FR2907673A1 - "nouvelle utilisation d'un ester de tocopherol en tant qu'agent cicatrisant" - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la cosmétique et plus particulièrement à une nouvelle utilisation d'un ester d'acide gras de tocophérol.Elle a plus particulièrement pour objet l'utilisation de compositions cosmétiques en tant qu'agent cicatrisant et comme agent réparateur seul ou en association avec un agent promoteur de la synthèse du collagène.Dans ces compositions cosmétiques selon l'invention, l'ester d'acide gras de tocophérol est présent à une dose variant de 0,5 à 5 % de la masse totale et l'agent promoteur de la synthèse du collagène est présent à une dose variant de 0,1 à 1 % de la masse totale.Utilisation comme agent cicatrisant ou réparateur après des phénomènes de stress.

Description

1 Nouvelle utilisation d'un ester de tocophérol en tant qu'agent

cicatrisant Dans son brevet français 2.825.088, la demanderesse a déjà décrit des esters de tocophérol avec un acide gras et notamment les esters d'acide gras insaturé ou polyinsaturé avec un tocophérol 10 Ces esters répondent à la formule générale I. dans laquelle R est le reste de la chaîne aliphatique d'un acide gras comportant au moins une double liaison éthylénique, et n est un nombre entier égal à 1 ou 2. Dans cette formule, on englobe aussi bien les esters d'a-tocophérol, de 12,-20 tocophérol, de y-tocophérol et de 8-tocophérol. Les tocophérols peuvent être sous forme racémique (dl) ou sous forme optiquement active (d ou I). Ces esters ont montré en application topique une activité certaine sur la synthèse du néocollagène et sur la synthèse de néoélastine. Ces propriétés sont 25 intéressantes mais nécessitent le besoin d'appliquer des concentrations importantes en principe actif pouvant varier de 0,001 à 1,5 % et plus particulièrement de 0,01 à 5 % en fonction du mode d'administration ou du mode d'application des diverses compositions. L'invention réside dans le fait que la demanderesse a trouvé de 30 nouvelles propriétés pour de tels composés seuls ou en association avec des substances actives sur la synthèse du collagène. 15 2907673 2 L'invention a donc pour objet l'utilisation des compositions cosmétiques 5 en tant qu'agent réparateur et cicatrisant. Ces propriétés se manifestent déjà à faibles doses. Elles sont renforcées par la présence d'un ou plusieurs ingrédients actifs sur la synthèse du collagène comme par exemple des extraits de Centella asiatica. Ces propriétés ont été mises en évidence par des tests montrant la prolifération de fibroblastes humains vieillis prématurément, sur l'induction de l'activité f3 galactosidasique associée à la sénescence, sur des fibroblastes prématurément vieillis et sur la cicatrisation d'une mono-couche de fibroblastes vieillis prématurément ainsi que par l'étude de l'activité cytotoxique, sur des fibroblastes normaux en culture. Cette nouvelle utilisation se manifeste tout particulièrement par application locale, notamment en utilisant une préparation liquide, pâteuse ou fluide comme des émulsions, des lotions, des pommades, des poudres, des lotions capillaires, des sprays, des ampoules, des sérums ou des patchs. Les principes actifs peuvent se trouver sous forme libre ou sous forme encapsulée ou microencapsulée ou encore de liposomes pour assurer une meilleure diffusion. Les préparations topiques peuvent en outre contenir un facteur de 25 diffusion ou un promoteur d'absorption comme l'acide laurique, l'Azone, le methyl ethyl dioxolane, le methyl n-•nonyldioxolane, le caprolactame ou la N-methyl vinyl pyrrolidone. Les compositions sont également susceptibles de renfermer un agent promoteur de la synthèse du collagène comme l'extrait de Centella, l'extrait de l'algue 30 Padina pavonica ou encore de l'algue Cyclotella. Pour cette nouvelle utilisation, la concentration en ester d'acide gras de tocophérol varie de 0,5 à 5 % et la teneur en agent promoteur de la synthèse du collagène de 0,1 à 1 % de la masse totale. 20 35 2907673 3 Les compositions renferment en outre des agents solubilisants, des 5 polymères épaississants, des huiles de silicone, des agents stabilisants et/ou des agents émulsionnants. D'une manière préférée, les compositions cosmétiques renferment des supports destinés à être dilués ou incorporés dans des préparations cosmétiques telles to que des crèmes ou des gels. La phase huileuse contenant éventuellement des agents tensioactifs non ioniques et/ou des silicones est ensuite additionnée d'une phase aqueuse contenant éventuellement un agent gélifiant ou un agent épaississant. Après agitation prolongée, il se forme une émulsion que l'on incorpore dans une base cosmétique grasse ou non grasse, pour produire une crème ou un gel. On procède de 15 manière semblable pour les préparations à phase continue huileuse. La phase huileuse contient éventuellement des agents tensioactifs non ioniques et/ou des silicones.

La nouvelle utilisation selon l'invention concerne en particulier l'emploi du y-linolénate de tocophérol dans des compositions cosmétiques à action réparatrice et cicatrisante. Cette nouvelle utilisation a été démontrée un vivo sur des tests de prolifération de fibroblastes humains prématurément vieillis, sur la synthèse du collagène par des fibroblastes humains, par une étude sur l'induction de l'activité beta- galactosidase sur des fibroblastes, et surtout par une étude sur la cicatrisation d'une mono-couche de fibroblastes tout en s'assurant de l'absence d'activité cytotoxique sur des fibroblastes normaux. Les compositions cosmétiques destinées à cette nouvelle utilisation 30 contiennent de 0,5 à 5 g de y-linolénate de tocophérol par 100 g de préparation et de préférence de 1 à 2,5 g pour 100 g de préparation cosmétique. Les exemples suivants. mettent en évidence ces nouvelles propriétés.

35 2907673 4 Exemple 1 : Etude de l'effet d'une préparation cosmétique à base de y-linolénate de 5 tocophérol sur la synthèse du collagène par des fibroblastes humains prématurément vieillis Principe de l'étude Les fibroblastes sont les principales cellules du derme. Ils sont spécialisés dans la to synthèse des deux types de fibres protéiques : les fibres de collagène et les fibres d'élastine constituants de la matrice extra-cellulaire. Le collagène constitue environ 70 % des protéines du derme et lui confère la résistance aux phénomènes d'arrachement dus aux tensions et aux tractions. La synthèse du collagène par les fibroblastes diminue avec le vieillissement des 15 cellules. II en résulte une perte d'élasticité et une perte de tonicité du derme. Les fibroblastes humains à faible passage en culture, soumis à différents types de stress à des doses sub-cytotoxiques tels que par exemple par action des ultra-violets, du peroxyde d'hydrogène, du terbutyl hydroperoxyde (t-BHP) ou de l'éthanol, présentent un phénotype semblable à celui des cellules sénescentes c'est à dire des 20 cellules ayant épuisé leur potentiel à se diviser dans les conditions de culture en laboratoire. Ce phénomène est défini comme une sénescence induite prématurément par le stress (SIPS) et se caractérise notamment par une morphologie des fibroblastes, par une augmentation du nombre de cellules présentant une activité betagalactosidasique associée à la sénescence (AS-13-Gal), un arrêt irréversible de la 25 prolifération cellulaire en phase G1 et une baisse de la synthèse du collagène ainsi qu'il a été décrit par O. Toussaint et al. Exp. Gerontol 2000). La conservation de la synthèse du collagène par une culture de fibroblastes humains prématurément vieillis, ayant été traitée par une préparation cosmétique contenant du y-linolénate de tocophérol peut donc être considérée comme un marqueur de la protection des cellules. Test Les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau humaine adulte (femme de 47 ans de type caucasien) au passage 2.

2907673 5 Trois dilutions de chaque échantillon ont été testées à raison de trois puits par concentration. Eléments de référence Les témoins suivants sont inclus pour chaque analyse : ^ témoin négatif : les cellules ne subissent aucun traitement ^ témoin de sénescence : les cellules sont exposées au préalable dans des conditions de stress (H2O2 ; 200 pM pendant 2 h) ^ témoin positif : les cellules sont exposées au stress puis mises en présence d'un facteur de croissance (TGF-p1) Les investigations ont été effectuées pendant 15 jours.

15 Déroulement de l'essai a) mise en contact des cellules avec les compositions cosmétiques selon l'invention et induction d'un phénomène de stress Les cellules sont ensemencées à raison de 10.000 cellules/cm2. Après 24 heures de culture, elles sont traitées avec le y-linolénate de tocophérol puis après 48 heures de 20 contact, on lave les cellules au tampon PBS puis on les soumet à un phénomène de stress au moyen de H2O2 200pM pendant 2 heures. b) dosage du collagène 72 heures après l'induction du phénomène de stress et sur le passage suivant, on dose le collagène dans la matrice extra-cellulaire et dans le milieu de culture au moyen du 25 coffret de dosage Sircol de la Société Biocolor Ltd (Irlande) selon les modalités du protocole décrit dans le coffret de dosage. Le dosage est réalisé à l'aide du colorant Rouge Sirius (Direct Red 80) qui présente une affinité spécifique pour la structure en triple hélice (Gly-X-Y)ä du collagène natif. L'absorbance du complexe colorant collagène est lue au spectro photomètre à 540 nm.

30 Une courbe étalon est établie entre 0 et 50 pg/ml de collagène de type I (collagène natif). Mesure de la densité cellulaire La densité cellulaire est évaluée par mesure de l'activité de la succinate-35 déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. In vivo cet enzyme transforme le 5 10 2907673 6 bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium en formazan bleu sous forme cristalline. On remet les cristaux en solution et on procède à une lecture au spectrophotomètre. Les absorbances mesurées sont proportionnelles aux quantités de formazan donc au niveau d'activité de la succinate déshydrogénase. Résultats Pour l'évaluation de la densité cellulaire, l'absorbance est mesurée et exprimée en i0 unité de MTT (U MTT) qui est proportionnelle à la quantité de cellules présentes dans chaque puits. La concentration en collagène est exprimée en tag de collagène par ml par unité de MTT (dag/ml) û U MTT dans la matrice extra-cellulaire et dans le milieu de culture. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 1 et l'histogramme 2 figurant en 15 annexe. Les chiffres obtenus permettent de constater une légère diminution du taux de collagène entre le témoin négatif et le témoin de sénescence. On constate qu'il n'y a pas de sécrétion de collagène dans le milieu de culture, ce qui laisse supposer un arrêt de la synthèse du collagène dans le témoin sénescence.

20 Au contraire, le TGF J3-1 à la dose de 10 ng/ml stimule de façon importante la synthèse du collagène avec une forte reprise de la sécrétion de collagène dans le milieu de culture. Ce résultat valide le modèle expérimental utilisé. Par contre, la quantité de collagène sécrétée dans le milieu de culture cellulaire, ne semble pas varier avec la concentration de produit étudié selon l'invention, alors que le 25 taux de collagène présent dans la matrice extra-cellulaire augmente significativement avec concentration du produit à étudier selon l'invention. De fortes concentrations de ylinolénate de tocophérol semblent donc favoriser l'accumulation de collagène dans la matrice extra-cellulaire.

30 Conclusions Dans les conditions expérimentales retenues, la préparation cosmétique à base de ylinolénate de tocophérol présente un effet stimulant sur la synthèse du collagène traduisant un effet de protection.

35 2907673 7 Exemple 2 : Etude de l'effet des préparations cosmétiques à base de y-linolénate de tocophérol sur la prolifération et la viabilité de fibroblastes humains 5 prématurément vieillis Méthode Les fibroblastes hurnains à faible passage en culture soumis à différents phénomènes de stress à des doses sub-cytotoxiques tels que les ultra-violets, le peroxyde 10 d'hydrogène, le terbutyl hydroperoxyde (t-BHP) ou l'éthanol présentent un phénotype semblable à celui de cellules sénescentes c'est à dire ayant épuisé leur potentiel à se diviser dans des conditions de culture pratiquées en laboratoire. Ce phénomène est appelé sénescence induite prématurément par phénomène de stress ( SIPS) et se caractérise en particulier par une modification de la morphologie des fibroblastes, une 15 augmentation du nombre des cellules présentant une activité p-galactosidase associée à la sénescence (AS f3-Gal) et un arrêt irréversible de la prolifération en phase G1 ainsi qu'il a été décrit par O. Toussaint et al. Exp. Gerontol 2000. Ainsi qu'il a été exposé à l'exemple 1, un maintien de la prolifération et un maintien de la viabilité d'une culture de fibroblastes humains ayant été traités avec du y-linolénate 20 de tocophérol peut donc être considérée comme un marqueur de la protection des cellules. Mode d'essai ^ Cellules utilisées : les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau 25 humaine adulte (femme de 47 ans) au passage 2. Trois dilutions de chaque échantillon ont été testées à raison de huit puits par concentration. 30 b) Eléments de référence Les témoins suivants sont inclus à chaque analyse : ^ témoin négatif : les cellules n'ont subi aucun traitement ^ témoin de sénescence : les cellules sont exposées aux agents de stress (H202 , 200 pM ; 2 h) 35 2907673 8 Déroulement de l'essai 5 a) mise en contact des cellules avec le y-linolénate de tocophérol et induction du stress Les cellules sont ensemencées à raison de 10.000 cellules/cm2. Après 24 h de culture, elles sont traitées avec le produit à étudier. Après 48 heures de contact, les cellules sont lavées avec du tampon PBS puis soumises à un phénomène de stress par H202 200 pM pendant 2 heures. to b) Etude de la prolifération 72 heures après induction du phénomène de stress et sur le passage suivant, la prolifération est évaluée à l'aide du Kit Oeil Proliferation ELISA BrdU, Roche). Il a pour principe de déterminer l'incorporation de bromodeoxyuridine (BrdU) dans l'ADN au 15 moment de sa réplication. La bromodeoxyuridine incorporée est détectée par une réaction antigène/anticorps, anti-BrdU, couplée à une peroxydase. La révélation de la réaction se fait au moyen de tetramethyl benzidine (TMB) et une lecture au photomètre à 450 nm. 20 c) Etude de la viabilité La viabilité des cellules est évaluée dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1, par mesure de l'activité de la succinate deshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. Cet enzyme a pour rôle de convertir le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) en cristaux de formazan de couleur bleue. Après 25 redissolution de ces cristaux, on procède à une lecture au spectrophotomètre. Les absorbances mesurées de la solution bleue sont proportionnelles au nombre de cellules vivantes. Résultats 30 a) Etude de la prolifération L'absorbance mesurée est proportionnelle à la quantité de BrdU incorporé et est comparée à celle des différents témoins (témoin négatif et témoin de sénescence). 35 2907673 9 b) Etude de la viabillité L'absorbance est mesurée à 540 nm. Les résultats sont exprimés sous forme de 5 pourcentage de viabilité par rapport aux cellules qui n'ont subi aucun traitement (témoin négatif). Le pourcentage de viabilité est exprimé comme suit : % = Abs cellules stressées + échantillons x 100 to Abs témoins négatifs c) Résultats Les résultats obtenus sont rassemblés au tableau 2 et dans l'histogramme n 2 figurant 15 en annexe. Les valeurs obtenues montrent nettement un effet sur la viabilité des cellules après phénomène de stress sur les cellules avec une perte d'environ 40 % par rapport au témoin négatif. Le y-Iinolénate de tocophérol selon l'invention permet de protéger les cellules vis-à-vis 20 du stress. On observe seulement une perte de viabilité de 16 % en présence de 50 pg/ml de y-Iinolénate et 0 % de mortalité à la dose de 500 pg/ml. La perte de viabilité constatée à la dose de 1000 pg/ml peut s'expliquer par un effet cytotoxique du produit testé à une concentration aussi élevée sur les cellules sénescentes.

25 Le maintien de la viabilité des cellules sous l'action du y-linolénate de tocophérol trouve une confirmation par l'étude de la prolifération par incorporation de BrdU. On constate une incorporation significative de BrdU par rapport aux témoins sénescences. Cette incorporation n'est toutefois pas dose-dépendante.

30 Conclusion Dans les conditions expérimentales retenues, les préparations cosmétiques à base de y-linolénate de tocophérol présente bien un effet sur la prolifération des cellules et sur la viabilité des cellules. Le produit selon l'invention amène donc bien un effet de protection dans le modèle expérimental retenu.

35 2907673 10 Exemple 3 : Etude de l'effet du y-linolénate de tocophérol selon l'invention sur la cicatrisation d'une mono-couche de fibroblastes humains prématurément 5 vieillis Méthode Les fibroblastes humains à faible passage en culture soumis à différents types de stress à des doses sub-cytotoxiques tels que les ultra violets, le peroxyde d'hydrogène, 10 le terbutyl hydroperoxyde ou l'éthanol, présentent un phénotype semblable à celui des cellules sénescentes c'est à dire ayant épuisé leur potentiel à se diviser dans des conditions de culture dans les conditions du laboratoire. L'étude se propose de tester l'effet du produit cosmétique selon l'invention sur la capacité de migration des cellules dans une rayure effectuée dans une mono-couche 15 de fibroblastes humains prématurément vieillis. La migration des cellules peut être considérée comme le marqueur d'une activité de protection du y-linolénate de tocophérol testé dans les conditions expérimentales utilisées. Mode expérimental 20 Les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau humain adulte (femme, 58 ans de type causasien) au passage 7. Trois dilutions de chaque échantillon ont été essayées à raison de 3 puits par concentration.

25 Les témoins suivants sont inclus dans chaque série d'essais : ^ témoins négatifs : les cellules n'ont subi aucun traitement ^ témoins de sénescence : les cellules sont exposées à des phénomènes de stress (H2O2 ; 200 pM ; 2 h).

30 Déroulement de l'essai Mise en contact des cellules avec le y-linolénate de tocophérol selon l'invention et induction des phénomènes de stress. Les cellules sont ensemencées à raison de 10.000 cellules/cm2. Après 24 heures de culture, elles sont traitées par le produit selon l'invention. Après 48 heures de contact, 35 2907673 11 les cellules sont lavées avec une solution de tampon PBS puis soumises au stress par H202 (200 pM pendant 2 heures).

5 Etude de la migration cellulaire Le nombre de cellules a été évalué 72 heures après l'induction du stress et sur le passage suivant, on procède à une rayure de 1 mm de large au moyen d'une pointe de pipette stérile sur la couche cellulaire. 24 heures après, les cellules sont colorées à l'aide d'un colorant vital (rouge neutre) afin de faciliter le comptage au microscope à to inversion de phases. Les cellules ayant migré dans la rayure sont dénombrées sur 2 cm de longueur. Résultats L'activité du produit selon l'invention est exprimée en pourcentage de protection selon 15 l'équation : % de protection du produit = (N cellules après traitement par le y-linolénate) -(N cellules témoin de sénescence) x 100 20 N cellules témoin négatif Les résultats obtenus sont mis en évidence dans le tableau 3 figuré en annexe. On peut observer une bonne différenciation entre le témoin négatif et le témoin de sénescence sénescence (2272 cellules et 493 cellules respectivement ayant migrées).

25 En présence de y-linolénate de tocophérol selon l'invention (100 pg/ml et 500 pg/ml respectivement) on constate une migration cellulaire significative et dosé-dépendante ; ce qui traduit une action protectrice du produit selon l'invention vis-à-vis du stress de 24 % et de 56 % respectivement. Il est intéressant de noter qu'à 1000 pg/ml, on ne constate aucune action protectrice 30 bien qu'aucune cytotoxicité n'ait été relevée dans une étude préliminaire. Au contraire, il semblerait qu'à une dose aussi élevée de produit, l'effet de stress se trouve accentué (284 cellules démontrées à 1000 pg/ml au lieu de 493 pour les témoins de sénescence). En conclusion dans les conditions expérimentales utilisées, le produit cosmétique à 35 base de y-linolénate de tocophérol selon l'invention- manifeste un effet sur la migration 2907673 12 des cellules dans une rayure pratiquée sur une mono-couche de fibroblastes prématurément vieillis aux concentrations de 100 et de 500 pg/ml traduisant un effet 5 protecteur sur le module expérimental utilisé. Exemple 4: Effet du y-linolénate de tocophérol sur l'induction de l'activité 13-galactosidaseassociée à la sénescence sur des fibroblastes humains prématurément vieillis l0 Méthode On a constaté que les fibroblastes humains à faible passage en culture soumis à différents types de stress à des doses subcytotoxiques, tels que les rayons UV, le peroxyde d'hydrogène, le terbutyl hydroperoxyde ou l'éthanol présentent un phénotype 15 semblable à celui des cellules sénescentes c'est à dire qu'ils ont épuisé leur aptitude à se diviser dans des conditions de culture en laboratoire. Ce phénomène est dénommé sénescence induite prématurément par stress (SIPS) et se caractérise notamment par une modification de la morphologie des fibroblastes, un arrêt de la prolifération en phase G1 et par une augmentation du nombre de cellules présentant une activité (3- 20 galactosidase associée à la sénescence (AS (3-Gal) telle que décrite par O. Toussaint et al. Exp. Gerontol 2000). Une baisse de l'activité AS p-Gal d'une culture de fibroblastes humains vieillis ayant été traités par le y-linolénate de tocophérol selon l'invention peut donc être considérée comme un marqueur de la protection des cellules.

25 Technique d'essai Les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau humaine adulte (femme, 58 ans) au passage 7. Les échantillons à trois dilutions différentes sont testés à raison de trois puits par 30 concentration. Les témoins suivants sont inclus lors de chaque analyse : - témoins négatifs : les cellules ne subissent aucun traitement - témoins de sénescence : les cellules sont exposées à un type de stress (H2O2 ; 200 pM ; 2 h).

35 2907673 13 Déroulement de l'étude Les cellules sont ensemencées à raison de 10.000 cellules/cm2. Après 24 heures de culture, elles sont traitées avec le y-linolénate de tocophérol selon l'invention. Après 48 heures de contact, les cellules sont lavées avec du tampon PBS puis soumises au stress par H202 (200 pM ; pendant 2 heures). Détection et quantification de l'activité AS Q-Gal Le nombre des cellules est évalué 72 heures après l'induction du stress et sur le passage suivant les cellules sont fixées au formaldéhyde. Elles sont ensuite mises en to incubation avec la solution de coloration (X Gal 1 mg/ml) pendant 12 à 16 heures. Les puits de culture sont observés à inversion de phases. Les cellules colorées en bleu (cellules positives pour l'activité AS (3-Gal) sont dénombrées sur au moins 400 cellules observées par puits selon la technique décrite par G. P. Dimri et al. (froc. Natl.

15 Acad Sci ; USA 1995 ) Résultats La quantité de cellules positives pour l'activité AS R-Gal (cellules colorées en bleu) est exprimée en pourcentage de protection de la manière suivante : % de produit du produit = AS a-Gal sans traitement - AS p-Gal avec traitement par le produit x 100 AS f3-Gal sans traitement 25 Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 4 ci-après annexé. Ces résultats montrent une bonne discrimination entre le témoin négatif et le témoin de sénescence (9,9 % et 39,8 % d'activité AS R-Gal respectivement selon la technique décrite par Chainiaux et al.

1JBCB 2002.

30 En présence de y-linolénate de tocophérol selon l'invention à la dose de 100 pg/ml et de 500 pg/ml, on observe une diminution significative et fonction de la dose (dose û dépendante) de l'activité AS p-Gal qui traduit une protection vis-à-vis du stress de 30,7 % et de 57,8 % respectivement. Par contre, on note comme pour les autres tests à la dose de 1000 dag/ml, une absence 35 de protection alors qu'aucune cytotoxicité n'a été décelée lors de l'étude préliminaire.

20 2907673 14 Conclusions Dans les conditions expérimentales utilisées, le y-linolénate de tocophérol selon l'invention manifeste nettement un effet sur l'activité AS {3-Gal aux concentrations de 5 100 pg/ml et de 500 pg/ml, ce qui traduit un effet de protection dans les conditions expérimentales utilisées. Exemple 5 : Recherche d'une activité cytotoxique du y-linolénate de tocophérol selon l'invention sur des fibroblastes humains normaux en culture On a évalué par un test in vitro la capacité éventuelle du produit cosmétique selon l'invention à induire des effets cytotoxiques sur une culture primaire de fibroblastes humains normaux.

15 Méthode Après application du produit cosmétique sur les cellules pendant 48 heures, la viabilité cellulaire a été évaluée par la mesure de l'activité de la succinate-déshydrogénase mitochondriale de cellules vivantes. Cet enzyme convertit le bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium (MTT) en formazan bleu sous forme de 20 cristaux. Après redissolution de ces cristaux, on effectue une mesure spectrophotométrique. Les absorbances mesurées sont proportionnelles au nombre de cellules vivantes (Mosmann J. Immunol. Meth. 1983, 55-63). Essai 25 Cinq dilutions de chaque échantillon ont été testées à raison de 7 puits de test par concentration. Un témoin négatif (milieu de culture) est inclus dans chaque analyse. Résultats L'absorbance a été mesurée à 540 nm. Les résultats obtenus sont exprimés sous 30 forme de pourcentage de mortalité en comparaison avec le témoin négatif selon l'équation : "/o mortalité = Abs témoin négatif û Abs produit x 100 lo 35 Abs témoin négatif 2907673 15 Les résultats obtenus ont été rassemblés dans le tableau 5 figuré en annexe. Ils montrent que même à la dose élevée de 500 dag/ml le produit selon l'invention ne manifeste pas de toxicité. Il en est de même aux autres concentrations étudiées. 5 25

Claims (12)

REVENDICATIONS

1.-Utilisation en cosmétique d'esters d'acide gras de tocophérol de formule générale I. CH3 dans laquelle R est le reste d'une chaîne aliphatique d'un acide gras comportant au moins une double liaison éthylénique et n est un nombre entier égal à 1 ou à 2, en vue de la réalisation d'une préparation à action cicatrisante et/ou réparatrice.

2.- Utilisation cosmétique selon la revendication 1, dans laquelle le tocophérol est choisi parmi l'a-tocophérol, le J3-tocophérol, le y-tocophérol et le â-tocophérol.

3.- Utilisation cosmétique selon la revendication_ 1 ou la_rev_endication 2, dans laquelle le tocophérol est une substance racémique ou se présente sous forme optiquement active.

4.- Utilisation cosmétique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle 20 l'ester d'acide gras de tocophérol est en association avec une ou plusieurs substances actives sur la synthèse du collagène.

5. Utilisation cosmétique selon la revendication 4, dans laquelle la substance active sur la synthèse du collagène est un extrait de Centella asiatica.

6. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 à 5, sous forme d'une composition destinée à l'application locale.

7- Utilisation en cosmétique selon l'une des revendications précédentes, sous forme 30 d'une composition liquide, pâteuse, fluide ou pulvérulente. 15 2907673 17

8- Utilisation en cosmétique selon l'une des revendications précédentes, sous forme de gel, de crème, d'émulsion H/E ou E/H, de lotion, de pommade, de poudre, de lotion capillaire, de spray, d'ampoule, de sérum ou de patch. 5

9- Utilisation en cosmétique selon l'une des revendications précédentes, sous forme d'une composition destinée à l'application locale dans laquelle la concentration en ester d'acide gras de tocophérol varie de 0,5 à 5 %.

10- Utilisation en cosmétique selon la revendication 4, dans laquelle la concentration io en agent promoteur de la synthèse du collagène varie de 0,1 à 1 % de la masse totale.

11- Utilisation en cosmétique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'ester d'acide gras de tocophérol est le y-linolénate d'a-tocophérol.

12- Utilisation en cosmétique selon l'une des revendications précédentes en vue de la production d'une préparation à action cicatrisante et/ou réparatrice caractérisée en ce qu'elle est formée d'une association de y-linolénate d'a. -tocophérol et d'extrait de Centella asiatica.20