FR2908892A1

FR2908892A1 - Chromogenic determination of factor VIII:C activity, comprises adding substance comprising at least one metal ion except calcium ion, potentiating the determination of the factor VIII:C activity, identified as being present in plasma

Info

Publication number: FR2908892A1
Application number: FR0610181A
Authority: FR
Inventors: Jean Amiral; Anne Marie Vissac
Original assignee: Hyphen Biomed SAS
Current assignee: Hyphen Biomed SAS
Priority date: 2006-11-21
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2008-05-23
Anticipated expiration: 2026-11-21
Also published as: FR2908892B1

Abstract

Chromogenic determination of factor VIII:C activity, particularly in therapeutic fractions in which the determination of therapeutic test sample containing factor VIII:purified C/recombinant, which is achieved through providing reagents adding thrombin, factor IXa, phospholipids, calcium, factor X, buffer for sample dilution with albumin, chromogenic substrate specific to factor Xa and EDTA, comprises adding a substance potentiating the determination of the factor VIII:C activity, identified as being present in plasma, where the substance comprises at least one metal ion except calcium ion. An independent claim is included for a set for the chromogenic determination of the factor VIII:C activity especially in the therapeutic fractions for the implementation of the process comprising at least reagent comprising a reagent 1 (R1) containing human factor X in excess, a reagent 2 (R2) containing human factor IXa, thrombin, calcium and synthetic phospholipids in the form of micelles in constant and optimized quantities, where the R1 and R2 is in the combined potentially form, reagent 3 (R3) containing a specific chromogenic substrate factor Xa, reagent 4 (R4) containing a Tris-benzosulfonic acid (BSA) buffer for dilution of samples in the presence of albumin, 1% BSA and sodium azide made in the proper proportions, comprising at least the substance potentiating the determination of the activity of the factor VIII: C, where at least one of the substance potentiating the determination being identified as present in plasma comprising metal ion other than Ca2>+>.

Description

1 Procédé pour le dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C et1 Method for the chromogenic assay of the activity of factor VIII: C and

nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C, dans les plasmas ou les fractions thérapeutiques. necessary for chromogenic assay of factor VIII: C activity in plasmas or therapeutic fractions.

La présente invention concerne un procédé de dosage de l'activité du facteur de coagulation VIII :C ou Facteur Anti-Hémophilique A, en particulier dans des fractions thérapeutiques (extraites du plasma, hautement purifiées ou recombinantes). Ce procédé de dosage est rapide, fiable, reproductiblle et sensible, et permet de mesurer la totalité de l'activité de ce facteur VIII :C, de façon identique qu'il soit dans son environnement plasmatique ou non. L'invention concerne également un nécessaire de dosage de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans les fractions thérapeutiques pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention. The present invention relates to a method for assaying the activity of coagulation factor VIII: C or Anti-Hemophilic Factor A, in particular in therapeutic fractions (extracted from plasma, highly purified or recombinant). This assay method is rapid, reliable, reproducible and sensitive, and makes it possible to measure the totality of the activity of this factor VIII: C, in an identical manner whether it is in its plasma environment or not. The invention also relates to a kit for assaying the activity of factor VIII: C in particular in the therapeutic fractions for carrying out the process of the present invention.

Le processus de coagulation met en jeu de nombreux facteurs sanguins interagissant en cascade. L'un des facteurs essentiels de la coagulation est le facteur VIII :C. En effet, ce facteur VIII :C s'associe au facteur IX activé (IXa) et ce complexe VIII :C/IXa, en présence de calcium et de phospholipides, va permettre une activation du facteur X. Ce facteur X activé (Xa) va se complexer au facteur V et, en présence de phospholipides et de calcium, ce complexe va permettre de cliver la prothrombine en thrombine (facteur Ila) laquelle va à son tour permettre au fibrinogène de devenir de la fibrine. Cette fibrine sera un constituant principal du caillot de coagulation. Ce processus de coagulation est représenté de façon schématique sur la figure 1. The coagulation process involves many blood factors interacting in cascade. One of the essential factors of coagulation is factor VIII: C. Indeed, this factor VIII: C combines with activated factor IX (IXa) and this VIII: C / IXa complex, in the presence of calcium and phospholipids, will allow activation of factor X. This activated factor X (Xa) will complex with factor V and, in the presence of phospholipids and calcium, this complex will make it possible to cleave prothrombin into thrombin (factor IIa) which in turn will allow fibrinogen to become fibrin. This fibrin will be a main constituent of the coagulation clot. This coagulation process is shown schematically in Figure 1.

Dans le plasma, le facteur VIII :C est une protéine d'environ 230 [(Da constituée d'une chaîne polypeptidique lourde dans un complexe d'ions métalliques associée à une chaîne polypeptidique légère. Ce facteur VIII :C comporte six dornaines : Al-A2-B-A3-C1-C2. Dans la circulation sanguine, le facteur VIII :C est sous la forme d'un complexe avec une protéine de haut poids moléculaire (le Facteur von Willebrand, noté vWF) qui le stabilise. Un déficit en facteur VIII :C est observé dans l'hémophilie A ou la maladie de von Willebrand (par défaut de stabilisation). Cela se traduit par des épisodes hémorragiques cataclysmiques, contrôlés cliniquement grâce à 2908892 2 l'utilisation de concentrés thérapeutiques riches en facteur VIII :C (extrait du plasma, ou d'origine recombinante). On réalise fréquemment un dosage de l'activité du facteur de coagulation VIII :C du 5 plasma humain lors d'analyses sanguines pour le diagnostic de pathologies telles que l'hémophilie de type A ou la maladie de Willebrand, ou pour le suivi des traitements substitutifs (apportant du facteur VIII :C au patient). Lors de l'élaboration de médicaments ou de fractions thérapeutiques pour le traitement de telles pathologies sanguines, on doit également effectuer des dosages de l'activité du 10 facteur VIII :C purifié (extrait du plasma), ou d'un facteur VIII :C recombinant. Plusieurs techniques de dosage sont ainsi utilisées : des dosages par coagulation où on utilise du plasma substrat déficient en facteur VIII :C auquel on ajoute le plasma dilué à tester. On mesure le temps 15 de coagulation qui va être alors inversement proportionnel au taux de facteur VIII :C présent dans le plasma à tester. des dosages chromogéniques où on utilise des réactifs purifiés et un substrat chromogène spécifique du facteur de coagulation Xa. Le facteur VIII :C à doser (facteur limitant) est incubé avec du facteur IXa, des traces de 20 thrombine, du calcium, des phospholipides et du facteur X. Le complexe facteur IXaNIII :C/phospholipides et calcium formé, active le facteur X en facteur Xa, de façon dépendante du taux de facteur VIII :C. Ce facteur Xa formé est ensuite mesuré par son action sur le substrat chromogène spécifique du Xa. L'intensité de la coloration sera proportionnellle à l'activité du 25 Xa qui, elle-même, est corrélée à la concentration de facteur VIII :C activé dans l'échantillon. Les procédés de dosages chromogéniques existants fonctionnent selon le principe suivant : Divers réactifs apportent des facteurs de coagulation, des phospholipides, des ions Cal+ et un substrat chromogène spécifique d'un des facteurs de coagulation (ici, le facteur Xa). On ajoute soit du plasma humain contenant le facteur VIII :C, soit du facteur VIII :C purifié à partir de plasma humain, bovin ou autres ou un facteur VIII :C 30 2908892 3 recombinant. Ce facteur VIII :C apporté va activer une cascade métabolique jusqu'à l'activation du facteur X (facteur Xa). Cette quantité de facteur Xa sera proportionnelle au taux de facteur VIII :C apporté. On ajoute ensuite le substrat chromogène spécifique du facteur Xa avec de l'EDTA, un agent chélatant le Cal+ qui 5 arrête la cascade d'activation du Xa. Le substrat est constitué d'une séquence peptidique avec une séquence de stabilisation p-nitroanilide (pNA) incolore. Grâce au facteur Xa, un clivage va s'opérer entre la séquence peptidique et la séquence de stabilisation pNA laquelle sera alors détectable par colorimétrie avec une absorption à 405 nm. Cette coloration sera donc proportionnelle à la quantité de facteur Xa et 10 donc proportionnelle à la quantité de VIII :C ajoutée. La figure 2 illustre de façon schématique le principe de fonctionnement de ces procédés de dosages chromogéniques. Par conséquent, la qualité d'un procédé de dosage chromogénique est fonction de 15 sa grande précision dans la mesure colorimétrique corrélée à la quantité de facteur VIII :C activé, de sa sensibilité de détection, de sa reproductibilité ainsi que de sa rapidité de dosage. Les procédés de dosages chromogéniques existants se composent de la façon 20 suivante réactif 1 (R1) contenant du facteur X humain en excès. - réactif 2 (R2) contenant du facteur IXa humain, de la thrombine, du calcium et des phospholipides synthétiques sous forme de micelles en quantités constantes et optirnisées. 25 réactif 3 (R3) contenant un substrat chromogène spécifique du facteur Xa réactif 4 (R4) constitué par un tampon Tris-BSA de dilution des échantillons en présence d'albumine, 1% BSA et de l'azide de sodium. L'échantillon à doser contenant du facteur VIII :C (plasma humain, facteur VIII :C purifié ou recombinant). 30 Cette méthode chromogénique de dosage de l'activité du facteur VIII :C est en particulier référencée dans la Pharmacopée Européenne. 2908892 4 De tels réactifs R1 et R2 peuvent être mélangés dans un seul réactif. Toutefois, la durée de stabilité du réactif unique est inférieure à celle de l'utilisation de deux réactifs. 5 Les techniques de l'art antérieur visant à doser l'activité du facteur VIII :C dans des fractions thérapeutiques par dosage chromogène présentent l'inconvénient de ne pas être reproductibles, fiables et sensibles, en particulier pour le dosage des concentrés thérapeutiques de facteur VIII :C, très purifiés, et a fortiori les préparations de facteur VIII :C recombinantes. En effet, les résultats sont très 10 médiocres au niveau de la sensibilité. L'activité du facteur VIII :C est inférieure à très inférieure à ce qu'elle est dans un milieu plasmatique. Ainsi, pour chaque lot de facteur VIII :C purifié ou recombinant, un ré-étalonnage est nécessaire, augmentant ainsi le temps et le coût du dosage. 15 Lors du dosage d'échantillons thérapeutiques (tel que, par exemple, ceux connus sous la dénomination commerciale ReFacto commercialisée par les Laboratoires Wyeth), lorsque l'on ajoute une quantité donnée 1 de facteur VIII :C recombinant délété du domaine B dilué dans le tampon de dilution (réactif 4 (R4) décrit plus haut), on ne dose qu'une très faible activité de ce facteur VIII :C alors que, lorsque l'on 20 utilise la même quantité de ce facteur recombinant dans un plasma délété du facteur VIII :C, on dose toute l'activité biologique liée au facteur VIII :C recombinant. La figure 3 illustre ce résultat qui témoigne que, sans plasma, le dosage de l'activité du facteur VIII :C recombinant n'est pas sensible, ni fiable. 25 Le procédé de dosage chromogénique fait partie des méthodes de contrôle utilisées par les laboratoires pharmaceutiques produisant ces concentrés naturels ou recombinants de facteur VIII :C. Or, comme énoncé ci-dessus, il n'est: pas performant et il est important de pouvoir proposer un procédé de dosage chromogénique qui ne nécessite pas l'apport de plasma délété pour des impératifs de sécurité. 30 Par conséquent, le but à la base de l'invention est de pouvoir proposer un procédé de dosage chromogénique sensible et fiable in vitro du facteur de coagulation VIII :C contenu en particulier dans des fractions thérapeutiques en vue de réaliser des 2908892 5 médicaments correctement dosés en facteur VIII :C pour le traitement de pathologies telles que l'hémophilie de type A ou la maladie de von Willebrand. A cet effet, les inventeurs ont choisi de rechercher de quelle manière le plasma 5 pouvait jouer un rôle essentiel dans un tel dosage de l'activité du facteur VIII :C. Ils ont mené diverses études sur le plasma délété du facteur VIII :C. Ces études leur ont permis d'identifier au moins une substance plasmatique potentialisant: le dosage de l'activité du facteur VIII :C activant le facteur X en facteur Xa. 10 Ainsi, l'invention concerne un procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans des fractions thérapeutiques, dans lequel le dosage de l'échantillon thérapeutique à tester contenant le facteur VIII :C purifié ou recombinant est réalisé à l'aide de réactifs apportant au moins la thrombine, le facteur IXa, des phospholipides, du calcium, le facteur X, le tampon de dilution des 15 échantillons avec de l'albumine, le substrat chromogène spécifique du facteur Xa et I'EDTA, caractérisé en ce que ledit procédé de dosage comporte en outre une étape d'addition d'au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, cette substance étant identifiée comme étant présente dans le plasma, ladite substance étant constituée d'au moins un ion métallique à l'exception du Ca2+. 20 De préférence, la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma est au moins un ion métallique divalent positif autre que le Ca2+. 25 Le Ca2 est utilisé dans les dosages chromogéniques depuis plusieurs années. On a pu remarquer qu'il n'a cependant pas d'action potentialisatrice au sens de la présente invention. Cette au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, 30 et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma peut avantageusement être une combinaison d'au moins deux ions métalliques divalents portant deux charges positives. 2908892 6 De façon encore plus avantageuse, la présente invention concerne un procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C, en particulier dans les fractions thérapeutiques, fiable grâce à l'ajout d'au moins une substance potentialisant le dosage étant au moins un ion métallique divalent positif, autre que le 5 Cal+, complexé à au moins une protéine plasmatique telle que la céruloplasmine ou la glycoprotéine acide a1 (AGP), autrement appelée Glycoprotéine Alpha Acide, Glyco-Proteine Acide, Glyco-Proteine Alpha Acide, ou encore Orosomucoïde. En effet, des fractions du plasma de haut poids moléculaire (45 000 à 500 000 10 Daltons), potentialisent également le dosage de l'activité du facteur VIII :C, suggérant l'intervention de ladite substance sous forme d'un complexe entre le ou les ion(s) métallique(s) et diverses protéines ou substances du plasma. Dans ces modes de réalisation où la substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est un ion métallique divalent positif complexé à au moins une protéine plasmatique telle 15 que la glycoprotéine acide al (AGP) complexée au Cul+, la concentration nécessaire dudit ion métallique est très faible, de l'ordre de 1 pg/ml de complexe soit moins de 0,1 pg de Cul+. Ainsi, de manière avantageuse, à partir des fractions thérapeutiques diluées dans un 20 tampon R4 tel que défini précédemment, la caractéristique principale de la présente invention est la potentialisation du procédé de dosage et sa sensibilité accrue dans un contexte sans plasma grâce à l'ajout, dans le milieu de dosage de l'activité du facteur VIII :C, d'au moins une substance identifiée comme présente dans le plasma. La au moins une substance de potentialisation est de préférence ajoutée au tampon 25 R4 qui est alors appelé le tampon R4+. Le procédé objet de l'invention propose donc de doser par une méthode chromogénique l'activité du facteur VIII :C dans des fractions thérapeutiques pour la réalisation de médicaments en mettant en oeuvre l'addition d'une substance 30 complémentaire qui confère alors au procédé l'avantage de pouvoir être réalisé de façon manuelle ou automatisée, de manière fiable même sur des fractions thérapeutiques. Dans la mesure où cette substance est identifiée comme présente dans le plasma, elle peut être extraite du plasma ou provenir de toute autre source, 2908892 7 et être intégrée au niveau des réactifs permettant la mise en oeuvre du procédé de dosage sans avoir recours à du plasma lui-même. Pour la fabrication de médicaments visant à soigner des pathologies sanguines telles 5 que l'hémophilie A ou la maladie de von Willebrand, des fractions thérapeutiques riches en facteur VIII :C sont préparées. Ces fractions contiennent essentiellement du facteur VIII :C purifié à partir de plasma ou du facteur VIII :C recombinant. Les facteurs VIII :C peuvent être purifiés à partir de plasma humain, porcin ou autres. En règle générale, le facteur VIII :C humain est utilisé en thérapeutique. 10 Plusieurs types de facteurs VIII :C purifiés à partir de plasma existent : - le concentré de facteur VIII :C, riche en facteur de von Willebrand (vWF), qui le stabilise. II est par ailleurs très difficile de séparer le facteur VIII :C du vWF lors de l'extraction plasmatique, les deux protéines étant très solidement associées. 15 Ce facteur de Willebrand est une glycoprotéine multimérique de 1000 à 20000 KDa. se complexant au facteur VIII non activé mais pas au facteur VIII :C activé. Cette liaison permet une stabilisation du facteur VIII :C et une augmentation de sa demi-vie dans la circulation sanguine. La concentration molaire en vWF est toujours très largement en excès par rapport à celle du facteur VIII :C (de 10 à plus de 100 fois 20 supérieure). Dans le plasma, par exemple, il y a 0.1 pg/ml de facteur VIII :C pour 10 pg/ml de vWF. le facteur VIII :C très pur qui est obtenu à partir d'un plasma passé au travers d'une colonne d'affinité pourvue d'un anticorps monoclonal spécifique du 25 facteur VIII :C. Les facteurs VIII :C recombinants sont de plusieurs types : le facteur VIII :C recombinant complet (rec-VIII :C) avec les six domaines A1-A2-B-A3-C1-C2 du facteur VIII :C natif. 30 le facteur VIII :C recombinant dépourvu du domaine B (B domainless FVIII :C) que l'on peut trouver dans le commerce sous la dénomination commerciale ReFacto (laboratoires Wyeth). Ce facteur VIII :C recombinant dépourvu du domaine B possède la même activité que le facteur VIII :C natif et la même absence d'immunogénicité chez le patient. De 2908892 8 plus, il est très intéressant d'utiliser un tel composé pour des traitements car sa rapidité d'action est cent fois supérieure à celle observée avec le composé recombinant natif et le rendement de production est vingt fois supérieur en comparaison à la production du facteur VIII :C dans sa structure nativeä Pour l'élaboration de médicaments, plusieurs étapes de contrôle sont indispensables avant une mise sur le marché de ce médicament. Parmi ces tests, la quantité de facteur VIII :C contenue dans un échantillon est dosée. 10 Comme déjà évoqué, la qualité d'un procédé de dosage chromogénique est fonction de sa grande précision dans la mesure colorimétrique corrélée à la quantité de facteur VIII :C activé, de sa sensibilité de détection, de sa reproductibilité ainsi que de sa rapidité de dosage. Le procédé de dosage proposé selon la présente invention réunit toutes ces qualités et notamment une sensibilité nettement supérieure à celle 15 obtenue avec les procédés de l'art antérieur. En effet, après de nombreuses études fines de filtration et d'identification, cette sensibilité accrue a été obtenue grâce à l'ajout d'au moins une substance dans le procédé de dosage chrornogénique selon l'invention. Cette au moins une substance 20 potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est choisie notamment parmi au moins une substance ionique métallique, autre que le Cal+, présente dans le plasma. Cette substance ionique métallique est choisie parmi celles exposant deux charges positives telles que le Cul+ et ses sels, le Zn2+ et ses sels, le Mn 2+ et ses sels, le Mg2+ et ses sels, le Lie+ et ses sels, ou d'autres ions métalliques et leurs sels 25 ayant des propriétés équivalentes à ceux-ci, à l'exception du Cal+ et ses sels. De plus, cette substance potentialisant le dosage peut être une combinaison de plusieurs ions métalliques divalents positifs telle qu'une combinaison du Cul+ et du Zn2+, du Cul+ et du Mn2+, du Cul+ et du Mg2+ , du Zn2+ et du Mn 2+ ou d'autres 30 combinaisons de deux, trois ou plus d'ions métalliques. D'autre part, cette substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma peut être avantageusement au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+ complexé à au moins une protéine 5 2908892 9 plasmatique capable d'interagir avec des ions métalliques divalents positifs. De telles protéines peuvent être I'AGP ou la céruloplasmine. De façon plus préférentielle, l'activité optimale est obtenue avec comme substances 5 potentialisant le dosage, une concentration définie de Cul+, additionnée d'une petite quantité de Zn2+ et de traces d'AGP. Cette combinaison semble permettre la présentation du facteur VIII :C dans sa forme la plus active. La présente invention porte donc également sur un procédé de dosage chromogénique cle l'activité du facteur VIII :C, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de 10 l'activité du facteur VIII :C est en majorité du Cul+, le reste étant du Zn2+ complexés à des traces d'AGP. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C est réalisé avec une majorité de cuivre 15 Cul+, le reste étant du Zn2+ et des traces de céruloplasmine. Dans d'autres modes de réalisations, le zinc utilisé en petites quantités est remplacé soit par du Mn2+, du Mg2+, du Lie+ ou un autre ion métallique divalent positif 20 II est rappelé que diverses protéines ou substances plasmatiques sont capables de fixer les ions divalents positifs. Ainsi de telles protéines plasmatiques comme l'AGP ou la céruloplasmine peuvent fixer un ou plusieurs ions métalliques tels que le Mn2+, le Mg2+, le Lie+ ou d'autres ions ayant des propriétés équivalentes. 25 Pour les dosages des fractions thérapeutiques particulièrement, la présente invention permet de pallier également aux défauts des techniques antérieures : le dosage selon la présente invention permet d'être réalisé sur la fraction thérapeutique en mesurant son activité physiologique réelle, et avec un étalonnage reproductible, et 30 ceci avec une réalisation plus simple en comparaison aux dosages réalisés dans l'art antérieur. En effet, la présente invention permet de détecter de façon reproductible et fiable, avec un niveau de sensibilité accru. 2908892 10 Lors de leurs recherches en filtration, les inventeurs ont observé un dosage nettement plus fiable et sensible lorsque la substance potentialisant le dosage est le cuivre ou ses sels ou une protéine capable d'interagir avec le cuivre telle que notamment la glycoprotéine acide al (AGP) ou la céruloplasmine additionnées ou 5 non du zinc Zn2+. La au moins une substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C et présente dans le plasma peut être obtenue à partir de plasma humain, bovin ou de toute autre origine. Les réactifs utilisés pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention 10 sont ceux décrits plus haut, déjà utilisés dans l'art antérieur et connus de l'homme du métier à savoir les réactifs appelés ici RI, R2 (ou une combinaison des réactifs R1 et R2), R3, R4 tels que définis précédemment apportant en quantités adéquates au moins la thrombine, le facteur IXa, des phospholipides, du calcium, le facteur X, le tampon de dilution des échantillons avec de l'albumine, le substrat chromogène 15 spécifique du facteur Xa et l'EDTA. De plus, dans la méthode de dosage manuelle, en point final , d'autres réactifs et matériels habituels et connus de l'homme du métier peuvent être nécessaires tels que l'eau distillée stérile, l'acide acétique à 20% ou l'acide citrique à 2%. Lors des 20 calibrations du facteur VIII :C, il est également utilisé des plasmas ou fractions concentrées en facteur VIII :C comme matériel de référence et lors des contrôles, des plasmas ou des fractions thérapeutiques dosées précisément par rapport au matériel de référence sont employés. Ces calibrations et contrôles sont établis par rapport aux standards internationaux ou de la pharmacopée. 25 Comme nous l'avons dit précédemment, le procédé de dosage est plus fiable lorsque l'on ajoute au moins une substance potentialisant ce dosage de l'activité du facteur VIII :C et cette au moins une substance est constituée de préférence par du cuivre ou ses sels et ceci dans des proportions optimales comprises entre 5 pg/ml et 50 30 pg/ml. Lorsque le zinc Zn2+ est utilisé en tant que au moins une substance potentialisant le dosage, ses proportions sont comprises entre 0.5 tag/ml et 25 pg/ml. 2908892 11 Lorsque le dosage est réalisé avec une protéine plasmatique, telle que l'AGP ou la céruloplasmine, en tant que substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, les proportions de protéine plasmatique sont comprises entre 0.1 pg/ml et 100 pg/ml. Ainsi, lorsque le dosage est réalisé avec la glycoprotéine acide al (AGP) en tant que substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, les proportions optimales d'AGP sont comprises entre 0.25 pg/ml et 2 pg/ml. 10 Les proportions optimales dans les dosages utilisant la céruloplasmine sont comprises entre 0.1 et 10 pg/ml. Lorsque la substance potentialisant le dosage du facteur VIII :C est une combinaison de Cul+, de Zn2+ complexés à des traces d'AGP, les concentrations utilisées pour le 15 dosage sont de l'ordre d'environ 15 pg/ml de Cul+, 0,5 à 5 pg/ml de Zn2+ et environ 1 pg/ml d'AGP. Cependant, ces quantités relatives doivent être optimisées pour la plus grande fiabilité du dosage. 20 D'autres sources testées (milieux biologiques ou non) ont également un effet potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C dans les fractions thérapeutiques. Il s'agit notamment des urines et du jus d'orange dans lesquels on retrouve également les substances potentialisantes présentes également dans le plasma. De même, le cuivre provenant d'oligosol ou de granules disponibles en 25 pharmacie (granions) ou du cuivre associé à l'AGP ou à la céruloplasmine est utilisable dans le procédé selon la présente invention. Cette dernière expérimentation ne montre pas de grandes différences dans les résultats en comparaison avec la céruloplasmine seule car cette protéine porte déjà 95% du cuivre circulant dans le sang. Les résultats de dosage obtenus avec de tels composés sont très satisfaisants 30 et plus fiables qu'avec les procédés de dosage de l'art antérieur. Le pH est également un facteur influent pour la sensibilité du dosage. Tous les dosages seront effectués avec un pH proche de 7.2 et à 37 C, ce qui équivaut aux conditions physiologiques. 5 2908892 12 La figure 4 illustre les courbes dose-réponse obtenues lors du dosage de l'activité du facteur VIII :C dans différents types d'échantillons avec ajout ou non d'au moins une substance potentialisant le dosage, telle que décrite précédemment. Sur la figure 4, 5 Tampon R4+ signifie que la au moins une substance potentialisant le dosage a été ajoutée au réactif de dilution 4 (R4) dans la mise en oeuvre du procédé. Cependant, cette au moins une substance peut être ajoutée dans l'un des réactifs du dosage (RI, R2, R3 ou R4) tels que cités précédemment mais elle peut également être ajoutée isolément. Les échantillons dosés apparaissant sur la figure 4 sont : 10 - le ReFacto, un facteur VIII :C recombinant décrit précédemment (noté VIII refacto sur la figure 4) le facteur VIII :C de la société Octapharma, qui est un facteur VIII :C d'extraction purifié par affinité à partir de plasmas (noté VIII octapharma sur la figure 4) 15 un Plasma pool Pontoise qui équivaut à un plasma normal. Chaque courbe permet d'illustrer que le dosage est plus sensible lorsque le R4+ est utilisé c'est-à-dire lorsque la au moins une substance de potentialisation est ajoutée dans le procédé de dosage de l'activité du facteur VIII :C selon la présente invention. 20 Des résultats identiques non montrés ont été obtenus lorsque la au moins une substance potentialisant le dosage telle que décrit précédemment a été ajoutée seule ou à l'un des réactifs RI, R2 ou R3 et à différentes étapes du procédé. Dans ces courbes de dosage chromogène, les pourcentages utilisés correspondent 25 à des valeurs relatives. Les valeurs données intègrent les dilutions utilisées pour le dosage. Le taux de 200% dans le dosage chromogène utilisé correspond à l'activité du facteur VIII :C dans le plasma pool Pontoise (plasma normal) ou le Refacto ou le facteur VIII :C purifié de la société Octapharma respectivement diilué à 1/20. La dilution standard du dosage chromogène étant le 1/40, un pool de plasma normal ou 30 le Refacto ou le facteur VIII :C purifié de la société Octapharma respectivement dilué à 1/40 correspond alors au point 100% de facteur VIII :C. Dans un plasma normal non dilué, la concentration de facteur VIII :C est comprise entrel00 à 200 ng/ml. Pour un concentré en facteur VIII :C, il est d'usage de faire au préalable une pré-dilution pour amener la concentration en facteur VIII :C dudit concentré à une 2908892 13 concentration comprise entre 100 ng/ml et 200 ng/ml , la concentration en facteur VIII :C d'un plasma normal non dilué, puis d'appliquer la dilution du dosage à 1/40 ou d'autres dilutions appropriées. 5 Pour réaliser un dosage fiable et reproductible, une gamme d'étalonnage est réalisée à l'aide d'un plasma calibrateur de concentration définie précisément. Ces techniques de réalisation d'une gamme d'étalonnage sont bien connues de l'homme du métier. 10 Les exemples de réalisation de l'invention ne sont fournis qu'à titre illustratif et ne sauraient en aucun cas limiter la portée de l'invention. En effet, par exemple, un tel procédé de dosage de l'activité du facteur VIII :C selon la présente invention peut bien entendu être utilisé pour doser le facteur VIII :C du plasma humain à tester, en particulier lors d'utilisation de dilutions importantes. 15 La présente invention concerne également un nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur de coagulation VIII :C en particulier dans les fractions thérapeutiques. Ce nécessaire fonctionne selon le procédé de dosage de la présente 20 invention. II est constitué au moins des réactifs (R1 à R4, avec une combinaison possible des réactifs R1 et R2) décrits précédemment pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention et apportés dans les proportionsadéquates. De plus, ce nécessaire est caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une 25 substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, ladite au moins une substance étant identifiée comme présente dans le plasma et étant constituée d'au moins un ion métallique autre que le Cal+. 30 Elle peut être obtenue à partir de plasma humain, bovin ou d'autres origines mais elle peut également être obtenue à partir de tout autre milieu, biologique ou non, pouvant la contenir tels que des urines ou des oligosols, ou des granions. La substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C est au moins une substance étant identifiée comme une substance ionique métallique divalente 2908892 14 positive autre que le Cal+. Cette au moins une substance ionique métallique potentialisant le dosage est choisie parmi celles exposant deux charges positives telles que le Cul+ ou ses sels, le Zn2+ et ses sels, le Mn 2+ et ses sels, le Mg2+ et ses sels, le Lie+ et ses sels, ou d'autres ions métalliques ayant des propriétés 5 équivalentes à ceux-ci, à l'exception du Cal+ et ses sels. De plus, cette substance potentialisant le dosage peut être une combinaison de plusieurs ions métalliques divalents portant deux charges positives, telle qu'une combinaison du Cul+ et du Zn2+, du Cul+ et du Mn2+, du Cul+ et du Mg2+ , du Zn2+ et 10 du Mn 2+ ou d'autres combinaisons de deux, trois ou plus d'ions métalliques. D'autre part, cette substance potentialisant le dosage de l'activité du facteur VIII :C, et identifiée comme étant une substance présente dans le plasma peut être avantageusement au moins un ion métallique divalent positif autre que le Cal+ complexé à au moins une protéine plasmatique capable d'interagir avec des ions 15 métalliques divalents positifs. De telles protéines peuvent être l'AGP ou la céruloplasmine. De façon préférentielle, l'activité optimale dans ce nécessaire de dosage chromogénique, est obtenue avec comme substances potentialisant le dosage, une 20 majorité de Cul+, le reste étant du Zn2+ et de traces d'AGP. Cette combinaison semble permettre la présentation du facteur VIII :C dans sa forme la plus active. La présente invention porte donc également sur un nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C en particulier dans des fractions thérapeutiques, caractérisé en ce que la substance potentialisant le dosage de 25 l'activité du facteur VIII :C est une majorité de Cul+, le reste étant du Zn2+ et des traces d'AGP. Dans un autre mode réalisation de l'invention, le nécessaire de dosage utilisant le procédé de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C est réalisé avec 30 une concentration définie de Cul+ associée à de faibles quantités de Zn2+ et des traces de céruloplasmine. Dans d'autres modes de réalisations, le zinc utilisé en petites quantités est remplacé soit par du Mn2+, du Mg2+, du Lie+ ou un autre ion métallique divalent positif. 2908892 15 Il est rappelé que diverses protéines ou substances plasmatiques sont capables de fixer les ions métalliques divalents positifs. Les quantités relatives apportées de chacune des substances potentialisant le 5 dosage de l'activité du facteur VIII :C dans ce nécessaire sont identiques à celles utilisées dans le procédé de dosage décrit en première partie de la présente demande. Ledit nécessaire de dosage chromogénique de l'activité du facteur VIII :C selon la 10 présente invention est caractérisé en ce que la au moins une substance potentialisant le dosage est obtenue à partir de plasma humain ou anirnal. De plus, cette au moins une substance potentialisant le dosage selon la présente invention est obtenue à partir d'un milieu biologique la contenant tel que l'urine mais 15 elle peut également être obtenue à partir d'un milieu non biologique la contenant tel que le jus d'orange ou des gravions. Le nécessaire non utilisé se présente dans une forme lyophilisée à reconstituer avec 20 de l'eau distillée, stérile de préférence, dans des proportions et les conditions précisées dans les exemples de réalisation de l'invention. Les résultats de dosage de l'activité du facteur VIII :C dans les plasmas ou les fractions thérapeutiques sont exprimés en pourcentage ou en Unités Internationales 25 (UI), 1 Unité Internationale étant la teneur dans 1 ml de plasma normal, tel que défini dans les standards internationaux (WHO/NIBSC). Exemple de réalisation 30 Par définition, un pool de plasmas normaux correspond à 100% de facteur VIII :C. La dilution standard du dosage étant le 1/40, cette dilution au 1/40 correspond alors à 100% de facteur VIII :C et la dilution au 1/20 à 200%. Ceci sera rappelé plus loin dans la partie étalonnage. Dans ces conditions de dosage, 200% équivaut à environ 5 à 10 ng/ml de facteur VIII :C dans le pool de plasmas. 2908892 Réactifs : RI : Réactif 1 : Facteur X humain 5 Facteur X humain, lyophilisé en présence d'un inhibiteur de polymérisation de la fibrine 2 flacons (à reconstituer par 2,5 ml d'eau distillée). R2 : Réactif 2 : Réactif activateur (IXa û Thrombine û Calcium û Phospholipides) 10 Facteur IXa humain, en quantité constante et optimisée, contenant de la thrombine humaine, du calcium et des phospholipides synthétiques, lyophilisé : 2 flacons (à reconstituer par 2,5 ml d'eau distillée). R3 : Réactif 3 : SXa-11 15 Substrat chromogène spécifique du facteur Xa (SXa-11), lyophilisé : 2 flacons de 15 mg(à reconstituer par 2,5 ml d'eau distillée). R4 : Réactif 4 : Tampon Tris-BSA Tampon Tris - BSA, prêt à l'emploi. Contient 1% de BSA et de l'azide de sodium. (4 20 flacons de 25 ml). La substance de potentialisation du dosage selon l'invention peut être ajoutée seule ou à l'un de ces réactifs lors du dosage. De préférence, cette substance telle l'ion Cul+ est ajoutée dans une concentration comprise dans la plage de 5 pg/ml à 50 25 pg/ml au réactif 4 (R4) qui est alors nommé réactif 4+ (R4+). Réactifs et matériels nécessaires mais non fournis : Réactifs : Eau distillée. 30 Acide acétique (20%) ou acide citrique 2% (méthode en point final ). Plasmas de calibration (fournis par la Société Hyphen Biomed sous le nom BIOPHEN Plasma Calibrator et sous la référence 222101)). Plasmas contrôles normaux ou anormaux (fournis par la Société Hyphen Biomed sous le nom BIOPHEN Normal Control Plasma avec la référence 16 2908892 17 223201 et sous le nom BIOPHEN Abnormal Control Plasma avec pour référence 223301). Matériels : Spectrophotomètre ou automates pour dosages chromogéniques, à 405nm. 5 -Chronomètre. - Pipettes calibrées. Conservation : Les réactifs non encore utilisés doivent être conservés à 2-8 C, dans leur coffret 10 d'origine. Ils sont alors stables jusqu'à la date d'expiration indiquée sur l'étiquette. Préparation et stabilité des réactifs : RI : Réactif 1 : Facteur X humain 15 reconstituer chaque flacon par exactement 2,5 ml d'eau distillée. Laisser stabiliser 30 minutes à température ambiante (18-25 C). Agiter délicatement avant utilisation. Stabilité du facteur X reconstitué, conservé dans son flacon d'origine : ^ 72 heures à 2-8 C. 20 ^ 24 heures à température ambiante (18-25 C). ^ Ne pas congeler. R2 : Réactif 2 : Réactif activateur Reconstituer chaque flacon par exactement 2,5 ml d'eau distillée. 25 Laisser stabiliser 30 minutes à température ambiante (18-25 C). - Agiter délicatement avant utilisation. Stabilité du flacon reconstitué, conservé dans son flacon d'origine : ^ 72 heures à 2-8 C. ^ 24 heures à température ambiante (18-25 C). 30 ^ Ne pas congeler. R3 : Réactif 3 : Substrat chromogène spécifique du facteur Xa (SXaù11) -Reconstituer chaque flacon par exactement 2,5 ml d'eau distillée. 2908892 18 Laisser stabiliser la solution 30 minutes à température ambiante (18-25 C), en agitant de temps en temps. Bien agiter lors de la reconstitution (vortex) jusqu'à dissolution complète. Bien homogénéiser avant toute utilisation. 5 Stabilité du substrat reconstitué, conservé dans son flacon d'origine : ^ 3 mois à 2-8 C. ^ 7 jours à température ambiante (18-25 C). ^ Ne pas congeler. 10 R4 : Réactif 4 : Tampon TrisBSA Tampon prêt à l'emploi (25 ml par flacon). Agiter avant emploi. Ce réactif est stable jusqu'à la date de péremption, conservé à 2-8 C, à l'abri de toute contamination. 15 La substance de potentialisation du dosage selon l'invention est alors ajoutée seule ou à l'un de ces réactifs lors du dosage. De préférence, cette substance telle l'ion Cul+ est ajoutée dans une concentration comprise dans la plage de 5 pg/ml à 50 pg/ml au réactif 4 (R4) qui est alors nommé réactif 4+ (R4+). 20 Précautions : Pour assurer une bonne stabilité des réactifs, refermer les flacons après usage, avec leurs bouchons respectifs (capsule verte pour le facteur X (RI) rouge pour le mélange activateur avec IXa (R2), capsule jaune pour le 25 substrat SXa-11 (R3), et bouchon blanc pour le tampon (R4+)). Manipuler les réactifs avec précautions d'usage afin d'éviter toute contamination. Si le substrat jaunit, ceci indique la présence d'une contamination. II doit être rejeté et un nouveau flacon doit être utilisé. 30 Nota : Les flacons R1, R2 et R3 sont lyophilisés sous vide ; retirer délicatement le bouchon de lyophilisation pour s'affranchir de toute perte du produit à l'ouverture du flacon. 2908892 19 Suivant la méthode automatique utilisée , les réactifs peuvent être reconstitués avec des volumes différents de ceux indiqués. Dans tous les cas, les rapports respectifs de chaque réactif, R1, R2 et R3, préconisés dans la méthode manuelle (concentration finale dans le milieu réactionnel et volume 5 total), doivent être respectés. Utiliser uniquement les réactifs d'un même lot de coffrets. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots de coffrets pour réaliser un dosage. Les réactifs R1, R2 et R3 sont optimisés pour chaque lot de coffrets. Les études de vieillissement, réalisées à 30 C pendant 3 semaines, montrent 10 que les réactifs peuvent être expédiés à température ambiante, sans aucun dommage. Etalonnage : 15 Gamme haute (0 à 200%)_ La gamme haute est réalisée à l'aide d'un plasma calibrateur, de concentration ( C) en facteur VIII :C précisément définie, ou d'un pool de plasma citratés normaux (au moins 30 individus normaux, hommes et femmes, de 18 à 55 ans, sans traitement ou 20 pathologie connue), qui par définition titre 100% de facteur VIII :C. Le coffret BIOPHEN Plasma Calibrator, commercialisé par la société Flyphen BioMed sous la référence 222101,, peut être utilisé pour obtenir la gamme d'étalonnage. Le dosage intègre une dilution du plasma au 1/40. La dilution du plasma au 1/40 représente par définition 100% de facteur VIII :C. La gamme d'étalonnage va de 0 à 25 200% de facteur VIII :C. La dilution au 1/20 (en tampon Tris-BSA (R4+)) représente 200% de facteur VIII :C. Pour un calibrateur titrant C, le taux de 200% (dans les conditions du dosage) est obtenu en diluant ce calibrateur par le facteur suivant : 20 x (C) / 100. 30 A partir de cette solution, faire la gamme d'étalonnage suivante dans le diluant R4 + : % facteur VIII :C Etalon 200% facteur VIII :C ( l) Tampon Tris-BSA (R4+) ( l) 0 0 500 2908892 20 50 125 375 100 250 250 200 500 0 Pour les concentrés de facteur VIII :C, l'échantillon à tester doit être pré-dilué en R4+ de façon à cibler une concentration de facteur VIII :C inférieure à 2UI/ml. Il est recommandé d'effectuer une pré-dilution, afin d'amener la concentration théorique de 5 facteur VIII :C entre 0,2 et 2 UI/ml, puis une dilutionl/40 pour la réalisation du test. La concentration en facteur VIII :C attendue se situe ainsi entre 20 et 200%. Gamme basse (0 à 25%) 10 L'étalonnage peut être réalisé à l'aide d'un pool de plasmas citratés normaux ou d'un calibrateur commercial à taux de facteur VIII :C connu, soit C. Diluer ce plasma avec du plasma déficient en facteur VIII :C (commercialisé sous la référence DPO40A/K par la société Hyphen BioMed) de façon à obtenir un taux de 25% (le facteur de dilution en plasma déficient en facteur VIII :C est de 4 pour un pool normal, ou de 4 x 15 C/100 pour le calibrateur avec un taux C). Le dosage intègre une dilution du plasma au 1/10. La gamme d'étalonnage va de 0 à 25% de facteur VIII :C. La dilution au 1/10 (en tampon Tris-BSA (R4+)) représente 25% de facteur VIII :C. A partir de cette dilution faire la gamme d'étalonnage suivante dans le diluant R4 + : 20 fo Etalon 200% facteur VIII :C ( l) Tampon Tris-BSA (R4+) ( l) facteur VIII :C 0 0 500 6,25 125 375 12,5 250 250 25 500 0 ^ Réaliser la gamme d'étalonnage extemporanément afin d'éviter toute dégradation du facteur VIII :C. 25 Mode opératoire : 2908892 Méthode manuelle : Gamme haute : Diluer les échantillons à tester et les contrôles au 1/40 en tampon Tris-BSA (R4+). Pour les concentrés thérapeutiques où le facteur VIII :C est recherché, cibler une concentration en facteur VIII :C comprise entre 0,005 et 0,050 UI/ml dans une dilution finale (soit environ 20 à 200% de facteur VIII :C selon ce protocole opératoire) Gamme basse : Diluer les échantillons à tester et les contrôles au 1/10 en tampon Tris-BSA (R4+). Dans les puits d'une microplaque ou dans des tubes plastique incubé à 37 C, introduire : Réactifs Microplaque Tube plastique Calibrateur ou échantillons dilués à tester ou 50 l 100 l contrôles RI : Facteur X, préincubé à 37 C 50 100 R2 : Mélange IXa, préincubé à 37 C 50 l 100 l Mélanger et incuber à 37 C, pendant 5 minutes puis introduire : R3 : Substrat SXa-11 préincubé à 37 C 50 l 100 l Mélanger et incuber à 37 C, pendant 5 minutes exactement Arrêter la réaction en introduisant : Acide citrique (20g/L) ou 20% d'acide acétique 50 l 100 l Mélanger et mesurer la densité optique à 405 nm contre le blanc correspondant La couleur jaune obtenue stable pendant 2 heures. Le blanc échantillon est obtenu par mélange des réactifs dans l'ordre inverse de celui du test: Acide Citrique (20g/L), substrat SXa-11, échantillon dilué, facteur X, 20 In plasma, factor VIII: C is a protein of approximately 230 [(Da consisting of a heavy polypeptide chain in a complex of metal ions associated with a light polypeptide chain. This factor VIII: C has six domains: Al -A2-B-A3-C1-C2 In the bloodstream, factor VIII: C is in the form of a complex with a high molecular weight protein (von Willebrand factor, noted vWF) which stabilizes it. Factor VIII: C deficiency is observed in haemophilia A or von Willebrand disease (by default of stabilization). This results in cataclysmic bleeding episodes, clinically controlled through 2908892 2 the use of therapeutic concentrates rich in factor VIII: C (extracted from plasma, or of recombinant origin) Assay for the activity of coagulation factor VIII: C of human plasma is frequently performed in blood tests for the diagnosis of pathologies such as hemophilia. type A or Wi disease llebrand, or for monitoring replacement therapy (providing factor VIII: C to the patient). When developing drugs or therapeutic fractions for the treatment of such blood pathologies, assays should also be performed for the activity of purified factor VIII: C (extracted from plasma), or factor VIII: C. recombinant. Several assay techniques are thus used: assays by coagulation in which substrate plasma deficient in factor VIII: C is used, to which the diluted plasma to be tested is added. The coagulation time is measured, which will then be inversely proportional to the level of factor VIII: C present in the plasma to be tested. chromogenic assays using purified reagents and a chromogenic substrate specific for coagulation factor Xa. Factor VIII: C to be assayed (limiting factor) is incubated with factor IXa, traces of thrombin, calcium, phospholipids and factor X. The factor IXaNIII: C / phospholipids and calcium complex formed activates factor X in factor Xa, depending on the level of factor VIII: C. This factor Xa formed is then measured by its action on the chromogenic substrate specific for Xa. The intensity of the staining will be proportional to the activity of Xa which itself correlates with the concentration of activated factor VIII: C in the sample. The existing chromogenic assay methods operate according to the following principle: Various reagents provide coagulation factors, phospholipids, Cal + ions and a chromogenic substrate specific to one of the coagulation factors (here, factor Xa). Either human plasma containing factor VIII: C or factor VIII: C purified from human, bovine or other plasma or a recombinant factor VIII: C is added. This factor VIII: C provided will activate a metabolic cascade until the activation of factor X (factor Xa). This amount of factor Xa will be proportional to the level of factor VIII: C provided. The factor Xa specific chromogenic substrate is then added with EDTA, a Cal + chelating agent which stops the Xa activation cascade. The substrate consists of a peptide sequence with a colorless p-nitroanilide (pNA) stabilization sequence. Thanks to factor Xa, a cleavage will take place between the peptide sequence and the pNA stabilization sequence which will then be detectable by colorimetry with absorption at 405 nm. This coloring will therefore be proportional to the amount of factor Xa and therefore proportional to the amount of VIII: C added. FIG. 2 schematically illustrates the operating principle of these chromogenic assay methods. Therefore, the quality of a chromogenic assay method depends on its high accuracy in colorimetric measurement correlated with the amount of activated factor VIII: C, its detection sensitivity, its reproducibility as well as its assay speed. . Existing chromogenic assay methods consist of Reagent 1 (R1) containing excess human factor X as follows. - reagent 2 (R2) containing human factor IXa, thrombin, calcium and synthetic phospholipids in the form of micelles in constant and optimized quantities. Reagent 3 (R3) containing a chromogenic substrate specific for Reactive Factor Xa 4 (R4) consisting of a Tris-BSA buffer for diluting the samples in the presence of albumin, 1% BSA and sodium azide. The sample to be assayed containing factor VIII: C (human plasma, purified or recombinant factor VIII: C). This chromogenic method of assaying the activity of factor VIII: C is in particular referenced in the European Pharmacopoeia. 2908892 4 Such reagents R1 and R2 can be mixed in a single reagent. However, the stability time of the single reagent is less than that of using two reagents. The techniques of the prior art aiming to assay the activity of factor VIII: C in therapeutic fractions by chromogenic assay have the drawback of not being reproducible, reliable and sensitive, in particular for the assay of therapeutic factor concentrates. VIII: C, highly purified, and a fortiori the recombinant factor VIII: C preparations. Indeed, the results are very poor in terms of sensitivity. Factor VIII: C activity is less than much less than it is in a plasma environment. Thus, for each batch of purified or recombinant factor VIII: C, recalibration is necessary, thus increasing the time and cost of the assay. When assaying therapeutic samples (such as, for example, those known under the trade name ReFacto marketed by Wyeth Laboratories), when adding a given amount 1 of recombinant B-domain deleted factor VIII: C diluted in dilution buffer (reagent 4 (R4) described above), only a very low activity of this factor VIII: C is assayed whereas, when the same amount of this recombinant factor is used in a deleted plasma factor VIII: C, all the biological activity linked to the recombinant factor VIII: C is assayed. FIG. 3 illustrates this result which shows that, without plasma, the assay of the activity of recombinant factor VIII: C is neither sensitive nor reliable. The chromogenic assay method is one of the control methods used by pharmaceutical laboratories producing these natural or recombinant factor VIII: C concentrates. However, as stated above, it is: not efficient and it is important to be able to propose a chromogenic assay process which does not require the supply of deleted plasma for safety reasons. Therefore, the aim at the basis of the invention is to be able to provide a method for the sensitive and reliable chromogenic assay in vitro of the coagulation factor VIII: C contained in particular in therapeutic fractions with a view to producing medicaments correctly. dosed with factor VIII: C for the treatment of pathologies such as type A hemophilia or von Willebrand disease. To this end, the inventors have chosen to investigate how the plasma could play an essential role in such an assay of the activity of factor VIII: C. They carried out various studies on plasma deleted for factor VIII: C. These studies enabled them to identify at least one potentiating plasma substance: the assay of the activity of factor VIII: C activating factor X into factor Xa. Thus, the invention relates to a method for the chromogenic assay of the activity of factor VIII: C in particular in therapeutic fractions, in which the assay of the therapeutic sample to be tested containing the purified or recombinant factor VIII: C is carried out. using reagents providing at least thrombin, factor IXa, phospholipids, calcium, factor X, the sample dilution buffer with albumin, the chromogenic substrate specific for factor Xa and EDTA , characterized in that said assay method further comprises a step of adding at least one substance potentiating the assay of factor VIII: C activity, this substance being identified as being present in plasma, said substance being consisting of at least one metal ion with the exception of Ca2 +. Preferably, the substance potentiating the assay of factor VIII: C activity, and identified as being a substance present in plasma is at least one positive divalent metal ion other than Ca2 +. Ca2 has been used in chromogenic assays for several years. It has been observed that it has, however, no potentiating action within the meaning of the present invention. This at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C, 30 and identified as being a substance present in the plasma can advantageously be a combination of at least two divalent metal ions carrying two positive charges. Even more advantageously, the present invention relates to a method for the chromogenic assay of the activity of factor VIII: C, in particular in the therapeutic fractions, reliable thanks to the addition of at least one substance potentiating the assay being at least one positive divalent metal ion, other than 5 Cal +, complexed to at least one plasma protein such as ceruloplasmin or acidic glycoprotein a1 (AGP), otherwise known as Glycoprotein Alpha Acid, Glyco-Protein Acid, Glyco-Protein Alpha Acid , or Orosomucoïde. In fact, high molecular weight plasma fractions (45,000 to 500,000 10 Daltons) also potentiate the assay of factor VIII: C activity, suggesting the intervention of said substance in the form of a complex between the factor VIII: C. or metal ion (s) and various plasma proteins or substances. In those embodiments where the substance potentiating the assay of factor VIII: C activity is a positive divalent metal ion complexed to at least one plasma protein such as acid glycoprotein α1 (AGP) complexed with Cul +, the concentration required of said metal ion is very weak, of the order of 1 pg / ml of complex, ie less than 0.1 pg of Cul +. Thus, advantageously, from the therapeutic fractions diluted in an R4 buffer as defined above, the main characteristic of the present invention is the potentiation of the assay method and its increased sensitivity in a context without plasma thanks to the addition. , in the medium for assaying the activity of factor VIII: C, of at least one substance identified as present in plasma. The at least one potentiation substance is preferably added to the R4 buffer which is then called the R4 + buffer. The process which is the subject of the invention therefore proposes to assay by a chromogenic method the activity of factor VIII: C in therapeutic fractions for the production of medicaments by implementing the addition of a complementary substance which then confers on the process the advantage of being able to be carried out manually or automatically, reliably even on therapeutic fractions. Insofar as this substance is identified as present in the plasma, it can be extracted from the plasma or come from any other source, 2908892 7 and be integrated in the reagents allowing the implementation of the assay process without having to resort to plasma itself. For the manufacture of medicaments for treating blood pathologies such as hemophilia A or von Willebrand disease, therapeutic fractions rich in factor VIII: C are prepared. These fractions essentially contain factor VIII: C purified from plasma or recombinant factor VIII: C. Factors VIII: C can be purified from human, porcine or other plasma. Generally, human factor VIII: C is used therapeutically. Several types of factor VIII: C purified from plasma exist: - factor VIII: C concentrate, rich in von Willebrand factor (vWF), which stabilizes it. It is also very difficult to separate factor VIII: C from vWF during plasma extraction, the two proteins being very firmly associated. This von Willebrand factor is a multimeric glycoprotein of 1000 to 20,000 KDa. complexing with unactivated factor VIII but not with activated factor VIII: C. This binding allows a stabilization of factor VIII: C and an increase of its half-life in the bloodstream. The molar concentration of vWF is always very much in excess of that of factor VIII: C (from 10 to more than 100 times higher). In plasma, for example, there is 0.1 pg / ml of factor VIII: C per 10 pg / ml of vWF. very pure factor VIII: C which is obtained from plasma passed through an affinity column provided with a monoclonal antibody specific for factor VIII: C. The recombinant factors VIII: C are of several types: the complete recombinant factor VIII: C (rec-VIII: C) with the six domains A1-A2-B-A3-C1-C2 of the native factor VIII: C. Recombinant factor VIII: C lacking the B domain (B domainless FVIII: C) which can be found commercially under the trade name ReFacto (Wyeth Laboratories). This recombinant factor VIII: C lacking the B domain has the same activity as the native factor VIII: C and the same lack of immunogenicity in the patient. Moreover, it is very interesting to use such a compound for treatments because its speed of action is a hundred times greater than that observed with the native recombinant compound and the production yield is twenty times greater in comparison with the production. factor VIII: C in its native structure. For the development of medicaments, several control steps are essential before placing this medicament on the market. Among these tests, the amount of factor VIII: C contained in a sample is assayed. As already mentioned, the quality of a chromogenic assay method depends on its high precision in the colorimetric measurement correlated with the quantity of activated factor VIII: C, on its detection sensitivity, its reproducibility as well as its speed of detection. dosage. The assay method proposed according to the present invention combines all these qualities and in particular a sensitivity markedly higher than that obtained with the methods of the prior art. Indeed, after numerous detailed filtration and identification studies, this increased sensitivity was obtained by adding at least one substance in the chrornogenic assay method according to the invention. This at least one substance 20 potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is chosen in particular from at least one metallic ionic substance, other than Cal +, present in the plasma. This metallic ionic substance is chosen from those exhibiting two positive charges such as Cul + and its salts, Zn2 + and its salts, Mn 2+ and its salts, Mg2 + and its salts, Lie + and its salts, or others. metal ions and their salts having properties equivalent thereto, with the exception of Cal + and its salts. In addition, this assay potentiating substance can be a combination of several positive divalent metal ions such as a combination of Cul + and Zn2 +, Cul + and Mn2 +, Cul + and Mg2 +, Zn2 + and Mn 2+ or d other combinations of two, three or more metal ions. On the other hand, this substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C, and identified as being a substance present in the plasma can advantageously be at least one positive divalent metal ion other than Cal + complexed with at least one protein. 5 2908892 9 capable of interacting with positive divalent metal ions. Such proteins can be AGP or ceruloplasmin. More preferably, the optimum activity is obtained with, as substances 5 which potentiate the dosage, a defined concentration of Cul +, supplemented with a small quantity of Zn2 + and traces of AGP. This combination appears to allow the presentation of factor VIII: C in its most active form. The present invention therefore also relates to a method for the chromogenic assay of the activity of factor VIII: C, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is predominantly Cul +, the remainder being Zn2 + complexed to traces of AGP. In another embodiment of the invention, the method for the chromogenic assay of factor VIII: C activity is carried out with a majority of Cul + copper, the remainder being Zn2 + and traces of ceruloplasmin. In other embodiments, the zinc used in small amounts is replaced either by Mn2 +, Mg2 +, Lie + or another positive divalent metal ion. It is recalled that various proteins or plasma substances are capable of binding the divalent ions. positive. Thus, such plasma proteins such as AGP or ceruloplasmin can bind one or more metal ions such as Mn2 +, Mg2 +, Lie + or other ions having equivalent properties. For the assays of the therapeutic fractions in particular, the present invention also makes it possible to overcome the defects of the prior techniques: the assay according to the present invention makes it possible to be carried out on the therapeutic fraction by measuring its actual physiological activity, and with a reproducible calibration, and this with a simpler realization compared to the assays carried out in the prior art. Indeed, the present invention makes it possible to detect reproducibly and reliably, with an increased level of sensitivity. During their research in filtration, the inventors observed a clearly more reliable and sensitive assay when the substance potentiating the assay is copper or its salts or a protein capable of interacting with copper such as in particular the acid glycoprotein al ( AGP) or ceruloplasmin with or without zinc Zn2 +. The at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C and present in the plasma can be obtained from human plasma, bovine or any other origin. The reagents used for carrying out the process according to the present invention are those described above, already used in the prior art and known to those skilled in the art, namely the reagents referred to here as R1, R2 (or a combination of reagents R1 and R2), R3, R4 as defined above providing at least adequate amounts of thrombin, factor IXa, phospholipids, calcium, factor X, the sample dilution buffer with albumin, the substrate chromogen specific for factor Xa and EDTA. In addition, in the manual endpoint assay method, other reagents and materials customary and known to those skilled in the art may be required such as sterile distilled water, 20% acetic acid or 2% citric acid. In factor VIII: C calibrations, plasmas or concentrated factor VIII: C fractions are also used as reference material and in controls, plasmas or therapeutic fractions precisely dosed against the reference material are used. These calibrations and controls are established in relation to international or pharmacopoeial standards. As we have said previously, the assay method is more reliable when one adds at least one substance potentiating this assay of the activity of factor VIII: C and this at least one substance preferably consists of copper. or its salts and this in optimal proportions of between 5 pg / ml and 50 pg / ml. When zinc Zn2 + is used as at least one substance potentiating the dosage, its proportions are between 0.5 tag / ml and 25 pg / ml. 2908892 11 When the assay is carried out with a plasma protein, such as AGP or ceruloplasmin, as a substance potentiating the assay of factor VIII: C activity, the proportions of plasma protein are between 0.1 pg / ml and 100 pg / ml. Thus, when the assay is carried out with the acid glycoprotein al (AGP) as a substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C, the optimal proportions of AGP are between 0.25 pg / ml and 2 pg / ml . Optimal proportions in dosages using ceruloplasmin are between 0.1 and 10 µg / ml. When the substance potentiating the factor VIII: C assay is a combination of Cul +, Zn2 + complexed with traces of AGP, the concentrations used for the assay are of the order of about 15 µg / ml Cul +. , 5 to 5 µg / ml Zn2 + and about 1 µg / ml AGP. However, these relative amounts must be optimized for the greatest reliability of the assay. Other sources tested (biological media or not) also have an effect potentiating the assay of the activity of factor VIII: C in the therapeutic fractions. These include urine and orange juice in which there are also potentiating substances also present in the plasma. Likewise, copper from oligosol or from pharmacy-available granules (granions) or copper associated with AGP or ceruloplasmin can be used in the process according to the present invention. This last experiment does not show large differences in the results compared to ceruloplasmin alone because this protein already carries 95% of the copper circulating in the blood. The assay results obtained with such compounds are very satisfactory and more reliable than with the assay methods of the prior art. The pH is also an influencing factor for the sensitivity of the assay. All the assays will be carried out with a pH close to 7.2 and at 37 C, which is equivalent to physiological conditions. FIG. 4 illustrates the dose-response curves obtained during the assay for the activity of factor VIII: C in different types of samples with or without the addition or not of at least one substance potentiating the assay, as described previously. In Figure 4, Buffer R4 + means that the at least one assay potentiating substance has been added to dilution reagent 4 (R4) in carrying out the method. However, this at least one substance can be added in one of the assay reagents (RI, R2, R3 or R4) as mentioned above but it can also be added in isolation. The assayed samples appearing in FIG. 4 are: ReFacto, a recombinant factor VIII: C described previously (denoted VIII refacto in FIG. 4) factor VIII: C from the company Octapharma, which is a factor VIII: C d Affinity purified extraction from plasmas (denoted VIII octapharma in Figure 4) a Pontoise Plasma pool which is equivalent to normal plasma. Each curve makes it possible to illustrate that the assay is more sensitive when R4 + is used, that is to say when the at least one potentiation substance is added in the method for assaying the activity of factor VIII: C according to the present invention. Identical results not shown were obtained when the at least one substance potentiating the assay as described above was added alone or to one of the reagents R1, R2 or R3 and at different stages of the process. In these chromogenic assay curves, the percentages used correspond to relative values. The values given include the dilutions used for the assay. The level of 200% in the chromogenic assay used corresponds to the activity of factor VIII: C in the Pontoise pool plasma (normal plasma) or Refacto or purified factor VIII: C from the company Octapharma respectively diluted at 1/20. The standard dilution of the chromogenic assay being 1/40, a normal plasma pool or Refacto or purified factor VIII: C from the company Octapharma respectively diluted to 1/40 then corresponds to the point 100% of factor VIII: C. In normal undiluted plasma, the concentration of factor VIII: C is between 100 and 200 ng / ml. For a factor VIII: C concentrate, it is customary to carry out a pre-dilution beforehand to bring the factor VIII: C concentration of said concentrate to a concentration of between 100 ng / ml and 200 ng / ml, factor VIII: C concentration of undiluted normal plasma, then apply the assay dilution of 1/40 or other appropriate dilutions. 5 To achieve a reliable and reproducible assay, a calibration range is performed using a calibrator plasma of precisely defined concentration. These techniques for producing a calibration range are well known to those skilled in the art. The exemplary embodiments of the invention are provided for illustrative purposes only and should in no way limit the scope of the invention. Indeed, for example, such a method for assaying the activity of factor VIII: C according to the present invention can of course be used to assay factor VIII: C in human plasma to be tested, in particular when using dilutions. important. The present invention also relates to a kit for the chromogenic assay of the activity of coagulation factor VIII: C in particular in therapeutic fractions. This kit operates according to the assay method of the present invention. It consists at least of the reagents (R1 to R4, with a possible combination of the reagents R1 and R2) described above for the implementation of the process of the present invention and provided in the appropriate proportions. In addition, this kit is characterized in that it further comprises at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C, said at least one substance being identified as present in plasma and consisting of at least one metal ion other than Cal +. It can be obtained from human or bovine plasma or from other origins, but it can also be obtained from any other medium, biological or not, which may contain it, such as urine or oligosols, or granions. The substance potentiating the assay of factor VIII: C activity is at least one substance identified as a positive divalent metal ionic substance other than Cal +. This at least one metal ionic substance potentiating the assay is chosen from those exhibiting two positive charges such as Cul + or its salts, Zn2 + and its salts, Mn 2+ and its salts, Mg2 + and its salts, Lie + and its salts. salts, or other metal ions having properties equivalent thereto, except Cal + and its salts. In addition, this assay potentiating substance can be a combination of several divalent metal ions carrying two positive charges, such as a combination of Cul + and Zn2 +, Cul + and Mn2 +, Cul + and Mg2 +, Zn2 + and 10 du. Mn 2+ or other combinations of two, three or more metal ions. On the other hand, this substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C, and identified as being a substance present in the plasma can advantageously be at least one positive divalent metal ion other than Cal + complexed with at least one protein. plasma capable of interacting with positive divalent metal ions. Such proteins can be AGP or ceruloplasmin. Preferably, the optimum activity in this chromogenic assay kit is obtained with, as substances potentiating the assay, a majority of Cul +, the remainder being Zn2 + and traces of AGP. This combination appears to allow the presentation of factor VIII: C in its most active form. The present invention therefore also relates to a kit for the chromogenic assay of the activity of factor VIII: C in particular in therapeutic fractions, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is a majority. of Cul +, the remainder being Zn2 + and traces of AGP. In another embodiment of the invention, the assay kit using the chromogenic assay method for factor VIII: C activity is performed with a defined concentration of Cul + associated with low amounts of Zn2 + and traces of ceruloplasmin. . In other embodiments, the zinc used in small amounts is replaced either by Mn2 +, Mg2 +, Lie + or another positive divalent metal ion. It is recalled that various proteins or plasma substances are capable of fixing the positive divalent metal ions. The relative amounts added of each of the substances potentiating the assay of the activity of factor VIII: C in this kit are identical to those used in the assay method described in the first part of the present application. Said kit for chromogenic assay of factor VIII: C activity according to the present invention is characterized in that the at least one assay potentiating substance is obtained from human or animal plasma. In addition, this at least one substance potentiating the dosage according to the present invention is obtained from a biological medium containing it such as urine but it can also be obtained from a non-biological medium containing it such as orange juice or gravies. The unused kit is provided in a lyophilized form to be reconstituted with distilled water, preferably sterile, in the proportions and under the conditions specified in the exemplary embodiments of the invention. The results of the assay of factor VIII: C activity in plasmas or therapeutic fractions are expressed as a percentage or in International Units (IU), 1 International Unit being the content in 1 ml of normal plasma, as defined in international standards (WHO / NIBSC). Embodiment 30 By definition, a pool of normal plasmas corresponds to 100% factor VIII: C. The standard dilution of the assay being 1/40, this 1/40 dilution then corresponds to 100% factor VIII: C and the 1/20 dilution to 200%. This will be recalled later in the calibration part. Under these assay conditions, 200% is equivalent to about 5-10 ng / ml factor VIII: C in the plasma pool. 2908892 Reagents: RI: Reagent 1: Human factor X 5 Human factor X, lyophilized in the presence of a fibrin polymerization inhibitor 2 vials (to be reconstituted with 2.5 ml of distilled water). R2: Reagent 2: Activator reagent (IXa û Thrombin û Calcium û Phospholipids) 10 Human factor IXa, in constant and optimized quantity, containing human thrombin, calcium and synthetic phospholipids, lyophilized: 2 vials (to be reconstituted by 2, 5 ml of distilled water). R3: Reagent 3: SXa-11 15 Chromogenic substrate specific for factor Xa (SXa-11), lyophilized: 2 vials of 15 mg (to be reconstituted with 2.5 ml of distilled water). R4: Reagent 4: Tris-BSA buffer Tris-BSA buffer, ready to use. Contains 1% BSA and sodium azide. (4 20 vials of 25 ml). The potentiation substance of the assay according to the invention can be added alone or to one of these reagents during the assay. Preferably, this substance such as the Cul + ion is added in a concentration ranging from 5 pg / ml to 50 pg / ml to reagent 4 (R4) which is then called reagent 4+ (R4 +). Reagents and materials required but not provided: Reagents: Distilled water. 30 Acetic acid (20%) or citric acid 2% (end point method). Calibration plasmas (supplied by the company Hyphen Biomed under the name BIOPHEN Plasma Calibrator and under the reference 222101)). Normal or abnormal control plasmas (supplied by the company Hyphen Biomed under the name BIOPHEN Normal Control Plasma with the reference 16 2908892 17 223201 and under the name BIOPHEN Abnormal Control Plasma with the reference 223301). Materials: Spectrophotometer or automatons for chromogenic assays, at 405nm. 5 - Stopwatch. - Calibrated pipettes. Storage: Reagents not yet used should be stored at 2-8 C, in their original box. They are then stable until the expiration date indicated on the label. Reagent Preparation and Stability: RI: Reagent 1: Human Factor X Reconstitute each vial with exactly 2.5 ml of distilled water. Leave to stabilize for 30 minutes at room temperature (18-25 C). Shake gently before use. Stability of reconstituted factor X stored in original vial: ^ 72 hours at 2-8 C. 20 ^ 24 hours at room temperature (18-25 C). ^ Do not freeze. R2: Reagent 2: Activator reagent Reconstitute each vial with exactly 2.5 ml of distilled water. 25 Leave to stabilize for 30 minutes at room temperature (18-25 C). - Shake gently before use. Stability of the reconstituted vial, stored in its original vial: ^ 72 hours at 2-8 C. ^ 24 hours at room temperature (18-25 C). 30 ^ Do not freeze. R3: Reagent 3: Chromogenic substrate specific for factor Xa (SXaù11) -Reconstitute each vial with exactly 2.5 ml of distilled water. 2908892 18 Leave the solution to stabilize for 30 minutes at room temperature (18-25 C), stirring occasionally. Shake well during reconstitution (vortex) until complete dissolution. Homogenize well before any use. 5 Stability of the reconstituted substrate, stored in its original vial: ^ 3 months at 2-8 ° C. ^ 7 days at room temperature (18-25 ° C.). ^ Do not freeze. R4: Reagent 4: TrisBSA buffer Ready to use buffer (25 ml per vial). Shake before use. This reagent is stable until the expiration date, stored at 2-8 C, away from contamination. The potentiation substance of the assay according to the invention is then added alone or to one of these reagents during the assay. Preferably, this substance, such as the Cul + ion, is added in a concentration ranging from 5 pg / ml to 50 pg / ml to reagent 4 (R4) which is then called reagent 4+ (R4 +). 20 Precautions: To ensure good stability of the reagents, close the bottles after use, with their respective caps (green cap for factor X (RI), red for the activator mixture with IXa (R2), yellow cap for the substrate SXa- 11 (R3), and white cap for the buffer (R4 +)). Handle reagents with the usual precautions to avoid contamination. If the substrate turns yellow, this indicates the presence of contamination. It should be discarded and a new vial should be used. Note: Flasks R1, R2 and R3 are lyophilized under vacuum; carefully remove the freeze-drying cap to avoid any loss of the product when opening the bottle. 2908892 19 Depending on the automatic method used, the reagents can be reconstituted with volumes different from those indicated. In all cases, the respective ratios of each reagent, R1, R2 and R3, recommended in the manual method (final concentration in the reaction medium and total volume), must be respected. Use only reagents from the same lot of kits. Do not mix reagents from different kit lots to perform an assay. Reagents R1, R2 and R3 are optimized for each kit lot. Aging studies, performed at 30 ° C for 3 weeks, show that the reagents can be shipped at room temperature without any damage. Calibration: 15 High range (0 to 200%) _ The high range is performed using a calibrator plasma, with a precisely defined factor VIII: C concentration (C), or a pool of normal citrated plasma ( at least 30 normal individuals, men and women, aged 18 to 55, with no treatment or known pathology), which by definition has 100% factor VIII: C. The BIOPHEN Plasma Calibrator set, marketed by the Flyphen BioMed company under the reference 222101, can be used to obtain the calibration range. The assay includes a dilution of the plasma to 1/40. The dilution of the plasma to 1/40 represents by definition 100% factor VIII: C. The calibration range is 0 to 200% factor VIII: C. The 1/20 dilution (in Tris-BSA (R4 +) buffer) represents 200% of factor VIII: C. For a calibrator titrating C, the rate of 200% (under the conditions of the assay) is obtained by diluting this calibrator by the following factor: 20 x (C) / 100. 30 From this solution, make the calibration range in diluent R4 +:% factor VIII: C Standard 200% factor VIII: C (l) Tris-BSA buffer (R4 +) (l) 0 0 500 2908892 20 50 125 375 100 250 250 200 500 0 For concentrates of factor VIII: C, the test sample must be pre-diluted with R4 + in order to target a factor VIII: C concentration of less than 2IU / ml. It is recommended to carry out a pre-dilution, in order to bring the theoretical concentration of factor VIII: C between 0.2 and 2 IU / ml, then a dilution 1/40 for the performance of the test. The expected factor VIII: C concentration is thus between 20 and 200%. Low range (0 to 25%) 10 Calibration can be performed using a pool of normal citrated plasmas or a commercial calibrator with known factor VIII: C level, i.e. C. Dilute this plasma with plasma deficient in factor VIII: C (marketed under the reference DPO40A / K by the company Hyphen BioMed) so as to obtain a level of 25% (the dilution factor in plasma deficient in factor VIII: C is 4 for a normal pool , or 4 x 15 C / 100 for the calibrator with a rate C). The assay includes a 1/10 plasma dilution. The calibration range is 0 to 25% factor VIII: C. The 1/10 dilution (in Tris-BSA (R4 +) buffer) represents 25% of factor VIII: C. From this dilution, make the following calibration range in diluent R4 +: 20 fo Standard 200% factor VIII: C (l) Tris-BSA buffer (R4 +) (l) factor VIII: C 0 0 500 6.25 125 375 12.5 250 250 25 500 0 ^ Carry out the calibration range immediately in order to avoid any degradation of factor VIII: C. Procedure: 2908892 Manual method: High range: Dilute the samples to be tested and the controls 1/40 in Tris-BSA (R4 +) buffer. For therapeutic concentrates where factor VIII: C is desired, target a factor VIII: C concentration of between 0.005 and 0.050 IU / ml in a final dilution (i.e. approximately 20 to 200% of factor VIII: C according to this operating protocol) Low range: Dilute the samples to be tested and the controls 1/10 in Tris-BSA (R4 +) buffer. In the wells of a microplate or in plastic tubes incubated at 37 C, introduce: Reagents Microplate Plastic tube Calibrator or diluted samples to be tested or 50 l 100 l controls RI: Factor X, preincubated at 37 C 50 100 R2: Mix IXa , preincubated at 37 C 50 l 100 l Mix and incubate at 37 C for 5 minutes then introduce: R3: Substrate SXa-11 preincubated at 37 C 50 l 100 l Mix and incubate at 37 C for exactly 5 minutes Stop the reaction by introducing: Citric acid (20g / L) or 20% acetic acid 50 l 100 l Mix and measure the optical density at 405 nm against the corresponding white The yellow color obtained stable for 2 hours. The sample blank is obtained by mixing the reagents in the reverse order to that of the test: Citric acid (20g / L), substrate SXa-11, diluted sample, factor X, 20

mélange IXa. Mesurer la densité optique à 405 nm. La valeur du blanc mesurée doit être soustraite de l'absorbance obtenue pour le test. IXa mixture. Measure the optical density at 405 nm. The measured blank value should be subtracted from the absorbance obtained for the test.

21 5 10 15 2908892 Méthode automatisée : Les adaptations sur les divers automates présents sur le marché sont disponibles sur 5 demande. Pour toute adaptation, les rapports respectifs des réactifs et de l'échantillon testé et le protocole général de la méthode manuelle doivent être respectés. Nota : 10 Suivant les méthodes utilisées, si des volumes plus ou moins importants doivent être utilisés, respecter très exactement le rapport des volumes et des concentrations des différents réactifs constituant le milieu réactionnel. Résultats : 15 Pour la méthode en point final, tracer la droite étalon en portant en ordonnées la densité optique (DO) à 405 nm et en abscisses le taux de facteur VIII :C (%), en coordonnées bi-logarithmiques pour la gamme haute et en coordonnées linéaires pour la gamme basse.21 5 10 15 2908892 Automated method: Adaptations to the various PLCs on the market are available on request. For any adaptation, the respective ratios of the reagents and the tested sample and the general protocol of the manual method must be respected. Note: 10 Depending on the methods used, if larger or smaller volumes are to be used, comply very exactly with the ratio of volumes and concentrations of the various reagents constituting the reaction medium. Results: 15 For the end-point method, plot the standard line by plotting the optical density (OD) at 405 nm on the ordinate and the factor VIII rate: C (%) on the abscissa, in bi-logarithmic coordinates for the high range and in linear coordinates for the low range.

20 La concentration en facteur VIII :C dans l'échantillon à doser est déduite directement de la courbe d'étalonnage ; les résultats sont exprimés en % de facteur VIII :C. • En technique automatique, les taux sont directement calculés par l'instrument en fonction des valeurs d'étalonnage. • La zone de mesure va de 5 à 200% pour la gamme haute, de 1 à 25% pour la 25 gamme basse. Si la dilution utilisée est 1/40 (gamme haute) ou 1/10 (gamme basse), le taux de facteur VIII :C est obtenu directement sur la courbe. Si d'autres dilutions sont utilisées, le taux mesuré, multiplié par le facteur de dilution D utilisé et divisé par 40, soit D/40, pour la gamme haute, et 10, soit D/10, pour la 30 gamme basse. Contrôle de qualité : 22 2908892 23 L'utilisation de plasmas de contrôle, titrés en facteur VIII :C, permet de valider la courbe d'étalonnage et la réactivité homogène du dosage, dans les différentes séries, pour un même lot de réactifs. Différents plasmas de contrôle sont disponibles ; 5 - Biophen Normal Control Plasma (commercialisé par la société Hyphen BioMed, sous la référence 223201) -Biophen Abnormal Control Plasma (commercialisé par la société Hyphen BioMed, sous la référence 223301) 10 Performances et caractéristiques : La limite de détection est déterminée en mesurant sur la courbe d'étalonnage le taux apparent de facteur VIII :C, correspondant à la DO moyenne obtenue pour un taux réactionnel sans facteur VIII :C incrémentée à 3 écart-types. Cette limite de détection est d'environ 10% en gamme haute et 2% en gamme basse.The factor VIII: C concentration in the sample to be assayed is deduced directly from the calibration curve; the results are expressed as% factor VIII: C. • In the automatic technique, the rates are calculated directly by the instrument according to the calibration values. • The measurement zone goes from 5 to 200% for the high range, from 1 to 25% for the low range. If the dilution used is 1/40 (high range) or 1/10 (low range), the factor VIII: C level is obtained directly on the curve. If other dilutions are used, the measured rate multiplied by the dilution factor D used and divided by 40, or D / 40, for the high range, and 10, or D / 10, for the low range. Quality control: 22 2908892 23 The use of control plasmas, titrated in factor VIII: C, makes it possible to validate the calibration curve and the homogeneous reactivity of the assay, in the different series, for the same lot of reagents. Different control plasmas are available; 5 - Biophen Normal Control Plasma (marketed by the company Hyphen BioMed, under the reference 223201) -Biophen Abnormal Control Plasma (marketed by the company Hyphen BioMed, under the reference 223301) 10 Performances and characteristics: The detection limit is determined by measuring on the calibration curve the apparent level of factor VIII: C, corresponding to the mean OD obtained for a reaction rate without factor VIII: C incremented by 3 standard deviations. This detection limit is approximately 10% in high range and 2% in low range.

15 Valeurs attendues : Le taux normal de facteur VIII :C varie de 50 à 200%. Ce taux dirninue dans les pathologies comme l'hémophilie A ou la maladie de Von Willebrand. Des 20 concentrations élevées de facteur VIII :C sont observées dans les atteintes hépatiques ou les pathologies inflammatoires.15 Expected values: The normal factor VIII: C level varies from 50 to 200%. This rate decreases in pathologies such as hemophilia A or Von Willebrand's disease. High concentrations of factor VIII: C are observed in liver damage or inflammatory pathologies.

Claims

1- Method for the chromogenic assay of the activity of factor VIII: C in particular in therapeutic fractions in which the assay of the therapeutic sample to be tested containing the purified or recombinant factor VIII: C is carried out using reagents providing at least thrombin, factor IXa, phospholipids, calcium, factor X, sample dilution buffer with albumin, chromogenic substrate specific for factor Xa and EDTA, characterized in that said method of assay further comprises a step of adding at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C, identified as being present in plasma, said substance consisting of at least one metal ion to the except Cal +.

2- chromogenic assay method according to claim 1, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is at least one positive divalent metal ion other than Cal +.

3- Chromogenic assay method according to claim 1 or 2, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is at least one divalent metal ion exhibiting two positive charges chosen from Cul + or its salts. , Zn2 + and its salts, Mn2 + and its salts, Mg2 + and its salts, Lie + and its salts, or other metal ions having properties equivalent to these, with the exception of Cal + and its salts. 25

4- A chromogenic assay method according to claim 3, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is a combination of at least two divalent metal ions carrying two positive charges. 30

5- A chromogenic assay method according to one of claims 2 and 3, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is at least one divalent positive metal ion other than Cal + complexed to at least a plasma protein such as AGP (a1 acid glycoprotein) or ceruloplasmin. 24 2908892 25-

6- A chromogenic assay method according to claim 5, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C consists of a majority of Cul +, the remainder consisting of Zn2 + and 5 traces of AGP.

7- A chromogenic assay method according to claim 5, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C consists of a majority of Cul +, the remainder consisting of Zn2 + and 10 traces of ceruloplasmin .

8- A method of chromogenic assay of the activity of factor VIII: C according to one of claims 1 to 7, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is obtained from human or animal plasma.

9- A method of chromogenic assay of the activity of factor VIII: C according to one of claims 1 to 8, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is obtained from a biological medium containing it, such as urine

10- Process for chromogenic assay of the activity of factor VIII: C according to one of claims 1 to 8, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is obtained from a non-biological medium containing it, such as orange juice or granions.

11- Kit for chromogenic assay of the activity of factor VIII: C, in particular in therapeutic fractions, for the implementation of the method according to one of claims 1 to 10, comprising at least the following reagents - reagent 1 (RI ) containing excess human factor X, 2908892 2G reagent 2 (R2) containing human factor IXa, thrombin, calcium and synthetic phospholipids in micelle form in constant and optimized amounts, R1 and R2 can be in combined form potentially, 5 - reagent 3 (R3) containing a chromogenic substrate specific for factor Xa reagent 4 (R4) consisting of a Tris-BSA buffer for diluting the samples in the presence of albumin, 1% BSA and sodium azide provided in the appropriate proportions and, characterized in that it further comprises at least one substance potentiating the dosage of the activity of factor VIII: C, said at least one substance potentiating the dosage being identified as present. nte in plasma and consisting of at least one metal ion other than Cal +.

12- Chromogenic assay kit according to claim 11, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is at least one divalent positive metal ion other than Cal +.

13- Chromogenic assay kit according to one of claims 11 and 12, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is at least one positive divalent metal ion chosen from Cul + or its salts. , Zn2 + and its salts, Mn 2+ and its salts, Mg2 + and its salts, Lie + and its salts, or other metal ions having properties equivalent to these, with the exception of Cal + and its salts. salts. 25

14- chromogenic assay kit according to claim 13, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is a combination of at least two divalent metal ions carrying two positive charges mentioned in claim 13. 30

15- Chromogenic assay kit according to one of claims 12 and 13, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is at least one positive divalent metal ion other than Cal + complexed to at least a plasma protein such as AGP or ceruloplasmin. 2908892 27

16- Chromogenic assay kit according to claim 15, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C consists of a majority of Cul +, the remainder consisting of Zn2 + and traces of PCR .

17- Chromogenic assay kit according to claim 15, characterized in that the substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C consists of a defined majority of Cul +, the remainder consisting of Zn2 + and traces of ceruloplasmin .

18- Kit for chromogenic assay of the activity of factor VIII: C according to one of claims 11 to 17, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is obtained from human or animal plasma. 15

19- Kit for chromogenic assay of the activity of factor VIII: C according to one of claims 11 to 18, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is obtained from a biological medium containing it such as urine

20- Kit for chromogenic assay of the activity of factor VIII: C according to one of claims 11 to 18, characterized in that the at least one substance potentiating the assay of the activity of factor VIII: C is obtained at from a non-biological medium containing it such as orange juice or granions. 5 10