FR2857364A1

FR2857364A1 - Assay of teichoic acids of 'polysaccharide type' in a (vaccine) preparation from a Gram positive bacterial culture comprises treatment of the preparation with hydrofluoric acid to release oligosaccharides specific for the teichoic acids

Info

Publication number: FR2857364A1
Application number: FR0314442A
Authority: FR
Inventors: Philippe Talaga; Patricia Sepulcri; Blanc Sandrine Vialle
Original assignee: Aventis Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 2003-12-08
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2005-01-14
Anticipated expiration: 2023-12-08
Also published as: FR2857364B1

Abstract

Assay of the teichoic acids (I) of 'polysaccharide' type in a preparation (A) from a Gram positive bacterial culture comprises treatment of the preparation with hydrofluoric acid at a temperature of less than or equal to 40 [deg]C to release the oligosaccharides specific for the teichoic acids present in the preparation, and assay of specific oligosaccharides obtained. An independent claim is also included for purified C5-polysaccharide (II) having a repeating unit of formula: [6)-beta -D-Glcp- (1-3)-alpha -AATp- (1-4)-alpha -D-GalpNAc (6-O)-P-Cho)-(1-3)-beta -D-GalpNAc (6-O)-P-Cho)-(1-1)-D-Ribitol-5-P-(O-] n.

Description

L'invention a pour objet un procédé de dosage des acides téchoïques,The subject of the invention is a process for the determination of teichoic acids,

notamment dans des préparations d'antigènes de bactéries Gram +. especially in antigen preparations of Gram + bacteria.

Les acides téchoïques sont des polysaccharides, notamment connus pour être des constituants du complexe constitué de la membrane et de la paroi des bactéries Gram+. Il existe une grande variété d'acides téchoïques, la plupart spécifiques d'espèce. Teichoic acids are polysaccharides, in particular known to be constituents of the complex consisting of the membrane and the wall of Gram + bacteria. There is a wide variety of teichoic acids, most of them species-specific.

Comme tous les polysaccharides, les acides téchoïques sont constitués d'un enchaînement d'unités répétitives. Ces unités répétitives sont ellesmêmes constituées (i) d'un enchaînement d'au moins deux sucres différents, substitués ou non, et (ii) d'un groupement phosphate lié à l'un des sucres. Ce groupement phosphate est impliqué dans les liaisons assurant la constitution de l'enchaînement. En outre, le polysaccharide peut être conjugué par liaison covalente, e.g. de type phosphodiester, à d'autres structures chimiques telles qu'une protéine, un lipide, une lipoprotéine ou un glycolipide. Les acides téchoïques sont en étroit contact avec le peptidoglycane de la paroi. Des liaisons covalentes renforcent ce lien. Parmi les acides téchoïques, on distingue les acides lipotéchoïques qui, en raison de leur queue lipidique, peuvent s'ancrer dans la membrane externe par liaisons hydrophobes. Like all polysaccharides, teichoic acids consist of a sequence of repeating units. These repeating units are themselves (i) a sequence of at least two different sugars, substituted or unsubstituted, and (ii) a phosphate group bonded to one of the sugars. This phosphate group is involved in the bonds ensuring the constitution of the sequence. In addition, the polysaccharide may be covalently bonded, e.g., phosphodiester-like, to other chemical structures such as a protein, lipid, lipoprotein, or glycolipid. Teichoic acids are in close contact with the peptidoglycan of the wall. Covalent bonds reinforce this link. Among the teichoic acids, there are lipotechoic acids which, because of their lipid tail, can anchor in the outer membrane by hydrophobic bonds.

La structure des acides téchoïques peut être très différente selon les espèces bactériennes. Un grand nombre d'entre eux ont une structure simple; mais certains possèdent une structure beaucoup plus complexe. Ainsi, le complexe constitué de la membrane et de la paroi de Streptococcus pneumoniae contient au moins deux acides téchoïques ubiquitaires de structure complexe. Il s'agit du polysaccharide C et de l'acide lipotéchoïque (encore dénommé antigène de Forssmann). The structure of teichoic acids can be very different depending on the bacterial species. Many of them have a simple structure; but some have a much more complex structure. Thus, the complex consisting of the membrane and the wall of Streptococcus pneumoniae contains at least two ubiquitous teichoic acids of complex structure. It is polysaccharide C and lipotechoic acid (also called Forssmann antigen).

Le polysaccharide C est constitué d'un enchaînement d'unités répétitives, chacune formée de quatre résidus monosaccharidiques, un résidu de glucopyrannose (Glcp), un résidu de 2 acétamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D galactose (AAT) et deux résidus de N-acétyl galactopyrannose (GalpNAc), suivis d'un résidu de ribitol-5-phosphate (ribitol-5-P). Au moins un des deux résidus de GalpNAc est substitué par de la phosphocholine (P-Cho) La formule développée de cette unité répétitive est la suivante: [6)3-D-Glcp-(143)-a-AATp-(144)-a-D-GaIpNAc-(143)-[3-D-GaIpNAc-(141)-oRibitol-5-P-(O4] 6 6 1 1 O)-P-Cho O)-P-Cho C Karlsson et coll., Eur. J. Biochem. (1999) 265: 1091 ont montré que l'unité répétitive pouvait exister sous deux formes: (i) une forme bi-substituée avec deux résidus phosphocholine, comme représentée ci dessus; et (ii) une forme monosubstituée avec un seul résidu de phosphocholine. Par conséquent, la chaîne du polysaccharide C contient en proportion variable des unités répétitives monosubstituées et bi-substituées. Ces proportions varient notamment en fonction des conditions de culture et du sérotype du pneumocoque. The polysaccharide C consists of a series of repeating units, each consisting of four monosaccharide residues, a glucopyranose residue (Glcp), a residue of 2 acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D galactose ( AAT) and two residues of N-acetyl galactopyranose (GalpNAc), followed by a residue of ribitol-5-phosphate (ribitol-5-P). At least one of the two residues of GalpNAc is substituted by phosphocholine (P-Cho). The structural formula of this repeating unit is as follows: [6) 3-D-Glcp- (143) -a-AATp- (144) -αD-GaIpNAc- (143) - [3-D-GaIpNAc- (141) -ORibitol-5-P- (O 4) 6 6 1 1 O) -P-ChoO) -P-Cho C Karlsson et al. , Eur. J. Biochem. (1999) 265: 1091 showed that the repeating unit could exist in two forms: (i) a bi-substituted form with two phosphocholine residues, as shown above; and (ii) a monosubstituted form with a single phosphocholine residue. As a result, the polysaccharide C chain contains, in variable proportion, monosubstituted and bi-substituted repeating units. These proportions vary in particular according to the culture conditions and the pneumococcal serotype.

L'acide lipotéchoïque, quant à lui, possède la structure primaire du polysaccaride C associée à un glycolipide, de formule (3-D-Glcp(1-4)-13-DAAT (1-3)- a-D-Glcp(1-3)acyl2Gro, dans laquelle Glcp désigne un résidu de glucopyrannose, AAT désigne un résidu de 2 acétamido-4-amino-2,4,6trideoxy-D-galactose, acyl désigne un résidu d'acide gras et Gro un résidu de glycérol. Ce glycolipide est lié par liaison phosphodiester au ribitol terminal de la chaîne. Lipoteichoic acid, on the other hand, has the primary structure of the polysaccharide C associated with a glycolipid, of formula (3-D-Glcp (1-4) -13-DAAT (1-3) - aD-Glcp (1- 3) acyl2Gro, wherein Glcp is a glucopyranose residue, AAT is a residue of 2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D-galactose, acyl is a fatty acid residue and Gro is a glycerol residue. This glycolipid is linked by phosphodiester bond to the terminal ribitol of the chain.

Certaines bactéries Gram+, telles Streptococcus pneumoniae, possèdent une capsule et/ou sont responsables de graves infections. A l'encontre d'une telle bactérie, il existe des vaccins constitués par des polysaccharides de capsule sous forme purifiée. Les procédés utilisés pour purifier les polysaccharides capsulaires éliminent autant que possible les polysaccharides de la paroi (acides téchoïques). En effet, bien que très immunogènes, les acides téchoïques sont faiblement protecteurs et leur présence dans un vaccin augmente inutilement la charge antigénique. Some Gram + bacteria, such as Streptococcus pneumoniae, have a capsule and / or are responsible for serious infections. In contrast to such a bacterium, there are vaccines consisting of capsule polysaccharides in purified form. The methods used to purify the capsular polysaccharides remove as much as possible the polysaccharides from the wall (teichoic acids). Indeed, although highly immunogenic, teichoic acids are weakly protective and their presence in a vaccine unnecessarily increases the antigenic charge.

Selon les exigences des autorités de santé, le contenu d'un vaccin de haute qualité doit être caractérisé avec précision. Il faut pouvoir doser non seulement l'antigène vaccinal mais aussi tous les contaminants éventuels, au rang desquels se trouvent les acides téchoïques, notamment pour ce qui concerne les vaccins à base de polysaccharides capsulaires. Le dosage des contaminants est d'autant plus difficile et délicat qu'il porte sur de très petites quantités. Les méthodes de dosage doivent donc être sensibles, performantes et spécifiques. According to the requirements of the health authorities, the contents of a high quality vaccine must be accurately characterized. It is necessary to be able to determine not only the vaccine antigen but also all the possible contaminants, among which are the teichoic acids, in particular with regard to the capsular polysaccharide vaccines. The dosage of contaminants is all the more difficult and delicate as it relates to very small quantities. The assay methods must be sensitive, efficient and specific.

Cette dernière exigence de spécificité est particulièrement difficile à respecter. En effet, il existe de fortes analogies de structure entre les acides téchoïques et les polysaccharides de capsule. Par exemple, pour ce qui concerne Streptococcus pneumoniae, l'unité répétitive du polysaccharide C contient un groupement phosphate tout comme celle des polysaccharides capsulaires des sérotypes 6B, 10A, 11A, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 23F. Le groupement phosphate de l'unité répétitive du polysaccharide C intervient directement dans l'enchaînement des unités répétitives par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester, tout comme ceux des polysaccharides capsulaires de sérotype 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20. Les polysaccharides capsulaires des sérotypes 6B et 10A sont ceux qui présentent la plus forte analogie avec les acides téchoïques du pneumocoque dans la mesure où ils possèdent un ribitol phosphate impliqué dans l'enchaînement des unités répétitives. This last requirement of specificity is particularly difficult to respect. Indeed, there are strong structural analogies between teichoic acids and capsule polysaccharides. For example, with respect to Streptococcus pneumoniae, the repeating unit of polysaccharide C contains a phosphate group as well as that of capsular polysaccharides of serotypes 6B, 10A, 11A, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 23F. The phosphate group of the repeating unit of the polysaccharide C directly intervenes in the repetitive unit sequence via a phosphodiester bond, as well as those of the serotype 6B, 10A, 17F, 19A, 19F and 20 capsular polysaccharide. The capsular polysaccharides of serotypes 6B and 10A are the ones with the strongest analogy with the teichoic acids of pneumococcus insofar as they possess a ribitol phosphate involved in the sequence of repetitive units.

Jones C. et coll. ont décrit dans Biologicals (1991) 19: 41 une méthode de dosage du polysaccharide C par résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette méthode évalue la résonance du radical N-méthyl des groupements phosphocholine du polysaccharide C. Cette technique n'est pas précise car, comme indiqué plus haut, la proportion des groupements phosphocholine n' est pas constante. Jones C. et al. have described in Biologicals (1991) 19: 41 a method of assaying the polysaccharide C by nuclear magnetic resonance (NMR). This method evaluates the resonance of the N-methyl radical of the phosphocholine groups of the polysaccharide C. This technique is not precise because, as indicated above, the proportion of phosphocholine groups is not constant.

Talaga P. et coll. proposent dans Vaccine (2001) 19: 2987 une méthode de dosage basée sur la quantification du ribitol libéré lors de l'hydrolyse du polysaccharide C à la suite de deux traitements successifs: le premier avec l'acide fluorhydrique (HF) à 48 % pendant 2 heures à 65 C, le deuxième avec l'acide trifluoroacétique 2N pendant 2 heures à 120 C. Ce double traitement entraîne la rupture des liaisons osidiques. L'hydrolysat contient essentiellement des monosaccharides. Le ribitol est ensuite séparé des autres constituants par chromatographie haute performance échangeuse d'anions (HPAEC) sur une colonne de chromatographie analytique CarboPacTM MAl en utilisant pour l'élution, une solution de soude isocratique 480 mM. Le ribitol est ensuite quantifié par un système de détection ampérométrique en champs pulsés (PAD). Même si cette technique de dosage du ribitol permet une évaluation juste et sensible de la quantité de polysaccharide C, elle est incompatible avec la présence dans le milieu, d'un polysaccharide capsulaire qui contient du ribitol. Talaga P. et al. propose in Vaccine (2001) 19: 2987 an assay method based on the quantification of ribitol released during the hydrolysis of polysaccharide C following two successive treatments: the first with hydrofluoric acid (HF) at 48% for 2 hours at 65 ° C., the second with 2N trifluoroacetic acid for 2 hours at 120 ° C. This double treatment causes the breakdown of the saccharide bonds. The hydrolyzate contains essentially monosaccharides. The ribitol is then separated from the other constituents by high performance anion exchange chromatography (HPAEC) on a CarboPacTM MA1 analytical chromatography column using a 480 mM isocratic sodium hydroxide solution for elution. Ribitol is then quantified by a pulsed-field amperometric (PAD) detection system. Although this ribitol assay technique allows a fair and sensitive evaluation of the amount of polysaccharide C, it is incompatible with the presence in the medium of a capsular polysaccharide that contains ribitol.

Or, certains polysaccharides capsulaires d'intérêt vaccinal contiennent du ribitol. However, some capsular polysaccharides of vaccine interest contain ribitol.

Comme on vient de le voir, il s'agit par exemple des polysaccharides de capsule des sérotypes 6B et 10A de Streptococcus pneumoniae. La technique de Talaga et coll. ne convient donc pas pour effectuer le dosage du polysaccharide C e.g. dans les vaccins pneumocoque du commerce. As we have just seen, these are, for example, capsule polysaccharides of serotypes 6B and 10A of Streptococcus pneumoniae. The technique of Talaga et al. therefore not suitable for performing the C e.g. polysaccharide assay in commercial pneumococcal vaccines.

En bref, les méthodes de dosage des acides téchoïques connues à ce jour présentent des inconvénients. Il n'existe pas encore de méthode qui soit précise, sensible, fiable et applicable à toute préparation d'antigène bactérien. In short, the methods of assaying teichoic acids known to date have disadvantages. There is no method yet that is accurate, sensitive, reliable and applicable to any bacterial antigen preparation.

La présente invention pallie ce manque en proposant une nouvelle méthode de dosage des acides téchoïques, qui recherche les oligosaccharides spécifiques des acides téchoïques libérés par rupture des liaisons phosphodiester, au cours du traitement par l'acide fluorhydrique (HF), selon la méthode de Jennings & Lugowski, Can. J. Chem. (1980) 58: 2610. Lorsque l'unité répétitive renferme une molécule de (3-D GalpNac ou une molécule de (3-D GlcpNac, il peut également se produire une rupture secondaire. The present invention overcomes this deficiency by proposing a new method for the determination of teichoic acids, which looks for the specific oligosaccharides of teichoic acids released by rupture of the phosphodiester bonds, during the treatment with hydrofluoric acid (HF), according to the Jennings method. & Lugowski, Can. J. Chem. (1980) 58: 2610. When the repeating unit contains a molecule of (3-D GalpNac or a molecule of (3-D GlcpNac, a secondary break may also occur.

Autrement dit, selon la structure de l'acide téchoïque, l'oligosaccharide spécifique sera substantiellement identique à l'unité répétitive ou bien s'en distinguera. In other words, depending on the structure of teichoic acid, the specific oligosaccharide will be substantially identical to the repetitive unit or will be distinguished from it.

Ainsi, dans le cas du polysaccharide C, l'oligosaccharide spécifique a pour formule: R-D-GIcp-(143)-a-AATp-(144)-a-D-GaIpNAc (143) -R-D-GaIpNAc Après hydrolyse, restent alors des oligosaccharides spécifiques qui sont par la suite séparés les uns des autres et dosés. Thus, in the case of the polysaccharide C, the specific oligosaccharide has the formula: RD-GIcp- (143) -a-AATp- (144) -aD-GaIpNAc (143) -RD-GaIpNAc After hydrolysis, then remain oligosaccharides which are subsequently separated from one another and assayed.

Par ailleurs, on indique par souci d'exhaustivité, que cette définition s'applique mutatis mutandis aux oligosaccharides spécifiques des polysaccharides capsulaires possédant des unités répétitives incorporant des groupements phosphate impliqués dans la chaîne, tels les polysaccharides des sérotypes 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20 du pneumocoque. Moreover, it is indicated for the sake of completeness, that this definition applies mutatis mutandis to oligosaccharides specific capsular polysaccharides having repeating units incorporating phosphate groups involved in the chain, such polysaccharides serotypes 6B, 10A, 17F, 19A , 19F and 20 of the pneumococcus.

Ainsi la présente invention a pour objet une méthode de dosage des acides téchoïques dans une préparation d'antigène de bactérie Gram+, selon laquelle: (i) on traite la préparation par l'acide fluorhydrique (HF) à une température inférieure ou égale à 40 C, afin de libérer les oligosaccharides spécifiques des acides téchoïques présent dans la préparation; et (ii) on dose les oligosaccharides spécifiques obtenus en (i). Thus, the subject of the present invention is a method for assaying teichoic acids in a Gram + bacterial antigen preparation, according to which: (i) the preparation is treated with hydrofluoric acid (HF) at a temperature of 40 or less; C, in order to release the specific oligosaccharides of teichoic acids present in the preparation; and (ii) the specific oligosaccharides obtained in (i) are dosed.

Le traitement par l'acide fluorhydrique (HF) est avantageusement mis en oeuvre à une température allant de -70 C à 40 C, de préférence allant de 0 C à 20 C, de façon encore plus préférée ente 4 C et 10 C. D'une manière générale, plus la température augmente, plus la sélectivité d'action de l'acide fluorhydrique sur les liaisons phosphodiesters diminue. C'est pourquoi, il est important de ne pas dépasser 40 C. The treatment with hydrofluoric acid (HF) is advantageously carried out at a temperature ranging from -70 ° C. to 40 ° C., preferably ranging from 0 ° C. to 20 ° C., more preferably still between 4 ° C. and 10 ° C. In general, the higher the temperature, the more the action selectivity of the hydrofluoric acid on the phosphodiester bonds decreases. Therefore, it is important not to exceed 40 C.

De manière typique, on utilise l'acide fluorhydrique à une concentration finale comprise entre 10 et 73 % (poids / poids), bornes incluses; de préférence entre 40 et 60 % ; de manière tout à fait préférée entre 45 et 50 % ; e.g. à une concentration de 48 %. Typically, hydrofluoric acid is used at a final concentration of between 10 and 73% (w / w), inclusive; preferably between 40 and 60%; most preferably between 45 and 50%; e.g. at a concentration of 48%.

La durée du traitement à l'acide fluorhydrique n'est pas critique. Elle est inversement proportionnelle à la température. L'homme du métier est à même d'adapter cette durée en fonction de la température choisie et de la concentration à laquelle est utilisé l'acide fluorhydrique. Toutefois, on indique que plus la température est élevée, plus la durée du traitement doit être courte pour assurer autant que possible l'intégrité des liaisons osidiques. D'une manière générale, il est préférable que le traitement n'excède pas 96 heures. Lorsque la température est comprise entre 20 et 40 C, on préconise une durée de traitement n'excèdant pas 1 heure; entre 0 et 10 C, n'excédant pas 2 heures. A l'inverse lorsque la température est inférieure à 0 C, la durée du traitement peut dépasser 24 heures. The duration of hydrofluoric acid treatment is not critical. It is inversely proportional to the temperature. The person skilled in the art is able to adapt this duration as a function of the temperature chosen and the concentration at which hydrofluoric acid is used. However, it is indicated that the higher the temperature, the shorter the treatment time to ensure the integrity of the saccharide bonds as much as possible. In general, it is preferable that the treatment does not exceed 96 hours. When the temperature is between 20 and 40 C, it is recommended a treatment time not exceeding 1 hour; between 0 and 10 C, not exceeding 2 hours. Conversely, when the temperature is below 0 ° C., the duration of the treatment may exceed 24 hours.

De bons résultats sont obtenus lorsque l'on utilise l'HF à une concentration de 48 %, à 4 C pendant 48 heures. Dans ces conditions, les taux de recouvrement en oligosaccharide spécifique peuvent atteindre 90 % de la valeur théorique. Good results are obtained when HF is used at a concentration of 48% at 4 C for 48 hours. Under these conditions, the specific oligosaccharide recovery rates can reach 90% of the theoretical value.

Pour doser le(s) oligosaccharide(s) spécifique(s) des acides téchoïques obtenus après traitement avec l'HF, il convient avantageusement de le(s) séparer des autres constituants et de le(s) caractériser. Séparation, caractérisation et quantification peuvent être mises en oeuvre selon différentes techniques, e.g. biochimiques, accessibles à l'homme du métier. On indique toutefois que les méthodes connues pour permettre la séparation et/ou le dosage des monosaccharides sont tout particulièrement appropriées. In order to determine the specific oligosaccharide (s) of the teichoic acids obtained after treatment with HF, it is advantageous to separate it (s) from the other constituents and to characterize it (s). Separation, characterization and quantification can be carried out according to different techniques, e.g. biochemical, accessible to those skilled in the art. However, it is pointed out that the known methods for separating and / or measuring monosaccharides are particularly suitable.

Selon un mode particulier, on a recours à une technique de chromatographie par échange 10 d'anions hautement résolutive (HPAEC), éventuellement couplée à une détection ampérométrique en champs pulsés (PAD). In a particular embodiment, a highly-resolved anion exchange chromatography (HPAEC) technique, possibly coupled with pulsed-field amperometric (PAD) detection, is employed.

A cette fin, un support de chromatographie approprié doit permettre une bonne résolution et être compatible avec un milieu de pH très élevé (>_ 12). En pratique, dans ces conditions de pH, le support doit rester intact, exempt de dégradation. Il peut être constitué par une résine e.g., de polystyrène-divinyl-benzène sulfonaté, ayant par exemple un degré de réticulation variant entre 1 et 5 %. La résine est avantageusement sous forme de microbilles dont le diamètre varie de préférence entre 450 et 550 nm. Si le milieu issu du traitement à l'HF contient un nombre certain d'éléments différents, il peut être utile d'optimiser la résolution. A cette fin, la résine e.g., de polystyrène-divinylbenzène sulfonaté peut être conditionnée sous forme de colonne et être complétée en sa partie supérieure par une couche d'un matériau porteur de charges positives, e.g., d'un sel d'amine primaire, d'un sel d'amine secondaire, d'un sel d'amine tertiaire, d'un sel d'ammonium quaternaire, ou d'un groupement ammonium. Ce matériau peut se présenter sous forme de billes ayant avantageusement un diamètre de 5 à 15 m, e.g.10 m environ. Ce matériau peut être poreux ou non. A titre d'exemple on indique qu'un matériau approprié peut être constitué par du latex ayant avantageusement un degré de réticulation de 3 à 7 %, e.g., 5 % environ. For this purpose, a suitable chromatography support must allow good resolution and be compatible with a very high pH medium (> 12). In practice, under these pH conditions, the support must remain intact, free of degradation. It may consist of a resin e.g., sulfonated polystyrene-divinylbenzene, having for example a degree of crosslinking varying between 1 and 5%. The resin is advantageously in the form of microbeads whose diameter preferably varies between 450 and 550 nm. If the medium resulting from the HF treatment contains a number of different elements, it may be useful to optimize the resolution. For this purpose, the eg sulfonated polystyrene-divinylbenzene resin may be packed in column form and supplemented at its upper part by a layer of a positive charge bearing material, eg, a primary amine salt, a secondary amine salt, a tertiary amine salt, a quaternary ammonium salt, or an ammonium group. This material may be in the form of beads advantageously having a diameter of 5 to 15 m, e.g. This material may be porous or not. By way of example, it is indicated that a suitable material may be a latex advantageously having a degree of crosslinking of 3 to 7%, e.g., about 5%.

Le matériel de chromatographie (e.g. colonne analytique) commercialisé par les sociétés Dionex et Metrohm sous les marques de commerce respectives CarboPacTM et Metrosep Carb répond aux critères requis. Ce matériel est couramment désigné comme étant de type CarboPacTM . La colonne CarboPacTM PA1 est tout particulièrement préférée. The chromatography equipment (e.g., analytical column) marketed by Dionex and Metrohm under the respective trade names CarboPacTM and Metrosep Carb meets the required criteria. This material is commonly referred to as CarboPacTM. The CarboPacTM PA1 column is very particularly preferred.

Une fois la préparation issue du traitement par l'HF déposée sur la colonne de chromatographie, on élue avec une solution d'élution possédant un pH ? 12, notamment pour que les fonctions hydroxyles des sucres s'ionisent et soient sous forme d'oxyanions séparables par chromatographie d'échange d'anions. Si la technique PAD est utilisée par la suite pour la détection, la solution d' élution doit être aussi compatible avec cette dernière. A cet égard, la solution d'élution est avantageusement dépourvue de carbonate. Once the preparation resulting from the treatment with HF deposited on the chromatography column, eluted with an elution solution having a pH? 12, in particular for the hydroxyl functions of sugars to ionize and be in the form of separable oxyanions by anion exchange chromatography. If the PAD technique is subsequently used for detection, the elution solution must also be compatible with the latter. In this respect, the elution solution is advantageously free of carbonate.

De manière avantageuse, la solution d'élution est une solution de soude dont la molarité 10 est comprise entre 10 et 300 mM, de manière préférée entre 20 et 150 mM, de façon encore plus préférée entre 40 et 100 mM. Advantageously, the elution solution is a sodium hydroxide solution whose molarity is between 10 and 300 mM, preferably between 20 and 150 mM, more preferably between 40 and 100 mM.

Le débit de la solution d'élution est fonction du type de colonne utilisée, mais est généralement compris entre 0.1 et 4 mUmin. The flow rate of the elution solution is a function of the type of column used, but is generally between 0.1 and 4 mUmin.

Les oligosaccharides spécifiques sont décelés sur le chromatogramme sous la forme de pics de chromatographie ayant des temps de rétention caractéristiques dans des conditions opératoires déterminées (même colonne de chromatographie, même solution et vitesse d'élution, etc). The specific oligosaccharides are detected on the chromatogram in the form of chromatography peaks having characteristic retention times under specific operating conditions (same chromatography column, same solution and elution rate, etc.).

Enfin on recherche et on quantifie l'oligosaccharide spécifique de l'acide téchoïque que l'on cherche à doser à l'aide d'un système de détection, par exemple par ampérométrie en champs pulsés (PAD). Cette méthode de détection est basée sur l'oxydation des sucres sur une électrode de travail entraînant la formation d'un courant électrique qui est mesuré. Des potentiels de régénération et de nettoyage sont souvent appliqués à l'électrode de travail. Finally, the specific oligosaccharide of teichoic acid which is to be assayed by means of a detection system, for example by pulsed-field amperometry (PAD), is investigated and quantified. This detection method is based on the oxidation of sugars on a working electrode resulting in the formation of an electric current that is measured. Regeneration and cleaning potentials are often applied to the working electrode.

Pour connaître la quantité absolue de l'acide téchoïque que l'on cherche à doser, on se reporte avantageusement à une courbe d'étalonnage établie à partir d'une préparation purifiée de l'acide téchoïque en question, dans les même conditions de traitement et d'analyse. In order to know the absolute quantity of teichoic acid that is to be determined, it is advantageous to refer to a calibration curve established from a purified preparation of the teichoic acid in question, under the same treatment conditions. and analysis.

Selon un mode de réalisation particulier, la méthode selon l'invention s'applique au dosage d'un acide téchoïque dans une préparation contenant La. majoritairement, des polysaccharides de capsules de bactéries Gram+. En effet, du fait du mode de purification de ces polysaccharides, les préparations purifiées que l'on obtient, contiennent des quantités résiduelles d'acide téchoïque qu'il convient de doser. According to a particular embodiment, the method according to the invention is applicable to the determination of a teichoic acid in a preparation containing La. Predominantly, polysaccharides of Gram + bacteria capsules. Indeed, because of the purification mode of these polysaccharides, the purified preparations that are obtained, contain residual amounts of teichoic acid that should be determined.

Les polysaccharides capsulaires peuvent être sous leur forme native libre ou sous une forme modifiée par dépolymérisation partielle, activation ou conjugaison à un peptide ou une protéine porteuse comme l'anatoxine tétanique ou l'anatoxine diphtérique. The capsular polysaccharides may be in their native free form or in a modified form by partial depolymerization, activation or conjugation to a peptide or a carrier protein such as tetanus toxoid or diphtheria toxoid.

Selon un mode de réalisation d'un intérêt particulier, la méthode selon l'invention s'applique au dosage des acides téchoïques de Streptoccocus pneumoniae. According to one embodiment of particular interest, the method according to the invention is applicable to the determination of the teichoic acids of Streptococcus pneumoniae.

Les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) sont des bactéries encapsulées Gram positif, responsables de pathologies infectieuses notamment de méningites, de bronchites, de rhinites et otites à complications chez l'adulte comme chez l'enfant. Les pneumocoques sont divisés en sérotypes selon la structure des polysaccharides qui forment la capsule. Le sérotypage des pneumocoques est réalisé à l'aide d'une batterie d'immun sérums, chaque immunsérum étant spécifique d'un seul type de polysaccharide capsulaire (immun sérums monospécifiques). Plus de 90 sérotypes différents, ont été recensés jusqu'à présent. Pneumococci (Streptococcus pneumoniae) are Gram-positive encapsulated bacteria that are responsible for infectious diseases including meningitis, bronchitis, rhinitis and otitis with complications in adults and children. Pneumococci are divided into serotypes according to the structure of the polysaccharides that form the capsule. Pneumococcal serotyping is performed using a battery of immune sera, each antiserum being specific for a single type of capsular polysaccharide (immune monospecific sera). More than 90 different serotypes have been identified so far.

Les vaccins contre le pneumocoque actuellement commercialisés contiennent tous des polysaccharides de capsule. Du fait du mode de purification de ces polysaccharides, ces vaccins contiennent des quantités résiduelles d'acides téchoïques qu'il convient de doser. The pneumococcal vaccines currently marketed all contain capsule polysaccharides. Because of the mode of purification of these polysaccharides, these vaccines contain residual amounts of teichoic acids which should be determined.

Ainsi, sous un aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode de dosage des acides téchoïques du pneumocoque dans une préparation contenant un polysaccharide 30 caspulaire d'au moins un sérotype du pneumocoque. Thus, in a particular aspect, the subject of the invention is a method for the determination of pneumococcal teichoic acids in a preparation containing a caspular polysaccharide of at least one pneumococcal serotype.

Ce sérotype peut être notamment choisi dans le groupe constitué par les sérotypes (valences) les plus répandus; Soient les sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F. This serotype may be chosen in particular from the group consisting of the most common serotypes (valences); Serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F.

Grâce à la méthode de dosage selon l'invention, il est en particulier possible de quantifier les acides téchoïques du pneumocoque dans n'importe quelle préparation contenant un ou des polysaccharide(s) capsulaire(s), quels que soient le nombre et le type de valence. La préparation peut notamment contenir une ou plusieurs des valences caractérisées par un polysaccharide capsulaire dont la structure présente des analogies avec celles des acides téchoïques, soit les valences 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20. En effet, la présence des polysaccharides capsulaires des sérotypes sus-nommés dont l'hydrolyse dans les conditions de l'invention entraîne la production d'oligosaccharides spécifiques, est sans incidence sur le dosage des acides téchoïques. By virtue of the assay method according to the invention, it is in particular possible to quantify the pneumococcal teichoic acids in any preparation containing one or more capsular polysaccharide (s), whatever the number and the type. of valence. The preparation may especially contain one or more of the valencies characterized by a capsular polysaccharide whose structure has analogies with those of the teichoic acids, namely the valences 6B, 10A, 17F, 19A, 19F and 20. In fact, the presence of the capsular polysaccharides the aforementioned serotypes whose hydrolysis under the conditions of the invention leads to the production of specific oligosaccharides, has no effect on the dosage of teichoic acids.

La préparation peut aussi contenir une ou plusieurs des valences 11A, 15B, 18C et 23F. En bref, la préparation peut contenir les 23 valences les plus répandues ou n'importe quelle combinaison possible à partir de ces 23 valences. A titre d'exemple, une telle préparation peut contenir les valences les plus répandues 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. Elle peut aussi contenir une ou plusieurs des valences additionnelles 1, 3, 5 et 7F. The preparation may also contain one or more of the valences 11A, 15B, 18C and 23F. In short, the preparation can contain the 23 most prevalent valences or any combination possible from these 23 valences. By way of example, such a preparation may contain the most widespread valences 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F and 23F. It may also contain one or more of the additional valences 1, 3, 5 and 7F.

A titre indicatif, on soumet les remarques suivantes: Les oligosaccharides spécifiques du polysaccharide C et de l'acide lipotéchoïque libérés lors du traitement par HF à froid selon l'invention, sont identiques. En effet, les 25 deux acides téchoïques possèdent la même unité répétitive. On ne peut donc pas doser le polysaccharide C et l'acide lipotéchoïque séparément. As an indication, the following remarks are made: The oligosaccharides specific for the polysaccharide C and lipotechoic acid released during the treatment with cold HF according to the invention are identical. Indeed, the two teichoic acids have the same repetitive unit. Therefore, polysaccharide C and lipotechoic acid can not be measured separately.

- Les polysaccharides capsulaires des sérotypes 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20, dont l'enchaînement des unités répétitives fait intervenir des liaisons phosphodiesters, 30 sont dégradés essentiellement sous la forme d'oligosaccharides spécifiques. The capsular polysaccharides of serotypes 6B, 10A, 17F, 19A, 19F and 20, whose repeating unit sequence involves phosphodiester linkages, are degraded essentially in the form of specific oligosaccharides.

- Les polysaccharides capsulaires des sérotypes 11A, 15B, 18C et 23F, dont les liaisons phosphodiesters ne sont pas directement impliquées dans l'enchaînement des - 10 - unités répétitives, ne peuvent pas être hydrolysés sous forme d'oligosaccharides spécifiques. Soumis au traitement à l'HF, ils peuvent néanmoins se dépolymériser de manière partielle et aléatoire en des produits hétérogènes, incluant en particulier des molécules tels que le glycérol ou la choline, et des monosaccharides. The capsular polysaccharides of serotypes 11A, 15B, 18C and 23F, whose phosphodiester bonds are not directly involved in the sequence of repeating units, can not be hydrolysed in the form of specific oligosaccharides. Subject to HF treatment, they can nevertheless depolymerize partially and randomly into heterogeneous products, including in particular molecules such as glycerol or choline, and monosaccharides.

Enfin les autres polysaccharides capsulaires qui ne contiennent pas de groupements phosphate ne sont pas dépolymérisés ou sont dépolymérisés de façon partielle et aléatoire pour donner après traitement à l'HF, des produits hétérogènes, en majorité de haut poids moléculaire, nonidentifiables et non-quantifiables, ainsi qu'une minorité de monomères et des monosaccharides. Finally the other capsular polysaccharides which do not contain phosphate groups are not depolymerized or are partially and randomly depolymerized to give, after treatment with HF, heterogeneous products, mostly high molecular weight, non-identifiable and non-quantifiable, as well as a minority of monomers and monosaccharides.

En définitive, le milieu issu du traitement à l'HF peut présenter une complexité plus ou moins importante en fonction du nombre et du type de polysaccharide capsulaire présent au départ. Il convient donc de séparer l'oligosaccharide spécifique des acides téchoïques, des autres produits d'hydrolyse (monomères, monosaccharides, polysaccharides non hydrolysés ou partiellement hydrolysés...). Ultimately, the medium resulting from treatment with HF may have a greater or lesser complexity depending on the number and type of capsular polysaccharide present at the start. It is therefore necessary to separate the specific oligosaccharide teichoic acids, other hydrolysis products (monomers, monosaccharides, polysaccharides unhydrolyzed or partially hydrolysed ...).

L'oligosaccharide spécifique des acides téchoïques de S. pneumoniae se comporte comme un monosaccharide lorsqu'il est analysé et séparé par la technologie HPAEC- PAD. Pour le séparer et le quantifier par HPAEC-PAD de façon particulièrement résolutive, on recommande l'utilisation d'une colonne de chromatographie CarboPac PA1TM et une solution de soude isocratique 75 mM. Dans ces conditions, le pic de chromatographie correspondant a un temps de rétention de 4,30 min 10 % lorsque le débit de la solution d'élution est de 1 ml/min. La surface du pic de chromatographie reflète la quantité relative de polysaccharide C et d'acide lipotéchoïque présents dans la préparation. The oligomeric acid-specific oligosaccharide of S. pneumoniae behaves as a monosaccharide when analyzed and separated by HPAEC-PAD technology. In order to separate it and quantify it with HPAEC-PAD in a particularly resolutive manner, it is recommended to use a CarboPac PA1 ™ chromatography column and a 75 mM isocratic sodium hydroxide solution. Under these conditions, the chromatography peak corresponding to a retention time of 4.30 min 10% when the flow rate of the elution solution is 1 ml / min. The area of the chromatography peak reflects the relative amount of C-polysaccharide and lipotechoic acid present in the preparation.

Dans le cadre des travaux ayant concourus à la présente invention, on a découvert que S. pneumoniae de sérotype 5 ne possédait pas de polysaccharide C. Par contre, on trouve un acide téchoïque de substitution que l'on a appelé polysaccharide C5. La formule de son unité répétitive diffère légèrement de celle du polysaccharide C. Elle est la suivante: [6)-(3-D-Galp-(143)-a-AATp-(144)-a-D-GaIpNAc-(143)-13-D-GaIpNAc-(141)-oRibitol-5-P-(O4] 6 6 I 1 O)-P-Cho O)-P-Cho C'est pourquoi, selon un mode très particulier, l'invention s'applique également au dosage du polysaccharide C5, notamment dans une préparation contenant le polysaccharide caspulaire du sérotype 5 de S. pneumoniae. Le mode opératoire décrit ci- avant pour le dosage du polysaccharide C et l'acide lipotéchoïque convient également pour le dosage du polysaccharide C5. Son pic de chromatographie a dans ces conditions un temps de rétention de 3,30 min 10 %. In the context of the work that has contributed to the present invention, it has been discovered that S. pneumoniae of serotype 5 does not possess a polysaccharide C. On the other hand, there is a teichoic acid substitute which has been called a C5 polysaccharide. The formula of its repeating unit differs slightly from that of polysaccharide C. It is as follows: [6) - (3-D-Galp- (143) -α-AATp- (144) -αD-GaIpNAc- (143) - 13-D-GaIpNAc- (141) -Oribitol-5-P- (O 4] 6 O 10 O) -P-Cho O) -P-Cho That is why, according to a very particular mode, the invention is also applies to the assay of the C5 polysaccharide, especially in a preparation containing the S. pneumoniae serotype 5 caspular polysaccharide. The procedure described above for the determination of polysaccharide C and lipotechoic acid is also suitable for the determination of C5 polysaccharide. Its peak chromatography in these conditions a retention time of 3.30 min 10%.

Pour déterminer les quantités absolues résiduelles en acides téchoïques, on se réfère à 10 des courbes-étalon réalisées à partir de préparations mère exprimant des quantités connues en fonction des surfaces des pics de chromatographie. To determine the residual absolute amounts of teichoic acids, reference is made to standard curves made from parent preparations expressing known amounts as a function of the areas of the chromatography peaks.

La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants qui servent à illustrer l'invention sans pour autant en limiter le contenu. The present invention will be better understood in the light of the following examples which serve to illustrate the invention without limiting its content.

La figure 1 représente le chromatogramme HPAEC-PAD, après traitement à l'HF, du vaccin Pneumo 23TM contenant les polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F. Les pics surmontés d'une * correspondent aux monosaccharides provenant de l'hydrolyse des polysaccharides capsulaires. Le pic Rib correspond au ribitol. Le pic Fru correspond au fructose (étalon-interne). Les pics oligo C et oligo C5 et correspondent respectivement aux oligosaccharides spécifiques C et C5. FIG. 1 represents the HPAEC-PAD chromatogram, after treatment with HF, of Pneumo 23TM vaccine containing the capsular polysaccharides of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A , 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F. The peaks surmounted by a * correspond to the monosaccharides resulting from the hydrolysis of the capsular polysaccharides. The Rib peak corresponds to ribitol. The Fru peak corresponds to fructose (internal standard). The oligo C and oligo C5 peaks correspond respectively to the specific oligosaccharides C and C5.

La figure 2 représente le chromatogramme HPAEC-PAD, après traitement à l'HF, d'une formulation vaccinale F3 telle que décrite dans WO 98/51339 contenant les conjugués Tt et Dt des polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F du pneumocoque. FIG. 2 represents the HPAEC-PAD chromatogram, after treatment with HF, of an F3 vaccine formulation as described in WO 98/51339 containing the Tt and Dt conjugates of capsular polysaccharides of serotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F and 23F of the pneumococcus.

- 12 - Exemple 1: Dosage des quantités résiduelles en polysaccharide C et C5 dans le vaccin Pneumo 23TM contenant les polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B1 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F du pneumocoque. EXAMPLE 1 Assay of Residual Amounts of Polysaccharide C and C5 in Pneumo 23TM Vaccine Containing the Capsular Polysaccharides of Serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B1 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F and 33F of the pneumococcus.

1.1. Solutions mère pour gamme étalon. 1.1.1. Polysaccharide C5: Ce dernier est purifié comme décrit dans le paragraphe suivant, à partir d'une préparation de polysaccharide capsulaire du pneumocoque de sérotype 5 obtenue par précipitation alcoolique fractionnée d'un extrait capsulaire, suivie d'une extraction phénolique pour éliminer les protéines, d'une précipitation fractionnée en présence de chlorure de calcium pour éliminer les acides nucléiques, et finalement d'une seconde précipitation alcoolique fractionnée. Le précipité obtenu, est lavé à l'alcool absolu puis séché sous vide. Le dessicat est remis en solution à une concentration de 10 mg/ml dans un tampon NaCl 200 mM. 1.1. Stock solutions for standard range. 1.1.1. C5 polysaccharide: The latter is purified as described in the following paragraph, from a serotype 5 pneumococcal capsular polysaccharide preparation obtained by fractional alcoholic precipitation of a capsular extract, followed by phenolic extraction to remove the proteins, fractional precipitation in the presence of calcium chloride to remove nucleic acids, and finally a second fractional alcoholic precipitation. The precipitate obtained is washed with absolute alcohol and then dried under vacuum. The desiccate is redissolved at a concentration of 10 mg / ml in 200 mM NaCl buffer.

On dépose 4 ml de cette solution sur une colonne de chromatographie (90 cm x 1,6 cm de diamètre) contenant du gel de sépharose CL 4B. On soumet la colonne à un flux d'une solution de NaCl 200 mM à un débit de 0,6 ml/min de manière à séparer le polysaccharide C5 du polysaccharide capsulaire. L'éluat est recueilli en fractions. La mesure de l'absorbance UV à 206 nm de chaque fraction est mesurée. Cela permet d'identifier deux séries de fractions bien distinctes: la première contenant le polysaccharide capsulaire de type 5; la seconde, éluée contenant le polysaccharide C5. Cette seconde série de fractions est dialysée contre de l'eau distillée, concentrée à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis conservée sous forme de lyophilisat. Le taux de pureté du lyophilisat est d'environ 70 %. 4 ml of this solution is deposited on a chromatography column (90 cm × 1.6 cm in diameter) containing sepharose gel CL 4B. The column is subjected to a flow of a 200 mM NaCl solution at a rate of 0.6 ml / min so as to separate the C5 polysaccharide from the capsular polysaccharide. The eluate is collected in fractions. The measurement of the UV absorbance at 206 nm of each fraction is measured. This makes it possible to identify two distinct series of fractions: the first containing the type 5 capsular polysaccharide; the second, eluted containing the C5 polysaccharide. This second series of fractions is dialyzed against distilled water, concentrated using a rotary evaporator, and then preserved in the form of lyophilisate. The purity level of the lyophilizate is about 70%.

Par la suite on détermine la quantité exacte de polysaccharide C5 dans la préparation ainsi obtenue, en dosant le ribitol libéré après hydrolyse. Subsequently, the exact amount of C5 polysaccharide in the preparation thus obtained is determined by assaying the ribitol released after hydrolysis.

- 13 - Le lyophilisat est remis en solution en eau purifiée ultrafiltrée à raison de 10 g/ml (poids sec). The lyophilizate is re-dissolved in purified ultrafiltered water at the rate of 10 g / ml (dry weight).

En parallèle, on réalise une gamme-étalon de ribitol de 0 à 4 g/ml dans de l'eau purifiée ultrafiltrée. Pour contrôler la reproductibilité de la chromatographie, on peut rajouter à tous les échantillons une quantité fixe de mannose qui joue le rôle d'étalon interne. In parallel, a ribitol standard range of 0 to 4 g / ml is made in ultrafiltered purified water. To control the reproducibility of the chromatography, we can add to all the samples a fixed quantity of mannose which plays the role of internal standard.

400 l de la solution de polysaccharide C5 préparée ci-dessus sont séchés sous azote. Le dessicat est traité par 200 l d'acide fluorhydrique à 48 % pendant 2 heures à 65 C. On sèche et on rajoute 400 l d'acide trifluoroacétique 2 N pendant 2 heures à 135 C. On sèche sous courant d'azote. 400 l of the C5 polysaccharide solution prepared above are dried under nitrogen. The desiccate is treated with 200 l of 48% hydrofluoric acid for 2 hours at 65 ° C.. Drying and adding 400 l of 2 N trifluoroacetic acid for 2 hours at 135 ° C. is dried under a stream of nitrogen.

Pour analyse par chromatographie HPAEC-PAD, on dissout les dessicats obtenus à l'étape précédente dans 400 l d'eau purifiée ultrafiltrée. For analysis by HPAEC-PAD chromatography, the desicates obtained in the preceding step are dissolved in 400 l of ultrafiltered purified water.

On injecte une aliquote de 100 l de chacune des solutions sur une colonne analytique CARBOPAC MAI (4 X 250 mm) (DIONEX #44066) préalablement équilibrée par une solution de soude 480 mM. On soumet la colonne à un flux d'une solution de soude 480 mM pendant 60 minutes à un débit de 0,4 ml/min pour éluer les monosaccharides neutres tels que le ribitol et le mannose. La température de la colonne est maintenue à 30 C. A 100 l aliquot of each of the solutions is injected onto a CARBOPAC MAI analytical column (4 × 250 mm) (DIONEX # 44066) previously equilibrated with a 480 mM sodium hydroxide solution. The column is streamed with 480 mM sodium hydroxide solution for 60 minutes at a rate of 0.4 ml / min to elute the neutral monosaccharides such as ribitol and mannose. The temperature of the column is maintained at 30 C.

Dans ces conditions, le pic de chromatographie correspondant au ribitol apparaît à 19,9 5 % min tandis que le pic correspondant au mannose (étalon interne) apparaît à 25,2 25 5 % min. On établit alors la courbeétalon (quantité de ribitol en fonction de la surface des pics). Par interpolation, on détermine la quantité de ribitol contenu dans la préparation de départ. Puis on déduit alors la quantité exacte de polysaccharide C5, sachant que l'unité répétitive du polysaccharide C5 est constituée de 11,1% (p/p) de ribitol. Under these conditions, the peak of chromatography corresponding to ribitol appears at 19.9 min. 5 min. Whereas the peak corresponding to mannose (internal standard) appears at 25.2 min. The standard curve (amount of ribitol as a function of peak area) is then established. By interpolation, the amount of ribitol contained in the starting preparation is determined. Then the exact amount of C5 polysaccharide is deduced, knowing that the repeating unit of the C5 polysaccharide consists of 11.1% (w / w) ribitol.

1.1.2. Polysaccharide C: - 14 - On dissout la poudre de polysaccharide C purifié (Staten Serum Institute, DanemarK) dans de l'eau ultrapurifiée puis on ajuste sa concentration la concentration en polysaccharide C à 10 g/ml sur la base du dosage du ribitol effectué selon la même méthode que celle détaillée au paragraphe 1.1.1. 1.1.2. Polysaccharide C: The purified polysaccharide powder C (Staten Serum Institute, DanemarK) is dissolved in ultrapurified water and its concentration is adjusted to the concentration of polysaccharide C at 10 g / ml on the basis of the ribitol assay performed. using the same method as detailed in paragraph 1.1.1.

1.2. Gammes-étalon: De 0 à 5 g/ml en acide téchoïques précisément dosés préparées à partir des solutions mères par dilution dans de l'eau purifiéeultrafiltrée. Les échantillons de la gamme sont ensuite séchés sous azote. 1.2. Standard ranges: From 0 to 5 g / ml of precisely dosed teichoic acids prepared from the stock solutions by dilution in purified, ultrafiltered water. The samples in the range are then dried under nitrogen.

1.3. Préparation de l'échantillon à doser On dialyse 3 doses de vaccins (1,5 ml) contre de l'eau distillée puis on lyophilise le dialysat. Le lyophilisat est alors repris par 1,5 ml d'eau purifiée ultrafiltrée dont on prélève une aliquote de 40 l qui est ensuite séché sous azote. 1.3. Preparation of the sample to be assayed 3 doses of vaccine (1.5 ml) were dialyzed against distilled water and the dialysate was lyophilized. The lyophilizate is then taken up in 1.5 ml of ultrafiltered purified water from which a 40 l aliquot is taken which is then dried under nitrogen.

Pour contrôler la reproductibilité de la chromatographie, on peut rajouter dans l'échantillon à analyser une quantité fixe de fructose qui sert d'étalon interne. To control the reproducibility of the chromatography, we can add in the sample to be analyzed a fixed amount of fructose which serves as internal standard.

1.4. Hydrolyse par l'HF Tous les dessicats ( échantillon à doser et échantillons de la gamme étalon) sont traités par 400 pi d'acide fluorhydrique à 48 % pendant 48 heures à 5 C. On sèche sous courant d'azote et on reprend par 400 l d'eau purifiée ultrafiltrée au moment de l'analyse. 1.4. Hydrolysis with HF All the desiccates (sample to be assayed and samples of the standard range) are treated with 400 μl of 48% hydrofluoric acid for 48 hours at 5 ° C. The mixture is dried under a stream of nitrogen and is taken up in 400 ° C. 1 purified water ultrafiltered at the time of analysis.

1.5. Analyse par chromatographie HPAEC-PAD On injecte 100 l de chacun des hydrolysats sur une colonne analytique CARBOPAC PAl (4 X 250 mm) (DIONEX #35391) préalablement équilibrée par une solution de soude 75 mM. On soumet la colonne à un flux d'une solution de soude 75 mM pendant min à un débit de 1 ml/min pour éluer les oligosaccharides spécifiques du polysaccharide C et du polysaccharide C5 ainsi que les monosaccharides neutres au pH de l'analyse. La température de la colonne est maintenue à 30 C. Pour parachever la chromatographie, on ajoute graduellement une solution de soude 75 mM contenant de - 15 - l'acétate de sodium de façon à éluer tous les monosaccharides, oligosaccharides et polysaccharides restants. 1.5. Analysis by HPAEC-PAD Chromatography 100 μl of each of the hydrolysates are injected onto a CARBOPAC PAl analytical column (4 × 250 mm) (DIONEX # 35391) previously equilibrated with a 75 mM sodium hydroxide solution. The column is subjected to a flow of a 75 mM sodium hydroxide solution for a minute at a flow rate of 1 ml / min in order to elute the polysaccharide C and C5 polysaccharide-specific oligosaccharides as well as the neutral monosaccharides at the pH of the analysis. The temperature of the column is maintained at 30 ° C. To complete the chromatography, a solution of sodium mordre containing 75 mM sodium is gradually added so as to elute all remaining monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides.

Dans ces conditions, le pic de chromatographie correspondant au ribitol libéré lors de l'hydrolyse du polysaccharide C, du polysaccharide C5 et des polysaccharides capsulaires 6B et 10A apparaît à 2,65 5% min. Les pics correspondant aux oligosaccharides spécifiques du polysaccharide C5 et du polysaccharide C ainsi que le pic de fructose (étalon interne) apparaissent respectivement à 3,30 5% min, 4,30 5% min et 8,5 5% min (voir figure 1). Under these conditions, the peak of chromatography corresponding to ribitol released during the hydrolysis of polysaccharide C, polysaccharide C5 and capsular polysaccharides 6B and 10A appears at 2.65% min. The peaks corresponding to the oligosaccharides specific for the C5 polysaccharide and the C polysaccharide as well as the fructose peak (internal standard) appear respectively at 3.30% min, 4.30% min and 8.5% min (see FIG. ).

On établit les courbes-étalon (quantité de polysaccharide C ou C5 en fonction de la surface des pics). Par interpolation, on détermine les quantités de polysaccharide C et C5 présentes dans la préparation de départ. The standard curves (amount of C or C5 polysaccharide as a function of peak area) are established. By interpolation, the amounts of polysaccharide C and C5 present in the starting preparation are determined.

Exemple 2: Dosage des quantités résiduelles en polysaccharide C et C5 dans la formulation vaccinale F3 telle que décrite dans WO 98/51339 contenant les conjugués Dt et/ou Tt des polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F du pneumocoque. EXAMPLE 2 Assay of the Residual Quantities in Polysaccharide C and C5 in the F3 Vaccine Formulation As Described in WO 98/51339 Containing the Dt Conjugates and / or Tt of the Capsular Polysaccharides of the Serotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, Pneumococcal 9V, 14, 18C, 19F and 23F.

Pour préparer l'échantillon à doser on utilise le même protocole que celui décrit au paragraphe 1.3. Le volume de l'aliquote prélevée est ici de 1 ml. Le profil de chromatographie que l'on obtient est celui montré à la figure 2. To prepare the sample to be assayed, the same protocol as described in section 1.3 is used. The volume of the aliquot taken is here 1 ml. The chromatography profile that is obtained is that shown in FIG.

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Claims

claims

1. purified C5 polysaccharide having a repeating unit of formula: [6) - [iD-Galp- (143) -α-AATp- (144) -αD-GaIpNAc- (143) -RD-GaIpNAc- (1> 1) -DRibitol-5-P- (O4] 6 6 1 1 O) -P-Cho O) -P-Cho

2. Use of the polysaccharide C5 according to claim 1, for the assay of this polysaccharide in a preparation containing a capsular polysaccharide of S. pneumoniae serotype 5.