PROCEDE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION
D'ANTIGENES PROTEIQUES DE MYCOBACTERIUM
BOVIS-BCG, PRODUITS OBTENUS ET LEURS
APPLICATIONS.
PROCÉDÉ DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION D'ANTIGENES
PROTÉIQUES DE MYCOBACTERIUM
BOVIS-BCG, PRODUITS OBTENUS ET LEURS APPLICATIONS.
Objet de l'invention
La présente invention concerne un procédé de production et de purification d'antigènes protéiques de Mycobacterium Bovis-BCG. Elle s'étend à différents antigènes de Mycobaçterium Bovis-BCG pouvant être obtenus par ce procédé ainsi qu'aux applications, en particulier dans des tests de diagnostic de la tuberculose.
Brève description de l'état de la technique
Les techniques de culture carencée en zinc du BCG ont été décrites dans le "Journal of General Microbiology (1981) 124, 353-357".
Alors que le BCG croît sur le milieu Sauton normal en formant un voile qui atteint son développement maximum après 14 jours, si lors de la préparation du milieu Sauton - milieu synthétique simple - l'addition des ions zinc est omise selon la technique décrite, le BCG pousse mal, le voile sombre après 8 à 9 jours et le rendement poids sec de la culture après 14 jours est 4 à 5 fois inférieur à celui d'une culture normale; les bactéries toutefois sont toujours alcoolo-acido résistantes.
Ce milieu est 2 à 3 fois plus riche en protéines et en aldéhydes qu'un milieu de culture normal.
De plus, il y apparaît une classe de protéines précipitables à pH 4,5, de telles protéines sont à peine détectables dans les conditions de culture normale. Pour obtenir cet effet de carence en zinc sur les cultures de BCG, il est indispensable d'utiliser pour la préparation de milieu Sauton une eau distillée de résistivité égale ou supérieure à 106 ohms.cm; il faut également que la verrerie en pyrex utilisée soit soigneusement rincée avec une eau de même résistivité.
2
Élément caractéristique de l'invention
On s'est aperçu qu'il est possible d'améliorer la quantité d'antigènes qui est libérée dans de tels filtrats de culture carencé par l'addition lors de la préparation du milieu, d'une quantité de zinc égale à 10% de la quantité usuellement additionnée au milieu Sauton, soit 0,1425 mg de ZnS04 7H20 par litre de milieu (au lieu de 1,425 mg). Ceci conduit au développement plus important d'un "voile anormal" avec libération accrue de protéines dans le milieu; dans ces conditions la récolte peut prendre place après 21 jours au lieu de 14 jours.
Ces filtrats de culture constituent un excellent matériel de départ pour l'isolement d'antigènes de surface et extracytoplasmiques, non seulement du BCG, mais aussi de différentes espèces de mycobactéries (souches humaines, bovines, aviaires et atypiques) et l'effet de carence en zinc peut être étendu à d'autres espèces de bactéries à croissance lente.
Techniques de purification d'antigènes spécifiques
A partir de tels filtrats de culture carencée, il est possible de préparer des antigènes caractéristiques de l'invention.
La purification des antigènes de Mycobacterium Bovis-BCG (Souche 1173 P2) est obtenue par chromatographies successives sur Phenylsepharose, DEAE Sephacel et filtration moléculaire sur Sephadex (les termes SEPHAROSE, SEPHACEL et SEPHADEX sont des marques).
Première étape
Récolte des filtrats de culture carencée en zinc
<EMI ID=1.1>
Les milieux de culture sont rassemblés et la plupart des bactéries sont éliminées par décantation.
Le milieu est alors filtré sur une unité Millipak
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
téines, on ajoute du phosphate KH2PO4 / Na2HP04 pour atteindre une concentration 0,02 M, et du chlorure de sodium, pour atteindre une concentration 0,45M; le Tween
80 et EDTA sont ajoutés pour obtenir respectivement une concentration 0,005% P/V et 10-<3> M finales. (Tween est une marque).
Le pH est ajusté à pH 7,3 avec de l'acide chiorhydrique 5N. Tous les tampons utilisés dans la purification sont ajustés à pH 7,3 et contiennent du Tween 80 0,005% P/V; ils ont été stérilisés par autoclavage à
120[deg.] pendant 20 minutes. Toutes les opérations qui
<EMI ID=4.1>
Le milieu est appliqué sur une colonne de phénylsépharose de la société suédoise Pharmacia 5 x 16 cm équilibré par 600 ml de tampon phosphate 0,02 M contenant du chlorure de sodium 0,45 M et de l'EDTA 10-<3> M.
Deuxième étape
<EMI ID=5.1>
se.
Le débit est de 800 ml par heure. Le gel est lavé par environ 600 ml du même tampon pour éliminer les protéines non fixées, et puis successivement par 800 ml des tampons phosphates 0,02 M et 0,004 M et finalement avec le même volume d'éthanol 10% V/V. La fraction éluée avec
<EMI ID=6.1>
de poids moléculaire 64.000 en conditions dénaturantes et la fraction éluée par l'éthanol 10% V/V la protéine
<EMI ID=7.1>
sont des marques).
Troisième étape
<EMI ID=8.1>
Aux deux fractions .contenant la P32 et la P64 du tampon phosphate est ajouté pour atteindre respectivement les concentrations 0,004 M et 0,02 M et de l'EDTA pour atteindre une concentration 10-4 M finale.
Les solutions protéiques sont alors appliquées sur des colonnes de DEAE sephacel (5 x 5 cm) équilibrées
<EMI ID=9.1>
(P32) et l'autre par 500 ml de tampon phosphate 0.02 M EDTA 10-4 M (P64).
La P32 est éluée par 600 ml de tampon phosphate 0,025 M, toutes les fraction du seul pic obtenu sont rassemblées et concentrées dans un appareil Amicon (AMICON est une marque) sous 1 kg/cm <2> de pression d'azote sur une membrane Amicon PM10.
La P64 est éluée par 2 1 d'un gradient phosphate s'étalant de 0,02 M à 0,12 M; les fractions du pic obtenu sont analysées en électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS) et les fractions purifiées sont rassemblées et concentrées dans les mêmes conditions que pour la P32.
Quatrième étape
Filtration moleculaire.
Les échantillons ainsi concentrés de P32 et de P64 sont soumis à une filtration moléculaire sur Sephadex G100 (P32) et G200 (P64) (2,5 x 40 cm) - à un débit de 12 ml/par heure.
Les deux protéines ainsi purifiées sont homogènes sur la base de 3 critères
- une bande en électrophorèse en conditions dénaturantes
(dodécylsulfate de sodium - SDS),
- un pic en filtration moléculaire,
- une ligne de précipitation en contre-immunoélectropho= rèse (CIE). Ces protéines sont des constituants des cellules de BCG ayant cru en conditions normales; elles sont présentées dans les extraits cellulaires solubles.
Caractéristiques physico-chimiques et chimiques des protéines isolées
A. Poids moléculaire
<EMI ID=10.1>
B. La composition en acides aminés de ces protéines est
reprise dans le tableau ci-dessous
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
<EMI ID=13.1>
dans ces deux protéines, le rapport des acides glutamique et aspartique sur les acides aminés basiques ly-
<EMI ID=14.1>
A noter aussi l'absence de cystéine et dé tryptophane.dans la P64.
<EMI ID=15.1>
Le spectre U.V. de la P32 correspond au spectre classique des protéines. Son absorption à 280 mm est
<EMI ID=16.1>
La P64 présente un spectre anormal, avec une absorbance unusuelle à 340 mm et un rapport d'absorbance A
280/A 260 de 1,05 (ce rapport est de 1,7 pour la P32)-
Une solution de P64 à 1 mg/ml dans le même tampon que celui décrit pour la P32 donne une absorbance à 280 mm de 0,39 (voir graphique annexé).
Le dosage des protéines est effectué par la méthode au Bleu de Coamassie (Réf. Spector, TH. Analytical Biochemistry 1978, 86, 142 - 146), la sérum albumine bovine est utilisée comme standard.
Ces spectres sont repris dans la figure unique annexée.
D. Présence du sucre
Le contenu en sucre déterminé par le test phénol acide sulfurique est de 1,4% pour la P32 et égal ou inférieur à 0,3% pour la P64..
Propriétés biologiques des protéines
A. Ces deux protéines sont des antigènes de Mycobacterium Bovis-BCG. Elles ont été identifiées par
<EMI ID=17.1>
P32 est l'antigène 85.A., la P64 est l'antigène 82.
Des antigènes proches ou identiques aux 2 protéines isolées sont présents chez d'autres souches bovines, et chez des souches humaines telle la bacille de KOCH agent de la tuberculose.
B. Ces deux protéines sont immunogènes - en effet, injectées à l'animal soit à l'état pur soit dans des mélanges complexes elles provoquent la formation d'anticorps dirigés contre elles.
Plusieurs anticorps monoclonaux dirigés contre la P64 ont été préparés et peuvent être utilisés. L'anticorps monoclonal IV C7 a une affinité élevée pour la P64-
Cet anticorps monoclonal a donné une réaction immunohistochimique positive sur des biopsies de poumon de patients tuberculeux (dans environ 10 cas testés). Les coupes pulmonaires de patients non tuberculeux n'ont pas donné de réaction (également environ 10 cas testés).
Activité tuberculinique
Les deux protéines rélèvent l'hypersensibilité différée chez des cobayes préalablement sensibilisés soit avec du BCG vivant (1 mg poids humide contenant entre 4 et 8.106 cellules par cobaye pesant entre 300 et
500 g), soit avec du BCG tué (2 mg poids humide dans 0,5 ml d'ajuvant incomplet de Freund).
La P64 relève 50 à 100 x plus efficacement l'hypersensibilité différée que la ?32'
Son activité par mg de protéine est de l'ordre de
40% de celle de 1 mg de PPD lyophilisée.
La mesure de l'activité tuberculinique, in vivo, consiste en la mesure du diamètre de l'induration produite 24 heures après l'injection en intradermique du produit à tester par rapport à la PPD lyophilisée (exprimée en poids) utilisée comme référence (PPD = Purified Protein Derivative).
Les résultats d'une expérience type sur cobaye sont repris dans le tableau ci-dessous.
Activité des protéines purifiées mesurées par rapport à la PPD et exprimées en pour cent.
<EMI ID=18.1>
Les valeurs entre parenthèses représentent les limites de confiance à p = 0,05.
<EMI ID=19.1>
La protéine P32 induit la production d'interferon 7 in vitro dans des cultures de cellules de rate prove-
<EMI ID=20.1>
Les souris sont sensibilisées par injection intraveineuse de BCG ayant cru en voile sur du milieu Sauton.
La dose injectée par souris est de 0,2 ml d'une suspension contenant 2,5.106 bactéries vivantes (C.F.U.
- colony forming unit). Après une à quatre semaines les souris sont sacrifiées, les cellules de la rate, en suspension dans du milieu R.P.M.I. 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal inactivé, sont distribuées dans des plaques pour microcultures en présence soit des antigènes à tester, soit de la PPD utilisée comme référence.
L'unité d'interferon est définie ici comme la réciproque de la dernière dilution du surnageant de culture qui donne 50% de protection de la lyse de la lignée cellulaire L 929 infectée par le virus V.S.V.
Les résultats d'une expérience type sont repris dans le tableau ci-dessous.
<EMI ID=21.1>
ron par ml de surnageant de culture. Ils peuvent être transformés en unités internationales.
<EMI ID=22.1>
Applications des antigènes purifiés
Les antigènes protéiques purifiés, les anticorps polyclonaux dressés contre elles, les anticorps monoclonaux dressés contre la P64, et ultérieurement les anticorps monoclonaux dressés contre la P32 et les peptides issus par hydrolyse des protéines peuvent être utilisés dans différents tests de diagnostic rapide de la tuberculose : ELISA, RIA, Immunoliposomes, Immunohistochimie, pour la détection d'anticorps et d'antigènes dans les échantillons cliniques, sérums, expectorations, lavages, bronchoalvéolaires et biopsies.
Les antigènes protéiques et anticorps polyclonaux ou monoclonaux réactifs peuvent être présentés sous formes de trousses (kits) de détection.
Des peptides issus par hydrolyse des protéines P64 et P32, et des anticorps monoclonaux dirigés contre ces peptides testés (sur modèle animal) comme spécifiques des souches de mycobactéries bovines et humaines permettraient d'améliorer le diagnostic de la tuberculose et d'exclure les infections par mycobactéries d'origine aviaire ou par des mycobactéries atypiques.
Des peptides issus par hydrolyse de la protéine P64 et présentant des activités tuberculiniques pourraient éventuellement servir de standard de référence en lieu et place des PPD bovines et humaines.
Un exemple de production d'anticorps est donné ci-dessous.
Des souris BALB/c sont immunisées au moyen d'un
<EMI ID=23.1>
par la chaleur et adsorbées sur phosphate d'aluminium. Elles reçoivent 2 injections intrapéritonéales de ce mélange espacées par un intervalle d'au moins 1 moins. L'immunisation est contrôlée par la recherche des anticorps par ELISA une semaine après la deuxième injection. Sept jours plus tard, les souris reçoivent par voire in- <EMI ID=24.1>
elles sont sacrifiées et leur rate est prélevée. Les splénocytes sont alors fusionés avec des cellules de myélome Sp2/0 selon la technique classique décrite par Fazekas de St. Groth et Scheidegger (Production of Monoclonal antibodies : strategy and tactics. J. of immunological methods, 35 (1980) 1-21). Les cellules fusionnées provenant d'une rate sont réparties en 10 microplaques à 96 puits et mises en culture en milieu Iscove-HAT enrichi par 10% de sérum foetal de veau inactive loc. cit. Quatorze jours plus tard, la présence d'anticorps dans les cultures est controlée par ELISA. Après développement suffisant, les colonies positives sont transférées en plaques à 24 puits et clonées en agar mou.
Les résultats indiquent qu'une des anticorps monoclonaux anti P64 (IV C7) permet de distinguer entre les souches de mycobactéries bovines et humaines d'une part, et les souches aviaires et atypiques d'autre part.
REVENDICATIONS
1. Procédé de production et de purification d'antigènes protéiques de Mycobacterium Bovis-BCG dans un milieu Sauton carencé en zinc caractérisé par l'addition, lors de la préparation de ce milieu, d'une quantité de zinc égale à environ 10% de. la quantité usuellement additionnée (soit environ 0,1425 mg de ZnS04 7H20) par litre de milieu, récolte du filtrat et purification des antigènes protéiques.
PRODUCTION AND PURIFICATION PROCESS
MYCOBACTERIUM PROTEIN ANTIGENS
BOVIS-BCG, PRODUCTS OBTAINED AND THEIR
APPLICATIONS.
METHOD FOR THE PRODUCTION AND PURIFICATION OF ANTIGENS
MYCOBACTERIUM PROTEINS
BOVIS-BCG, PRODUCTS OBTAINED AND THEIR APPLICATIONS.
Subject of the invention
The present invention relates to a process for the production and purification of protein antigens of Mycobacterium Bovis-BCG. It extends to various Mycobaçterium Bovis-BCG antigens obtainable by this process as well as to applications, in particular in diagnostic tests for tuberculosis.
Brief description of the state of the art
BCG zinc deficient culture techniques have been described in the "Journal of General Microbiology (1981) 124, 353-357".
While BCG grows on normal Sauton medium, forming a veil which reaches its maximum development after 14 days, if during the preparation of Sauton medium - simple synthetic medium - the addition of zinc ions is omitted according to the technique described, the BCG grows badly, the dark veil after 8 to 9 days and the dry weight yield of the culture after 14 days is 4 to 5 times lower than that of a normal culture; however, bacteria are still alcohol-acid resistant.
This medium is 2 to 3 times richer in proteins and aldehydes than a normal culture medium.
In addition, there appears a class of proteins that can be precipitated at pH 4.5, such proteins are barely detectable under normal culture conditions. To obtain this zinc deficiency effect on BCG cultures, it is essential to use for the preparation of Sauton medium distilled water with resistivity equal to or greater than 106 ohms.cm; the pyrex glassware used must also be thoroughly rinsed with water of the same resistivity.
2
Character-defining element of the invention
It has been found that it is possible to improve the quantity of antigens which is released in such deficient culture filtrates by the addition during the preparation of the medium, of an amount of zinc equal to 10% of the amount usually added to Sauton medium, ie 0.1425 mg of ZnSO4 7H20 per liter of medium (instead of 1.425 mg). This leads to the greater development of an "abnormal veil" with increased release of proteins in the medium; under these conditions the harvest can take place after 21 days instead of 14 days.
These culture filtrates constitute an excellent starting material for the isolation of surface and extracytoplasmic antigens, not only of BCG, but also of different species of mycobacteria (human, bovine, avian and atypical strains) and the deficiency effect. zinc can be extended to other species of slow growing bacteria.
Techniques for purification of specific antigens
From such deficient culture filtrates, it is possible to prepare antigens characteristic of the invention.
The purification of Mycobacterium Bovis-BCG antigens (strain 1173 P2) is obtained by successive chromatographies on Phenylsepharose, DEAE Sephacel and molecular filtration on Sephadex (the terms SEPHAROSE, SEPHACEL and SEPHADEX are trademarks).
First stage
Harvest of zinc-deficient culture filtrates
<EMI ID = 1.1>
The culture media are collected and most of the bacteria are eliminated by decantation.
The medium is then filtered on a Millipak unit
<EMI ID = 2.1>
<EMI ID = 3.1>
tines, KH2PO4 / Na2HPO4 phosphate is added to reach a concentration of 0.02 M, and sodium chloride, to reach a concentration of 0.45M; the Tween
80 and EDTA are added to obtain a concentration of 0.005% P / V and 10- <3> M respectively. (Tween is a brand).
The pH is adjusted to pH 7.3 with 5N hydrochloric acid. All the buffers used in the purification are adjusted to pH 7.3 and contain Tween 80 0.005% W / V; they were sterilized by autoclaving at
120 [deg.] For 20 minutes. All operations that
<EMI ID = 4.1>
The medium is applied to a phenylsepharose column from the Swedish company Pharmacia 5 x 16 cm equilibrated with 600 ml of 0.02 M phosphate buffer containing 0.45 M sodium chloride and EDTA 10- <3> M.
Second step
<EMI ID = 5.1>
se.
The flow rate is 800 ml per hour. The gel is washed with approximately 600 ml of the same buffer to remove the unbound proteins, and then successively with 800 ml of the 0.02 M and 0.004 M phosphate buffers and finally with the same volume of 10% V / V ethanol. The fraction eluted with
<EMI ID = 6.1>
of molecular weight 64,000 under denaturing conditions and the fraction eluted by ethanol 10% V / V the protein
<EMI ID = 7.1>
are brands).
Third step
<EMI ID = 8.1>
To the two fractions containing P32 and P64 phosphate buffer is added to reach the concentrations 0.004 M and 0.02 M respectively and EDTA to reach a final concentration 10-4 M.
The protein solutions are then applied to DEAE sephacel columns (5 x 5 cm) balanced
<EMI ID = 9.1>
(P32) and the other with 500 ml of 0.02 M EDTA 10-4 M phosphate buffer (P64).
P32 is eluted with 600 ml of 0.025 M phosphate buffer, all the fractions of the single peak obtained are combined and concentrated in an Amicon device (AMICON is a brand) under 1 kg / cm <2> of nitrogen pressure on a membrane Amicon PM10.
P64 is eluted by 2 l of a phosphate gradient ranging from 0.02 M to 0.12 M; the fractions of the peak obtained are analyzed by electrophoresis under denaturing conditions (SDS) and the purified fractions are combined and concentrated under the same conditions as for P32.
Step four
Molecular filtration.
The thus concentrated samples of P32 and P64 are subjected to molecular filtration on Sephadex G100 (P32) and G200 (P64) (2.5 x 40 cm) - at a flow rate of 12 ml / per hour.
The two proteins thus purified are homogeneous on the basis of 3 criteria
- an electrophoresis strip under denaturing conditions
(sodium dodecyl sulfate - SDS),
- a peak in molecular filtration,
- a precipitation line in counter-immunoelectrophy = rèse (CIE). These proteins are constituents of BCG cells that have grown under normal conditions; they are presented in the soluble cell extracts.
Physico-chemical and chemical characteristics of isolated proteins
A. Molecular weight
<EMI ID = 10.1>
B. The amino acid composition of these proteins is
shown in the table below
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1>
<EMI ID = 13.1>
in these two proteins, the ratio of glutamic and aspartic acids to basic amino acids ly-
<EMI ID = 14.1>
Also note the absence of cysteine and tryptophan in P64.
<EMI ID = 15.1>
The U.V. spectrum of P32 corresponds to the conventional protein spectrum. Its absorption at 280 mm is
<EMI ID = 16.1>
P64 has an abnormal spectrum, with an unusual absorbance at 340 mm and an absorbance ratio A
280 / A 260 of 1.05 (this ratio is 1.7 for P32) -
A solution of P64 at 1 mg / ml in the same buffer as that described for P32 gives an absorbance at 280 mm of 0.39 (see attached graph).
The determination of the proteins is carried out by the method of Bleu de Coamassie (Ref. Spector, TH. Analytical Biochemistry 1978, 86, 142 - 146), bovine serum albumin is used as standard.
These spectra are shown in the attached single figure.
D. Presence of sugar
The sugar content determined by the phenol sulfuric acid test is 1.4% for P32 and equal to or less than 0.3% for P64.
Biological properties of proteins
A. These two proteins are Mycobacterium Bovis-BCG antigens. They have been identified by
<EMI ID = 17.1>
P32 is the 85.A antigen, P64 is the 82 antigen.
Antigens close to or identical to the 2 proteins isolated are present in other bovine strains, and in human strains such as the bacillus of KOCH tuberculosis agent.
B. These two proteins are immunogenic - in fact, injected into the animal either in the pure state or in complex mixtures, they cause the formation of antibodies directed against them.
Several monoclonal antibodies directed against P64 have been prepared and can be used. The monoclonal antibody IV C7 has a high affinity for P64-
This monoclonal antibody gave a positive immunohistochemical reaction on lung biopsies of tuberculosis patients (in approximately 10 cases tested). Lung sections from non-tuberculosis patients did not give a reaction (also about 10 cases tested).
Tuberculin activity
The two proteins raise the delayed hypersensitivity in guinea pigs previously sensitized either with live BCG (1 mg wet weight containing between 4 and 8,106 cells per guinea pig weighing between 300 and
500 g), or with killed BCG (2 mg wet weight in 0.5 ml of incomplete Freund's adjuvant).
P64 reports 50 to 100 x more effectively delayed hypersensitivity than? 32 '
Its activity per mg of protein is around
40% of that of 1 mg of lyophilized PPD.
The measurement of tuberculin activity, in vivo, consists of measuring the diameter of the induration produced 24 hours after the intradermal injection of the product to be tested relative to the lyophilized PPD (expressed by weight) used as a reference (PPD = Purified Protein Derivative).
The results of a typical guinea pig experiment are shown in the table below.
Activity of purified proteins measured with respect to PPD and expressed in percent.
<EMI ID = 18.1>
The values in parentheses represent the confidence limits at p = 0.05.
<EMI ID = 19.1>
The P32 protein induces the production of interferon 7 in vitro in cultures of proven spleen cells.
<EMI ID = 20.1>
The mice are sensitized by intravenous injection of BCG having believed in veil on Sauton medium.
The dose injected per mouse is 0.2 ml of a suspension containing 2.5.106 live bacteria (C.F.U.
- colony forming unit). After one to four weeks the mice are sacrificed, the spleen cells, suspended in R.P.M.I. 1640 containing 10% of inactivated fetal calf serum, are distributed in plates for microcultures in the presence either of the antigens to be tested, or of the PPD used as reference.
The interferon unit is defined here as the reciprocal of the last dilution of the culture supernatant which gives 50% protection from the lysis of the cell line L 929 infected with the virus V.S.V.
The results of a typical experiment are shown in the table below.
<EMI ID = 21.1>
per ml of culture supernatant. They can be transformed into international units.
<EMI ID = 22.1>
Applications of purified antigens
The purified protein antigens, the polyclonal antibodies raised against them, the monoclonal antibodies raised against P64, and subsequently the monoclonal antibodies raised against P32 and the peptides resulting from protein hydrolysis can be used in various tests for rapid diagnosis of tuberculosis: ELISA, RIA, Immunoliposomes, Immunohistochemistry, for the detection of antibodies and antigens in clinical samples, sera, sputum, washing, bronchoalveolar and biopsies.
The protein antigens and reactive polyclonal or monoclonal antibodies can be presented in the form of detection kits.
Peptides derived by hydrolysis of the proteins P64 and P32, and monoclonal antibodies directed against these peptides tested (on animal model) as specific for the strains of bovine and human mycobacteria would improve the diagnosis of tuberculosis and exclude infections by mycobacteria of avian origin or by atypical mycobacteria.
Peptides derived by hydrolysis of the P64 protein and exhibiting tuberculin activities could possibly serve as a reference standard in place of bovine and human PPDs.
An example of antibody production is given below.
BALB / c mice are immunized with a
<EMI ID = 23.1>
by heat and adsorbed on aluminum phosphate. They receive 2 intraperitoneal injections of this mixture spaced at least 1 min apart. Immunization is checked by looking for antibodies by ELISA one week after the second injection. Seven days later, the mice receive by even <EMI ID = 24.1>
they are sacrificed and their spleen is removed. The splenocytes are then fused with Sp2 / 0 myeloma cells according to the conventional technique described by Fazekas de St. Groth and Scheidegger (Production of Monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. of immunological methods, 35 (1980) 1-21) . The fused cells originating from a spleen are distributed in 10 96-well microplates and cultured in Iscove-HAT medium enriched with 10% of inactive loc fetal calf serum. cit. Fourteen days later, the presence of antibodies in the cultures is checked by ELISA. After sufficient development, the positive colonies are transferred to 24-well plates and cloned into soft agar.
The results indicate that one of the anti-P64 monoclonal antibodies (IV C7) makes it possible to distinguish between the strains of bovine and human mycobacteria on the one hand, and the avian and atypical strains on the other hand.
CLAIMS
1. Process for the production and purification of Mycobacterium Bovis-BCG protein antigens in a Sauton medium deficient in zinc, characterized by the addition, during the preparation of this medium, of an amount of zinc equal to approximately 10% of . the amount usually added (ie approximately 0.1425 mg of ZnSO 4 7H 2 O) per liter of medium, collection of the filtrate and purification of the protein antigens.