FR2876916A1

FR2876916A1 - Implantable product, useful for osseous reconstruction, comprises phosphorus dendrimers immobilized on the functionalized surface

Info

Publication number: FR2876916A1
Application number: FR0411332A
Authority: FR
Inventors: Veronique Santran; Christian Rey; Christophe Drouet
Original assignee: MIDI PYRENEES INCUBATEUR
Current assignee: MIDI PYRENEES INCUBATEUR
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2004-10-25
Publication date: 2006-04-28
Anticipated expiration: 2024-10-25
Also published as: FR2876916B1

Abstract

Implantable product (I) for osseous reconstruction, having a biomaterial surface and treated to favor an integration of (I) in the osseous site, comprises phosphorus dendrimers, exposing the peripheral sequences with anionic terminations, immobilized on the functionalized surface. An independent claim is also included for the preparation of (I) (for osseous reconstruction), comprising immobilization of phosphorus dendrimers exposing peripheral sequences with anionic terminations on an (I) surface (i.e. the surface to be functionalized). ACTIVITY : Osteopathic. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

PRODUIT IMPLANTABLE DE SURFACE FONCTIONNALISEE AU MOYEN DEIMPLANTABLE SURFACE PRODUCT FUNCTIONALIZED BY MEANS OF

DENDRIMERES A TERMINAISONS ANIONIQUES DENDRIMERES WITH ANIONIC TERMINATIONS

L'invention a trait à la réparation du tissu osseux. Elle concerne 5 plus particulièrement le domaine technique des biomatériaux, des implants et prothèses utilisés en chirurgie réparatrice du tissu osseux, notamment chirurgie orthopédique. The invention relates to the repair of bone tissue. It relates more particularly to the technical field of biomaterials, implants and prostheses used in bone repair surgery, including orthopedic surgery.

Dans tout le texte, on entend par: - "produit implantable" : un dispositif médical de type implant ou 10 prothèse, une partie constitutive de ce dispositif médical, ou un dispositif assurant le maintien en place et/ou la stabilisation d'un des éléments précédemment cités, au niveau du site d'implantation; - "biomatériau" : un matériau constitutif d'un dispositif médical invasif (chirurgical ou non chirurgical) et/ou d'un produit implantable, selon les termes définis dans la classification française et européenne (classe I, IIa, IIb, III) ; ces biomatériaux sont biocompatibles, peuvent présenter des propriétés de bioactivité, de biodégradation, des propriétés biomécaniques de résistance, d'élasticité... ; - "un groupement de type phosphonate" : une séquence ionique qui comprend un groupement terminal correspondant à une base conjuguée d'un 20 groupement phosphonique P(OH)2, éventuellement associée à un cation organique ou minéral, notamment un proton (H+), - "un groupement de type carboxylate" : une séquence ionique qui comprend un groupement terminal correspondant à la base conjuguée d'un groupement carboxylique E Cu ô -0E11, éventuellement associée à un cation organique ou minéral, notamment un proton (H+). Throughout the text, the following terms mean: - "implantable product": a medical device of the implant or prosthesis type, a constituent part of this medical device, or a device ensuring the retention and / or stabilization of one of the previously mentioned elements, at the site of implantation; - "biomaterial": a material constituting an invasive medical device (surgical or non-surgical) and / or an implantable product, according to the terms defined in the French and European classification (class I, IIa, IIb, III); these biomaterials are biocompatible, may have properties of bioactivity, biodegradation, biomechanical properties of resistance, elasticity ...; "a phosphonate group" means an ionic sequence which comprises a terminal group corresponding to a conjugate base of a phosphonic group P (OH) 2, optionally combined with an organic or inorganic cation, in particular a proton (H +), "a carboxylate group" means an ionic sequence which comprises a terminal group corresponding to the conjugate base of a carboxylic group E Cu δ -OE11, optionally combined with an organic or inorganic cation, in particular a proton (H +).

La matrice extra-cellulaire calcifiée du tissu osseux est le siège d'un remodelage permanent qui se caractérise par deux activités biologiques opposées, la formation d'os nouveau par les ostéoblastes, et la dégradation (résorption) d'os ancien par les ostéoclastes. Ce remodelage osseux assure la croissance de l'os au cours du développement de l'individu, la réparation de l'os après un traumatisme ou une fracture, le maintien qualitatif et quantitatif de la masse osseuse et l'homéostasie du calcium sérique de l'organisme. De nombreux évènements peuvent pourtant perturber cette homéostasie osseuse. The calcified extra-cellular matrix of bone tissue is the site of permanent remodeling, which is characterized by two opposite biological activities, osteoblast formation of new bone, and osteoclast degradation (resorption) of old bone. This bone remodeling ensures the growth of the bone during the development of the individual, the repair of the bone after trauma or fracture, the maintenance of quality and quantity of bone mass and the homeostasis of serum calcium in the body. 'organization. Many events can however disturb this bone homeostasis.

Dans certains cas graves de troubles traumatiques ou pathologiques, par exemple, des fractures non consolidées, des maladies génétiques osseuses (maladie de Paget, ostéogénèse imparfaite, dysplasie fibreuse de l'os...), des malformations du squelette qui peuvent être innées ou induites (par exemple, par une activité physique néfaste ou encore à la suite d'une chimiothérapie)..., la sévérité de la perte de la substance osseuse peut se révéler telle que les capacités naturelles de l'os à se reconstituer soient insuffisantes et qu'une chirurgie réparatrice du tissu osseux (greffe de tissus ou implantation de matériaux osseux synthétiques de substitution) particulièrement lourde en soit le seul remède. In some serious cases of traumatic or pathological disorders, for example, unconsolidated fractures, genetic bone diseases (Paget's disease, osteogenesis imperfecta, fibrous dysplasia of the bone ...), skeletal malformations that may be innate or induced (for example, by harmful physical activity or following chemotherapy) ..., the severity of the loss of bone substance may be such that the natural capacity of the bone to rebuild is insufficient and that bone repair surgery (tissue grafting or implantation of synthetic synthetic bone substitute material) is particularly cumbersome and the only remedy.

Actuellement, la chirurgie réparatrice du tissu osseux concerne plus d'un million de personnes à travers le monde, et ce nombre ne cesse de croître d'année en année. Currently, bone repair surgery affects more than one million people worldwide, and this number continues to grow year by year.

Parmi les différentes techniques employées pour tenter de réparer les tissus osseux, on peut citer la greffe (autogreffe ou allogreffe) qui donne généralement de bons résultats du fait des propriétés ostéogènes intrinsèques aux greffons, mais est assortie de limites inéluctables. S'agissant de l'autogreffe, la quantité de greffons autologues est particulièrement limitée. L'allogreffe, quant à elle, est immunogène et n'est jamais exempte de risques graves d'infection. Among the various techniques used to try to repair the bone tissue, we can mention the transplant (autograft or allograft) which usually gives good results because of the osteogenic properties intrinsic to the grafts, but is accompanied by unavoidable limits. As regards autografting, the quantity of autologous grafts is particularly limited. Allogeneic transplantation is immunogenic and is never free from serious risks of infection.

Une autre technique consiste à remplacer le tissu osseux traumatisé ou malade, dans son intégralité ou plus spécifiquement seulement la partie touchée, par un dispositif médical implantable réalisé en un biomatériau de type titane, zircone, et leurs alliages, alliage cobalt-chrome, bioverres, phosphates de calcium, carbonates de calcium, les polypeptides cellulosiques, l'alginate le polyéthylène glycol (PLG), les copolymères des acides lactiques et glycoliques (PLGA), le hyaluronate, le collagène, la gélatine, le chitosane, la fibrine, l'agarose, les acides polyacryliques et leurs dérivés, les oxydes de polyéthylène et leurs copolymères, les alcools polyvinyliques, les polyphosphazènes... Par ailleurs, pour favoriser et/ou accélérer la réhabilitation osseuse au niveau du site d'implantation, différents traitements physiques et/ou chimiques ont été imaginés pour améliorer les performances interfaciales de ces produits implantables. Another technique consists in replacing the traumatized or diseased bone tissue, in its entirety or more specifically only the affected part, with an implantable medical device made of a titanium-type zirconia biomaterial, and their alloys, cobalt-chromium alloy, bioglass, calcium phosphates, calcium carbonates, cellulosic polypeptides, alginate polyethylene glycol (PLG), copolymers of lactic and glycolic acids (PLGA), hyaluronate, collagen, gelatin, chitosan, fibrin, agarose, polyacrylic acids and their derivatives, polyethylene oxides and their copolymers, polyvinyl alcohols, polyphosphazenes ... Moreover, to promote and / or accelerate bone rehabilitation at the implantation site, various physical treatments and / or chemicals have been devised to improve the interfacial performance of these implantable products.

Par exemple, il a été proposé de fonctionnaliser la surface des produits implantables en les recouvrant de molécules bio-adhésives, de facteurs d'adhésion ou de molécules fonctionnellement analogues. US 2002/10111694 et US 6,280,760 proposent d'utiliser des séquences peptidiques de type RGD, c'est-à-dire des enchaînements peptidiques avec un motif de résidus arginine-glycine-acide aspartique, spécifiquement reconnu par les intégrines. US 2003/015385 propose de recouvrir les produits implantables d'une fine couche de chitosan. For example, it has been proposed to functionalize the surface of implantable products by covering them with bio-adhesive molecules, adhesion factors or functionally analogous molecules. US 2002/10111694 and US 6,280,760 propose the use of RGD peptide sequences, i.e. peptide sequences with a motif of arginine-glycine-aspartic acid residues, specifically recognized by integrins. US 2003/015385 proposes to cover the implantable products with a thin layer of chitosan.

WO 98/36782 et FR 2 138 735 préconisent, quant à eux, de traiter la surface des produits implantables de façon à accentuer leur porosité et ainsi favoriser d'autant plus la pénétration du tissu. WO 98/36782 and FR 2 138 735 advocate, in turn, to treat the surface of the implantable products so as to increase their porosity and thus further promote penetration of the tissue.

Jusqu'à présent, les perfectionnements ainsi apportés aux produits implantables ont permis tout au plus d'améliorer leurs propriétés d'ostéoconduction, c'est-à-dire leur capacité à favoriser l'attachement des cellules à leur surface, ce qui, éventuellement in fine, peut conduire à une meilleure pénétration du tissu osseux au niveau du site d'implantation. Toutefois, les résultats jusqu'alors obtenus se sont avérés souvent décevants; la formation ainsi que la reconstruction du tissu osseux requièrent une série d'évènements de grande complexité et ne se limitent aucunement à une étape d'adhésion des cellules à la surface des produits implantables. Up to now, the improvements thus made to the implantable products have allowed at most to improve their osteoconduction properties, that is to say their ability to promote the attachment of the cells to their surface, which, possibly ultimately, can lead to better penetration of bone tissue at the site of implantation. However, the results so far achieved have often been disappointing; the formation and reconstruction of the bone tissue require a series of highly complex events and are not limited to a step of adhesion of the cells to the surface of the implantable products.

La réhabilitation du tissu osseux commence par le recrutement et la prolifération de cellules souches ostéoprogénitrices qui s'accompagne d'une différenciation cellulaire concomitante à la formation d'ostéoïdes et à la minéralisation de l'os. Le terme d'ostéoinduction résume ces différentes notions. Rehabilitation of bone tissue begins with the recruitment and proliferation of osteoprogenitor stem cells that is accompanied by concomitant cell differentiation in osteoid formation and mineralization of the bone. The term osteoinduction summarizes these different notions.

Dans ce contexte, l'invention a pour principal objectif de proposer de nouveaux produits implantables destinés à la reconstruction osseuse, susceptibles de présenter des propriétés améliorées en terme d'ostéoinduction et, éventuellement, d'ostéoconduction. In this context, the main objective of the invention is to propose new implantable products intended for bone reconstruction, which may have improved properties in terms of osteoinduction and, possibly, osteoconduction.

L'invention vise notamment à atteindre cet objectif en proposant des produits implantables destinés à la reconstruction osseuse qui soient capables de favoriser au moins une activité biologique participant au processus de remodelage du tissu osseux et/ou au processus de pénétration du tissu osseux, choisie parmi: la prolifération des cellules du tissu osseux et/ou leur différenciation; et/ou de modifier avantageusement les propriétés physico-chimiques d'un implant par une meilleure qualité de l'interface implant/tissu osseux et/ou par l'augmentation des capacités de nucléation des phosphates de calcium à la surface de cet implant. The invention aims in particular to achieve this objective by proposing implantable products intended for bone reconstruction which are capable of promoting at least one biological activity participating in the bone remodeling process and / or the process of penetration of the bone tissue, chosen from : the proliferation of bone tissue cells and / or their differentiation; and / or to advantageously modify the physicochemical properties of an implant by improving the quality of the implant / bone tissue interface and / or by increasing the nucleation capacities of calcium phosphates on the surface of this implant.

En particulier, l'invention vise à mettre au point un procédé, de mise en oeuvre simple, permettant de fonctionnaliser la surface des produits implantables, en vue d'améliorer leurs performances interfaciales d'ostéoinduction et, éventuellement, d'ostéoconduction. Elle a également pour vocation à s'appliquer, dans les grandes lignes, à des produits implantables réalisés dans des biomatériaux classiques au regard du domaine technique de la chirurgie réparatrice du tissu osseux. In particular, the invention aims to develop a method, simple to implement, to functionalize the surface of implantable products, to improve their osteoinduction interfacial performance and, possibly, osteoconduction. It is also intended to apply, broadly, to implantable products made in conventional biomaterials with regard to the technical field of bone repair surgery.

L'invention concerne donc un produit implantable de reconstruction du tissu osseux ayant au moins une surface réalisée en au moins un biomatériau et traitée de façon à favoriser une intégration dudit produit implantable en site osseux. Selon l'invention, sur cette surface, dite surface fonctionnalisée, sont immobilisés des dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s). Par la suite, à des fins de simplification, ces dendrimères selon l'invention pourront être désignés par l'expression "dendrimères à terminaisons anioniques". The invention therefore relates to an implantable bone tissue reconstruction product having at least one surface made of at least one biomaterial and treated so as to promote integration of said implantable product into bone site. According to the invention, on this surface, called said functionalized surface, are immobilized phosphorus dendrimers exposing peripheral sequences with anionic termination (s). Subsequently, for simplification purposes, these dendrimers according to the invention may be designated by the term "anionic-terminated dendrimers".

Avantageusement et selon l'invention, l'immobilisation desdits dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) 25 anionique(s), sur ladite surface, est réalisée par adsorption. Advantageously and according to the invention, the immobilization of said phosphorus dendrimers exposing anionic terminal (s) peripheral sequences on said surface is carried out by adsorption.

L'invention repose ainsi sur une application innovante des dendrimères à la fonctionnalisation des surfaces des produits implantables destinés à la reconstruction osseuse. En l'espèce, l'invention par l'utilisation de dendrimères à terminaisons anioniques permet d'établir, à la surface des produits implantables, un environnement favorable à la pénétration du tissu osseux en mimant la matrice extra- cellulaire de l'os et en particulier la phase matricielle de l'os, formée de fibres de collagène et de protéines associées. The invention thus relies on an innovative application of dendrimers to the functionalization of the surfaces of implantable products intended for bone reconstruction. In the present case, the invention by the use of anionic-terminated dendrimers makes it possible to establish, on the surface of the implantable products, an environment favorable to the penetration of the bone tissue by mimicking the extracellular matrix of the bone and in particular the matrix phase of the bone, formed of collagen fibers and associated proteins.

Dans l'os naturel, les fibres de collagène établissent des interactions avec de nombreuses protéines de la matrice extra-cellulaire et fournissent ainsi une surface inductrice de nucléation et/ou de formation de cristaux de phosphates de calcium apatitiques. Parmi les protéines associées aux fibres de collagène, nombreuses ont été caractérisées pour leur participation dans le remodelage du tissu osseux. Il s'agit, pour la plupart, de protéines anioniques et/ou de protéines acides (anioniques à pH physiologique). In natural bone, collagen fibers interact with many extracellular matrix proteins and thus provide an inducing surface for nucleation and / or formation of apatitic calcium phosphate crystals. Many of the proteins associated with collagen fibers have been characterized for their involvement in bone remodeling. Most of these are anionic proteins and / or acidic proteins (anionic at physiological pH).

A titre d'exemple, l'ostéopontine et l'ostéonectine sont deux protéines ayant toutes deux la particularité de présenter des domaines de liaison de forte affinité au calcium (Ca2+), et de médier la fixation cellulaire via des motifs peptidiques du type RGD. L'ostéopontine et l'ostéonectine ont été également identifiées comme étant des substrats de la transglutaminase, une enzyme qui crée des liaisons y-amide entre les groupements 'y-carboxoamide des peptides et la glutamine, et agit en réticulant la matrice environnante par activation du Ca2+ rencontré dans l'espace extra-cellulaire. For example, osteopontin and osteonectin are two proteins both of which have the particularity of presenting high affinity binding domains to calcium (Ca 2+), and of mediating cell attachment via peptide motifs of the RGD type. Osteopontin and osteonectin have also been identified as substrates for transglutaminase, an enzyme that creates γ-amide linkages between the γ-carboxamide moieties of peptides and glutamine, and acts by cross-linking the surrounding matrix by activation. Ca2 + encountered in extracellular space.

Plus particulièrement, l'ostéopontine (ou "bone sialoprotein") est une protéine acide. Le segment acide du résidu d'acide aspartique qu'elle contient, permet la liaison au Ca2+ et sert ainsi d'agent nucléateur de cristaux de phosphates de calcium à structure apatitique. Le résidu d'acide aspartique fixateur de Ca2+ est d'ailleurs inclus dans le motif RGD de cette protéine. More particularly, osteopontin (or "bone sialoprotein") is an acidic protein. The acid segment of the aspartic acid residue that it contains allows Ca 2+ binding and thus serves as a nucleator for calcium phosphate crystals with an apatite structure. The aspartic acid residue fixing Ca2 + is also included in the RGD motif of this protein.

L'ostéonectine est une protéine acide, riche en résidus cystéine. Entre autre, elle médie, elle aussi, la déposition d'apatite. Osteonectin is an acidic protein, rich in cysteine residues. Among other things, she also meditates the apatite deposition.

D'autres protéines, également présentes dans la matrice extra-cellulaire de l'os, comme des chondroïtine sulfate-protéoglycannes (CS-PGIII) qui s'associent également au collagène et favorisent la minéralisation. Other proteins, also present in the extracellular matrix of bone, such as chondroitin sulfate-proteoglycans (CS-PGIII) that also associate with collagen and promote mineralization.

Les phosphoprotéines, riches en résidus sérine, thréonine et acides, jouent un rôle dans l'interface entre la phase organique collagénique et la phase minérale. Ces protéines sont phosphorylées dans les ostéoblastes, puis sont sécrétées dans la matrice extra-cellulaires où elles s'associent à des régions spécifiques du collagène, au niveau des lacunes (en formant des complexes séryl-phosphoester) renfermant du calcium, stabilisé par des fonctions carboxylate présentes à ce niveau. Ces fonctions carboxylate, qui sont présentes au niveau des lacunes de la phase collagénique de l'os naturel, constituent ainsi des sites de l'amorce du processus de nucléation qui est une cristallisation par épitaxie du calcium et du phosphate circulant libéré par la phosphatase alcaline à partir des sucres phosphorylés. Phosphoproteins, rich in serine, threonine and acid residues, play a role in the interface between the collagenic organic phase and the mineral phase. These proteins are phosphorylated in osteoblasts, then secreted into the extracellular matrix where they associate with specific regions of the collagen, at the level of the deficiencies (forming seryl-phosphoester complexes) containing calcium, stabilized by functions carboxylate present at this level. These carboxylate functions, which are present at the level of the deficiencies of the collagen phase of the natural bone, thus constitute sites of the initiation of the nucleation process which is an epitaxial crystallization of calcium and circulating phosphate released by alkaline phosphatase. from phosphorylated sugars.

Avec les dendrimères exposant des séquences périphériques a terminaison(s) anionique(s), l'invention permet de recréer artificiellement de façon stable, à la surface des produits implantables, un environnement anionique à l'image de la matrice extra-cellulaire du tissu osseux, particulièrement riche en protéines anioniques, en phosphates circulant et en groupements carboxylate qui forment les sites de l'amorce du processus de nucléation. With the dendrimers exhibiting anionically terminating peripheral sequences, the invention makes it possible to artificially recreate, on the surface of the implantable products, an anionic environment in the image of the extracellular matrix of the tissue. bone, particularly rich in anionic proteins, circulating phosphates and carboxylate groups that form the sites of the nucleation process primer.

Schématiquement et de manière générale, on peut décrire de tels dendrimères phosphorés comme des polymères tridimensionnels de forme globalement sphérique, formés d'un coeur comprenant au moins un atome de phosphate et autour duquel des monomères sont greffés successivement les uns aux autres selon un processus arborescent, formant ainsi des couches successives de monomères qui délimitent de nombreuses cavités. Chaque couche de monomères constitue une génération particulière du dendrimère. A leur surface, les dendrimères exposent des séquences périphériques avec, à leur extrémité libre, un ou plusieurs groupements terminaux, on parle aussi de fonctions terminales ou, plus simplement, de terminaisons. Schematically and in general terms, such phosphorus-containing dendrimers can be described as three-dimensional polymers of globally spherical shape, formed of a core comprising at least one phosphate atom and around which monomers are grafted successively to one another according to a tree process. , thus forming successive layers of monomers that delimit many cavities. Each layer of monomers constitutes a particular generation of the dendrimer. On their surface, the dendrimers expose peripheral sequences with, at their free end, one or more terminal groups, we also speak of terminal functions or, more simply, terminations.

Depuis ces dernières années, une chimie très riche a été développée autour de ces macromolécules, s'attachant notamment à préparer de nouveaux dendrimères aux propriétés de surface bien particulières, en modifiant les fonctions terminales de dendrimères de base déjà existants. In recent years, a very rich chemistry has been developed around these macromolecules, focusing particularly on the preparation of new dendrimers with very particular surface properties, by modifying the terminal functions of already existing basic dendrimers.

Dans le cadre de l'invention, il s'agit de dendrimères phosphorés qui exposent des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s). Ces dendrimères peuvent avoir été préalablement préparés, par exemple, en fonctionnalisant des dendrimères de base (disponibles dans le commerce ou dont la préparation est déjà bien connue) pour leur conférer des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s). A titre d'exemples d'enseignement de méthode de préparation de dendrimères exposant des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s), on peut citer les documents FR 2 734 268, Majoral et al., 2001 (Polym. Mat. Sci. Eng., 84:166-167), Majoral et al., 2000 (Tetrahedron, 56:6269-6277). In the context of the invention, these are phosphorus dendrimers which expose peripheral sequences with anionic termination (s). These dendrimers may have been previously prepared, for example, by functionalizing base dendrimers (commercially available or whose preparation is already well known) to give them peripheral sequences with anionic termination (s). As examples of teaching methods for the preparation of dendrimers exhibiting peripheral sequences with anionic termination (s), mention may be made of the documents FR 2 734 268, Majoral et al., 2001 (Mat Sci Polymer Eng., 84: 166-167), Majoral et al., 2000 (Tetrahedron, 56: 6269-6277).

Les dendrimères particuliers utilisés pour mimer fonctionnellement les protéines de la matrice extra-cellulaire conformément à l'invention, se sont révélés non seulement non toxiques pour l'organisme mais également compatibles avec la fonctionnalisation de surfaces réalisées en des biomatériaux les plus divers (titane, zircone, et leurs alliages, alliage cobalt-chrome, bioverres, phosphates de calcium, carbonates de calcium, les polypeptides cellulosiques, l'alginate le polyéthylène glycol (PLG), les copolymères des acides lactiques et glycoliques (PLGA), le hyaluronate, le collagène, la gélatine, le chitosane, la fibrine, l'agarose, les acides polyacryliques et leurs dérivés, les oxydes de polyéthylène et leurs copolymères, les alcools polyvinyliques, les polyphosphazènes...) et ce, par simple immobilisation -notamment par adsorption- sur ces surfaces. The particular dendrimers used to functionally mimic the proteins of the extracellular matrix according to the invention have proven not only to be non-toxic for the organism but also compatible with the functionalization of surfaces made of a variety of biomaterials (titanium, zirconia, and their alloys, cobalt-chromium alloy, bioverres, calcium phosphates, calcium carbonates, cellulosic polypeptides, alginate polyethylene glycol (PLG), copolymers of lactic and glycolic acids (PLGA), hyaluronate, collagen, gelatin, chitosan, fibrin, agarose, polyacrylic acids and their derivatives, polyethylene oxides and their copolymers, polyvinyl alcohols, polyphosphazenes, etc.) by simple immobilization - in particular by adsorption - on these surfaces.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, sur la surface fonctionnalisée d'un produit implantable conforme à l'invention, sont immobilisés adsorbés des dendrimères phosphorés qui exposent des séquences périphériques à terminaison(s) de type phosphonate. Outre l'avantage de mimer les protéines de la matrice extra-cellulaire de l'os naturel, sans présenter de toxicité pour l'organisme, et de pouvoir s'adsorber de façon stable sur la surface de produits implantables, notamment à base de titane ou de phosphates de calcium en formant des ponts ioniques ou par chélation du calcium, les dendrimères à terminaisons de type phosphonate conduisent de façon surprenante et inattendue à une amélioration supplémentaire des propriétés d'ostéoinduction d'une surface fonctionnalisée conforme à l'invention. En l'espèce, ils permettent avantageusement de stimuler la prolifération des cellules osseuses et la différenciation des cellules ostéoprogénitrices en cellules ostéoblastiques. According to a particularly preferred embodiment, on the functionalized surface of an implantable product in accordance with the invention, adsorbed phosphorated dendrimers are adsorbed which expose terminal phosphonate-type peripheral sequences. In addition to the advantage of mimicking the proteins of the extracellular matrix of the natural bone, without exhibiting toxicity to the body, and being able to be stably adsorbed on the surface of implantable products, in particular based on titanium or calcium phosphates forming ionic bridges or by calcium chelation, the phosphonate-terminated dendrimers surprisingly and unexpectedly lead to further improvement of the osteoinduction properties of a functionalized surface according to the invention. In this case, they advantageously make it possible to stimulate the proliferation of bone cells and the differentiation of osteoprogenitor cells into osteoblastic cells.

Bien qu'aucune explication certaine ne soit pour l'instant donnée, des travaux effectués par les inventeurs leur ont permis de constater une augmentation remarquable de la prolifération des cellules de la lignée ostéoblastique lorsque celles- ci sont cultivées sur des plots de biomatériau dont la surface est recouverte de dendrimères exposant des séquences périphériques à terminaison(s) de type phosphonate conformes à l'invention, par rapport à des cellules cultivées sur le plastique (polystyrène) des puits de culture. Although no definite explanation is currently given, the work done by the inventors has allowed them to observe a remarkable increase in the proliferation of the cells of the osteoblastic line when these cells are grown on biomaterial pads. The surface is coated with dendrimers exhibiting phosphonate-terminated terminal sequences according to the invention, compared to cells cultured on the plastic (polystyrene) of the culture wells.

Egalement, et sans qu'aucune explication certaine ne soit non plus donnée pour l'instant, d'autres travaux menés par les inventeurs leur ont aussi permis de constater une augmentation remarquable de la différenciation de cellules ostéoprogénitrices lorsque celles-ci sont cultivées sur ces mêmes plots de biomatériau, par rapport à des cellules ostéoprogénitrices cultivées sur le plastique (polystyrène) des puits de culture. Also, and without any definite explanation being given either for the moment, other works carried out by the inventors have also allowed them to note a remarkable increase of the differentiation of osteoprogenitor cells when these are cultivated on these same plots of biomaterial, compared to osteoprogenitor cells grown on plastic (polystyrene) culture wells.

Par ailleurs, il est connu -notamment de Glimcher et al., 1990 (Biomaterials, 11:7-10)- que la présence de phosphoprotéines et de groupements phosphorylés sur le collagène favorise la germination des cristaux de phosphates de calcium et le processus de minéralisation du tissu osseux. On peut donc raisonnablement penser que la présence de groupements anioniques terminaux -notamment de type phosphonate- sur les dendrimères fonctionnalisés selon l'invention serait favorable à la nucléation de phosphates de calcium. Le fait d'immobiliser, notamment par adsorption, de tels dendrimères sur la surface d'un biomatériau permet ainsi de mettre à disposition ces terminaisons anioniques en surface du biomatériau et de favoriser la formation de germes de phosphates de calcium par l'intermédiaire d'interactions entre terminaisons anioniques et cations Ca.. Or, il est reconnu que la nucléation de phosphates de calcium à la surface d'un biomatériau augmente sensiblement la bioactivité de celui-ci, et notamment sa liaison avec le tissu. Furthermore, it is known-particularly from Glimcher et al., 1990 (Biomaterials, 11: 7-10) - that the presence of phosphoproteins and phosphorylated groups on collagen promotes the nucleation of calcium phosphate crystals and the process of mineralization of bone tissue. It is therefore reasonable to think that the presence of terminal anionic groups - especially of the phosphonate type - on the functionalized dendrimers according to the invention would be favorable to the nucleation of calcium phosphates. The fact of immobilizing, in particular by adsorption, such dendrimers on the surface of a biomaterial thus makes it possible to provide these anionic terminations on the surface of the biomaterial and to promote the formation of calcium phosphate seeds by means of However, it is recognized that the nucleation of calcium phosphates on the surface of a biomaterial significantly increases the bioactivity thereof, and in particular its binding with the tissue.

La qualité de l'interface entre le biomatériau fonctionnalisé selon l'invention et le tissu néo-formé s'en trouverait améliorée par la présence accrue de cristaux de phosphates de calcium interagissant avec la surface du biomatériau via les terminaisons des dendrimères immobilisés. De plus, puisque la formation de ces cristaux de phosphates de calcium se fait in situ, ces cristaux sont comparables à ceux formés naturellement lors du processus naturel de remodelage osseux. Il s'agit ainsi de cristaux de phosphates de calcium apatitique, non- stoechiométriques, et nanocristallins présentant une surface hydratée hautement réactive et une surface spécifique élevée. The quality of the interface between the functionalized biomaterial according to the invention and the neo-formed tissue would be improved by the increased presence of calcium phosphate crystals interacting with the surface of the biomaterial via the terminations of the immobilized dendrimers. In addition, since the formation of these calcium phosphate crystals is in situ, these crystals are comparable to those formed naturally during the natural process of bone remodeling. It is thus crystals of apatitic, non-stoichiometric, and nanocrystalline calcium phosphates having a highly reactive hydrated surface and a high specific surface area.

L'immobilisation de tels dendrimères sur une surface réalisée en un biomatériau selon l'invention, permettrait par ce biais d'améliorer la qualité de l'interface produit implantable/tissu. Or, la mauvaise qualité de l'interface entre un tissu biologique et un produit implantable est la principale cause de révision des prothèses. The immobilization of such dendrimers on a surface made of a biomaterial according to the invention, in this way would improve the quality of the implantable product interface / tissue. However, the poor quality of the interface between a biological tissue and an implantable product is the main cause of revision of the prostheses.

A titre de dendrimères déjà connus et qui peuvent être avantageusement utilisés pour mettre en oeuvre l'invention, on peut citer les dendrimères à terminaisons de type phosphonate comme décrits dans le document FR 2 734 268. Le procédé de préparation de ces dendrimères particuliers ainsi que le schéma réactionnel général correspondant sont donnés dans ce document FR 2 734 268. As dendrimers already known and which can advantageously be used to implement the invention, mention may be made of phosphonate-type end-dendrimers as described in document FR 2 734 268. The process for preparing these particular dendrimers as well as the corresponding reaction scheme is given in this document FR 2 734 268.

De façon très générale, il s'agit de fonctionnaliser une partie ou la totalité des séquences périphériques à terminaisons aldéhyde (- CHO) de dendrimères déjà disponibles dans le commerce, en y greffant sur les séquences périphériques des terminaisons de type phosphonate. In a very general way, it is a question of functionalizing some or all of the aldehyde-terminal peripheral sequences (- CHO) of dendrimers already commercially available, by grafting on the peripheral sequences phosphonate-type terminations.

Schématiquement, on réalise une réaction de substitution des fonctions aldéhyde ( CHO) par des séquences du type CH=N RI P(0)(OH)2 ou du type CH=N RI P(0)(O-)2. Schematically, a substitution reaction of the aldehyde functions (CHO) is carried out by sequences of the type CH = N RI P (O) (OH) 2 or of the type CH = N RI P (O) (O-) 2.

Pour ce faire, on peut utiliser entre autres un réactif aminé à 20 terminaisons diéthylphosphonodiester du type NH2 RI P(0)(OC2H5)2, où RI est une chaîne organique dont la longueur peut être modulée, pouvant être aromatique. Par exemple, il peut s'agir d'une réaction totale entre: - des dendrimères phosphorés de base, du type génération 2.5 et de formule semi-développée: S=P- {O-C6H4-CH=N-N(CH3)P(S)-[O-C6H4-CH=N-N(CH3) P(S)-(O-C6H4-CHO)2]2} 3 un réactif aminé notamment NH2 C6H4 CH2 P(0) (OC2H5)2, qui conduit à la formation de dendrimères de formule semidéveloppée: S=P- {O-C -CH=N-N(CH3)P(S)-[O-C6H4-CH N N(CH3)P(S)-(O-C6H4-CH N-RI-P(0)(OC2H5h]2} 3 2876916 lo La modification chimique des terminaisons diéthylphosphonoester, P(0) (OC2H5)2, en terminaisons de type acide phosphonique P(0)(OH)2 ou phosphonate P(0)(O-)2, peut être alors réalisée par déprotection des groupements diéthylphosphonoester -P(0)(OC2H5)2, par exemple au moyen d'un traitement au bromure de triméthylsilane (CH3)3SiBr, sous gaz inerte, par exemple de l'argon. Il est possible de transformer les fonctions imine CH=N R1 formées en fonctions amine CH2 NH R1 par traitement en solution en présence de cyanoborohydrure de sodium NaBH3CN. Le passage des terminaisons acide phosphonique en terminaisons phosphonate peut se faire par ajout de base forte. For this purpose, it is possible to use, inter alia, a diethylphosphonodiester amino-terminated reagent of the NH 2 RI P (O) (OC 2 H 5) 2 type, where R 1 is an organic chain whose length may be modulated, which may be aromatic. For example, it may be a total reaction between: - basic phosphorus dendrimers, type 2.5 generation and semi-developed formula: S = P- {O-C6H4-CH = NN (CH3) P ( S) - [O-C6H4-CH = NN (CH3) P (S) - (O-C6H4-CHO) 2] 2} 3 an amino reactant including NH2 C6H4 CH2P (O) (OC2H5) 2, which leads to the formation of dendrimers of semi-expanded formula: S = P- {OC-CH = NN (CH3) P (S) - [O-C6H4-CHNN (CH3) P (S) - (O-C6H4-CHN-RI) The chemical modification of the diethylphosphonoester terminals, P (O) (OC 2 H 5) 2, in terminations of the phosphonic acid P (O) (OH) 2 or phosphonate P (O) type (P (O) (OC 2 H 5 H] 2) 3 O-) 2 can then be carried out by deprotection of the diethylphosphonoester-P (O) (OC 2 H 5) 2 groups, for example by means of a treatment with trimethylsilane bromide (CH 3) 3 SiBr, under an inert gas, for example from Argon It is possible to convert the imine functional groups CH = N R1 formed into amine functional groups CH2 NH R1 by treatment in solution in the presence of cyanoborohydride. NaBH 3 CN The passage of phosphonic acid termini into phosphonate termini can be done by addition of a strong base.

Avantageusement et selon l'invention, les dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) de type phosphonate conformes à l'invention peuvent avoir été préparés à partir de dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaisons aldéhyde, par fonctionnalisation totale ou seulement partielle. Eventuellement, la fonctionnalisation totale ou partielle a été réalisée selon la méthode générale précédemment évoquée, en utilisant un réactif aminé à terminaisons phosphonate notamment du type NH2 R1 P(0) (OC2H5)2. Advantageously and according to the invention, the phosphorus-containing dendrimers exhibiting phosphonate-type terminal sequences according to the invention may have been prepared from phosphorus dendrimers exhibiting aldehyde-terminal peripheral sequences, by total or only partial functionalization. . Optionally, the total or partial functionalization was carried out according to the general method previously mentioned, using a phosphonate-terminated amine reagent, in particular of the NH 2 R 1 P (O) (OC 2 H 5) 2 type.

Avantageusement et selon ce même mode de réalisation de l'invention, la surface fonctionnalisée d'un produit implantable conforme à l'invention 20 est fonctionnalisée par adsorption de dendrimères de formule semidéveloppée: S=P-{O-C -CH N-N(CH3)P(S)-[O-C -CH=N-N(CH3)P(S)-(O-C -CH N-R'P(0)(O-)2]2}3 Selon un autre mode de réalisation particulièrement préféré, sur la surface fonctionnalisée d'un produit implantable conforme à l'invention, sont adsorbés des dendrimères phosphorés qui exposent des groupements périphériques à terminaison(s) de type carboxylate. A l'instar d'autres dendrimères exposant des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s), ces dendrimères phosphorés particuliers sont aptes à s'adsorber avec une stabilité satisfaisante sur la surface de biomatériaux métalliques (tels que le titane, le zircone, et leurs alliages, alliage cobalt- 20 25 30 2876916 Il chrome) en formant des ponts ioniques, ou sur la surface de biomatériaux de type phosphates de calcium ou carbonates de calcium, en chélatant le calcium. Ces dendrimères phosphorés qui exposent des séquences périphériques à terminaison(s) de type carboxylate, à la surface des produits implantables permettent de mimer les protéines de la matrice extra-cellulaire de l'os naturel, et plus précisément la phase matricielle des sites de l'amorce du processus de nucléation. Advantageously and according to this same embodiment of the invention, the functionalized surface of an implantable product according to the invention is functionalized by adsorption of dendrimers of semi-developed formula: S = P- {OC-CHNN (CH 3) P (S) - [OC-CH = NN (CH3) P (S) - (OC-CH N-R'P (O) (O-) 2] 2} 3 According to another particularly preferred embodiment, on the functionalized surface of an implantable product according to the invention are adsorbed phosphorus dendrimers which expose carboxylate-type terminal groups (s), like other dendrimers exhibiting peripheral sequences with anionic termination (s). (s), these particular phosphorus dendrimers are capable of adsorbing with satisfactory stability on the surface of metal biomaterials (such as titanium, zirconia, and their alloys, cobalt-chromium alloy) by forming ionic bridges, or on the surface of biomaterials of t ype calcium phosphates or calcium carbonates, by chelating calcium. These phosphorus-containing dendrimers which expose terminal sequences of the carboxylate type on the surface of the implantable products make it possible to mimic the proteins of the extracellular matrix of the natural bone, and more specifically the matrix phase of the sites of the initiation of the nucleation process.

Avantageusement, les séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s) -notamment de type phosphonate ou de type carboxylate- des dendrimères qui peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention sont choisies parmi: - des séquences à terminaison phosphonate, de formule générale choisie parmi: OH 1 - 01-R-CH2-NH-R1-û -O- , Cat+ Advantageously, the peripheral sequences with anionic termination (s), in particular of the phosphonate or carboxylate type, of the dendrimers which may be used for the implementation of the invention are chosen from: phosphonate-terminated sequences, of general formula chosen from: OH 1 -O-R-CH 2 -NH-R 1 -O-O-, Cat +

O OHO OH

01-R-CH=N-RI-P-O-, Cat+ 01-R-CH = N-RI-P-O-, Cat +

OO

01-R-CH2-NH-R1-P-(O-)2, 2Cat+ 01-R-CH2-NH-R1-P- (O-) 2, 2Cat +

OO

et 01-R-CH=N-R1-P-(O-)2, 2Cat+and 01-R-CH = N-R1-P- (O-) 2, 2Cat +

OO

- des séquences à terminaison carboxylate, de formule générale choisie parmi: - 01-R-CH2-NH-R1-C-O-, Cat+ carboxylate-terminated sequences of general formula chosen from: -O-R-CH 2 -NH-R 1 -C-O-O-, Cat +

OO

- 01-R-CH=N-RI-C-O-, Cat+ O Dans les formules générales précédentes: - R et RI sont identiques ou non, et désignent des groupes alkyle ou aryle, et - X désigne un atome de soufre ou d'oxygène, et - Cat+ désigne un cation organique ou minéral, notamment H+. Embedded image In the preceding general formulas: R 1 and R 1 are identical or different, and denote alkyl or aryl groups, and - X denotes a sulfur atom or a hydrogen atom. oxygen, and - Cat + denotes an organic or mineral cation, especially H +.

Chacune desdites séquences périphériques est reliée, par son atome d'oxygène 01, à un atome de phosphore d'un monomère de la génération 5 précédente. Each of said peripheral sequences is connected by its oxygen atom O 1 to a phosphorus atom of a monomer of the previous generation.

Avantageusement, les dendrimères phosphorylés présentant des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s) pouvant être utilisés pour mettre en oeuvre l'invention, sont formés d'un coeur de formule générale choisie parmi: N, V N X et P P \N/ X désigne un atome de soufre ou d'oxygène. Advantageously, the phosphorylated dendrimers having peripheral sequences with anionic termination (s) which can be used to implement the invention, are formed of a core of general formula chosen from: N, VNX and PP \ N / X denotes a sulfur or oxygen atom.

Au niveau du(des) atome(s) de phosphore formant le coeur des dendrimères conformes à l'invention, se projette une pluralité de séquences de structure ramifiée qui se terminent par lesdites séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s) -notamment de type phosphonate et/ou de type carboxylate-. Avantageusement et selon l'invention, les couches internes de ces ramifications sont formées d'un assemblage de monomères de formule générale: -02-R-CH=N-NH-P I I X l'atome d'oxygène 02 de chacun de ces monomères est lié soit à l'atome de phosphore d'un monomère adjacent de la génération précédente, soit à un atome de phosphore du 25 coeur. At the level of the phosphorus atom (s) forming the core of the dendrimers according to the invention, there is a plurality of branched structure sequences which terminate in said peripheral sequences with anionic termination (s) notably phosphonate and / or carboxylate type. Advantageously and according to the invention, the inner layers of these branches are formed of an assembly of monomers of general formula: -O 2 -R-CH = N-NH-P IIX the oxygen atom O 2 of each of these monomers is bound either to the phosphorus atom of an adjacent monomer of the previous generation or to a phosphorus atom of the core.

Avantageusement, la surface fonctionnalisée d'un produit implantable conforme à l'invention, est fonctionnalisée par adsorption de dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) de type phosphonate et des dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) de type carboxylate. Advantageously, the functionalized surface of an implantable product in accordance with the invention is functionalized by adsorption of phosphorus-containing dendrimers exposing phosphonate-type terminal sequences and phosphorus-containing dendrimers exhibiting terminal sequences of the type (s). carboxylate.

Selon un autre mode de réalisation, la surface fonctionnalisée d'un produit implantable selon l'invention, est fonctionnalisée par immobilisation - notamment par adsorption- de dendrimères phosphorés exposant à la fois des séquences périphériques à terminaison(s) de type phosphonate et des séquences périphériques à terminaison(s) de type carboxylate. According to another embodiment, the functionalized surface of an implantable product according to the invention is functionalized by immobilization - in particular by adsorption - of phosphorus-containing dendrimers exhibiting both phosphonate-type terminal sequences and sequences. terminating devices of the carboxylate type.

Avantageusement et selon l'invention, les dendrimères à terminaisons anioniques adsorbés sur une surface fonctionnalisée d'un produit implantable conforme à l'invention sont de génération comprise entre 1.5 à 12.5. Advantageously and according to the invention, the anionically-terminated dendrimers adsorbed on a functionalized surface of an implantable product according to the invention are of generation between 1.5 to 12.5.

Avantageusement, la surface d'un produit implantable selon l'invention présente une concentration totale en dendrimères immobilisés -notamment adsorbés- au moins de l'ordre de 0,002 nmol/cm2. Advantageously, the surface of an implantable product according to the invention has a total concentration of immobilized dendrimers - in particular adsorbed - at least of the order of 0.002 nmol / cm 2.

Il convient de noter que l'invention n'est nullement restreinte à la fonctionnalisation des surfaces de produits implantables au moyen de dendrimères phosphorés qui exposent de façon exclusive des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s), notamment de type phosphonate et/ou de type carboxylate. Eventuellement, en complément des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s), les dendrimères phosphorés utilisés dans le cadre de l'invention, peuvent exposer des séquences périphériques à terminaison(s) autrement fonctionnalisées en vue d'obtenir des effets supplémentaires. En effet, la chimie des dendrimères est particulièrement riche et les possibilités de variation/modification des fonctions périphériques terminales d'un dendrimère de base sont aujourd'hui nombreuses et offrent à l'invention de nombreuses perspectives d'évolution. It should be noted that the invention is in no way restricted to the functionalization of the surfaces of implantable products by means of phosphorus dendrimers which exclusively expose peripheral sequences with anionic termination (s), in particular of the phosphonate type and / or or carboxylate type. Optionally, in addition to the peripheral sequences with anionic termination (s), the phosphorus dendrimers used in the context of the invention may expose terminally peripheral sequences (s) otherwise functionalized to obtain additional effects. Indeed, the chemistry of dendrimers is particularly rich and the possibilities of variation / modification of the terminal peripheral functions of a basic dendrimer are now numerous and offer the invention many opportunities for evolution.

En particulier, les dendrimères utilisés pour fonctionnaliser la surface d'un produit implantable conforme à l'invention, outre le fait d'exposer des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s), peuvent de façon avantageuse également exposer des séquences périphériques liés de façon covalente à des peptides, -notamment des peptides d'intérêt présentant des sites de liaison désirés, par exemple de type RGD-, à des protéines, à des oligosaccharides... selon l'activité cellulaire à induire (par exemple, pour favoriser l'ancrage cellulaire et ainsi améliorer la stabilisation des cellules sur la surface fonctionnalisée). In particular, the dendrimers used to functionalize the surface of an implantable product according to the invention, in addition to exposing peripheral sequences with anionic termination (s), can advantageously also expose peripheral sequences linked to covalently to peptides, in particular peptides of interest having desired binding sites, for example of the RGD- type, to proteins, to oligosaccharides ... depending on the cellular activity to be induced (for example, for promote cellular anchoring and thus improve cell stabilization on the functionalized surface).

Egalement, il peut être avantageux d'utiliser les cavités de ces dendrimères comme réservoirs permettant la distribution de divers molécules et/ou ions bioactifs aptes à favoriser les processus conduisant à la pénétration du tissu au niveau du site d'implantation d'un produit implantable. L'invention s'étend également à une méthode de préparation d'un produit Also, it may be advantageous to use the cavities of these dendrimers as reservoirs for the distribution of various molecules and / or bioactive ions capable of promoting the processes leading to the penetration of the tissue at the implant site of an implantable product. . The invention also extends to a method of preparing a product

implantable destiné à la reconstruction osseuse. Dans un procédé selon l'invention, on immobilise -notamment par adsorption- sur au moins une surface d'un produit implantable, dite surface à fonctionnaliser, des dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s). implantable for bone reconstruction. In a process according to the invention, phosphoric dendrimers exhibiting peripheral sequences with anionic termination (s) are immobilized, in particular by adsorption, on at least one surface of an implantable product, called the surface to be functionalized.

Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'adsorption avec une solution de concentration en dendrimères adaptée pour permettre une adsorption d'au moins de l'ordre de 0,002 nmol de dendrimères par cm2 de surface à fonctionnaliser; à l'intérieur de cette solution d'adsorption on immerge la surface à fonctionnaliser. Advantageously and according to the invention, adsorption is carried out with a solution of dendrimers concentration adapted to allow adsorption of at least of the order of 0.002 nmol of dendrimers per cm 2 of surface to be functionalized; inside this adsorption solution, the surface to be functionalized is immersed.

Avantageusement et selon l'invention, cette solution d'adsorption est à base d'un mélange eau/solvant(s) organique(s). Advantageously and according to the invention, this adsorption solution is based on a mixture of water / organic solvent (s).

Dans le cas où les dendrimères à terminaisons anioniques utilisés, présentent une faible solubilité dans l'eau, par exemple due à la présence de terminaisons aldéhyde, on ajoute à la solution d'adsorption une quantité de tétrahydrofuranne (THF). La quantité de THF à ajouter à la solution d'adsorption augmente avec le nombre de terminaisons aldéhyde de ces dendrimères. In the case where the anionic-terminated dendrimers used have a low solubility in water, for example due to the presence of aldehyde terminations, an amount of tetrahydrofuran (THF) is added to the adsorption solution. The amount of THF to be added to the adsorption solution increases with the number of aldehyde termini of these dendrimers.

Avantageusement et selon l'invention, on réalise l'adsorption des dendrimères sur une surface à fonctionnaliser réalisée en au moins un biomatériau choisi notamment dans le groupe constitué par: le titane, le zircone, et leurs alliages, un alliage cobalt-chrome, des bioverres, des phosphates de calcium, des carbonates de calcium, les polypeptides cellulosiques, l'alginate le polyéthylène glycol (PLG), les copolymères des acides lactiques et glycoliques (PLGA), le hyaluronate, le collagène, la gélatine, le chitosane, la fibrine, l'agarose, les acides polyacryliques et leurs dérivés, les oxydes de polyéthylène et leurs copolymères, les alcools polyvinyliques, les polyphosphazènes. 10 Advantageously and according to the invention, the adsorption of the dendrimers is carried out on a surface to be functionalized made of at least one biomaterial chosen in particular from the group consisting of: titanium, zirconia, and their alloys, a cobalt-chromium alloy, bioglass, calcium phosphates, calcium carbonates, cellulosic polypeptides, alginate polyethylene glycol (PLG), copolymers of lactic and glycolic acids (PLGA), hyaluronate, collagen, gelatin, chitosan, fibrin, agarose, polyacrylic acids and their derivatives, polyethylene oxides and copolymers thereof, polyvinyl alcohols, polyphosphazenes. 10

Avantageusement et selon l'invention, on utilise des dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s), notamment de type phosphonate ou de type carboxylate, éventuellement choisies parmi: - des séquences à terminaison phosphonate, de formule générale choisie parmi: OH 1 O-R-CH2-NH-R1-P-O- , Cat+ Advantageously and according to the invention, phosphorus-containing dendrimers are used which expose peripheral sequences with anionic termination (s), in particular of the phosphonate or carboxylate type, optionally chosen from: phosphonate-terminated sequences of general formula chosen among: OH 1 OR-CH 2 -NH-R 1 -PO-, Cat +

O OH 1O OH 1

01-R-CH=N-R1-P-O- , Cat+ 01-R-CH = N-R1-P-O-, Cat +

OO

01-R-CH2-NH-RI-P-(O-)2, 2Cat+ 01-R-CH 2 -NH-RI-P- (O-) 2, 2Cat +

OO

O-R-CH=N-R1-P-(O-)2, 2Cat+ O-R-CH = N-R1-P- (O-) 2, 2Cat +

OO

- des séquences à terminaison carboxylate, de formule générale choisie parmi O-R-CH2-NH-R1- I-O-, Cat+ O 20 et O-R-CH=N-RI-C-O-, Cat+ carboxylate-terminated sequences of the general formula selected from O-R-CH 2 -NH-R 1 -O-O-, Cat + O and O-R-CH = N-RI-C-O-, Cat +

OO

Dans les formules générales précédentes: - R et RI sont identiques ou non, et désignent des groupes alkyle ou aryle, 25 - X désigne un atome de soufre ou d'oxygène, et - Cat+ désigne un cation organique ou minéral, notamment H+. In the above general formulas: R and RI are identical or different, and denote alkyl or aryl groups, X represents a sulfur or oxygen atom, and Cat + denotes an organic or inorganic cation, in particular H +.

Avantageusement et selon l'invention, on utilise des dendrimères à terminaisons phosphonate de formule semi-développée: S=P-{O-C -CH N-N(CH3) P(S)-[O-C -CH N-N(CH3)P(S)-(O-C -CH N-RI-P(0)(O-)2]2}3 et Selon un mode de réalisation particulier, on utilise avantageusement en combinaison des dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) de type phosphonate et des dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaison(s) de type carboxylate. Advantageously and according to the invention, use is made of phosphonate-terminated dendrimers of semi-developed formula: ## STR5 ## In a particular embodiment, it is advantageous to use, in combination, phosphorus-containing dendrimers which exhibit phosphonate-type terminal (s) -terminated sequences and (c) -N-RI-P (O) (O-) 2] 2} 3. phosphorus dendrimers exposing terminal sequences of carboxylate type (s).

Selon un autre mode de réalisation particulier, on utilise avantageusement des dendrimères phosphorés exposant à la fois des séquences périphériques à terminaison(s) de type phosphonate et des séquences périphériques à terminaison(s) de type carboxylate. According to another particular embodiment, phosphorus-containing dendrimers are advantageously used, exposing both phosphonate-type terminal (s) peripheral sequences and carboxylate-type terminal (s) peripheral sequences.

L'invention concerne également un produit implantable comprenant au moins une surface fonctionnalisée au moyen de dendrimères exposant des séquences périphériques à terminaison(s) anionique(s), ainsi qu'un procédé de préparation d'un tel produit implantable, caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques ci-dessus et ci-après. The invention also relates to an implantable product comprising at least one surface functionalized by means of dendrimers exposing peripheral sequences with anionic termination (s), and a process for preparing such an implantable product, characterized in combination by all or some of the features above and below.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée suivante, qui se réfère aux travaux menés par les inventeurs dans le cadre de cette invention et dont certains des résultats sont présentés dans les figures annexées: figures lA et 1B, figure 2, figures 3A à 3C. Other objects, features and advantages of the invention will emerge from the following detailed description, which refers to the work carried out by the inventors in the context of this invention and of which some of the results are presented in the appended figures: FIGS. 1A and 1B , FIG. 2, FIGS. 3A to 3C.

Les figures lA et 1B correspondent l'isotherme d'adsorption représentatif de l'immobilisation de dendrimères particuliers et conformes à 20 l'invention, sur une surface réalisée en titane. FIGS. 1A and 1B correspond to the adsorption isotherm representative of the immobilization of particular dendrimers and in accordance with the invention, on a surface made of titanium.

La figure 2 montre l'effet, sur la prolifération cellulaire, de différents produits ayant une surface fonctionnalisée conformément à l'invention. Figure 2 shows the effect, on cell proliferation, of different products having a functionalized surface according to the invention.

Les figures 3A à 3C sont des diagrammes qui illustrent l'effet, sur la différenciation des cellules ostéoprogénitrices, d'une surface réalisée en un biomatériau sur laquelle des dendrimères conformes à l'invention sont immobilisés. FIGS. 3A to 3C are diagrams that illustrate the effect, on the differentiation of osteoprogenitor cells, of a surface made of a biomaterial on which dendrimers according to the invention are immobilized.

1) PREPARATION DE DENDRIMERES A TERMINAISONS ANIONIQUES a) Dendrimères à terminaisons de type phosphonate Des dendrimères phosphorés exposant des séquences 30 périphériques à terminaisons de type phosphonate peuvent être préparés en suivant les instructions données dans le document FR 2 734 268. 1) PREPARATION OF ANIONIC TERMINATION DENDRIMERS a) Phosphonate-terminated dendrimers Phosphorus-containing dendrimers exhibiting phosphonate-like termini can be prepared according to the instructions given in FR 2,734,268.

b) Dendrimères à terminaisons de type carboxylate Des dendrimères phosphorés exposant des séquences périphériques à terminaisons de type carboxylate peuvent être préparés en suivant l'enseignement de la publication Majoral et al., 2001 (Polym. Mat. Sei. Eng., 84:166- 167) et/ou celui de la publication Majoral et al., 2000 (Tetrahedron Letter, 56:6269- 6277). b) Carboxylate-terminated Dendrimers Phosphorus-containing dendrimers exhibiting carboxylate-type terminal sequences may be prepared following the teachings of Majoral et al., 2001 (Mat. Sci. Eng., 84: 166). - 167) and / or that of the publication Majoral et al., 2000 (Tetrahedron Letter, 56: 6269-62).

c) Protocole particulier de synthèse de dendrimères à terminaisons phosphonate A titre d'exemple pratique, des dendrimères phosphorés de 10 formule semi-développée suivante ont été préparés: S=P- {O -C -CH=N N(CH3) P(S)-[O-C H -CH N N(CH3)P(S)-(O-C6-CH =N-RI -P(0)(O h]2} 3 Pour ce faire, une réaction de fonctionnalisation a été réalisée sur des dendrimères initiaux à terminaisons aldéhyde, commercialisés par la société SIGMAALDRICH, France, dont la formule semi-développée est la suivante: S=P- { O-C6H4-CH=N-N(CH3)P(S)- [O-C6H4-CH=N-N(CH3)P(S)-(O-C6H4-CH=0)2]2} 3 Ces dendrimères initiaux sont dits du type génération 2.5; ils sont en effet formés de deux couches profondes de monomères et d'une couche périphériques de monomères "tronqués" et portant les fonctions terminales (en l'occurrence, des groupements aldéhyde). c) Particular Protocol for the Synthesis of Phosphonate Terminated Dendrimers As a practical example, phosphorus dendrimers of the following semi-developed formula were prepared: S = P- {O -C -CH = NN (CH 3) P (S ## STR5 ## initial aldehyde terminated dendrimers sold by the company SIGMAALDRICH, France, whose semi-developed formula is as follows: S = P- {O-C6H4-CH = NN (CH3) P (S) - [O-C6H4- CH = NN (CH3) P (S) - (O-C6H4-CH = O) 2] 2} 3 These initial dendrimers are said to be of the 2.5 generation type, they are indeed formed of two deep layers of monomers and one peripheral layer of "truncated" monomers carrying the terminal functions (in this case, aldehyde groups).

La quantité souhaitée de dendrimères initiaux à terminaisons aldéhyde, par exemple 0,15 mmol, est dissoute dans un mélange contenant 13 ml de tétrahydrofuranne (THF) et 10 ml de méthanol. The desired amount of initial aldehyde terminated dendrimers, for example 0.15 mmol, is dissolved in a mixture containing 13 ml of tetrahydrofuran (THF) and 10 ml of methanol.

Le réactif aminé NH2-R-P(0)(OC2H5)2, par exemple NH2-C6H4-CH2-P(0)(OC2H5) 2, est dissous dans un second ballon contenant 7 ml de THF. La quantité de réactif est choisie en excès par rapport à la quantité de dendrimères initiaux utilisée. Par exemple, deux équivalents de réactif aminé peuvent être employés par rapport au nombre de fonctions aldéhyde du dendrimère initial. The amine reagent NH2-R-P (O) (OC2H5) 2, for example NH2-C6H4-CH2-P (O) (OC2H5) 2, is dissolved in a second flask containing 7 ml of THF. The amount of reagent is chosen in excess of the amount of initial dendrimers used. For example, two equivalents of amino reactant may be employed relative to the number of aldehyde functions of the initial dendrimer.

Cette solution est transférée dans la solution précédente placée sous agitation, au goutte-à-goutte à l'aide d'une micro-seringue. La solution est 30 maintenue sous agitation pendant 2 heures. This solution is transferred to the preceding solution with stirring, drip using a micro-syringe. The solution is stirred for 2 hours.

Une solution contenant un équivalent au moins, par rapport aux fonctions aldéhyde du dendrimère initial, de cyanoborohydrure de sodium NaBH3CN est ajoutée au goutte-à-goutte dans le mélange réactionnel. La solution est maintenue sous agitation, à l'aide d'un barreau aimanté, à 25 C, pendant une durée variant typiquement de 1 à 3 jours. A solution containing at least one equivalent, relative to the aldehyde functions of the initial dendrimer, of sodium cyanoborohydride NaBH3CN is added dropwise into the reaction mixture. The solution is kept under stirring, using a magnetic bar, at 25 ° C., for a period typically varying from 1 to 3 days.

Il est à noter que ce protocole permet non seulement le greffage du réactif aminé à terminaisons phosphonate sur le dendrimère, conduisant à la formation d'imines (activé en présence de NaBH3CN), mais il permet également de procéder à l'amination réductive de l'étape (2) par la réduction des groupements imines 10 CH=N formés en groupements amines CH2--NH . It should be noted that this protocol not only allows the grafting of the phosphonate-terminated amino reagent to the dendrimer, leading to the formation of imines (activated in the presence of NaBH3CN), but it also makes it possible to carry out the reductive amination of the dendrimer. step (2) by reducing the CH = N imine groups formed into CH 2 -NH amine groups.

A l'issue de la réaction, la solution est évaporée sur évaporateur rotatif. Le résidu est repris dans 2 ml de THF, puis un excès d'éther est introduit dans le ballon afin de provoquer la précipitation des dendrimères. L'excès de réactif aminé reste solubilisé dans l'éther. Cette étape peut être répétée si besoin est, afin d'éliminer toute trace de réactif aminé résiduel. La solution est alors filtrée, et le résidu est séché sous vide puis analysé par RMN 31P et 1H. La réaction est totale lorsque le pic caractéristique des fonctions aldéhyde a totalement disparu. At the end of the reaction, the solution is evaporated on a rotary evaporator. The residue is taken up in 2 ml of THF, then an excess of ether is introduced into the flask in order to cause the precipitation of the dendrimers. The excess of amino reactant remains solubilized in the ether. This step can be repeated if necessary, in order to eliminate any trace of residual amine reagent. The solution is then filtered, and the residue is dried under vacuum and then analyzed by 31P and 1H NMR. The reaction is complete when the characteristic peak of the aldehyde functions has completely disappeared.

A ce stade, le composé solide obtenu est le dendrimère fonctionnalisé, présentant des séquences terminales du type aminodiéthylphosphonoester NH R P(0)(OC2H5)2. Rappelons ici que le choix des quantités relatives de dendrimère initial et des autres réactifs, notamment le réactif aminé porteur des fonctions phosphonate, permet de modifier le taux de fonctionnalisation du dendrimère. At this stage, the solid compound obtained is the functionalized dendrimer, having aminodiethylphosphonoester NH R P (O) (OC 2 H 5) 2 terminal sequences. Recall here that the choice of the relative amounts of initial dendrimer and other reagents, including the amino reactant carrying the phosphonate functions, allows to change the functionalization rate of the dendrimer.

La modification chimique des terminaisons di- éthylphosphonoester en groupements phosphonate (étape (3)) s'effectue de la manière suivante. The chemical modification of the di-ethylphosphonoester termini into phosphonate groups (step (3)) is carried out as follows.

Le produit obtenu précédemment est dissous, à température ambiante, dans un ballon contenant 15 à 25 ml de dioxanne-1,4 anhydre. Le ballon est traversé par une circulation de gaz inerte sec (par exemple, l'argon) permettant de travailler en conditions sèches (absence de vapeur d'eau). La solution est agitée par l'intermédiaire d'un barreau aimanté. The product obtained above is dissolved at room temperature in a flask containing 15 to 25 ml of anhydrous dioxane-1,4. The balloon is traversed by a circulation of dry inert gas (for example, argon) to work in dry conditions (absence of water vapor). The solution is stirred via a magnetic bar.

La transformation des groupements phosphonoester en groupements phosphonate s'effectue en deux temps comme suit. The transformation of the phosphonoester groups into phosphonate groups takes place in two stages as follows.

Dans un premier temps, un excès de bromure de triméthylsilane (CH3)3SiBr, liquide, est ajouté goutte à goutte dans la solution. L'utilisation de plusieurs équivalents de (CH3)3SiBr par rapport au nombre de fonctions terminales du dendrimère initial est favorable à cette étape. Par exemple, entre 1,5 à 5 équivalents peuvent être utilisés. First, an excess of liquid trimethylsilane (CH 3) 3 SiBr bromide is added dropwise to the solution. The use of several equivalents of (CH 3) 3 SiBr with respect to the number of terminal functions of the initial dendrimer is favorable at this stage. For example, between 1.5 to 5 equivalents can be used.

Au cours de cette étape, les fonctions terminales NH R P(0)(OC2H5)2 du dendrimère sont modifiées par la substitution des fonctions éthyles C2H5 par le groupement Si(CH3)3, conduisant à BrC2H5 comme sous- produit. During this step, the terminal functions NH R P (O) (OC 2 H 5) 2 of the dendrimer are modified by the substitution of the ethyl functions C2H5 by the group Si (CH3) 3, resulting in BrC2H5 as a by-product.

La solution est laissée sous agitation et sous flux de gaz inerte pendant plusieurs heures, typiquement 4 heures. Des réajustements de volume par ajouts de faibles quantités de dioxanne-1,4 peuvent s'avérer nécessaires afin de garder un volume réactionnel constant, à cause de l'évaporation du solvant accélérée sous flux gazeux. L'ensemble de ce protocole est effectué à température ambiante. La solution est alors évaporée sous évaporateur rotatif pour analyse de contrôle par RMN 31P et H. Dans un second temps, le résidu ainsi obtenu est repris dans 25 ml de THF et 75 ml d'eau désionisée. Cette étape permet de procéder à l'hydrolyse des groupements terminaux OSi(CH3)3 en OH, avec pour sous-produit l'alcool HO-Si(CH3)3. Notons que cette étape d'hydrolyse peut également être réalisée directement dans le ballon réactionnel (après 4h de mélange sous agitation) par l'ajout d'un excès (par exemple 75-100 ml pour un ballon de 250 ml) d'eau désionisée. The solution is stirred and under inert gas flow for several hours, typically 4 hours. Volume readjustments by adding small amounts of 1,4-dioxane may be necessary in order to keep a constant reaction volume, because of the evaporation of the accelerated solvent under a gas flow. This entire protocol is performed at room temperature. The solution is then evaporated under a rotary evaporator for control analysis by 31 P and H NMR. In a second step, the residue thus obtained is taken up in 25 ml of THF and 75 ml of deionized water. This step makes it possible to hydrolyze the terminal groups OSi (CH3) 3 to OH, with the alcohol HO-Si (CH3) 3 as a by-product. Note that this hydrolysis step can also be carried out directly in the reaction flask (after stirring for 4 hours) by adding an excess (for example 75-100 ml for a 250 ml flask) of deionized water. .

Au cours de l'hydrolyse, le dendrimère précipite progressivement, ce qui s'explique par la transformation des groupes phosphonoester hydrophobes en groupes de type acide phosphonique P(0)(OH)2 hydrophiles. 20 During hydrolysis, the dendrimer progressively precipitates, which is explained by the transformation of the hydrophobic phosphonoester groups into hydrophilic P (O) (OH) 2 phosphonic acid groups. 20

La solution/suspension est maintenue sous agitation pendant 1 heure puis filtrée. Le résidu ainsi obtenu est séché sous vide, puis analysé principalement par RMN 31P et 1H. The solution / suspension is stirred for 1 hour and then filtered. The residue thus obtained is dried under vacuum and then analyzed mainly by 31P and 1H NMR.

Le produit solide obtenu est le dendrimère comportant des groupements terminaux de type phosphate P(0)(OH)2. Rappelons que le réactif aminé comporte deux groupes OC2H5. Par conséquent, si ces deux groupes sont transformés en OH, il y a doublement du nombre de fonctions périphériques par rapport au dendrimère initial. Par exemple, pour un dendrimère initial de génération 2.5, qui comporte 12 fonctions aldéhyde terminales, la fonctionnalisation mènera, dans le cas d'une fonctionnalisation totale, à 24 groupements OH terminaux. The solid product obtained is the dendrimer comprising terminal groups of P (O) (OH) 2 phosphate type. Recall that the amino reagent has two OC2H5 groups. Therefore, if these two groups are converted to OH, there is a doubling of the number of peripheral functions relative to the initial dendrimer. For example, for an initial 2.5 generation dendrimer, which has 12 terminal aldehyde functions, the functionalization will lead, in the case of total functionalization, to 24 terminal OH groups.

La caractérisation de ces macromolécules est réalisée par résonance magnétique nucléaire (31P, 13C, 1H) ainsi que par spectroscopie infrarouge. Ces méthodes d'analyse spectroscopiques permettent de suivre le bon déroulement de chaque réaction. The characterization of these macromolecules is carried out by nuclear magnetic resonance (31P, 13C, 1H) as well as by infrared spectroscopy. These spectroscopic analysis methods make it possible to follow the smooth progress of each reaction.

Le passage des fonctions terminales acide phosphonique en fonctions phosphonate peut se faire notamment par traitement des dendrimères par une base, par exemple NaOH. The passage of terminal functions phosphonic acid phosphonate functions can be done in particular by treatment of dendrimers with a base, for example NaOH.

2) FONCTIONNALISATION DE SURFACE PAR ADSORPTION DE DENDRIMERES a) Protocole d'adsorption: Les dendrimères à terminaisons phosphonate précédemment préparés sont utilisés pour fonctionnaliser la surface de disques métalliques (14 mm de diamètre, 2 mm d'épaisseur) réalisés en un alliage Ti6A14V, alliage à base de titane largement utilisé pour la réalisation de prothèses orthopédiques. 2) SURFACE FUNCTIONALIZATION BY ADSORPTION OF DENDRIMERES a) Adsorption Protocol: The previously prepared phosphonate-terminated dendrimers are used to functionalize the surface of metal disks (14 mm in diameter, 2 mm thick) made of a Ti6A14V alloy, Titanium-based alloy widely used for the realization of orthopedic prostheses.

En l'espèce, les dendrimères phosphorés à terminaisons de type phosphonate utilisés dans le cas présent présentent un taux de fonctionnalisation proche de 50% (50% des groupements aldéhydes initiaux fonctionnalisés en groupements phosphonate, masse molaire proche de 4440 g/mol). In this case, the phosphorus-terminated phosphonate dendrimers used in the present case have a degree of functionalization close to 50% (50% of the initial aldehyde groups functionalized to phosphonate groups, molar mass close to 4440 g / mol).

Dans un premier temps, avant de subir l'adsorption, les disques sont polis mécaniquement pour obtenir des surfaces parfaitement lisses. Les disques sont ensuite nettoyés à l'alcool, rincés à l'eau déminéralisée, puis stérilisés à 180 C. At first, before undergoing adsorption, the discs are mechanically polished to obtain perfectly smooth surfaces. The discs are then cleaned with alcohol, rinsed with demineralised water and sterilized at 180 ° C.

Les dendrimères à terminaisons phosphonate sont mis en solution dans un mélange eau stérile/THF dans une proportion volumique 1:1. The phosphonate-terminated dendrimers are dissolved in a sterile water / THF mixture in a volume ratio of 1: 1.

Pour réaliser l'isotherme d'adsorption (ou courbe d'adsorption) de ces dendrimères à terminaisons phosphonate, des solutions d'adsorption de concentrations variant entre 0 et 450 g/ml (soit des concentrations molaires variant de 0 à 0,1 mol/ml) ont été utilisées. To realize the adsorption isotherm (or adsorption curve) of these phosphonate-terminated dendrimers, adsorption solutions with concentrations ranging between 0 and 450 g / ml (ie molar concentrations ranging from 0 to 0.1 mol / ml) were used.

Les disques de titane sont alors placés dans des puits de culture (plaque de 24 puits). La solution précédemment préparée est ajoutée à chaque puits. The titanium disks are then placed in culture wells (24-well plate). The previously prepared solution is added to each well.

L'adsorption se déroule en condition stérile, à température ambiante, pendant 2 heures. La solution d'adsorption est ensuite retirée. The adsorption takes place in a sterile condition at room temperature for 2 hours. The adsorption solution is then removed.

L'isotherme d'adsorption sur titane, correspondant aux 15 dendrimères particuliers utilisés, est exposée à la figure 1. The titanium adsorption isotherm, corresponding to the particular dendrimers used, is shown in FIG.

Cet isotherme peut être modélisé selon le modèle de Langmuir, menant à l'équation: N =N a m 1+bÉC dans laquelle Na est le nombre de moles de dendrimères adsorbés par cm2 de titane, b une constante, C la concentration de la solution d'adsorption, et N,n le nombre de moles de dendrimères adsorbés pour former une monocouche totalement occupée. La modélisation de cet isotherme mène ici à N,n. 2.218. 10-12 mol/cm2 à la monocouche. This isotherm can be modeled according to the Langmuir model, leading to the equation: N = N am 1 + bEC in which Na is the number of moles of dendrimers adsorbed per cm2 of titanium, b a constant, C the concentration of the solution adsorption, and N, n the number of moles of dendrimers adsorbed to form a fully occupied monolayer. The modeling of this isotherm leads here to N, n. 2218. 10-12 mol / cm 2 at the monolayer.

La concentration utilisée lors des expériences en présence de cellules (ci-après décrites) ont été réalisées avec une concentration pour la solution d'adsorption de 0.25 g/ml, soit 0.0563. 10-9 mol/ml. The concentration used during the experiments in the presence of cells (hereinafter described) were carried out with a concentration for the adsorption solution of 0.25 g / ml, ie 0.0563. 10-9 mol / ml.

La figure 1B montre un agrandissement de l'isotherme d'adsorption aux alentours de cette valeur à titre informatif. FIG. 1B shows an enlargement of the adsorption isotherm around this value for information purposes.

3) CULTURES CELLULAIRES SUR DES SURFACES FONCTIONNALISEES PAR DES DENDRIMERES A TERMINAISONS PHOSPHONATE bÉC a) Stimulation de la prolifération des cellules cultivées sur des surfaces fonctionnalisées Les tests de prolifération ont été réalisés avec des cellules MC3T3G, lignée ostéoblastique, cultivées dans du a-MEM, 10% de sérum, et 1% de pénicilline-streptomycine, 5% de CO2. Après trypsination, les cellules sont ensemencées à la densité de 2.104 cellules/cm2 d'une plaque de 24 puits. 3) CELL CULTURES ON FUNCTIONALIZED SURFACES BY PHOSPHONATE TERMINATION DENDRIMERS a) Stimulation of the proliferation of cells cultured on functionalized surfaces Proliferation tests were carried out with MC3T3G cells, an osteoblastic line, grown in α-MEM, 10% serum, and 1% penicillin-streptomycin, 5% CO2. After trypsination, the cells are seeded at the density of 2 × 10 4 cells / cm 2 of a 24-well plate.

La prolifération de ces cellules MC3T3G est mesurée à J4, J7, J14 et J21 par comptage cellulaire en double, et en fonction des quatre conditions de culture suivantes: - sans disque de titane fonctionnalisé dans les puits et sans dendrimères (plastique non traité : Po), sans disque de titane fonctionnalisé mais en présence de dendrimères adsorbés sur le plastique des puits (plastique fonctionnalisé : P-d), en présence de disques de titane non fonctionnalisés (titane non traité : Tio), en présence de disques de titane fonctionnalisés (titane fonctionnalisé :Ti-d). The proliferation of these MC3T3G cells is measured at D4, D7, D14 and D21 by double cell counting, and according to the following four culture conditions: - without titanium disc functionalized in the wells and without dendrimers (untreated plastic: Po ), without functionalized titanium disc but in the presence of dendrimers adsorbed on the plastic of the wells (functionalized plastic: Pd), in the presence of non-functionalized titanium disks (untreated titanium: TiO), in the presence of functionalized titanium disks (titanium functionalized: Ti-d).

Pour ces tests de culture cellulaire, il a été choisi d'utiliser un recouvrement des disques correspondant à une monocouche de dendrimères évaluée à 0,0025 g/disque soit une concentration de 0,01 g/cm2. For these cell culture tests, it was chosen to use a disk covering corresponding to a monolayer of dendrimers evaluated at 0.0025 g / disc, ie a concentration of 0.01 g / cm 2.

Les résultats de prolifération cellulaire obtenus dans ces différentes conditions de cultures (Po, P-d, Tio et Ti-d) sont représentés à la figure 2; l'axe des abscisses représente le temps exprimé en jour, et l'axe des ordonnées le nombre de cellules (N) par cm2. The cell proliferation results obtained under these different culture conditions (Po, P-d, TiO and Ti-d) are shown in FIG. 2; the x-axis represents the time expressed in days, and the y-axis the number of cells (N) per cm 2.

Ces résultats permettent ainsi d'affirmer que: - les dendrimères associés au titane fonctionnalisé par les dendrimères à 25 terminaisons phosphonate entraînent une augmentation du nombre de cellules par rapport au titane non traité, - à J4, le titane fonctionnalisé donne de bons résultats, ce qui semble aller dans le sens d'une meilleure adhésion cellulaire, - les dendrimères utilisés ne sont pas cytotoxiques si l'on compare les 30 résultats obtenus avec le plastique traité et le plastique non traité, et les résultats obtenus avec le titane fonctionnalisé et le titane non traité, - les dendrimères ne semblent pas subir de désorption; leur action persiste encore à J21. These results thus make it possible to affirm that: the dendrimers associated with the titanium functionalized with the phosphonate-terminated dendrimers cause an increase in the number of cells relative to the untreated titanium, whereas on J4, the functionalized titanium gives good results; which seems to go in the direction of a better cellular adhesion, - the dendrimers used are not cytotoxic if one compares the results obtained with the treated plastic and the untreated plastic, and the results obtained with the functionalized titanium and the untreated titanium, the dendrimers do not appear to be desorbed; their action persists still at J21.

b) Stimulation de la différenciation de cellules ostéoprogénitrices cultivées sur les surfaces fonctionnalisées Les cellules ostéoprogénitrices utilisées ont été obtenues à partir de crêtes iliaques humaines aspirées lors d'interventions chirurgicales effectuées sur des donneurs sains. Ces cellules sont cultivées dans du a-MEM, 10% de sérum, et 1% de pénicilline-streptomycine, 5% de CO2. A 90% de la confluence, les cellules sont trypsinées et poolées. Elles sont ensuite analysées pour leur potentiel de 10 différenciation. b) Stimulation of the differentiation of osteoprogenitor cells cultured on the functionalized surfaces The osteoprogenitor cells used were obtained from human iliac crests aspirated during surgeries performed on healthy donors. These cells are grown in α-MEM, 10% serum, and 1% penicillin-streptomycin, 5% CO2. At 90% of the confluence, the cells are trypsinized and pooled. They are then analyzed for their potential for differentiation.

Le niveau d'expression de trois marqueurs de la différenciation ostéoblastique (cbfa-1, phosphatase alcaline et ostéocalcine) est mesuré. La méthode utilisée est indiquée ci-après. The level of expression of three markers of osteoblastic differentiation (cbfa-1, alkaline phosphatase and osteocalcin) is measured. The method used is shown below.

L'ARN total est extrait des cellules progénitrices en utilisant le kit RNeasy (QIAGEN). L'ARN est lavé et élué selon le protocole du fabricant. Total RNA is extracted from progenitor cells using the RNeasy Kit (QIAGEN). The RNA is washed and eluted according to the manufacturer's protocol.

Les échantillons d'ARN sont réverse-transcrits en ADNc en utilisant la sélection d'oligo-dT selon le protocole du fabriquant (LIFE TECHNOLOGIES). L'expression du gène de la phosphatase est quantifiée en utilisant le système RT-PCR (APPLIED BIOSYSTEMS). Les conditions de réaction sont différentes selon la séquence à amplifier. Le contrôle est le plastique des puits de culture. RNA samples are reverse-transcribed to cDNA using oligo-dT selection according to the manufacturer's protocol (LIFE TECHNOLOGIES). Expression of the phosphatase gene is quantified using the RT-PCR system (APPLIED BIOSYSTEMS). The reaction conditions are different according to the sequence to be amplified. Control is the plastic of the culture wells.

Les séquencès amorce ("primers") 5' des gènes cbfa, phosphatase alcaline (PA) et ostéocalcine (OC) sont présentées dans le tableau 1. The primer sequences ('primers') of the cbfa, alkaline phosphatase (PA) and osteocalcin (OC) genes are shown in Table 1.

SEQUENCESSEQUENCE

Amorce 5' cbfa-1 5'-AGAGGTACCAGATGGGACTGTGGTT-3, Amorce 5' PA 51AGGCAGGATTGACCACCACGG-3i Amorce 5' OC 5 -TCTGCTCACTCTGCTGAC-3' Primer 5 'cbfa-1 5'-AGAGGTACCAGATGGGACTGTGGTT-3, 5' primer PA 51AGGCAGGATTGACCACCACGG-3i 5 'OC primer 5 -TCTGCTCACTCTGCTGAC-3'

Tableau 1Table 1

Les produits de la PCR sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1% et visualisés au bromure d'éthidium. L'intensité de la coloration est mesurée. The PCR products are separated by electrophoresis on a 1% agarose gel and visualized with ethidium bromide. The intensity of the coloration is measured.

Le potentiel de différenciation de ces cellules ostéoprogénitrices est analysé à J3, J9 et J21 et ceci selon qu'elles aient été ou non cultivées sur un support de titane fonctionnalisé. The differentiation potential of these osteoprogenitor cells is analyzed on D3, D9 and D21 and this according to whether or not they have been cultured on a functionalized titanium support.

Les résultats obtenus sont présentés aux figures 3A à 3C montrant respectivement l'intensité relative des trois marqueurs (cbfa-1, PA et OC) par rapport à un gène référence, à différents temps (J3, J9 et J21), sur substrat non traités (le plastique des puits de culture: Po) et sur substrat traité (Ti-d). The results obtained are shown in FIGS. 3A to 3C, respectively showing the relative intensity of the three markers (cbfa-1, PA and OC) relative to a reference gene, at different times (J3, J9 and J21), on untreated substrate. (plastic culture wells: Po) and treated substrate (Ti-d).

L'expression de cbfa-1 (Figure 3A) diminue ce qui est normal pour ce marqueur d'un stade de différenciation très précoce. The expression of cbfa-1 (FIG. 3A) decreases what is normal for this marker of a very early differentiation stage.

En revanche, l'augmentation de l'expression de la phosphatase alcaline (Figure 3B) est nettement accrue par rapport au contrôle. Ce marqueur indique une évolution vers un stade de différenciation plus avancé : celui d'un ostéoblaste en début de maturité. Ces résultats témoignent ainsi d'une différenciation induite et l'engagement des cellules progénitrices vers la voie ostéoblastique. On the other hand, the increase in the expression of alkaline phosphatase (FIG. 3B) is markedly increased compared to the control. This marker indicates a progression towards a more advanced stage of differentiation: that of an osteoblast at the beginning of maturity. These results thus testify to an induced differentiation and the commitment of the progenitor cells to the osteoblastic pathway.

L'expression de l'ostéocalcine (Figure 3C), un autre marqueur de différenciation de l'ostéoblaste, un peu plus tardif que le précédent, est activée à un moindre niveau. L'ostéocalcine inhibe la maturation du minéral osseux en retardant la nucléation. Cette diminution montre le rôle réel des dendrimères à terminaisons de type phosphonate dans l'induction de la nucléation cristalline, laquelle entraîne au contraire une diminution de l'expression de l'ostéocalcine. Expression of osteocalcin (Figure 3C), another marker of differentiation of osteoblast, a little later than the previous one, is activated at a lower level. Osteocalcin inhibits the maturation of bone mineral by delaying nucleation. This decrease shows the real role of phosphonate-terminated dendrimers in inducing crystalline nucleation, which on the contrary results in a decrease in osteocalcin expression.

Claims

1 / - Implantable bone reconstruction product having at least one surface made of at least one biomaterial and treated so as to promote integration of said implantable product into bone site, characterized in that said surface, said functionalized surface, are immobilized dendrimers Phosphorus exposing peripheral sequences with anionic termination (s).

2 / - The product of claim 1, characterized in that the immobilization of said phosphorus dendrimers exposing anionic termination (s) peripheral sequences, on said functionalized surface, is carried out by adsorption.

3 / - Product according to one of claims 1 or 2, characterized in that said functionalized surface is made of at least one biomaterial selected from the group consisting of: titanium, zirconia, and their alloys, a cobalt-chromium alloy , bioverres, calcium phosphates, calcium carbonates, cellulosic polypeptides, alginate polyethylene glycol (PLG), copolymers of lactic and glycolic acids (PLGA), hyaluronate, collagen, gelatin, chitosan , fibrin, agarose, polyacrylic acids and their derivatives, polyethylene oxides and copolymers thereof, polyvinyl alcohols, polyphosphazenes.

4 / - Product according to one of claims 1 to 3, characterized in that on said functionalized surface are immobilized phosphorus dendrimers exhibiting terminal sequences (s) of the phosphonate type.

5 / - Product according to one of claims 1 to 3, characterized in that on said functionalized surface are immobilized phosphorus dendrimers exhibiting terminal sequences (s) of the carboxylate type.

6 / - The product according to one of claims 1 to 5, characterized in that said peripheral sequences end (s) anion (s) are selected from: - phosphonate-terminated sequences, of general formula chosen from:

OH

O-R-CH 2 -NH-RI-P-O-Cat + O OH 1 -O-R-CH = N-RI-P-O-, Cat +

O

01-R-CH2-NH-R1-P - (O) 2, 2Cat +

O

O-R-CH = N-R1-P- (O-) 2, 2Cat + O - carboxylate-terminated sequences of the general formula selected from: OR-CH2-NH-R1-CO-, Cat + O OR-CH = N-R1-CO-, Cat + O-R and R1 denoting alkyl or aryl groups, - Cat + denoting an organic or mineral cation.

7 / - The product according to claim 6, characterized in that the phosphorylated dendrimers having peripheral sequences having anionic termination (s) are formed of: - a heart of general formula chosen from: X = P and N / P \NOT

P ---- / N \ 10 15 and

a plurality of monomers assembled into a branched structure which projects from each phosphorus atom of said core, describing successive layers of monomers, called generations, and ending in said anionic peripheral sequences; each of these monomers being of the following general sequence: O-R-CH = N-NH-PI X X denotes a sulfur or oxygen atom.

8 / - Product according to one of claims 1 to 7, characterized in that said functionalized surface is functionalized by adsorption of phosphorus dendrimers semi-developed formula: S = P- {OC-CH NN (CH3) P (S) - [OC-CH = NN (CH3) P (S) - (OC-CH N-RI-P (O) (O-) 2] 2} 3 9 / - Product according to one of claims 1 to 8, characterized in that said functionalized surface is functionalized by adsorption of phosphorus-containing dendrimers exposing phosphonate-terminated terminal sequences and phosphoric dendrimers exposing carboxylate-type terminus-terminated sequences.

10 / - Product according to one of claims 1 to 8, characterized in that on said functionalized surface are adsorbed phosphorus dendrimers exhibiting both terminal sequences of phosphonate type (s) and peripheral sequences terminating (s) ) of the carboxylate type.

11 / - Product according to one of claims 1 to 10, characterized in that said dendrimers adsorbed on said functionalized surface are of generation between 1.5 to 12.5.

12 / - Product according to one of claims 1 to 11, characterized in that said functionalized surface has a total concentration of immobilized dendrimers at least of the order of 0.002 nmol / cm 2.

13 / - Process for preparing an implantable product intended for bone reconstruction, in which at least one surface of an implantable product, said surface to be functionalized, is immobilized with phosphorus-containing dendrimers exhibiting peripheral sequences with termination (s) anionic (s).

14 / - Method according to claim 13, characterized in that the immobilization of said phosphorus dendrimers exposing anion-terminated peripheral sequences (s) on said surface to be functionalized is carried out according to an adsorption method in which an solution comprising said dendrimers, said adsorption solution, and inside which said surface is immersed to be functionalized.

15 / - Method according to claim 14, characterized in that an adsorption solution is used, based on a mixture of water / organic solvent (s), with a concentration of dendrimers adapted to lead to the obtaining a functionalized surface having a dendrimer concentration of at least about 0.002 nmol / cm 2.

16 / - Method according to one of claims 13 to 15, characterized in that said surface to be functionalized is made of at least one biomaterial selected from the group consisting of: titanium, zirconia and their alloys, a cobalt-chromium alloy , bioverres, calcium phosphates, calcium carbonates, cellulosic polypeptides, alginate polyethylene glycol (PLG), copolymers of lactic and glycolic acids (PLGA), hyaluronate, collagen, gelatin, chitosan , fibrin, agarose, polyacrylic acids and their derivatives, polyethylene oxides and copolymers thereof, polyvinyl alcohols, polyphosphazenes.

17 / - Method according to one of claims 13 to 16, characterized in that phosphoric dendrimers exhibiting phosphonate-type anionic termination (s) peripheral sequences are used.

18 / - Method according to one of claims 13 to 16, characterized in that phosphoric dendrimers exposing terminal sequences end (s) anionic (s) carboxylate type (s).

19 / - Method according to one of claims 13 to 18, characterized in that, in combination, used phosphorus dendrimers exhibiting phosphonate-type terminal sequences and phosphoric dendrimers exhibiting terminal sequences to termination (s) carboxylate type.

20 / - Method according to one of claims 13 to 17 and 19, characterized in that, as dendrimers exhibiting phosphonate-type terminated peripheral sequences of semideveloppée formula: S = P- { ## STR2 ## one of claims 13 to 18, characterized in that phosphorus-containing dendrimers are used which exhibit both phosphonate-type terminal (s) peripheral sequences and carboxylate-type terminal (s) peripheral sequences.