FR2879461A1 - Utilisation d'une fraction lipopolysaccharidique de bacterie filamenteuse non fructifiante non photosynthetique comme agent immunoregulateur cutane. - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'une fraction lipopolysaccharidique de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique comme agent immunorégulateur cutané, en particulier, pour maintenir et/ou rétablir l'équilibre immunitaire de la peau.

Description

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'une fraction de

lipopolysaccharides (LPS) de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique comme agent immunorégulateur et/ou pour la préparation d'une composition renfermant un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, notamment destinée à prévenir et/ou

limiter l'apparition des déséquilibres immunitaires cutanés, en particulier, liés aux stress de l'environnement.

Divers extraits de Vitreoscilla frliformis dotés de propriétés immunostimulantes non spécifiques ont été décrits par la Demanderesse en vue d'une utilisation cosmétique ou pharmaceutique, en particulier dans le traitement des signes cutanés du vieillissement. C'est le cas des demandes EP 0 604 631 et EP 0 765 667 qui utilisent, respectivement, des extraits de bactéries filamenteuses non fructifiantes, et une fraction de ces bactéries riche en ribosomes obtenue par centrifugation de la biomasse et dialyse du surnageant obtenu.

La demande EP 0 876 813 décrit une fraction immunostimulante obtenue à partir du milieu de culture de ces bactéries. La demande WO 94/02158 divulgue l'utilisation d'enveloppe de bactéries ou de fractions, notamment de LPS, obtenues à partir desdites enveloppes comme agent stimulant du système immunitaire.

Enfin, la demande EP 1 400 237 décrit un activateur pouvant être un extrait total de Vitreoscilla filiformis pour améliorer la résistance de la peau aux effets non spécifiques de l'activation du complément Cependant, aucune de ces demandes ne décrit de propriété immunorégulatrice de la fraction LPS de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique.

Or, il existe des pathologies reposant non pas sur une insuffisance de cellules immunitaires mais sur un déséquilibre immunitaire, c'est le cas, en particulier des maladies atopiques et des maladies autoimmunes qui présentent, respectivement, un excès de lymphocytes Th-2 et un excès de lymphocytes Th-1.

La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment superficiel, l'épiderme et un compartiment profond, le derme.

L'épiderme est composé principalement de trois types de cellules qui sont les kératinocytes (majoritaires), les mélanocytes et les cellules de Langerhans qui jouent un rôle primordial dans la réponse immunitaire et en particulier dans la présentation antigénique.

Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes et des macrophages tissulaires. Enfin, Le derme est traversé par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses.

La peau constitue une barrière contre les agressions extérieures, notamment chimiques, mécaniques, et à ce titre un certain nombre de réactions de défense contre les facteurs environnementaux (climat, rayons ultraviolets, tabac, pollutions...) et/ou les xénobiotiques (comme par exemple certains médicaments) se produisent à son niveau. De plus, la peau est le siège de réactions allergiques telles qu'observées dans les cas d'eczémas de contact ou d'eczémas atopiques.

Différents facteurs, tels que les polluants atmosphériques, les détergents, les allergènes, les rayonnements UV..., affectent négativement, par leur action au niveau de la peau, une variété de réponses immunes aussi bien localement au niveau du site d'exposition, qu'au niveau systémique, à des sites distants. Cette forme d'immunosuppression est liée notamment, à l'induction de cellules T suppresseur spécifiques d'antigène. L'altération de la réponse retardée est particulièrement importante car les réactions immunitaires générées par les lymphocytes T sont responsables de la protection contre de nombreuses pathologies chroniques infectieuses. Ces altérations du système immunitaire sont liées notamment, à la production induite par les UV, de médiateurs immunosuppresseurs tels que la cytokine IL-10 ou encore le neuromédiateur CGRP.

A côté de ces effets immunosuppresseurs au niveau de la peau, les expositions UV génèrent des réactions strictement inflammatoires, qui peuvent entraîner le développement d'un érythème, d'un oedème et/ou d'une hyperkératose. Ces réactions inflammatoires et/ou d'irritation sont bien différentes des effets des UVs préalablement mentionnés, et, à l'inverse de l'immunosuppression, ces réactions sont liées à une stimulation d'acteurs spécifiques du système immunitaire.

Dans l'art antérieur, des thérapies existent pour diminuer les effets délétères des UV sur l'immunité de la peau telles que des écrans solaires ou des agents pharmacologiques.

Des études ont confirmés le fait que, si certains écrans solaires sont efficaces pour prévenir de l'induction des érythèmes et des oedèmes, ils ne permettent pas de prévenir de façon satisfaisante la photoimmunosuppression (Dumay O et al. Br J Dermatol, 144 (6): 1161-1168, 2001; Kelly D et al. J Exp Med 191(3): 561-566, 2000; Baron ED et al. J Invest Dermatol, 121 (4) : 869-875, 2003).

Par ailleurs, les agents thérapeutiques utilisés classiquement dans le traitement des inflammations et des irritations de la peau tels que les corticoïdes et les AINS (indométacine, acide acétyle salicylique.. .) ne protègent pas le système immunitaire contre les UV. Qui plus est, comme suggéré par Berstresser et al (J Clin Invest 98(1) : 142-147, 1996), l'application locale de corticoïdes réduit en générale la réponse immunitaire de la peau.

Il apparaît donc que les produits capables de diminuer les inflammations et les irritations de la peau ne peuvent protéger le système immunitaire cutané.

Par ailleurs, la prévalence des maladies atopiques (accompagnées d'une présence excessive de lymphocytes de type Th-2 telles que la dermatite atopique, les allergies gastrointestinales, les rhinites et conjonctivites allergiques, l'asthme) et des maladies auto-immunes (accompagnées d'une présence excessive de lymphocytes de type Th-1 telles que le psoriasis, le vitiligo, la sclérodermie diffuse, le lupus érythémateux, certaines formes de pelades, la polyarthrite rhumatoïde, le diabète de type I) a augmenté progressivement durant les dernières décennies dans les sociétés occidentales. L'explication qui est apparue la plus plausible concernant l'augmention des affections liéesà Th-2 est l'hypothèse hygiéniste qui suggère que l'augmentation rapide des eczémas atopique est liée à la propreté actuelle des environnements et à la diminution de l'exposition aux microbes au début de la vie (Holt PG, In Nestlé Nutrition Workshop series Pediatric Program, Isolauri E et al ed, Allergic diseases and the environment, Karger AG, Base], vol 53 pp53-68, 2004).

Au cours de la réaction de type allergique qui peut être expliquée par une réorientation des réactions immunes du type Th-1 vers des réponses du type Th-2, l'interaction entre l'hôte sain et l'allergène est altérée. La réaction allergique s'accompagne alors d'un déséquilibre de la réponse immunitaire qui pourra alors être induite par les bactéries résidentes (Martinez FD, Respir Res: 2:129-132, 2001).

Ces troubles atopiques sont des réactions inflammatoires chroniques et souvent systémiques d'origine complexe (facteurs génétiques et d'environnement). Dans ces pathologies, les réponses des cellules T auxiliaires de type 2 (Th-2) à des antigènes (allergènes) inoffensifs de l'environnement jouent un rôle déterminant dans le déclenchement des troubles allergiques (Romagnani S, Curr Opin Immunol 6:838-846, 1994). Les cellules Th-2 expliquent l'intervention conjointe, dans le processus inflammatoire allergique des cellules B produisant des immunoglobulines E (par l'intermédiaire de la production d'interleukine IL-4 et d'IL-13), et des mastocytes (par l'intermédiaire de la production d'IL-5).

Les cellules Th-2 déterminent en outre d'autres aspects physiopathologiques de l'allergie et de l'asthme. L'IL-4, I'IL-9 et FIL13 peuvent en effet induire une hypersécrétion de mucus et contribuer, en association avec l'IL-5, à l'augmentation de l'hyperréactivité des voies aériennes. Enfin, l'IL-4, l'IL-5, l'IL-9 et l'IL-13, avec l'IL-1 1 produite par les éosinophiles et les cellules épithéliales et l'IL-6 produite par plusieurs types de cellules, y compris les Th-2 elles-mêmes, sont également responsables de la fibrose sous épithéliale et du remodelage des voies aériennes (Romagnani S, In Nestlé Nutrition Workshop series Pediatric Program, Isolauri E et al ed, Allergic diseases and the environment, Karger AG, Basel, vol 53 pp69-95, 2004). Ainsi, des réponses des cellules Th-2 à des allergènes fréquents dans l'environnement peuvent expliquer directement ou indirectement presque tous les aspects physiopathologiques de l'allergie et de l'asthme (Romagnani S, J Allergy Clin Immunol 105:399-408, 2000).

Des facteurs chimiotactiques peuvent de plus, provoquer directement une activation cellulaire et une libération de médiateurs inflammatoires par les éosinophiles et les basophiles et également promouvoir le recrutement sélectif, dans le tissu enflammé, des diverses sous populations de cellules effectrices, notamment cellules Th-2, basophiles, éosinophiles, et mastocytes (Gangur V, Ann Allergy Asthma Immunol 2000; 84:569-581). Les taux des cytokines Th-2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13), des chimiokines qui attirent les cellules Th-2 (CCL17, CCL22) des récepteurs chimiotactiques essentiellement exprimés par les cellules Th-2 (CCR4, CCR8) ou des facteurs chimiotactiques des cellules Th-2 (CRTh2) ainsi que des facteurs de transcriptions spécifiques de la différentiation des cellules Th-2 (GATA-3), sont augmentés dans les organes cibles de l'inflammation allergique, alors que l'expression des cytokines Th-1 (IFN- y) et facteurs de transcription spécifiques des cellules Th-1, tels T-box exprimés dans les cellules T-bet, est réduite dans les tissus des sujets allergiques, comparativement aux sujets sains (Nakamura Y, J AIIery Clin Immunol 2000; 105:1146-1152; Finotto S, Science 2002; 295:336-338; Ray A, J Clin Invest 1999; 104:995-1006).

Actuellement de nouvelles stratégies thérapeutiques non spécifiques des allergènes, visant les molécules liées aux Th-2, ainsi que des traitements immunologiques destinés à supprimer ou à corriger les réponses Th-2 spécifiques des allergènes sont à l'étude (Parronchi P, Curr Topics Microbiol Immunol 1999; 238:27-56).

Ainsi différentes modalités de traitement ont été proposées, elles appartiennent aux catégories suivantes: 1) cytokines spécifiques des Th-1 (ie: IFN-y) ; 2) immunosuppresseurs ou inhibiteurs de transcription des cytokines aspécifiques (ie: cyclosporine A et Tacrolimus) ; 3) inhibiteurs de cellules Th-2 spécifiques (ie: dimethylsulfonium dérivés du suplastast) ; 4) inducteurs des réponses Th-I (ie: photothérapie (psoralène et UVA) et herbes médicinales chinoises (Hochu-ekki-to)) ; et 5) anticorps anti-cellule T, anticorps anti-IL4, certains antagonistes des récepteurs des cytokines ou chimiokines. Ces thérapeutiques sont différentes dans leur efficacité et dans les effets secondaires qu'elles peuvent engendrer, dont entre autres, le développement de pathologies auto-immunes par augmentation de l'activité des cellules Th-1, l'inhibition des Th-2 ou l'inhibition de toutes réactions liés aux cellules T (immunosuppresseurs).

De plus, il est important ici de souligner que si il y a actuellement une augmentation des pathologies allergiques liées aux cellules de type Th-2, dans le même temps, il est observé dans les pays en développement une augmentation des pathologies liés aux cellules Th-1 (maladies auto-immunes, tels que le diabète de type 1, le psoriasis, le vitiligo).

Les cellules de type Th-1 ont un rôle important dans le développement de la réaction d'hypersensibilité retardée (HSR), ainsi lors de certaines maladies chroniques auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïdes et la thyroïdite, les lésions cutanées observées sont de type HSR, et les cellules CD4 T au sein de celles-ci sont principalement du type Th-l. Des résultats identiques ont été obtenus au cours de maladies infectieuses dues à des mycobactéries (tuberculose, lèpre), au cours de la maladie de Lyme et au cours du psoriasis.

Aussi, il apparaît qu'une thérapie qui permettrait de réorienter la réponse immunitaire allergique Th-2 ou autoimmune Th-1 vers un équilibre physiologique conduirait à des produits dont l'application topique pourrait induire une régulation des phénomènes immunitaires locaux.

De manière inattendue, la demanderesse a maintenant trouvé que certaines fractions de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosyntétique étaient capables corriger un déséquilibre immunitaire, qu'il soit lié à un excès de cellules de type Th-1 ou un excès de cellules de type Th-2.

Ainsi la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une fraction lipopolysaccharidique (LPS) de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique en tant qu'agent immunorégulateur, notamment pour prévenir et/ou limiter l'apparition des désordres cutanés que tout déséquilibre immunitaire provoque.

L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une fraction lipopolysaccharidique de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique comme agent immunorégulateur cutané destiné à maintenir et/ou rétablir l'équilibre immunitaire de la peau.

Cette fraction lipopolysaccharidique pourra en particulier être destinée à diminuer les démangeaisons.

Par agent immunorégulateur, on entend un agent capable de maintenir et/ou de rétablir un équilibre immunitaire cutané entre les populations des cellules de type Th-1 et de type Th-2, c'est-à-dire de maintenir une balance équilibrée entre les populations des cellules Th-1 et Th-2 et/ou de corriger une présence excessive en cellules de type Th-1 ou à l'inverse corriger une présence excessive en cellules de type Th-2, comme, par exemple, dans le cas d'une peau soumise à des conditions de stress conduisant à un déséquilibre immunitaire.

Un déséquilibre immunitaire pourra notamment être mis en évidence par l'augmentation dans un organisme d'une ou plusieurs cytokines caractéristiques d'un type de lymphocyte.

En effet, en plus de leur classification selon la structure de leur récepteur T, les lymphocytes de type Th-1 et de type Th-2 ont été classés selon leur profil de cytokines.

Les cytokines caractéristiques des lymphocytes de types 1 (Th-1) sont IL-2, IFN-y, le TNF-13. Les cytokines des lymphocytes de type 2 (Th- 2) sont l'IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13 10 Par conditions stressantes, on entend un stress physique tel que les radiations UV, un stress chimique, tel que l'exposition à des agents chimiques ou des allergènes ou bien un stress biologique tel que l'exposition à des microorganismes pathogènes (bactéries, virus, levures).

Les fractions lipopolysaccharidiques de bactéries selon l'invention sont préparées à partir de bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes telles que définies selon la classification du Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (vol. 3, section 23, 9 édition, 1989), parmi lesquelles on peut citer les bactéries appartenant à l'ordre des Beggiatoales, et plus particulièrement les bactéries appartenant aux genres Beggiatoa, Vitreoscilla, Flexithrix ou Leucothrix.

Parmi les bactéries dont le LPS constitue un ingrédient actif tel que défini selon l'invention, on citera plus particulièrement les bactéries appartenant à l'ordre des Beggiatoales, et notamment les bactéries appartenant au genre Beggiotoa, telles que par exemple diverses souches de Beggiotoa alba suivant le définition de B. alba correspond aux anciennes appellations Beggiotoa arachnoidea, B. gigantea, B leptomiformis, B minima, B. mirabilis du Bergey's manual, 8e'ne édition. On peut citer par ailleurs les bactéries appartenant au genre Vitreoscilla, dont on sait qu'il est proche et souvent difficilement discernable du genre Beggiatoa. Les bactéries qui viennent d'être définies, et dont plusieurs ont été décrites, ont généralement un habitat aquatique, et peuvent être trouvées notamment dans les sources d'eau thermale.

Parmi les bactéries utilisables, on peut citer par exemple, Vitreoscilla beggiatoïdes (ATCC43 181) et Beggiatoa a/ha (ATCC33555) Et préférentiellement selon l'invention la fraction LPS issu d'un extrait de Vitreoscilla frliforrnis, en particulier, la souche ATCC15551, est revendiquée.

II est connu que la culture des bactéries filamenteuses non photosynthétiques et non fructifiantes est relativement difficile, de même que l'obtention de cultures pures. On utilisera préférentiellement la culture décrite dans la demande de brevet WO 94/02158.

Différentes méthodes permettent d'isoler la fraction d'intérêt contenant les LPS: - la méthode modifiée phénol-eau (Johnson et Perry 1975, Can J Microbial 22, p29) ; - la méthode de Darveau et Hancock (1983, J Bact 155, p831) qui utilise le SDS pour solubiliser les LPS, ce qui permet de les séparer du peptidoglycane insoluble. Les protéines sont éliminées de la fraction contenant les LPS par une digestion 15 enzymatique (pronase), la fraction de LPS est ensuite précipitée à l'éthanol; - La méthode d'extraction utilisant la protéinase K. La méthode modifiée phénol-eau sera utilisée de préférence pour la préparation de l'extrait lipopolysaccharidique selon l'invention, un exemple de mise en oeuvre de cette méthode est décrit dans l'exemple 1.

De préférence, l'agent immunorégulateur sera formulé dans une composition cosmétique ou pharmaceutique destinée à être appliquée topiquement sur la peau, le cuir chevelu ou les muqueuses.

L'objet de la présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une fraction lipopolysaccharidique de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique pour la préparation d'une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable destinée à prévenir et/ou corriger l'apparition des déséquilibres immunitaires cutanés.

En particulier, la composition pourra être destinée à prévenir et/ou corriger l'hyper réactivité cutanée et les peaux allergiques.

L'hyper réactivité peut se définir comme une peau intolérante et irritable. La peau intolérante est une peau qui réagit par des sensations d'échauffement, de tiraillements, de fourmillements et/ou de rougeurs, à différents facteurs tels que l'application de produits cosmétiques ou dermatologiques ou de savon. En général, ces signes sont associés à un érythème. La peau irritable est une peau qui réagit par un prurit, c'està-dire par des démangeaisons ou par des picotements, à différents facteurs tels que l'environnement, les émotions, les aliments, le vent, les frottements, le rasoir, l'eau dure à forte concentration de calcaire, les variations de température ou la laine.

Les déséquilibres immunitaires cutanés peuvent conduire à des désordres cutanés tels que les désordres utopiques cutanés ou les maladies autoimmunes cutanées.

Ainsi, la composition comprenant la fraction lipopolysaccharidique selon l'invention peut être utilisée pour prévenir et/ou traiter des désordres atopiques cutanés, la dermatite utopique, l'eczéma utopique, la conjonctivite allergique ou les maladies autoimmunes cutanées tels que l'hypersensibilité retardée de contact (encore appelée dermite de contact) , le psoriasis ou le vitiligo, le lupus érythémateux, la sclérodermie diffuse, certaines formes de pelades.

Les compositions utilisées selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes adaptées aux applications envisagées, notamment par voie topique, dans les domaines cosmétiques et dermatologiques.

La composition selon l'invention peut ainsi être appliquée topiquement sur toute zone cutanée du corps, de la peau, du cuir chevelu ou des muqueuses et se présenter sous toute forme galénique adaptée par l'homme du métier. Elle peut se présenter notamment sous forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse ou huileuse, d'une émulsion huile- dans-eau ou eaudans-huile ou multiple, d'une émulsion siliconée, d'une microémulsion ou nanoémulsion, d'un gel aqueux ou huileux ou d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide.

Pour une application topique sur la peau, la composition peut avoir la forme notamment de solution aqueuse ou huileuse ou de dispersion du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semi- liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse 2879461 lo dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle du type crème ou gel aqueux ou anhydre, ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Elle peut également être présentée sous forme de patch ou de système à libération contrôlée. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.

Elles peuvent être également utilisées pour les cheveux sous forme de solutions aqueuses, alcooliques ou hydroalcooliques, ou sous forme de crèmes, de gels, d'émulsions, de mousses ou encore sous forme de compositions pour aérosol comprenant également un agent propulseur sous pression.

Les quantités des différents constituants des compositions selon l'invention sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés.

Ces compositions constituent notamment des crèmes de nettoyage, de protection, de traitement ou de soin pour le visage, pour les mains, pour les pieds, pour les grands plis anatomiques ou pour le corps, (par exemple crèmes de jour, crèmes de nuit, crèmes démaquillantes, crèmes de fond de teint, crèmes anti-solaires), des masques à laisser poser sur la peau ou les cheveux, des fonds de teint fluides, des laits de démaquillage, des laits corporels de protection ou de soin, des laits anti-solaires, des lotions, gels ou mousses pour le soin de la peau, comme des lotions de nettoyage, des lotions anti-solaires, des lotions de bronzage artificiel, des compositions pour le bain, des compositions désodorisantes comprenant un agent bactéricide, des gels ou lotions après- rasage, des crèmes épilatoires, des compositions pour traiter certaines maladies de la peau comme l'eczéma, le psoriasis.

Les compositions selon l'invention peuvent également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.

Les compositions peuvent aussi être conditionnées sous forme de composition pour aérosol 30 comprenant également un agent propulseur sous pression. ll

La composition selon l'invention peut aussi être une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous forme de shampooings colorants, des lotions restructurantes pour les cheveux, une composition de permanente (notamment une composition pour le premier temps d'une permanente), une lotion ou un gel antichute, un shampooing antiparasitaire, etc. La composition peut aussi être à usage buccodentaire, par exemple une pâte dentifrice. Dans ce cas, la composition peut contenir des adjuvants et additifs usuels pour les compositions à usage buccal et notamment des agents tensioactifs, des agents épaississants, des agents humectants, des agents de polissage tels que la silice, divers ingrédients actifs comme les fluorures, en particulier le fluorure de sodium, et éventuellement des agents édulcorants comme le saccharinate de sodium.

Lorsque la composition est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 % à 80 % en poids, et de préférence de 5 % à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les cires, les émulsionnants et les coémulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine cosmétique. L'émulsionnant et le coémulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en poids, et de préférence de 0,5 % à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition. L'émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques.

Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter 25 plus de 9 % du poids total de la composition.

De façon connue, la composition cosmétique peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les additifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine cosmétique, et par exemple de 0, 01 % à 10 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérules lipidiques.

Comme huiles ou cires utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles ou cires siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers), les cires d'abeille, de carnauba ou paraffine. On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stéarique).

Comme émulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la dénomination de TefoseR 63 par la société Gattefosse.

Comme solvants utilisables dans l'invention, on peut citer les alcools inférieurs, notamment l'éthanol et l'isopropanol, le propylène glycol.

Comme gélifiants hydrophiles utilisables dans l'invention, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les Bentones , les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium et la silice hydrophobe, éthylcellulose, polyéthylène.

La quantité d'activateur de fraction de LPS de bactérie filamenteuse non fructifiante présente dans les compositions selon l'invention sera adaptée par l'homme du métier pour obtenir l'activité immunorégulatrice. A titre indicatif, la quantité de LPS de bactérie filamenteuse non fructifiante dans les compositions sera comprise entre 0, 0001% et 10% en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence de 0,001 à 2%; en particulier elle sera d'au moins 0,01%.

La composition peut contenir d'autres actifs choisis parmi - les anti-inflammatoires; - les cytokines spécifiques des cellules de type Th1 (ie: IFN-y) ; - les immunosuppresseurs tels que des inhibiteurs de transcription des cytokines aspécifiques (inhibiteurs de calcineurine) (ie: cyclosporine A et Tacrolimus) ; - les inhibiteurs de cellules Th-2 spécifiques (ie: dimethylsulfonium dérivés du suplastast) ; - les inducteurs des réponses Th-1 (ie: photothérapie (psoralène et UVA) et herbes médicinales chinoises (Hochu-ekki-to)) ; - les anticorps anticellule T, anticorps anti-1L4, certains antagonistes des récepteurs des cytokines ou des chimiokines: - les antibactériens; - les antagonistes deneuropeptides; - les extraits de levures (tels que.Saccharomyces cerevisiae) ; - les extraits de bactéries Gram tels que des probiotiques) ; - les adjuvants de Freud; - des eaux thermales; - les solutions de goudron.

La composition peut également associer la fraction lipopolysaccharidique à des agents allergènes.

Par allergène ont entend des antigènes de l'environnement qui peuvent entraîner chez des personnes prédisposées des réactions allergiques. Lors des eczémas de contact allergique, retrouvés le plus communément, les allergènes sont alors des antigènes incomplets de faible poids moléculaire ou haptènes qui deviennent immunogènes après fixation sur des protéines. Chez les sujets sensibilisés, le contact ultérieur avec l'haptène entraîne l'activation des lymphocytes de type Th l.

Les allergènes responsables de ce type de réaction sont très nombreux, et ils peuvent avoir des origines qui peuvent être vestimentaires, cosmétologiques, médicamenteux, 30 professionnels.

Les agents cosmétiques potentiellement allergènes selon réactivité de la peau de l'utilisateur sont les agents kératolytiques ou agents exfoliants, les agents dépigmentants, les agents oxydants, les agents réducteurs, les agents comédolytiques. Et même certains composés qui sont considérés comme inertes dans une composition cosmétique ou dermatologique, tels que par exemple les conservateurs, les tensioactifs, les parfums, les solvants ou les propulseurs, peuvent présenter un caractère allergène lorsqu'ils sont appliqués sur les matières kératiniques, ce caractère irritant dépendant là encore du composé utilisé et de la réactivité de la peau de l'utilisateur.

Avantageusement, la composition selon l'invention comprendra des nanosphères ou des microsphères, telles que décrits par exemple dans les demandes de brevet EP447318, EP557489, EP1 151741, EP1201219 ou WO 97/12602.

L'invention a également pour objet un procédé cosmétique pour améliorer la l'équilibre immunitaire cutané, caractérisé en ce qu'on applique topiquement au moins une fraction de LPS de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosythétique.

Exemple 1 - Préparation d'un extrait de Vitreoscilla filiformis contenant des LPS (MA Apicella, J Mc Leod Gritliss and H Schneider, 1994, Methods in enzymology, vol 235, 242-252) Technique au phénol modifiée: Préparation des lipopolysaccharides bruts A 5 g de bactéries Vitreoscilla filiformis (ATCC 15551) congelées ou séchées à l'acétone sous forme de poudre sont ajoutés 25 ml de tampon 50 mM phosphate de Na pH7 contenant 5 mM d'EDTA, le mélange est agité.

Sont alors réalisées les étapes suivantes: - ajout de 100 mg de lysosyme, agitation pendant l nuit à 4 C, puis incubation à 37 C pendant 20 min; centrifugation pendant 3 min à basse vitesse; - ajustement du volume à 100 ml avec du tapon phosphate de Na (50 mM) à pH 7 contenant 20 mM MgCl2; ajout de Rnase, Dnase (à 1 mg/ml), incubation pendant 60 min à 37 C puis pendant 60 min à 60 C; - la suspension bactérienne est alors placée dans un bain à 70 C, et on lui ajoute un volume égal de phénol 90% (\y/Ni) préchauffé à 70 C; - elle est refroidie par agitation pendant 15min dans un bain glacé ; - centrifugation à 18 000g pendant 15min à 4 C.

Une interface marquée se fait entre les phases aqueuse et phénolique. La phase aqueuse 10 contient les lipopolysaccharides, après dialyse contre l'eau, cette phase est lyophilisée. Purification des lipopolysaccharides bruts à 35 mg des lipopolysaccharides/ml d'eau distillée sont centrifugés à basse vitesse (1100g, 5min). Le surnageant obtenu est alors centrifugé à haute vitesse (105 000g, 16h, 4 C). Le culot est suspendu dans de l'eau, la centrifugation est répétée jusqu'à obtenir des lipopolysaccharides purifiés. Le culot final est resuspendu dans de l'eau puis lyophilisé.

EXEMPLE Formulations Composition sous forme de crème On a préparé une crème ayant la composition suivante: - Fraction LPS selon l'exemple 1 0,03 g - Huile de vaseline 20 g - Acide stéarique 3 g -Alcool cétylique 3 g Stéarate de polyéthylèneglycol à 100 OE 5 g - Propylèneglycol 3 g Conservateur 0,3 g - Eau purifiée qsp 100 g Composition Fraction LPS de l'exemple 1 0.05 g Acide Stéarique 3.0 g Alcool Cétylique 1.5 g Monostéarate de glycérol auto-émulsionnable 3.0 g Huile de Tournesol 8.0 g Polyacrylamide 3.0 g Octyl Méthoxyccinamate 4.0 g Sel de Triéthanolamine de l'acide téréphalylidène dicamphor 2.6 g sulfonique (Mexoryl SX) Glycérol 5.0 g Tocophérol 2.0 g Conservateurs 0.3 g Pentasodium Etylènediaminetétraméthylène Phosphonate 0.1 g Eau Purifiée QSP 100.0 g Crème de soin Fraction LPS selon l'exemple 1 0.2 Stéarate de Glycérol 1.00 PEG 100 Stéarate 1.00 Acide Stéarique 1.00 Alcool Cétylique 2.00 Huile de Soja 3.00 Huile de Palme 2.00 Cyclométhicone 2.00 Diméthicone 1.00 Polyacrylamide 0.20 Glycérol 3.00 Méthyl Paraben 0.20 Parfum qsp 100.00 Eau Stérile Déminéralisée qsp Crème régénératrice pour le visage Fraction LPS selon l'exemple 1 - Carbomer 940e (acide polyacrylique réticulé) - Triéthanolamine - Acide stéarique - Alcool cétylique Monostéarate de glycérol autoémulsionnable - Huile de soja - Alcool de lanoline - Myristate d'isopropyle - 2-éthylhexanoate de cétyle et de stéaryle - Perhydrosqualène - Paraffine - Glycérine - Conservateurs - Eau Pour préparer cette crème, on chauffe la phase conservateurs et l'eau à 80 C on y disperse le Carbomer 940 qui est ensuite neutralisé par la triéthanolamine. La phase grasse, chauffée et homogénéisée à 80 C, est introduite sous vive agitation dans la phase aqueuse. L'extrait de l'exemple est dispersé dans 10 g d'eau et introduit à 40 C dans la crème, sous agitation. L'ensemble est refroidi jusqu'à température ambiante.

Gel pour le soin du visage Fraction LPS selon l'exemple 1 Hydroxypropylcellulose (Klucel H vendu par la société Hercules) Antioxydant I sopropanol Conservateur Eau 0,1 % 0,3 % 0,3 % 3,0 % 2,0 % 3, 0 % 10,0% 2,0 % 4,0 % 4,0 % 3,0 % 2,0 % 3,0 % 0,3 % qsp 100 aqueuse contenant la glycérine, les 0,05 % 1,00% 0,05 % 40,00 % 0,30 % qsp 100 % Ce gel est obtenu par mélange des constituants dans l'eau avec l'ajout, en dernier lieu du gélifiant.

Comme pour la composition 1, il peut être appliqué deux fois par jour, il est particulièrement adapté à une application le matin car ne laisse pas la peau grasse.

Crème de nuit réparatrice Fraction LPS selon l'exemple 1 0,5 eYo Conservateurs 1,35 % Sodium citrate 0,035 PEG-40 1,25 % Pentaerythrityl tetraethylhexanoate 4% Glycerin 7% Sorbitan tristearate 0,3 % Prunus Armeniaca (abricot) Kernel oil 2% Cetyl alcohol 0,7 % Propylene glycol 2% Triethanolamine 0,4 GYo Cyclohexasiloxane 2% Carbomer 0,75 % Tocopherol 1% Silica 2% Ascorbyl glucoside 0,1 % Eau Titanium dioxide silica alumina 3% Polycaprolactone bêta carotène 5% Eau qsp 100% Creme apaisante Fraction LPS selon l'exemple 1 1% - bisabolol 0,5% - extrait d'aloé vera 1% - stéarate de glycérol 2% 20 - polysorbate 60 (Tween 60 de la société ICI) 1,00% - acide stéarique 1,4% - triéthanolamine 0,7% - carbomer 0,4% huile de tournesol 10,00% - parfum 0,50% - conservateur 0, 30% - eau qsp 100% Formulation pour application sur le cuir chevelu Lotion non rincée Fraction LPS selon l'exemple 1 0,2 g Aminexil 1,5 g Propylène glycol 22,8 g Ethanol95 55,1 g Eau purifiée qsp 100 g Lotion non rincée Fraction LPS selon l'exemple 1 0,1 g Extrait de San Qi 0,1 g Propylène glycol 22,8 g Ethanol95 55,1 g Eau purifiée qsp 100 g Lotion anti-chute Fraction LPS selon l'exemple 1 0,1 g Minoxidil 2 g Propylène glycol 22,8 g Ethanol 95 55,1 g Eau purifiée qsp 100 g Crème régénératrice - Fraction LPS selon l'exemple I 0,1 % - extrait de San Qi 0,05 % - Carbomer 9400 (acide polyacrylique réticulé) 0,3 - Triéthanolamine 0,3 % - Acide stéarique 3,0 % - Alcool cétylique 2,0 % - Monostéarate de glycérol autoémulsionnable 3,0 % - Huile de soja 10,0 % - Alcool de lanoline 2,0 % - Myristate d'isopropyle 4,0 cYo - 2- éthylhexanoate de cétyle et de stéaryle 4,0 % Perhydrosqualène 3,0 % - Paraffine 2,0 % - Glycérine 3,0 % Conservateurs 0,3 % - Eau qsp 100 Pour préparer cette crème, on chauffe la phase aqueuse contenant la glycérine, les conservateurs et l'eau à 80 C; on y disperse le Carbomer 940 qui est ensuite neutralisé par la triéthanolamine. La phase grasse, chauffée et homogénéisée à 80 C, est introduite sous vive agitation dans la phase aqueuse. L'extrait de l'exemple est dispersé dans 10 g d'eau et introduit à 40 C dans la crème, sous agitation. L'ensemble est refroidi jusqu'à température ambiante.

Cette crème est appliquée sur la peau du visage et du cou une à deux fois par jour.

Lait pour le soin du visa e des peaux sèches et hyper réactives Fraction LPS selon l'exemple I 0,10 Ascorbate de magnésium 3,00 Huile de pépin de cassis 4,00 Huile de bourrache 4,00 Lactobacillus sp. sous forme lyophilisée 5,00 Stéarate de glycérol 1,00 Alcool cétylstéarylique/alcool cétylstéarylique oxyéthyléné à 33 moles OE (Sinnowax AO vendu par la société Henkel) 3,00 Alcool cétylique 1,00 Diméthicone (DC 200 Fluide vendu par la société Dow Corning) 1,00 Huile de vaseline 6,00 Myristate d'isopropyle (Estol 1PM 1514 vendu par Unicherna) 3,00 Glycérine 20,00 Conservateur 0,30 Eau qsp 100 Lotion pour le visage des peaux hyper réactives Fraction LPS selon l'exemple 1 0,50 Poudre de Lactobacillus sp. sous forme lyophilisée 5,00 Gluconate de magnésium 3,00 Lactate de calcium 2,00 Antioxydant 0,05 Isopropanol 40,0 Conservateur 0,30 Eau qsp 100 % Lotion pour le visage des peaux hyper réactives Fraction LPS selon l'exemple 1 0,50 Poudre de Bifidobacillus sp. sous forme lyophilisée 5,00 Gluconate de magnésium Lactate de calcium Antioxydant Isopropanol Conservateur Eau Gel pour le soin du visage des peaux hyper réactives Fraction LPS selon l'exemple 1 Hydroxypropylcellulose (Klucel H vendu par la société Hercules) Extrait de lactobacillus sp.

Gluconate de magnésium Linoléate de calcium Huile de pépins de cassis Huile d'Onagre Huile de bourrache Antioxydant Isopropanol Vitamine C Antioxydant Isopropanol Conservateur Eau qsp 100 % (% en poids) 0,10 1, 00 5,00 3,00 2,00 5,00 2,00 5,00 0,05 40,00 2,50 0,05 40,00 0,30 qsp 100, 00 EXEMPLE 3 - Mise en évidence de l'effet immunomodulateur de l'extrait selon l'invention Les essais sont réalisés avec la fraction de LPS obtenue selon l'exemple 1 et comparée avec 30 le surnageant soluble de la biomasse totale.

1) Mesure de l'action de la fraction de LPS et du surnageant soluble de la biomasse totale de Vitreoscilla filiformis sur la maturation des cellules dendritiques immatures Préparation des cellules dendritiques Des poches de sang (350 ml) provenant de sujets sains non apparentés ont été fournies par l'Hopital de Tübingen puis les cellules mononuclées ont été obtenues par centrifugation sur Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Norvège). Ces cellules (10' cellules /ml) ont été incubées avec des anticorps anti-CD3 (Pharmingen, San Diego, CA) et anti-CD14 (Pharmingen, san Diego, CA) pendant 30min dans la glace et les cellules qui ont été marquées par les anticorps ont été retirés en utilisant des billes magnétiques (M450, Dynal, Oslo, Norvège). Ainsi les cellules CD37CD14" ont été incubés avec des anti-CD4 conjugués à des microbilles (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Allemagne), et les cellules CD4+ ont été enrichies en utilisant des colonnes de séparation magnétique Mini MACS (Miltenyi Biotec). Par cette technique, le pourcentage de cellules dendritiques (<1% de toutes les cellules mononuclées du sang périphériques) augmente à 40-50% et peut atteindre par passage successif à une purification de 90% avec obtention de cellules dendritiques précurseurs (HLADR+, TCRalpha/beta; CD14-, CD56", CD19-).

Ces cellules dendritiques précurseurs ont ensuite été cultivées dans des plaques de 96 puits à Ix]05cellules/puits dans un milieu RPMI supplémenté avec du GM-CSF afin de les faire maturer. Leur maturation a ensuite été étudiées en utilisant des analyses par cytométrie en flux afin d'analyser à leur surface les molécules du CMH et les plus importantes molécules de costimulation B7-1 et B7-2. De plus, des analyses intracellulaires par cytométrie et ELISA ont aussi été faite afin d'étudier l'état de différentiation de ces cellules dendritiques par étude de la production de cytokines et de chimiokines produites (IL-12, IL-10...).

A la place d'utiliser du GM-CSF, les cellules dendritiques immatures ont été mises en contact avec des extraits de Vitreoscilla filiformis ou du LPS de Vitreoscilla filiformis, et une analyse identique de l'état de maturation a été faite.

- Analyse des antigènes de surface par cytométrie de flux à l'aide de marqueurs immunofluorescents suivants: molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, B7-1 (CD80), B7-1(CD86), des récepteurs des chimiokines (CCRI à CCR7; CXCRI à CXCR5) ; - Quantification des cytokines et chimiokines extra et intracellulaires par cytométrie de flux et ELISA (IL-10. IL-12, ligands de CCR4, de CXCR3, CCR5).

Cette analyse de la maturation par le LPS et des extraits de Vitreoscilla filiformis a été comparée à celle entraînée par des molécules connues contrôles (lipopeptides, LPS de E coli, CPG-ADN non méthylé, phospholipides, le peptide n-formyl-methionine-n-formyl- methionin).

2) Les cellules dendritiques maturées et activées par le LPS ou des extraits de Vitreoscilla filiformis ont ensuite étaient mise en contact avec des cellules T naïves ou Th-2. 10 Pour cela il a fallu au préalable préparer les cellules T: Préparation des lymphocytes T allogéniques: Des poches de sang (350 ml) provenant de sujets sains non apparentés ont été fournies par l'Hôpital de Tübingen. Les cellules mononuclées ont ensuite été obtenues par centrifugation sur Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Norvège). Ces cellules (l 0' cellules /ml) ont été déposées dans une boite de Pétri et une incubation de 2h à 37 C a permis l'adhérence des monocytes. Puis les lymphocytes T ont été purifiés en utilisant leur propriété à former des rosettes en présence d'hématies de mouton (GRM). Les GRM ont ensuite été éliminées par un choc osmotique en présence de NH4CI (8,7 mg/ml). Dans tous les cas, la viabilité des suspensions de lymphocytes T a été supérieure à 95%.

Dans cette étude, les lymphocytes ont été préparés à partir de trois poches de sang et congelés dans l'azote liquide avant leur utilisation. Nous avons utilisé les lymphocytes T provenant d'un même donneur tout au long de l'étude.

Cultures lymphocytaires mixtes Les cultures lymphocytaires mixtes (CML) ont été réalisées dans des microplaques à fond rond de 96 puits dans du milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum AB humain, d'antibiotiques et d'indométacine (1 g/ml). Les cellules dendritiques maturées et activées préalablement ont été distribuées dans les puits en début de culture à raison de 50 000 Cellules/puits dans 100 pl de milieu. Puis ont été ajouté 105 lymphocytes T (dans 100 pl). Chaque essai a est réalisé en triple ou quadruple exemplaire et les contrôles comportent des lymphocytes T ou des cellules dendritiques, seuls. La prolifération lymphocytaire a été mesurée du Sème au 6ème jour de culture par l'incorporation de 1 Ci de thymidine tritiée (5 Ci/mmole). Les cellules T ont été récoltées sur filtres et la radioactivité incorporée a été mesurée à l'aide un compteur (3 (Matrix, Packard Instruments). Les résultats sont exprimés en moyenne SD des coups/minute (cpm) obtenus dans les différents essais.

De plus une analyse du phénotype, des molécules de surface, des cytokines afin de connaître la modulation par les Cellules dendritiques sur les lymphocytes T. Plus précisément, avec action du LPS de Vitreoscilla filiformis et de l'extrait de Vitreoscilla filiformis et ses fractions et action de molécules connus comme influençant la maturation des cellules dendritiques tels que lipopeptides, LPS d'E.coli, CPG-DNA non méthylé, phospholipids, peptide n-formyl-methionine-n-formyl- methionin.

Analyses: - des marqueurs de surface par cytométrie de flux à l'aide de marqueurs immunofluorescents: CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CCR10, CXCR3, PSGL1 - des cytokines intra et extracellulaire par cytometrie et ELISA: IFN-gamma, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 - et des molécules de surface associés au développement des T régulateurs par cytométrie de flux à l'aide de marqueurs immunofluorescents (CTLA-4, Foxp3...) Ces essais mettent en évidence l'effet qualitatif de la maturation des cellules dendritiques par le LPS de Vitreoscilla filiformis et la biomasse sur la différentiation des cellules T.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'au moins une fraction lipopolysaccharidique de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique comme agent immunorégulateur cutané destiné à maintenir 5 et/ou rétablir l'équilibre immunitaire de la peau.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite fraction est destinée à diminuer les démangeaisons.

3. Utilisation d'au moins une fraction lipopolysaccharidique de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique pour la préparation d'une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, ladite composition étant destinée à prévenir et/ou corriger les déséquilibres immunitaires cutanés.

4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à diminuer un excès de cellules Th-2.

5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir et/ou traiter les désordres atopiques cutanés.

6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que les désordres atopiques cutanés sont choisis parmi la dermatite atopique, l'eczéma atopique.

7. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à 25 diminuer un excès de cellules de type Th-1.

8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir et/ou traiter les maladies autoimmunes cutanées.

9. Utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que les maladies autoimmunes cutanées sont choisies parmi l'hypersensibilité retardée de contact, le psoriasis, le vitiligo, la sclérodermie diffuse, le lupus érythémateux ou certaines pelades.

10. Utilisation d'au moins une fraction lipopolysaccharidique de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique pour la préparation d'une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, ladite composition étant destinée à prévenir et/ou corriger l'hyper réactivité cutanée.

11. Utilisation selon la revendication 3 ou 10, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à traiter les peaux allergiques.

12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique est Vitreoscilla filiformis.

13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à être appliquée topiquement sur la peau, les muqueuses ou le cuir chevelu.

14. Composition comprenant au moins une fraction lipopolysaccharidique de bactérie filamenteuse non fructifiante non photosynthétique et au moins un agent allergène.