mais aussi qui est plus étalée que celle des premiers. Cela est révélateur de la dégradation des polymères, puisque 15 l'élution des petites molécules est plus rapide et que l'élution des plus grosses molécules. Le mélange d'oligomères d'acide galacturonique précité, est ensuite refroidi rapidement. Puis, on ajuste le pH de ce mélange refroidi à 2,0 avec de l'acide acétique. Cet ajustement provoque alors la précipitation 20 des molécules de masse moyenne qui peuvent résulter d'une dégradation incomplète. Ainsi, après centrifugation du mélange à 15 000 g pendant 30 minutes et ce à une température de 4 C, on récupère le surnageant que l'on neutralise par de l'ammoniaque et qui est constitué de petites 25 molécules, tandis que le culot des tubes de centrifugation contenant les molécules de masse moyenne précitée est éliminé. Là encore, l'élution en chromatographie échange d'ions du surnageant en comparaison des deux autres profils d'élution décrit ci-dessus, montre un profil qui démarre encore un peu plus tôt et surtout qui 30 s'atténue bien plutôt que le profil des oligomères d'acide galacturonique après traitement thermique. Cela témoigne de l'élimination des composés de haut poids moléculaire et ce, grâce à la précipitation a pH 2 en présence d'acide acétique. Les petites molécules constituées d'oligosaccharides sont ensuite récupérées, soit par précipitation en présence d'un alcool, soit par ultrafiltration sur membrane de lkDa de seuil de coupure ; dans les 2 cas, les oligomères peuvent être séchés par lyophilisation. Dans le cas de la précipitation alcoolique on choisira préférentiellement un traitement par 7 volumes d'isopropariol. Le mélange est à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions et l'on récupère alors dans le culot des tubes, les Io fractions d'oligomères d'acide galacturonique. Pour ce faire, le précipité récupéré dans le culot est séché par exemple par évaporation. Ensuite, le précipité sec peut avantageusement être solubilisé dans de l'eau UHQ (10g d'oligomères d'acide galacturonique par litre) puis lyophilisé. La lyophilisation améliore le conditionnement des oligomères d'acide 15 galacturonique (OGA). On se référera au tableau I reporté ci-dessous, dans lequel apparaît alors, le pourcentage des fractions d'oligomères d'acide galacturonique obtenu par précipitation dans l'isopropanol, en fonction du degré de polymérisation. 20 Tableau I Degré de Rendement Degré de Rendement polymérisation polymérisation 2 0,3 % 0,01 14 0,9 % 0,05 3 3,5 % 0,2 15 0,6 % 0,03 4 10% 0,5 16 0,7% 0,03 5 13,5 % 0,6 17 0,15 % 0,03 6 14,5% 0,7 18 0,2% 0,03 7 14% 0,7 19 0,15% 0,03 8 14,5% 0,7 20 0,15% 0,03 9 11,5% 0,6 21 0,15% 0,03 9,75 % 0,6 22 0,1 % 0,03 Degré de olvmérisation Rendement Degré de polymérisation Rendement 11 6,5% 0,3 23 0,1 % 0,03 12 2'4% 0'1 24 0,1 % 0,03 13 1,3 % 0,06 25 0,1 % 0,03 Ainsi qu'on peut le constater, les oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation est compris entre 4 et 11 représentent près de 95 % de tous les composés obtenus selon ce procédé. Par ailleurs, près de 78 % des composés ont un degré de polymérisation compris entre 5 et 10. Par conséquent, le procédé ici mis en oeuvre est extrêmement sélectif. Dans le cas de la récupération des oligomères d'acide galacturonique par ultrafiltration sur membrane de 1 kDa de seuil de to coupure, on récupérera le rétentat contenant les oligomères de dp majoritairement compris entre 5 et 25 ; ces oligomères concentrés dans le rétentat sont lyophilisés. Par ailleurs, ces oligomères sont non substitués, en raison de l'élimination des acétates et des méthyles durant le procédé de préparation décrit ci-dessus. En outre, les fractions sont exemptes 15 d'oses neutres. Bien évidemment, des oligomères d'acide galacturonique sont susceptibles d'être obtenus selon le mode de préparation proposé dans l'exemple 2 ci-dessus à partir de polymères d'acide galacturonique disponibles dans le commerce. Le procédé selon l'invention, vise à obtenir des oligomères d'acide 20 galacturonique partiellement acétylés tout comme le sont les polymères d'acide galacturonique présents dans la plante, mais avec un taux d'acétylation déterminé. Pour ce faire, il a été mis au point un procédé d'acétylation ménagé. Ainsi, selon cette technique, en partant d'oligomères non substitués, l'acétylation des fractions d'oligomères 25 d'acide galacturonique peut être contrôlée. Example 1 A process for preparing galacturonic acid polymers from a specified amount of pectin is described below. First, 10 g of pectin are provided, which is dissolved in water, and advantageously in ultra-pure water. Such a quality of water can be obtained by means of a commercial device, for example the PURELAB UHQ system. Then 4 molar hydrochloric acid is added to the solution, then the mixture is brought to 50 ° C. and stirred for a period of 2 to 4 hours, advantageously the preparation is treated for 3 hours at 50 ° C. In this way, the neutral ose sequences are hydrolyzed while the bonds between the uronic acids are not degraded. After this stirring phase, the mixture is neutralized with 12 times molar sodium hydroxide. Then 2 volumes of isopropanol are added to the mixture. Thus, only high average mass molecules precipitate with isopropanol, while low mass molecules (mono and oligosaccharides) remain in solution. The mixture is then introduced into tubes of a centrifuge. The precipitate is then recovered in the pellet of said tubes, after centrifugation of the mixture brought to 4 ° C. and 15,000 g for 30 minutes, while the supernatant is removed. In this way, polymers of galacturonic acid are obtained. EXAMPLE 2 The precipitate obtained according to Example 1 is then re-dissolved in UHQ ultra pure water. The pH of the solution is then adjusted to 4.4 with 0.1 molar hydrochloric acid. In this way, the carboxylic functions of the galacturonic acid polymer (PGA) are predominantly in the ionized form COO-H + This improves the self-degradation when the mixture is heated to 121 ° C. in an autoclave for 40 minutes. decreasing the duration of the treatment reduces the degradation of the polymer, whereas conversely an increase in the duration of the treatment at 121 ° C increases the degradation of the polymer and leads to oligomers of galacturonic acid whose dp are on average, according to the majority of cases higher or lower than those obtained by treatment for 40 minutes.Thanks to this heat treatment and to the conditions of application, on the one hand all the substituents of the polymer are eliminated, in particular the acetyl substituents, and on the other hand, galacturonic acid oligomers are obtained whose degree of polymerization dp is mainly between 2 and 25 units dose. Moreover, when we compare the ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose) elution profiles, the galacturonic acid ~ o polymers obtained according to the abovementioned example 1 and the galacturonic acid oligomers obtained by virtue of the heat treatment described above, for the latter, we observe an elution which not only starts earlier, but also which is more spread out than that of the former. This is indicative of polymer degradation, since the elution of small molecules is faster and the elution of larger molecules is faster. The mixture of galacturonic acid oligomers mentioned above is then rapidly cooled. Then, the pH of this cooled mixture is adjusted to 2.0 with acetic acid. This adjustment then causes the precipitation of medium-mass molecules that may result from incomplete degradation. Thus, after centrifugation of the mixture at 15,000 g for 30 minutes and at a temperature of 4 ° C., the supernatant which is neutralized with ammonia and which consists of small molecules is recovered, while the pellet of the Centrifuge tubes containing the above-mentioned medium mass molecules are removed. Here again, the ion exchange chromatography elution of the supernatant in comparison with the two other elution profiles described above, shows a profile which starts a little earlier and especially which attenuates rather than the profile. oligomers of galacturonic acid after heat treatment. This shows the elimination of high molecular weight compounds by precipitation at pH 2 in the presence of acetic acid. The small molecules consisting of oligosaccharides are then recovered, either by precipitation in the presence of an alcohol, or by membrane ultrafiltration of lkDa cutoff threshold; in both cases, the oligomers can be dried by lyophilization. In the case of the alcoholic precipitation, treatment with 7 volumes of isopropariol is preferably chosen. The mixture is again centrifuged under the same conditions and then the tubes, the galacturonic acid oligomer fractions, are recovered in the pellet. To do this, the precipitate recovered in the pellet is dried, for example by evaporation. Then, the dry precipitate can advantageously be solubilized in UHQ water (10 g of galacturonic acid oligomers per liter) and then lyophilized. Lyophilization improves the conditioning of galacturonic acid oligomers (OGA). Reference is made to Table I below, in which appears the percentage of galacturonic acid oligomer fractions obtained by precipitation in isopropanol, depending on the degree of polymerization. Table I Degree of Yield Degree of Yield Polymerization Polymerization 2 0.3% 0.01 14 0.9% 0.05 3 3.5% 0.2 15 0.6% 0.03 4 10% 0.5 16 0.7% 0.03 5 13.5% 0.6 17 0.15% 0.03 6 14.5% 0.7 18 0.2% 0.03 7 14% 0.7 19 0.15% 0.03 8 14.5% 0.7 20 0.15% 0.03 9 11.5% 0.6 21 0.15% 0.03 9.75% 0.6 22 0.1% 0.03 Degree of olimerization Yield Polymerization degree Yield 11 6.5% 0.3 23 0.1% 0.03 12 2'4% 0'1 24 0.1% 0.03 13 1.3% 0.06 25 0 , 1% 0.03 As can be seen, galacturonic acid oligomers whose degree of polymerization is between 4 and 11 represent nearly 95% of all the compounds obtained by this process. On the other hand, nearly 78% of the compounds have a degree of polymerization of between 5 and 10. Therefore, the process used here is extremely selective. In the case of the recovery of galacturonic acid oligomers by membrane ultrafiltration with a cut-off 1 kDa threshold, the retentate containing the oligomers of dp predominantly between 5 and 25 will be recovered; these oligomers concentrated in the retentate are lyophilized. Moreover, these oligomers are unsubstituted due to the removal of acetates and methyls during the preparation process described above. In addition, the fractions are free of neutral sugars. Of course, oligomers of galacturonic acid may be obtained according to the method of preparation proposed in Example 2 above from commercially available galacturonic acid polymers. The process according to the invention aims to obtain partially acetylated galacturonic acid oligomers as are the galacturonic acid polymers present in the plant, but with a determined acetylation level. To do this, a method of acetylation has been developed. Thus, according to this technique, starting from unsubstituted oligomers, the acetylation of the galacturonic acid oligomer fractions can be controlled.
Les oligomères d'acide galacturonique sont additionnés d'anhydride acétique et l'acétylation est très douce et non dénaturante, c'est-à-dire qu'elle ne dégrade pas les oligomères. Exemple 3 : un cycle de traitement A 1 g d'oligomères d'acide galacturonique on ajoute 10 ml d'anhydride acétique 0,1 fois molaire et ce en quatre fois. Le mélange est alors mis sous agitation douce pendant 24 heures et à température ambiante. Puis, le processus d'acétylation est stoppé par l'ajout de 50 ml d'eau ultra pure UHQ. Ensuite le mélange est dialysé afin d'éliminer les ~o réactifs puis lyophilisé. Avant lyophilisation, le mélange est avantageusement congelé. De la sorte, on obtient un produit final contenant des oligomères d'acide galacturonique acétylés avec un rendement de 100 % par rapport aux oligomères de départ, c'est-à-dire que tous les oligomères présentent des substituant acétylés. 15 En revanche, on obtient en moyenne pour un premier cycle de traitement, 10 % d'acétylation, par rapport à toutes les substitutions possibles, sans diminution du degré de polymérisation dp. On pourra se référer au spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (1H RMN) illustré sur la Figure 1, lequel illustre le mode de calcul du taux 20 d'acétylation. En effet, le rapport de l'intégration des signaux 10 correspondants aux protons des acétates de la région allant de 2,5 à 3 ppm, à l'intégration des signaux 12 correspondants aux protons des résidus d'acide galacturonique de la région allant de 3,8 à 6 ppm permet de déterminer le taux d'acétylation. 25 Un deuxième cycle conduit à des oligomères d'acide galacturonique (OGA) acétylés à environ 30%. Le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton illustré sur la Figure 2, montre la progression des signaux 10 correspondants aux protons des acétates de la région, 2,5 à 3 ppm par rapport à ceux 12 de la région correspondant 30 aux résidus d'acide galacturonique, 3,8 à 6 ppm. Aussi, un troisième cycle conforme au premier cycle de traitement précité, conduit à des OGA acétylés à environ 40% sans modification du degré de polymérisation dp. Le spectre des molécules ainsi produites n'est en revanche pas représenté. Le taux d'acétylation des oligomères d'acide galacturonique auxquels ont fait subir le traitement du type précité est reproductible. Galacturonic acid oligomers are supplemented with acetic anhydride and the acetylation is very soft and non-denaturing, that is to say, it does not degrade the oligomers. Example 3: a treatment cycle To 1 g of galacturonic acid oligomers, 10 ml of 0.1 molar acetic anhydride are added in four portions. The mixture is then stirred gently for 24 hours and at room temperature. Then, the acetylation process is stopped by the addition of 50 ml UHQ ultra pure water. Then the mixture is dialyzed to remove o ~ reagents and lyophilized. Before lyophilization, the mixture is advantageously frozen. In this way, an end product is obtained containing acetylated galacturonic acid oligomers in 100% yield relative to the starting oligomers, that is to say that all the oligomers have acetyl substituents. On the other hand, on average, for a first treatment cycle, 10% acetylation is obtained, relative to all the possible substitutions, without decreasing the degree of polymerization dp. Reference may be made to the proton nuclear magnetic resonance spectrum (1H NMR) shown in FIG. 1, which illustrates the method of calculating the level of acetylation. This is because the ratio of the integration of the signals corresponding to the protons of the acetates of the region ranging from 2.5 to 3 ppm, to the integration of the signals 12 corresponding to the protons of the galacturonic acid residues of the region ranging from 3.8 to 6 ppm makes it possible to determine the level of acetylation. A second cycle results in approximately 30% acetylated galacturonic acid oligomers (OGA). The nuclear magnetic resonance spectrum of the proton shown in FIG. 2 shows the progression of the signals corresponding to the protons of the acetates of the region, 2.5 to 3 ppm relative to those of the region corresponding to the acid residues. galacturonic acid, 3.8 to 6 ppm. Also, a third cycle in accordance with the first treatment cycle mentioned above leads to approximately 40% acetylated OGAs without modifying the degree of polymerization dp. The spectrum of the molecules thus produced is not represented. The acetylation rate of the oligomers of galacturonic acid to which the treatment of the aforementioned type has been subjected is reproducible.
Exemple 4 Les oligomères d'acide galacturonique (OGA) ainsi obtenus, ont été appliqués à des micro-organismes pour en démontrer leurs activités. Ainsi, les OGA ont été introduits dans des milieux de culture inoculés par des bactéries à Gram positif (Staphylococcus aureus, Listeria innocuita) et to à Gram négatif (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa) à raison de 10' unités formant colonies (UFC) par millilitre pour E. coli, L. innoccua, S. aureus et S. typhimurium, et 5 x 10' UFC par millilitre pour P. aeruginosa. Le développement de ces micro-organismes en présence des OGA a été mis en oeuvre dans un mélange liquide 15 pendant 6 heures à 37 C sous agitation. La mesure de l'activité des oligomères d'acide galacturonique est faite par mesure de la densité optique du mélange à 600 nm. Les résultats présentés dans le tableau I ci-dessous correspondent à la moyenne de 4 essais distincts. La croissance des micro-organismes en présence des OGA est comparée à 20 un témoin sans OGA. Le pourcentage d'inhibition de croissance est déterminé par le rapport de la densité optique standard du témoin sans OGA à 600 nm moins la densité optique de l'essai, le tout divisé par la densité optique standard et multiplié par 100: DO600 Standard û DO600 essais / D0600 Standard x 100. Example 4 Galacturonic acid oligomers (OGA) thus obtained were applied to microorganisms to demonstrate their activities. Thus, OGAs were introduced into culture media inoculated with Gram-positive (Staphylococcus aureus, Listeria innocuita) and Gram-negative (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa) bacteria at 10 'colony forming units ( CFU) per milliliter for E. coli, L. innoccua, S. aureus and S. typhimurium, and 5 x 10 'CFU per milliliter for P. aeruginosa. The development of these microorganisms in the presence of OGAs was carried out in a liquid mixture for 6 hours at 37 ° C. with stirring. The measurement of galacturonic acid oligomer activity is measured by measuring the optical density of the mixture at 600 nm. The results presented in Table I below correspond to the average of 4 separate trials. The growth of microorganisms in the presence of OGAs is compared to a control without OGA. The percentage growth inhibition is determined by the ratio of the standard optical density of the non-OGA control at 600 nm minus the optical density of the assay, all divided by the standard optical density and multiplied by 100: DO600 Standard - DO600 tests / D0600 Standard x 100.
25 Tableau Il E. coli Pseudomonas Salmonella Staphylococcus Listeria OGADP 10.1 2 13.1 3 7.8 3 32.6 7 17.2 3 5-25 OGA DP 11.4 3 17.2 1 37.1 8 53.9 4 16.4 5 5-25 10%Ac OGA DP _ 25.0 6 25.5 6 27.5 4 8.4 5 5-25 13.6 5 40 % Ac Ainsi, il est montré que pour les micro-organismes Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, les oligomères d'acide galacturonique acétylés à un taux de 10 %, et présentant un degré de polymérisation compris entre 5 et 25, freinent le développement de ces micro-organismes avec une efficacité supérieure aux oligomères d'acide galacturonique non acétylés du même degré de polymérisation. Les fractions d'oligomères d'acide galacturonique (OGA) qui to réduisent de manière conséquente la croissance de bactéries pathogènes tel Staphylocoque et Pseudomonas, ainsi que Salmonella et qui présentent une faible activité vis-à-vis de Escherichia col/ présentent un grand intérêt pour l'alimentation humaine. En effet, si elles étaient incorporées à l'alimentation sous forme de compléments alimentaires par 15 exemple, elles pourraient réduire la croissance des pathogènes en ayant une très faible activité sur les saprophytes et Escherichia colt en particulier. À terme, il pourrait y avoir alors extinction de la flore pathogène. Par ailleurs, les OGA pourraient être exploités dans le domaine 20 des cosmétiques pour des applications cutanées. Dans ce cas, il y aurait comme dans le cas précédent diminution de la flore pathogène notamment des Staphylocoques et des Pseudomonas.Table II E. coli Pseudomonas Salmonella Staphylococcus Listeria OGADP 10.1 2 13.1 3 7.8 3 32.6 7 17.2 3 5-25 OGA DP 11.4 3 17.2 1 37.1 8 53.9 4 16.4 5 5-25 10% Ac OGA DP _ 25.0 6 25.5 6 27.5 4 8.4 5 5-25 13.6 5 40% Ac Thus, it is shown that for the microorganisms Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, galacturonic acid oligomers acetylated at a rate of 10%, and exhibiting a degree of polymerization of between 5 and 25, inhibit the development of these microorganisms with a higher efficiency than nonacetylated galacturonic acid oligomers of the same degree of polymerization. Fractions of galacturonic acid oligomers (OGA) which significantly reduce the growth of pathogenic bacteria such as Staphylococcus and Pseudomonas, as well as Salmonella, and which exhibit low activity with respect to Escherichia col / are of great interest. for human nutrition. Indeed, if they were incorporated into the diet as food supplements for example, they could reduce the growth of pathogens by having very low activity on saprophytes and Escherichia colt in particular. Ultimately, there may be extinction of the pathogenic flora. On the other hand, OGAs could be exploited in the field of cosmetics for cutaneous applications. In this case, there would be, as in the previous case, a decrease in the pathogenic flora, especially Staphylococci and Pseudomonas.