FR2872290A1 - Implementation of plurality of parallel enzymatic reaction, used to diagnose e.g. viral infection, comprises obtaining solid support comprising zone matrix, depositing substrate and implementing plurality of the reaction in reactive volume - Google Patents
Implementation of plurality of parallel enzymatic reaction, used to diagnose e.g. viral infection, comprises obtaining solid support comprising zone matrix, depositing substrate and implementing plurality of the reaction in reactive volume Download PDFInfo
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Abstract
Description
METHODE D'ANALYSE HAUTEMENT PARALLELE DE REACTIONSMETHOD OF HIGHLY PARALLEL ANALYSIS OF REACTIONS
ENZYMATIQUES ET SES APPLICATIONSENZYMATICS AND ITS APPLICATIONS
L'invention se rapporte à une nouvelle méthode pour l'analyse en parallèle d'une pluralité de réactions enzymatiques. L'invention vise en particulier les domaines du diagnostic et du criblage à haut débit de substances actives dans une réaction enzymatique, notamment du criblage d'enzymes, de substrats, d'inhibiteurs ou de régulateurs d'enzymes. L'invention est notamment relative à un procédé comprenant: a. l'obtention d'un support solide comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, b. le dépôt ou la fixation dans chaque zone hydrophile d'au moins un substrat capable de réagir dans une réaction enzymatique, c. la mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques réalisées en parallèle dans des volumes réactionnels constitués par les gouttes de solution aqueuse confinées dans chaque zone hydrophile du support et contenant les réactifs et tampons appropriés.  The invention relates to a new method for the parallel analysis of a plurality of enzymatic reactions. The invention is directed in particular to the fields of diagnosis and high throughput screening of active substances in an enzymatic reaction, in particular the screening of enzymes, substrates, inhibitors or enzyme regulators. The invention relates in particular to a method comprising: a. obtaining a solid support comprising a matrix of hydrophilic zones, each hydrophilic zone being delimited by a hydrophobic zone separating it from the other hydrophilic zones, b. depositing or fixing in each hydrophilic zone at least one substrate capable of reacting in an enzymatic reaction, c. the implementation of a plurality of enzymatic reactions carried out in parallel in reaction volumes constituted by the drops of aqueous solution confined in each hydrophilic zone of the support and containing the appropriate reagents and buffers.
Les enzymes de la famille des protéases ont pour fonction le clivage de certaines liaisons peptidiques, et elles jouent un rôle clé dans la cellule. Elles sont en effet impliquées dans d'importants processus biologiques tels que la maturation et la dégradation des protéines, la signalisation cellulaire, la différenciation, l'apoptose... La production de ces enzymes, leur fonctionnement anormal est associé à de nombreuses pathologies (réactions inflammatoires, cancers, infections par des agents pathogènes et maladie d'Alzheimer), ce qui en fait à la fois des cibles thérapeutiques et des marqueurs diagnostiques d'intérêt ([1] Leung, D.; Abbenante, G.; Fairlie, D. P. Protease Inhibitors: Current Status and Future Prospects, J Med Chem 43: 305 (2000). & [2] Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets Nat. Med. 9: 123 (2003)). 20  The enzymes of the protease family function to cleave certain peptide bonds, and they play a key role in the cell. They are indeed involved in important biological processes such as protein processing and degradation, cell signaling, differentiation, apoptosis ... The production of these enzymes, their abnormal functioning is associated with many pathologies ( inflammatory reactions, cancers, pathogen infections, and Alzheimer's disease), making them both therapeutic targets and diagnostic markers of interest ([1] Leung, D., Abbenante, G .; DP Protease Inhibitors: Current Status and Future Prospects, J Med Chem 43: 305 (2000). & [2] Weissleder, R. Ntziachristos, V. Shedding Light Onto Molecular Target Molecules 9: 123 (2003) . 20
Plus généralement, la détection de l'activité spécifique des enzymes, et notamment les protéases, ou le criblage de molécules actives sur ces enzymes présente un intérêt évident dans les domaines du diagnostic médical ou de la recherche pharmaceutique pour la découverte de nouvelles substances actives.  More generally, the detection of the specific activity of enzymes, and especially proteases, or the screening of active molecules on these enzymes is of obvious interest in the fields of medical diagnosis or pharmaceutical research for the discovery of new active substances.
Pour déterminer l'activité spécifique d'une enzyme, il est nécessaire de mesurer l'activité de l'enzyme étudiée sous différentes conditions, et notamment en faisant varier les conditions de concentrations en enzyme et en substrat, et éventuellement en co-facteur. De même, il est nécessaire lors de la recherche de molécules actives, par exemple de molécules interférant avec l'activité d'enzymes, d'observer l'effet d'un grand nombre de molécules, notamment d'inhibiteurs, en général plusieurs centaines, à diverses concentrations. Idéalement, toutes ces conditions devraient être testées simultanément et en utilisant les volumes les plus faibles possibles afin d'obtenir un résultat rapide tout en minimisant les coûts associés à de telles méthodes de criblage. Une méthode réunissant toutes ces caractéristiques serait donc particulièrement utile.  In order to determine the specific activity of an enzyme, it is necessary to measure the activity of the enzyme under study under various conditions, and in particular by varying the conditions of enzyme and substrate concentrations, and optionally as a cofactor. Similarly, it is necessary, when searching for active molecules, for example molecules interfering with the activity of enzymes, to observe the effect of a large number of molecules, in particular inhibitors, generally several hundred , at various concentrations. Ideally, all of these conditions should be tested simultaneously and using the lowest possible volumes to achieve a fast result while minimizing the costs associated with such screening methods. A method combining all these characteristics would therefore be particularly useful.
Aujourd'hui, il existe de nombreuses méthodes macroscopiques in vitro développées pour l'enzymologie. On citera en particulier les méthodes décrites dans la demande de brevet WO 02074997 (QTLBiosystems) et dans la demande de brevet WO 0194332.  Today, there are many in vitro macroscopic methods developed for enzymology. In particular, the methods described in the patent application WO 02074997 (QTLBiosystems) and in the patent application WO 0194332 are mentioned.
Schématiquement, on peut diviser en quatre groupes, les méthodes macroscopiques actuelles de détection d'activité protéolytique: a) celles utilisant un substrat protéique analysé sur gel d'électrophorèse (PAGE), b) celles utilisant un substrat peptidique analysé par chromatographie HPLC, c) celles utilisant un substrat peptidique chromogène analysé à l'aide d'un spectrophotomètre avec éventuellement un lecteur de microplaques, d) celles utilisant un substrat peptidique fluorogène analysé à l'aide d'un scanner 30 de fluorescence ou d'un spectrofluorimètre avec éventuellement un lecteur de microplaques.  Schematically, we can divide into four groups, the current macroscopic methods of detection of proteolytic activity: a) those using a protein substrate analyzed on gel electrophoresis (PAGE), b) those using a peptide substrate analyzed by HPLC chromatography, c ) those using a chromogenic peptide substrate analyzed using a spectrophotometer optionally with a microplate reader, d) those using a fluorogenic peptide substrate analyzed using a fluorescence scanner or a spectrofluorometer with possibly a microplate reader.
Les deux premières méthodes ne se révèlent pas adaptées aux exigences des criblages à haut débit. Les méthodes utilisant des substrats chromogènes ou fluorogènes pour mettre en évidence l'activité de l'enzyme sont utilisées avec les systèmes actuels de criblage à haut débit (plaques 96 ou 384 puits).  The first two methods are not suitable for the requirements of high throughput screening. Methods using chromogenic or fluorogenic substrates to demonstrate the activity of the enzyme are used with current high throughput screening systems (96 or 384-well plates).
Ces systèmes ne sont toutefois pas encore satisfaisants. En particulier, ils sont coûteux, encombrants et nécessitent de manipuler des quantités de produit importantes. Les volumes pour chaque réaction enzymatique en micro-plaque sont au moins égaux à 100 nL, voire largement supérieurs.  These systems are not yet satisfactory. In particular, they are expensive, bulky and require handling large amounts of product. The volumes for each microplate enzymatic reaction are at least 100 nL or even much higher.
Des dispositifs miniaturisés, regroupés sous le terme générique de puces à protéines , ont été récemment développés, plus particulièrement pour l'analyse d'interactions de protéines avec des ligands, tels que le dispositif décrit dans le brevet US 6,630,358 (Zyomyx). Ces dispositifs se révèlent toutefois inadaptés pour l'enzymologie du fait de l'immobilisation des enzymes qui perturbe leur conformation active.  Miniaturized devices, grouped under the generic term of protein chips, have recently been developed, more particularly for the analysis of protein interactions with ligands, such as the device described in US Pat. No. 6,630,358 (Zyomyx). These devices are, however, unsuitable for enzymology because of the immobilization of enzymes that disrupts their active conformation.
La demande de brevet WO2004039487 décrit un système amélioré où des protéines sont emprisonnées dans une matrice de type sol-gel.  Patent application WO2004039487 describes an improved system where proteins are trapped in a sol-gel type matrix.
Le dispositif développé par Biacore permet l'analyse d'interactions moléculaires (protéines-protéines ou protéines-ligands) (WO2004/038415 Al) à partir de faibles volumes, toutefois il n'est pas adapté pour l'analyse en parallèle d'un grand nombre de réactions enzymatiques.  The device developed by Biacore allows the analysis of molecular interactions (protein-proteins or protein-ligands) (WO2004 / 038415 Al) from low volumes, however it is not suitable for the parallel analysis of a large number of enzymatic reactions.
De même, des systèmes d'analyse de réactions enzymatiques, fondés sur l'utilisation de la microfluidique ont été décrits, notamment dans le brevet US6,632,629 (Caliper): La réaction enzymatique se fait alors dans un canal où les flux de réactifs se rencontrent. Cependant, dans un seul canal, on ne peut faire les réactions qu'en série et la parallèlisation des canaux est très difficile. Cette approche ne permet donc pas de suivre simultanément plusieurs centaines à plusieurs milliers de réactions enzymatiques.  Similarly, enzymatic reaction analysis systems based on the use of microfluidics have been described, in particular in US Pat. No. 6,632,629 (Caliper): The enzymatic reaction is then carried out in a channel where the flow of reagents meet. However, in a single channel, the reactions can only be done in series and the parallelization of the channels is very difficult. This approach therefore makes it impossible to simultaneously monitor several hundred to several thousand enzymatic reactions.
Des systèmes d'analyse hautement parallèle utilisant des micropuits de faibles volumes ont été décrits par Alderman J.C. et al (WO 03059518). Un système permettant de mettre en contact une matrice de protéines et de produits chimiques est décrit par Brennan T.M (US 6,210,894).  Highly parallel analysis systems using low volume microwells have been described by Alderman J.C. et al (WO 03059518). A system for contacting a matrix of proteins and chemicals is described by Brennan T.M (US 6,210,894).
Ces deux approches ont deux limitations en commun: - la matrice est fermée par un capot; l'alignement des capots avec les matrices peut constituer une difficulté lors de leur mise en place, - une fois le capot mis en place, il est impossible d'ajouter un autre réactif par la suite.  These two approaches have two limitations in common: - the matrix is closed by a hood; the alignment of the covers with the dies can be a difficulty when they are put in place, - once the cover is put in place, it is impossible to add another reagent afterwards.
Il existe par conséquent un réel besoin de développer de nouvelles méthodes microtechnologiques pour mesurer l'activité d'une enzyme et l'influence de composés sur cette activité, et analyser en parallèle un grand nombre de réactions enzymatiques utilisant de très faibles volumes réactionnels, qui soient économiques, automatisables et faciles à mettre en oeuvre.  There is therefore a real need to develop new microtechnological methods for measuring the activity of an enzyme and the influence of compounds on this activity, and to analyze in parallel a large number of enzymatic reactions using very low reaction volumes, which are economical, automatable and easy to implement.
Schaack et al. ont décrit un système de culture cellulaire en puits virtuels utilisant un support solide comportant des zones hydrophiles délimitées par une zone hydrophobe, de sorte qu'un milieu de culture cellulaire déposé sur une zone hydrophile du support forme une goutte confinée dans la zone hydrophile. Un tel support permet de réaliser en parallèle des milliers de cultures cellulaires dans de très faibles volumes.  Schaack et al. have described a virtual well cell culture system using a solid support having hydrophilic zones delimited by a hydrophobic zone, so that a cell culture medium deposited on a hydrophilic zone of the support forms a drop confined in the hydrophilic zone. Such a support makes it possible to perform in parallel thousands of cell cultures in very small volumes.
A la connaissance de la Demanderesse, l'utilisation d'un tel support n'a jamais été décrite ni suggérée pour la mise en oeuvre d'un grand nombre de réactions enzymatiques.  To the knowledge of the Applicant, the use of such a support has never been described or suggested for the implementation of a large number of enzymatic reactions.
Par rapport aux procédés de l'état de la technique, le procédé de l'invention présente de nombreux avantages, et permet notamment: - de travailler sur une surface réduite dans plusieurs centaines à plusieurs milliers de gouttes séparées.  Compared to the methods of the state of the art, the method of the invention has many advantages, and allows in particular: - to work on a reduced surface in several hundreds to several thousand separate drops.
- de réaliser des réactions enzymatiques indépendantes les unes des autres dans chacune des gouttes, - de mesurer l'activité enzymatique (ou son inhibition) dans toutes les gouttes simultanément.  to carry out enzymatic reactions independent of each other in each of the drops; to measure the enzymatic activity (or its inhibition) in all the drops simultaneously.
Plus particulièrement, il permet de tester en parallèle différentes conditions: - différentes enzymes - différentes concentrations d'enzymes et de substrats - différents inhibiteurs, de régulateurs ou de substrats d'enzymes (peptides, dérivés de peptides, petites molécules) différentes concentrations d'inhibiteurs de régulateurs ou de substrats d'enzymes.  More particularly, it makes it possible to test different conditions in parallel: - different enzymes - different concentrations of enzymes and substrates - different inhibitors, regulators or enzyme substrates (peptides, peptide derivatives, small molecules) different concentrations of inhibitors of regulators or enzyme substrates.
Le procédé de l'invention permet également de réaliser des mesures dynamiques, pour déterminer l'évolution de l'activité enzymatique au cours du temps. 10 L'invention a donc pour objet un procédé de mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques en parallèle dans des volumes réactionnels séparés, ladite méthode comprenant: a) l'obtention d'un support solide comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, les zones hydrophiles et hydrophobes étant caractérisées en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile, b) le dépôt ou la fixation dans chaque zone hydrophile d'au moins un substrat d'une réaction enzymatique, c) la mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques en parallèle dans un volume réactionnel constitué d'une goutte de solution aqueuse confinée dans chaque zone hydrophile du support et contenant les réactifs et tampons appropriés.  The method of the invention also makes it possible to carry out dynamic measurements in order to determine the evolution of the enzymatic activity over time. The subject of the invention is therefore a process for carrying out a plurality of enzymatic reactions in parallel in separate reaction volumes, said method comprising: a) obtaining a solid support comprising a matrix of hydrophilic zones, each hydrophilic zone being delimited by a hydrophobic zone separating it from the other hydrophilic zones, the hydrophilic and hydrophobic zones being characterized in that an aqueous solution deposited at a hydrophilic zone forms a drop confined by the surface tension in said zone; hydrophilic, b) depositing or fixing in each hydrophilic zone at least one substrate of an enzymatic reaction, c) carrying out a plurality of enzymatic reactions in parallel in a reaction volume consisting of a drop of aqueous solution confined in each hydrophilic zone of the support and containing the appropriate reagents and buffers.
Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, celuici comprend en plus une étape d. consistant à détecter en parallèle l'activité enzymatique dans chaque volume réactionnel et de façon préférée à la mesurer.  In a preferred embodiment of the method according to the invention, it further comprises a step d. comprising detecting in parallel the enzymatic activity in each reaction volume and preferably measuring it.
La mesure de l'activité enzymatique peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier; notamment par détection de substrats chromogènes avec un spectrophotomètre associé à un lecteur de microplaques, par immuno détection, par résonance plasmonique de surface ou SPR (Danielson, Eur J Pharm Sci. 2001 May, 13(2) :203-12) avec éventuellement une légère modification du support. En particulier, l'étape d. est mise en oeuvre par détection au cours de la réaction enzymatique et/ou à la fin de ladite réaction de la quantité d'un composé dont la fluorescence est révélée ou éteinte par la réaction enzymatique.  The measurement of the enzymatic activity can be carried out by any method known to those skilled in the art; in particular by detection of chromogenic substrates with a spectrophotometer associated with a microplate reader, by immuno-detection, by surface plasmon resonance or SPR (Danielson, Eur J Pharm Sci 2001 May, 13 (2): 203-12) with possibly a slight modification of the support. In particular, step d. is carried out by detecting during the enzymatic reaction and / or at the end of said reaction the amount of a compound whose fluorescence is revealed or extinguished by the enzymatic reaction.
De tels composés incluent notamment les substrats fluorogènes de type P'1fluorophore (J Am Chem Soc 2002 Dec 18, 124(50) : 14868-70; J Org Chem 2002 Feb 8 67(3) : 910-5; PNAS USA 2000 Jlu 5; 97(14) : 7754-9), FRET (Biopolymers, 2002, 66:93-100; Nat Biotechnol. 2000 18:1071-4; Chem Commun 2002 21: 2092-3), SQ (Molecular Probes & Neoplasia 2002 4: 228-36 et DA (Anal. Chem. 2004, 76, 1429-1436 (PerkinElmer), PNAS USA 2004, 101: 7511-5; Epub 2004 May 10 (QTL Biosystem)). En particulier, les substrats P'-1 fluorophores sont constitués de la partie P liée à une molécule qui a la particularité de devenir fluorescente lorsqu'elle est séparée de la molécule par une enzyme de clivage (par exemple une protéase dans le cas d'une liaison peptidique). Le principe est similaire pour les substrats DA (Donneur-Accepteur) et FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert): une molécule est fixée sur la partie P et elle n'émet pas de fluorescence tant qu'elle est au voisinage d'une deuxième molécule fixée à la deuxième partie P' liée à la partie P. Lorsque les parties P et P' sont séparées par action de l'enzyme, la molécule fixée sur P devient fluorescente.  Such compounds include, in particular, fluorophore substrates of the fluorophore type (J Am Chem Soc 2002 Dec 18, 124 (50): 14868-70; J Org Chem 2002 Feb 8 67 (3): 910-5; PNAS USA 2000 Jlu 5; 97 (14): 7754-9), FRET (Biopolymers 2002, 66: 93-100, Nat Biotechnol 2000 18: 1071-4, Chem Commun 2002 21: 2092-3), SQ (Molecular Probes & Neoplasia). 2002 4: 228-36 and DA (Anal Chem 2004, 76, 1429-1436 (PerkinElmer), PNAS USA 2004, 101: 7511-5, Epub 2004 May 10 (QTL Biosystem)). 1-fluorophores consist of the part P linked to a molecule which has the particularity of becoming fluorescent when it is separated from the molecule by a cleavage enzyme (for example a protease in the case of a peptide bond). principle is similar for DA (donor-acceptor) and FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) substrates: a molecule is fixed on the P part and it does not emit fluorescence as long as it is in the vicinity of a second one molecule attached to the second part P 'linked to the part P. When the parts P and P' are separated by action of the enzyme, the molecule attached to P becomes fluorescent.
En ce qui concerne les substrats SQ (Self-Quenched), les deux molécules mises en jeu sont identiques, et une grande densité de substrat (accrochés à un polymère par exemple) permet d'obtenir une diminution de la fluorescence. Après clivage, la fluorescence augmente à nouveau. Ce type de substrat SQ est aussi utilisable en solution dans le cas de substrats protéiques marqués avec une molécule fluorescente en quantité importante.  As regards the substrates SQ (Self-Quenched), the two molecules involved are identical, and a high density of substrate (hooked on a polymer for example) makes it possible to obtain a decrease in the fluorescence. After cleavage, the fluorescence increases again. This type of substrate SQ is also usable in solution in the case of protein substrates labeled with a fluorescent molecule in large quantities.
Parmi les substrats utilisables pour révéler une activité de type protéase, on utilisera les substrats suivants: DQ Gelatin (Molecular Probes), les substrats peptidiques fluorogènes commercialisés par Bachem ou Molecular probes. D'autres exemples de substrats fluorogènes adaptés pour les hélicases, phosphatases et protéases sont décrits dans Anal. Chem. 2004, 76: 1429-1436. II existe également des substrats fluorogènes adaptés pour les estérases, différents types d'oxydase, des enzymes participant au métabolisme des sucres (galactosidase, amylase...) ; des enzymes participant au métabolisme du phosphore (kinase, phosphatases...) ; des enzymes du complexe cytochrome P450, etc... (commercialisés par exemple par Molecular Probes, http://www.probes.com).  Among the substrates that can be used to reveal a protease-type activity, the following substrates will be used: DQ Gelatin (Molecular Probes), the fluorogenic peptide substrates marketed by Bachem or Molecular probes. Other examples of suitable fluorogenic substrates for helicases, phosphatases and proteases are described in Anal. Chem. 2004, 76: 1429-1436. There are also suitable fluorogenic substrates for esterases, various types of oxidase, enzymes involved in the metabolism of sugars (galactosidase, amylase ...); enzymes involved in phosphorus metabolism (kinase, phosphatases ...); enzymes of the cytochrome P450 complex, etc. (marketed for example by Molecular Probes, http://www.probes.com).
En présence de l'enzyme et du milieu réactionnel, la transformation du substrat, détectée par émission ou extinction de fluorescence, permet ainsi de mettre en évidence l'activité des enzymes spécifiques des substrats.  In the presence of the enzyme and of the reaction medium, the transformation of the substrate, detected by emission or quenching of fluorescence, thus makes it possible to demonstrate the activity of the substrate-specific enzymes.
Naturellement, le dispositif de détection sera déterminé en fonction du mode de révélation de l'activité enzymatique choisi par l'homme du métier.  Naturally, the detection device will be determined according to the mode of revelation of the enzymatic activity chosen by those skilled in the art.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé utilisant des composés fluorogènes, la quantité de fluorescence émise dans chaque volume réactionnel peut aisément être détectée à l'aide d'un scanner, tel que ceux couramment utilisés avec les méthodes utilisant les puces à ADN ou les puces à protéines (par exemple un appareil GeneTAC LSIV (PerkinElmer). On quantifie ensuite la fluorescence pour chaque zone hydrophile avec un logiciel adapté (par exemple Genepix Pro 4.0 Axon). On traite ensuite les données par un tableur (exemple Excel) permettant d'obtenir des valeurs et des graphiques.  In one embodiment of the process using fluorogenic compounds, the amount of fluorescence emitted in each reaction volume can easily be detected by means of a scanner, such as those commonly used with methods using DNA chips or the protein chips (for example a GeneTAC LSIV (PerkinElmer) device.) The fluorescence for each hydrophilic zone is then quantified with a suitable software (for example Genepix Pro 4.0 Axon) .The data is then processed by a spreadsheet (Excel example) allowing to obtain values and graphs.
Si on désire effectuer des mesures cinétiques, il est possible de retirer le support à des temps donnés et de mesurer la fluorescence. On peut ainsi quantifier 25 l'évolution de la fluorescence au cours du temps.  If one wishes to carry out kinetic measurements, it is possible to withdraw the support at given times and to measure the fluorescence. It is thus possible to quantify the evolution of the fluorescence over time.
Le support solide utilisé dans le procédé de l'invention est constitué par une plaque dont la surface est sensiblement plane, qui peut être en silicium, en verre ou en polymère, comme par exemple en polyuréthane, en nylon, en polyester, en polyéthylène, en polypropylène, en polyfluorocarbone, en polyméthylacrylate (PMMA), en polycarbonate, en chlorure de polyvinlyle (PVC), en polydiméthylsiloxane (PDMS) ou en polysulfone.  The solid support used in the process of the invention consists of a plate whose surface is substantially flat, which may be made of silicon, glass or polymer, such as polyurethane, nylon, polyester, polyethylene, polypropylene, polyfluorocarbon, polymethylacrylate (PMMA), polycarbonate, polyvinyl chloride (PVC), polydimethylsiloxane (PDMS) or polysulfone.
Selon l'invention, le support utilisé contient une matrice de zones hydrophiles délimitées par une zone hydrophobe, cette dernière pouvant être composée de plusieurs parties. Le terme matrice signifie que les zones hydrophiles sont disposées sur le support à des positions déterminées, par exemple en réseau normé, notamment orthonormé (formant des lignes et des colonnes). Les zones hydrophiles et hydrophobes sur le support sont caractérisées en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile. Un exemple d'un tel support est présenté à la figure 1. La goutte formée dans la zone hydrophile remplit tout ou partie de ladite zone hydrophile et y demeure confinée.  According to the invention, the support used contains a matrix of hydrophilic zones delimited by a hydrophobic zone, the latter being able to be composed of several parts. The term matrix means that the hydrophilic zones are arranged on the support at determined positions, for example in a normed network, in particular orthonormed (forming rows and columns). The hydrophilic and hydrophobic zones on the support are characterized in that an aqueous solution deposited at a hydrophilic zone forms a drop confined by the surface tension in said hydrophilic zone. An example of such a support is shown in FIG. 1. The drop formed in the hydrophilic zone fills all or part of said hydrophilic zone and remains confined thereto.
De préférence, chaque zone hydrophile consiste en des zones de la surface sensiblement plane du support d'une taille allant de 5 m2 à 10mm2, de préférence de 100 m2 à 5 mm2.  Preferably, each hydrophilic zone consists of zones of the substantially flat surface of the support with a size ranging from 5 m2 to 10 mm 2, preferably from 100 m2 to 5 mm 2.
Selon un mode préférentiel, le support contient au moins 10 zones hydrophiles, par exemple au moins 100 zones hydrophiles, par exemple entre 10 et 10000, notamment entre 300 et 3000 zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant susceptible de contenir un volume réactionnel constitué d'une goutte de solution aqueuse d'un volume compris entre 0,1 et 5000 nl, de préférence de 1 à 500 nI, par exemple entre 10 et 100 nl.  According to a preferred embodiment, the support contains at least 10 hydrophilic zones, for example at least 100 hydrophilic zones, for example between 10 and 10,000, in particular between 300 and 3000 hydrophilic zones, each hydrophilic zone being capable of containing a reaction volume consisting of a drop of aqueous solution with a volume of between 0.1 and 5000 nl, preferably 1 to 500 nl, for example between 10 and 100 nl.
En particulier, plusieurs centaines à plusieurs milliers de gouttes peuvent être réparties sur une lame de verre de dimensions standards (proche de 75 mm x 25 mm).  In particular, several hundred to several thousand drops may be distributed on a glass slide of standard dimensions (close to 75 mm x 25 mm).
Selon un autre mode préférentiel, le support utilisé dans le procédé de l'invention est un support solide en verre, en silicium, en plastique ou en métal, par exemple or ou argent, dont la surface est traitée pour obtenir une matrice de zones hydrophiles délimitées par une zone hydrophobe, les zones hydrophiles et hydrophobes étant caractérisées par leur différence d'angle de goutte supérieure à 40 .  According to another preferred embodiment, the support used in the process of the invention is a solid support made of glass, silicon, plastic or metal, for example gold or silver, whose surface is treated to obtain a matrix of hydrophilic zones. delimited by a hydrophobic zone, the hydrophilic and hydrophobic zones being characterized by their difference in drop angle greater than 40.
Pour conférer un caractère hydrophobe ou hydrophile à la surface plane du support, celle-ci est préférentiellement recouverte d'un matériau hydrophobe ou hydrophile, tel que les silanes hydrophobes ou hydrophiles, ou d'une couche de polymère hydrophobe, par exemple du téflon.  To impart a hydrophobic or hydrophilic character to the flat surface of the support, it is preferably covered with a hydrophobic or hydrophilic material, such as hydrophobic or hydrophilic silanes, or a hydrophobic polymer layer, for example Teflon.
Une matrice de zones hydrophiles sur fond hydrophobe (Fig la) peut être obtenue par exemple par application d'un masque sur la surface du support (éventuellement prétraitée, par exemple avec un mélange acide sulfuriqueleau oxygénée) suivie par une modification chimique. Ce masque peut être un polymère (par exemple photoresist), une solution visqueuse (par exemple contenant du glycérol). Le masque peut être dispensé sur la surface à l'aide d'un spotter ou être créé par photolithographie (notamment par les méthodes décrites dans les brevets US 5,985,551, US 5, 474,796 et WO 0216023). La protection de la surface avec un masque permet la modification différentielle de la surface: d'abord des zones non protégées par exemple avec un silane hydrophobe (perfluorosilanes, alkylsilanes...) ou avec une couche mince de polymère hydrophobe (par exemple téflon liquide) et ensuite, après l'enlèvement du masque, des zones déprotégées avec un autre composé (par exemple un silane hydrophile tel que 2 [methoxypolyethylenoxy]propyltrimethoxysilane, APTES, bis[2-hydroxyethyl]-3-am inopropyltriethoxysilane).  A matrix of hydrophilic zones on a hydrophobic bottom (FIG. 1a) can be obtained for example by applying a mask on the surface of the support (optionally pretreated, for example with a mixture of sulfuric acid and oxygenated water) followed by a chemical modification. This mask may be a polymer (for example photoresist), a viscous solution (for example containing glycerol). The mask can be dispensed on the surface by means of a spotter or can be created by photolithography (in particular by the methods described in US Pat. Nos. 5,985,551, 5,474,796 and WO 0216023). The protection of the surface with a mask allows the differential modification of the surface: first unprotected areas for example with a hydrophobic silane (perfluorosilanes, alkylsilanes ...) or with a thin layer of hydrophobic polymer (for example liquid teflon) ) and then, after removal of the mask, deprotected areas with another compound (for example a hydrophilic silane such as 2 [methoxypolyethylenoxy] propyltrimethoxysilane, APTES, bis [2-hydroxyethyl] -3-aminopropyltriethoxysilane).
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré du procédé, le support utilisé est caractérisé en ce que la matrice de zones hydrophiles est obtenue au moyen d'une modification chimique de la surface, notamment par le dépôt localisé de silanes hydrophobes ou hydrophiles, ou le dépôt localisé d'une couche de polymère hydrophobe tel que le téflon, dans les zones hydrophobes ou hydrophiles. En particulier, la modification chimique de la surface est réalisée après formation d'un masque obtenu par spottage, par photolithographie ou par altération de la couche hydrophobe par laser ou par plasma.  Thus, according to a preferred embodiment of the method, the support used is characterized in that the matrix of hydrophilic zones is obtained by means of a chemical modification of the surface, in particular by the localized deposition of hydrophobic or hydrophilic silanes, or the localized deposition of a hydrophobic polymer layer such as teflon, in the hydrophobic or hydrophilic zones. In particular, the chemical modification of the surface is carried out after forming a mask obtained by spotting, by photolithography or by altering the hydrophobic layer by laser or plasma.
D'autres exemples de production de support contenant une matrice de zones hydrophiles sont notamment décrits dans le brevet FR 0209326 (Schaack et al.) Etant donné que le support permet de confiner les microgouttes dans la matrice de zones hydrophiles, il n'est pas nécessaire de fixer les substrats sur le support, le substrat de chaque réaction enzymatique est alors en solution dans le volume réactionnel.  Other examples of production of support containing a matrix of hydrophilic zones are in particular described in patent FR 0209326 (Schaack et al.) Since the support makes it possible to confine the microdroplets in the matrix of hydrophilic zones, it is not possible to necessary to fix the substrates on the support, the substrate of each enzymatic reaction is then in solution in the reaction volume.
Cependant, dans certaines conditions, il peut s'avérer avantageux de fixer le substrat sur la surface du support ou bien à un gel ou à un hydrogel, notamment afin de pouvoir effectuer des lavages avant l'analyse, et de mesurer l'activité enzymatique dans des conditions diverses. Enfin, le simple dépôt de substrats dans un gel ou un hydrogel emplissant les zones hydrophiles est aussi possible.  However, under certain conditions, it may be advantageous to fix the substrate on the surface of the support or to a gel or a hydrogel, in particular in order to be able to carry out washes before the analysis, and to measure the enzymatic activity. under various conditions. Finally, the simple deposition of substrates in a gel or a hydrogel filling the hydrophilic zones is also possible.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé de l'invention, le substrat de chaque réaction enzymatique est fixé à la surface du support. De préférence, le substrat est lié à la surface, via un espaceur, soit de façon covalente, soit par adsorption. L'espaceur est greffé ou adsorbé à la matrice hydrophile, et permet de maintenir les composés à distance de la surface tout en présentant les substrats aux enzymes.  In a particular embodiment of the process of the invention, the substrate of each enzymatic reaction is attached to the surface of the support. Preferably, the substrate is bonded to the surface, via a spacer, either covalently or by adsorption. The spacer is grafted or adsorbed to the hydrophilic matrix, and allows the compounds to be kept away from the surface while presenting the substrates to the enzymes.
Des exemples d'espaceurs utilisables sont notamment des polymères artificiels 20 tels que le polyéthylène glycol ou les polyacrylamides ou des polymères naturels tels que les protéines, les sucres ou les acides nucléiques.  Examples of usable spacers include artificial polymers such as polyethylene glycol or polyacrylamides or natural polymers such as proteins, sugars or nucleic acids.
En particulier, il est possible de fixer sur cet espaceur de façon covalente ou par adsorption des substrats dits fluorogènes. On citera en particulier les quatre types de substrats fluorogènes P'1-Fluorophore, FRET, SQ et D-A qui ont été définis précédemment. La fixation des substrats au support permet avantageusement de laver le support après mise en oeuvre des réactions enzymatiques et de conserver l'empreinte sur la plaque de la modification enzymatique des substrats fixés sur la plaque. La plaque ainsi modifiée peut être analysée ultérieurement et les résultats comparés par rapport à une image de référence.  In particular, it is possible to fix on this spacer covalently or by adsorption so-called fluorogenic substrates. In particular, the four types of fluorogenic substrates P'1-Fluorophore, FRET, SQ and D-A which have been defined previously are mentioned. Fixing the substrates to the support advantageously makes it possible to wash the support after the enzymatic reactions have been carried out and to preserve the impression on the plate of the enzymatic modification of the substrates fixed on the plate. The plate thus modified can be analyzed later and the results compared compared to a reference image.
Le dépôt de tous les réactifs dans chaque zone hydrophile se fait au moyen de système automatisé approprié, notamment les robots de dispense piézo-électrique Sciflexarrayer de la société Scienion et Nano-plotter de la compagnie Gesim.  The deposition of all the reagents in each hydrophilic zone is done by means of appropriate automated system, in particular the Sci-vlexirrayer piezoelectric dispensing robots from Scienion and Nano-plotter from Gesim.
Les substrats déposés dans chaque zone hydrophile peuvent être identiques ou différents d'une zone hydrophile à l'autre. Le cas échéant, au moins deux substrats différents sont déposés dans une même zone hydrophile.  The substrates deposited in each hydrophilic zone may be identical or different from one hydrophilic zone to another. Where appropriate, at least two different substrates are deposited in the same hydrophilic zone.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, les gouttes de solution aqueuse contenant le substrat sont déposées au niveau de chaque zone hydrophile à l'aide d'un robot à système d'éjection piezoélectrique, par contact ou trempage. Ce robot permet de déposer, à des endroits précis, dans les zones to hydrophiles choisies du support solide, des quantités connues de substrats. Ce même robot peut également déposer l'ensemble des réactifs et tampons nécessaires à la mise en oeuvre des réactions enzymatiques.  According to a preferred embodiment of the method of the invention, the drops of aqueous solution containing the substrate are deposited at each hydrophilic zone by means of a robot with a piezoelectric ejection system, by contact or soaking. This robot makes it possible to deposit, at specific locations, in the selected hydrophilic zones of the solid support, known quantities of substrates. This same robot can also deposit all the reagents and buffers necessary for carrying out the enzymatic reactions.
Le procédé de l'invention permet en particulier la détection d'une activité enzymatique dans plusieurs échantillons en parallèle, notamment plusieurs échantillons biologiques, notamment au moins 10, par exemple entre 10 et 10000, notamment entre 300 et 3000 échantillons. Dans cette application, le mélange réactionnel de chaque goutte contient un échantillon susceptible de présenter l'activité enzymatique à détecter.  The method of the invention allows in particular the detection of an enzymatic activity in several samples in parallel, in particular several biological samples, in particular at least 10, for example between 10 and 10,000, in particular between 300 and 3000 samples. In this application, the reaction mixture of each drop contains a sample capable of exhibiting the enzymatic activity to be detected.
Les échantillons sont déposés dans chaque zone hydrophile à l'aide d'un dispositif approprié, par exemple, un robot à injection piezo-électrique, indépendamment du substrat, ou concomitamment. Afin de limiter l'évaporation, on peut ajouter du glycérol (de 1 à 25% en volume) aux échantillons contenant les réactifs. On peut également abaisser la température de la surface de dépôt et des réactifs et/ou augmenter le taux d'humidité dans l'enceinte du dispositif utilisé pour le dépôt des échantillons.  The samples are deposited in each hydrophilic zone using a suitable device, for example a piezoelectric injection robot, independently of the substrate, or concomitantly. In order to limit evaporation, glycerol (from 1 to 25% by volume) can be added to the samples containing the reagents. It is also possible to lower the temperature of the deposition surface and the reagents and / or to increase the humidity level in the chamber of the device used for depositing the samples.
Le contrôle de l'évaporation des gouttes peut être assuré (en plus de la présence 30 de glycérol dans les microgouttes) par l'utilisation d'une enceinte permettant de conserver un taux d'humidité élevé pendant plusieurs jours.  The control of the evaporation of the drops can be ensured (in addition to the presence of glycerol in the microdroplets) by the use of an enclosure making it possible to maintain a high humidity level for several days.
Selon un mode préférentiel de mise en oeuvre, le procédé permet la détection en parallèle d'une activité enzymatique dans une pluralité d'échantillons biologiques susceptibles de présenter une activité enzymatique détectable par le procédé de l'invention.  According to a preferred embodiment, the method allows the parallel detection of an enzymatic activity in a plurality of biological samples capable of having an enzymatic activity detectable by the method of the invention.
Par échantillon biologique , il faut comprendre tout matériel biologique et en particulier, un échantillon de cellules, un extrait protéique de cellules, un échantillon de tissus, d'organes, de fluides biologiques tels que le sang, l'urine, la salive ou encore le liquide céphalo-rachidien.  By biological sample, it is necessary to understand all biological material and in particular, a sample of cells, a protein extract of cells, a sample of tissues, organs, biological fluids such as blood, urine, saliva or else the cerebrospinal fluid.
L'échantillon biologique peut être préparé à partir de cellules d'un organisme biologique, et notamment d'un prélèvement de tissus ou de fluides biologiques tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou la salive. Le prélèvement peut être réalisé sur un animal, (en particulier un mammifère et de préférence un homme) ou une plante. Le prélèvement peut en particulier être réalisé sur un individu sain ou un patient atteint d'une pathologie. La pathologie peut notamment être un cancer, une pathologie neuro-dégénérative, une pathologie infectieuse et en particulier une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire. L'échantillon biologique peut être également prélevé d'une culture de cellules eucaryotes ou procaryotes, de bactéries, de champignons ou de levures. Il peut aussi être prélevé d'un produit agro-alimentaire, et notamment des graines, des fruits, des céréales ou des aliments cuisinés.  The biological sample can be prepared from cells of a biological organism, including a sample of tissues or biological fluids such as blood, cerebrospinal fluid, urine or saliva. The sample may be taken from an animal (in particular a mammal and preferably a man) or a plant. The sampling can in particular be performed on a healthy individual or a patient suffering from a pathology. The pathology can in particular be a cancer, a neuro-degenerative pathology, an infectious pathology and in particular a viral, bacterial or parasitic pathology. The biological sample can also be taken from a culture of eukaryotic or prokaryotic cells, bacteria, fungi or yeasts. It can also be taken from an agri-food product, including seeds, fruits, cereals or cooked foods.
Au sens de l'invention, on entend également par le terme échantillon , toute composition susceptible de produire une réaction enzymatique détectable par le procédé de l'invention en présence d'un substrat approprié. Un échantillon peut notamment contenir une enzyme purifiée dans un tampon approprié et le cas échéant, un ou plusieurs autres réactifs nécessaires (co-facteurs, co- substrat, catalyseurs...). L'échantillon peut contenir des composés chimiques synthétiques ou naturels.  For the purposes of the invention, the term "sample" is also intended to mean any composition capable of producing an enzymatic reaction detectable by the process of the invention in the presence of a suitable substrate. A sample may in particular contain a purified enzyme in an appropriate buffer and, where appropriate, one or more other necessary reagents (co-factors, co-substrate, catalysts, etc.). The sample may contain synthetic or natural chemical compounds.
Le procédé de l'invention permet notamment la détection de toute activité enzymatique détectable au moyen de substrats fluorogènes, par une émission ou une extinction de fluorescence. Notamment, il permet la détection d'activité enzymatique des enzymes de réparation de l'ADN, les enzymes impliquées dans le métabolisme et les cycles énergetiques (ATPase) , ou même la détection des réactions enzymatiques en cascades (telles que le système de protéolyse ubiquitine-dépendant), de type kinase, phosphorylase, notamment celles impliquées dans des voies de signalisation.  The method of the invention allows in particular the detection of any enzymatic activity detectable by means of fluorogenic substrates, by emission or extinction of fluorescence. In particular, it allows the detection of enzymatic activity of DNA repair enzymes, enzymes involved in metabolism and energy cycling (ATPase), or even the detection of enzymatic reactions in cascades (such as the ubiquitin proteolysis system). -dependent), kinase, phosphorylase type, especially those involved in signaling pathways.
Dans un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé de l'invention permet de détecter une activité enzymatique de type protéase. Les protéases détectées selon le procédé sont notamment des protéases virales, bactériennes, métalloprotéases ou des métalloprotéases de la matrice extracellulaire (MMPs).  In a preferred embodiment, the method of the invention makes it possible to detect a protease enzyme activity. The proteases detected according to the method are in particular viral, bacterial, metalloprotease or extracellular matrix metalloprotease (MMPs) proteases.
Le procédé de l'invention présente des applications plus particulièrement dans les domaines du diagnostic médical.  The method of the invention has applications more particularly in the fields of medical diagnosis.
Dans un mode de mise en oeuvre préféré, le ou les échantillons susceptibles de présenter une activité enzymatique sont des échantillons biologiques prélevés sur un individu, de préférence chez l'homme, et la détection d'une activité enzymatique dans l'échantillon permet le diagnostic le pronostic et/ou le suivi de l'évolution d'une pathologie ou d'une infection virale, parasitaire ou bactérienne ou permet le suivi du traitement administré à un patient.  In a preferred embodiment, the sample or samples capable of exhibiting enzymatic activity are biological samples taken from an individual, preferably from humans, and the detection of an enzymatic activity in the sample enables the diagnosis to be made. the prognosis and / or the follow-up of the evolution of a pathology or a viral, parasitic or bacterial infection or allows the follow-up of the treatment administered to a patient.
Au sens de l'invention, on entend par pathologie, tout trouble ou dysfonctionnement du corps humain ou animal. La mesure de l'activité enzymatique peut être associée à la présence d'une pathologie, notamment d'une infection (diagnostic) ou également associée à un niveau d'évolution (pronostic) d'une pathologie, notamment d'une pathologie d'origine virale ou d'un cancer.  Within the meaning of the invention, pathology is understood to mean any disorder or dysfunction of the human or animal body. The measurement of the enzymatic activity can be associated with the presence of a pathology, in particular of an infection (diagnosis) or also associated with a level of evolution (prognosis) of a pathology, in particular of a pathology of Viral origin or cancer.
Le procédé de l'invention permet par exemple de déterminer si une substance active inhibe ou non l'activité de protéases impliquées dans des pathologies spécifiques. Des exemples de protéases impliquées dans des pathologies spécifiques sont notamment donnés dans le tableau 1 de la page 307 de la revue Journal of Medicinal Chemistry, 2000, Vol. 43, No 3.  The method of the invention makes it possible, for example, to determine whether an active substance inhibits the activity of proteases involved in specific pathologies or not. Examples of proteases involved in specific pathologies are in particular given in Table 1 on page 307 of the Journal of Medicinal Chemistry, 2000, Vol. 43, No. 3.
Le procédé de l'invention permet en particulier de détecter l'activité enzymatique de protéases impliquées dans une infection par un virus de type VIH, HBS, par exemple dans une pathologie telle que l'hépatite C ou le cancer, l'activité enzymatique de ces protéases étant utilisée comme marqueur diagnostique. En outre, on peut l'utiliser dans la recherche d'inhibiteurs d'enzymes produites lors du développement de ces pathologies et qui favorisent leur établissement ou leur développement. En particulier, on peut rechercher des inhibiteurs de la protéase NS3 du virus de l'hépatite C ou pour observer l'activité des métalloprotéases de la matrice extracellulaire dont certaines sont liées au développement de cancers.  The method of the invention makes it possible in particular to detect the enzymatic activity of proteases involved in an infection with an HIV-type virus, HBS, for example in a pathology such as hepatitis C or cancer, the enzymatic activity of these proteases being used as a diagnostic marker. In addition, it can be used in the search for enzyme inhibitors produced during the development of these pathologies and which promote their establishment or development. In particular, inhibitors of the hepatitis C virus NS3 protease or to observe the activity of metalloproteases of the extracellular matrix, some of which are related to the development of cancers, can be investigated.
Plus généralement, l'invention porte sur l'utilisation du procédé tel que défini plus haut, pour le diagnostic d'une pathologie ou d'une infection virale, bactérienne ou 10 parasitaire.  More generally, the invention relates to the use of the method as defined above, for the diagnosis of a pathology or a viral, bacterial or parasitic infection.
Le procédé de l'invention présente également des applications plusparticulièrement dans les domaines du criblage à haut débit pour la recherche de substances actives. Ce type de criblage intéresse principalement l'industrie pharmaceutique.  The method of the invention also has applications more particularly in the field of high throughput screening for the search for active substances. This type of screening mainly concerns the pharmaceutical industry.
L'invention vise en particulier un procédé de criblage à haut débit d'inhibiteurs ou de régulateurs d'une activité enzymatique, comprenant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention tel que décrit plus haut, dans lequel le mélange réactionnel de chaque goutte contient un réactif susceptible de présenter une activité enzymatique en présence d'un composé candidat dont l'activité inhibitrice ou régulatrice est recherchée.  The invention aims in particular at a method of high-throughput screening of inhibitors or regulators of an enzymatic activity, comprising the implementation of a method according to the invention as described above, in which the reaction mixture of each drop contains a reagent capable of exhibiting an enzymatic activity in the presence of a candidate compound whose inhibitory or regulatory activity is desired.
Plus généralement, l'invention concerne l'utilisation du procédé de mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques tel que défini plus haut, pour le criblage à haut débit d'enzymes, d'inhibiteurs ou de régulateurs d'une activité enzymatique ou de substrats d'enzymes.  More generally, the invention relates to the use of the method for carrying out a plurality of enzymatic reactions as defined above, for the high-throughput screening of enzymes, inhibitors or regulators of an enzymatic activity. or enzyme substrates.
L'invention porte également sur une méthode d'obtention d'un support approprié pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, ladite méthode comprenant: a) le dépôt sur un support solide hydrophile d'un masque à base de glycérol, comprenant un mélange glycérollsucroseleau dans des proportions telles que la solution obtenue est compatible avec la dispense piezoélectrique, notamment en terme de viscosité, et b) le dépôt d'une couche de silanes hydrophobes par co-évaporation avec du pentane en atmosphère inerte, dans des conditions permettant la formation d'une couche de silanes hydrophobes dans la zone hydrophobe; c) éventuellement, la stabilisation thermique ou la déshydratation sous vide de la couche de silanes hydrophobes.  The invention also relates to a method for obtaining a support suitable for carrying out the processes of the invention, said method comprising: a) the deposition on a hydrophilic solid support of a glycerol-based mask, comprising a glycerol / water mixture in such proportions that the solution obtained is compatible with the piezoelectric exemption, especially in terms of viscosity, and b) the deposition of a layer of hydrophobic silanes by co-evaporation with pentane in an inert atmosphere, in conditions allowing the formation of a layer of hydrophobic silanes in the hydrophobic zone; c) optionally, thermal stabilization or vacuum dehydration of the layer of hydrophobic silanes.
Selon un mode de réalisation particulier, le support solide hydrophile est une lame de verre nettoyée au piranha ou de silicium oxydée en surface.  According to a particular embodiment, the hydrophilic solid support is a glass blade cleaned with piranha or silicon oxide surface.
L'invention porte également sur un support comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, les zones hydrophiles et hydrophobes étant définies en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile, ledit support étant caractérisé en ce qu'au moins un substrat d'une enzyme est fixé à sa surface dans chacune des zones hydrophiles.  The invention also relates to a support comprising a matrix of hydrophilic zones, each hydrophilic zone being delimited by a hydrophobic zone separating it from the other hydrophilic zones, the hydrophilic and hydrophobic zones being defined in that an aqueous solution deposited at the level of a hydrophilic zone forms a drop confined by the surface tension in said hydrophilic zone, said support being characterized in that at least one substrate of an enzyme is attached to its surface in each of the hydrophilic zones.
De préférence, le substrat est lié à la surface du support par l'intermédiaire d'un espaceur comme décrit plus haut. En particulier, le substrat est un substrat peptidique fluorogène et permet la détection par fluorescence d'une activité de type protéase.  Preferably, the substrate is bonded to the surface of the support via a spacer as described above. In particular, the substrate is a fluorogenic peptide substrate and allows the fluorescence detection of a protease type activity.
Un tel support est utilisable notamment dans le procédé de mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques selon l'invention.  Such a support can be used in particular in the method of implementing a plurality of enzymatic reactions according to the invention.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer certains modes de réalisation préférés du procédé de l'invention et de comprendre plus aisément sa mise en oeuvre, sans toutefois limiter la portée de l'invention.  The examples which follow make it possible to illustrate certain preferred embodiments of the method of the invention and to more easily understand its implementation, without however limiting the scope of the invention.
DESCRIPTION DES FIGURESDESCRIPTION OF THE FIGURES
Figure 1: La figure 1 présente un exemple de support utilisable dans le procédé de l'invention. A. Exemple de disposition des zones hydrophiles en réseau orthonormé. B. Exemple de modification chimique de la surface du support à l'aide de silane perfluoré C. Exemple de modification chimique de la surface à l'aide d'une mince couche de Teflon.  Figure 1: Figure 1 shows an example of support used in the method of the invention. A. Example of layout of the hydrophilic zones in an orthonormal network. B. Example of chemical modification of the surface of the support with perfluorinated silane C. Example of chemical modification of the surface using a thin layer of Teflon.
Figure 2: La figure 2 est une photographie des supports sur lesquels sont déposés les gouttes de volume réactionnel à l'aide d'un robot à injection piezoélectrique.  Figure 2: Figure 2 is a photograph of the supports on which are deposited the reaction volume drops with a piezoelectric injection robot.
Figure 3: La figure 3a montre la disposition des gouttes sur le support pour l'analyse en parallèle de l'activité d'une protéase.  Figure 3: Figure 3a shows the arrangement of the drops on the support for the parallel analysis of the activity of a protease.
La figure 3b est un graphe représentant pour chaque groupe de gouttes abritant la même réaction, l'intensité de fluorescence détectée en fonction du temps.  FIG. 3b is a graph representing, for each group of drops harboring the same reaction, the fluorescence intensity detected as a function of time.
Figure 4: La figure 4 est un graphe représentant l'effet de différentes concentrations en substrat sur le signal fluorescent mesuré (respectivement, 10 mg/ml, 100 mg/ml, 250 mg/ml et 500 mg/ml) en fonction du temps (40, 60, 80, 120, 160, 200, 240 min) et avec ou sans inhibiteur.  Figure 4: Figure 4 is a graph showing the effect of different substrate concentrations on the measured fluorescent signal (10 mg / ml, 100 mg / ml, 250 mg / ml and 500 mg / ml, respectively) as a function of time (40, 60, 80, 120, 160, 200, 240 min) and with or without inhibitor.
Figure 5: La figure 5 est un graphe représentant l'effet de différentes concentrations en protéase sur sur le signal fluorescent obtenu (respectivement, 10mg/ml, 100mgIml, 250mg/ml et 500mglml) en fonction du temps (40, 60, 80, 120, 160, 200, 240 min) et avec ou sans inhibiteur.  FIG. 5: FIG. 5 is a graph showing the effect of different protease concentrations on the fluorescent signal obtained (respectively 10 mg / ml, 100 mg / ml, 250 mg / ml and 500 mg / ml) as a function of time (40, 60, 80, 120, 160, 200, 240 min) and with or without inhibitor.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemplel: Préparation d'un support approprié pour le procédé de l'invention comprenant une matrice de zones hydrophiles La matrice de zones hydrophiles sur fond hydrophobe s'obtient par l'utilisation d'un masque à base de glycérol, suivi d'un dépôt de silanes hydrophobe en phase gazeuse sous atmosphère inerte.  EXAMPLE Preparation of a Support Which Is Suitable for the Process of the Invention Comprising a Matrix of Hydrophilic Zones The matrix of hydrophilic zones on a hydrophobic bottom is obtained by the use of a glycerol-based mask, followed by a deposit of hydrophobic silanes in the gaseous phase under an inert atmosphere.
La méthode utilisée comprend les étapes suivantes: 1. Dépôt d'un masque constitué d'un mélange glycérol/sucrose/eau (par exemple 15% en poids de glycérol, 25% en poids sucrose, complété avec de l'eau) sur un support solide hydrophile (lame de verre nettoyée au piranha constitué d'un mélange 1:1 d'acide sulfurique-eau oxygéné, silicium oxydé en surface...) 2. Dépôt d'une couche de silanes hydrophobes (par exemple, perfluorooctyltriéthoxysilanes) par co-évaporation avec du pentane en atmosphère inerte (dessiccateur sous argon par exemple).  The method used comprises the following steps: 1. Deposit of a glycerol / sucrose / water mixture mask (for example 15% by weight of glycerol, 25% by weight of sucrose, supplemented with water) on a Hydrophilic solid support (piranha-cleaned glass slide consisting of a 1: 1 mixture of sulfuric acid-oxygenated water, surface-oxidized silicon, etc.) 2. Deposition of a layer of hydrophobic silanes (for example, perfluorooctyltriethoxysilanes) by co-evaporation with pentane in an inert atmosphere (desiccator under argon for example).
3. Passage à l'étuve à 115 C pendant environ 2 heures.  3. Overnight oven at 115 ° C for about 2 hours.
4. Lavage du masque à l'eau Cette méthode possède l'avantage d'être rapide et facile à mettre en oeuvre par rapport aux méthodes utilisant des matériaux de type photoresist .  4. Washing the mask with water This method has the advantage of being fast and easy to implement compared to methods using photoresist-type materials.
Exemple 2: Exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention pour la détection d'une activité protéolytique en présence de différentes concentrations d'inhibiteurs Nous avons utilisé dans cet exemple, le procédé par photolithographie développé par Butler et al (Am. Chem. Soc., 2001, 123: 8887) pour créer un support constitué d'une lame de verre comprenant une matrice de spots hydrophiles liés à une surface perfluoré (voir Figures 1A et 1B). Les différences de tension de surface sont telles qu'une solution aqueuse déposée dans une zone hydrophile reste confinée dans la zone hydrophile définie. Des supports présentant entre 300 et 3000 spots hydrophiles (d'environ 500 p.m de diamètre) ont été utilisés dans la présente méthode de détection de l'activité protéase (voir Figure 2) Des gouttes d'environ 20 nI contenant les réactifs ont été déposées à la surface des lames de verre. Un robot (Sciflexarrayer, société Scienion) a été utilisé pour déposer les réactifs sur les lames de verre au niveau d'un spot hydrophile défini, de sorte que les supports permettent de tester un grand nombre de conditions différentes en une seule réaction.  EXAMPLE 2 Example of Implementation of the Method of the Invention for the Detection of a Proteolytic Activity in the Presence of Different Concentrations of Inhibitors In this example, the photolithography method developed by Butler et al (Am. Chem) was used. Soc., 2001, 123: 8887) to create a support consisting of a glass slide comprising a matrix of hydrophilic spots bound to a perfluorinated surface (see FIGS. 1A and 1B). The differences in surface tension are such that an aqueous solution deposited in a hydrophilic zone remains confined in the defined hydrophilic zone. Supports having between 300 and 3000 hydrophilic spots (about 500 μm in diameter) have been used in the present method of detecting protease activity (see FIG. 2) Drops of about 20 nI containing the reagents have been deposited. on the surface of the glass slides. A robot (Sciflexarrayer, Scienion company) was used to deposit the reagents on the glass slides at a defined hydrophilic spot, so that the supports make it possible to test a large number of different conditions in a single reaction.
On a procédé comme suit: La protéase, le substrat fluorogénique, ici de la gélatine Self-Quenched (notée gélatine SQ) (DQ Gelatin, Molecular Probes), dans un tampon contenant 10% de glycérol et le cas échéant, l'inhibiteur de protéase (ici la 1,10-phénantroline) sont mélangés directement dans les gouttes déposées à l'aide du robot à injection piezo- électrique sur le support selon le schéma de dépôt préétabli. Le tampon de réaction a la composition suivante: 0.05M Tris-HCI, 0.15 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.2 mM NaN3, pH 7.6.  The following were carried out as follows: The protease, the fluorogenic substrate, here Self-Quenched gelatin (denoted gelatin SQ) (DQ Gelatin, Molecular Probes), in a buffer containing 10% glycerol and, if appropriate, the inhibitor of protease (here 1,10-phenanthroline) are mixed directly in the drops deposited with the piezoelectric injection robot on the support according to the preset deposition scheme. The reaction buffer has the following composition: 0.05 M Tris-HCl, 0.15 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, 0.2 mM NaN 3, pH 7.6.
En particulier, différentes concentrations de protéase ont été testées, ainsi que la présence d'un inhibiteur. Au total, 40 conditions de réactions enzymatiques (mesurées sur 400 gouttes) ont été testées en parallèle. L'évolution des réactions au cours du temps est suivie par libération de la fluorescence après clivage du substrat par la protéase. La fluorescence est mesurée à l'aide d'un scanner de fluorescence Genetac LSIV. On excite le fluorophore à 488 nm et on mesure l'émission à 512 nm.  In particular, different protease concentrations were tested, as well as the presence of an inhibitor. In total, 40 enzymatic reaction conditions (measured on 400 drops) were tested in parallel. The evolution of the reactions over time is followed by release of the fluorescence after cleavage of the substrate by the protease. The fluorescence is measured using a Genetac LSIV fluorescence scanner. The fluorophore is excited at 488 nm and the emission measured at 512 nm.
Le figure 3a présente le type d'image obtenue.  Figure 3a shows the type of image obtained.
Après quantification et traitement des données à l'aide du logiciel Genepix Pro 4.0., la cinétique de la protéolyse peut être précisément établie.  After quantification and data processing using Genepix Pro 4.0 software, the kinetics of proteolysis can be precisely established.
La cinétique de la protéolyse et l'effet de l'inhibiteur ont pu être déterminés en parallèle pour chaque goutte individuelle. Après traitement des données, les valeurs moyennes de fluorescence et les écart-types déduits pour chaque type de réaction ont été rassemblées sur le graphe présenté à la figure 3b. On observe en particulier, l'activité de la protéase grâce à la variation de fluorescence au cours du temps. Cette activité augmente avec la concentration en protéase.  The kinetics of proteolysis and the effect of the inhibitor could be determined in parallel for each individual drop. After data processing, the mean fluorescence values and standard deviations deduced for each type of reaction were collated on the graph presented in Figure 3b. In particular, the activity of the protease is observed thanks to the variation of fluorescence over time. This activity increases with protease concentration.
Les effets de la concentration en substrat ont été analysés (Figure 4), ainsi que les effets de la concentration en protéase (Figure 5).  The effects of substrate concentration were analyzed (Figure 4), as well as the effects of protease concentration (Figure 5).
Cet exemple montre que le procédé de l'invention fournit une méthode rapide et 10 simple à mettre en oeuvre pour analyser en parallèle de nombreuses réactions enzymatiques dans différentes conditions.  This example shows that the process of the invention provides a quick and simple method for carrying out parallel analysis of numerous enzymatic reactions under different conditions.
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