FR2847819A1

FR2847819A1 - Procede de preparation d'un materiau conducteur a activite fibrinolytique implantable dans l'organisme

Info

Publication number: FR2847819A1
Application number: FR0215199A
Authority: FR
Inventors: Jean Maxime Nigretto; Sylvie Longchamp; Severine Hourdin
Original assignee: Universite de Cergy-Pontoise
Current assignee: Universite de Cergy-Pontoise
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2004-06-04
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: FR2847819B1

Abstract

La présente Invention a pour objet un procédé de préparation d'un matériau conducteur implantable dans l'organisme présentant une activité fibrinolytique, ledit matériau et ses applications.

Description

Procédé de préparation d'un matériau conducteur à activité fibrinolytique implantable dans l'organisme.

En chirurgie, particulièrement en chirurgie cardiovasculaire, l'utilisation d'un matériau en contact avec le sang est principalement limitée par la formation d'un thrombus au niveau de l'interface sang/matériau. Celui-ci est généralement attribué à l'adsorption préalable des protéines plasmatiques sur la surface du matériau.

Parmi les nombreuses protéines plasmatiques impliquées dans la cascade d'événements conduisant à la formation du caillot, on peut citer celles intervenant dans la phase finale à savoir la thrombine, produit de transformation de la prothrombine sous l'effet de la prothrombinase, qui par activation du fibrinogène soluble conduit à la formation de fibrine soluble qui elle-même se transforme par polymérisation et stabilisation par le facteur XIII en filaments de fibrine insolubles qui encerclent dans leurs mailles les cellules circulantes et forment ainsi le caillot sanguin.

A côté des facteurs responsables de la formation du thrombus, il existe des facteurs fibrinolytiques, parmi lesquels on peut citer le plasminogène, qui par activation par l'activateur tissulaire du plasminogène (tissue plasminogenactivator, t-PA) est transformé en plasmine qui possède une activité fibrinolytique agissant sur les filaments de fibrine insolubles et permet la dissolution des caillots.

Dans le but de diminuer le caractère thrombogène des matériaux implantables, les recherches se sont orientées vers le contrôle de l'adsorption initiale des protéines sur le matériau utilisé. Deux grands axes de recherche ont été principalement développés (1) : - La prévention de l'adsorption des protéines.

La prévention de l'adsorption des protéines est rendue difficile par le fait que les protéines présentent une activité de surface élevée en raison de leur nature amphiphile et de leur poids moléculaire généralement élevé.

A titre d'exemple d'essais explorant cette voie, on peut citer les travaux visant à diminuer cette adsorption par greffage de polymères hydrophiles à la surface du matériau. L'oxyde de polyéthylène (PEO) fait partie de ces polymères. Il a été démontré que la présence de ces greffons diminuait l'adsorption des protéines de

façon significative. Le PEO éloignerait les protéines de la surface par un phénomène d'exclusion stérique (2) ou bien les molécules d'eau limiteraient l'accès aux greffons (3,4).

D'autres polymères, tels que les dextranes, ont été testés et ont fourni des résultats similaires (5).

Il a également été démontré que des couches de phospholipides pouvaient minimiser l'adsorption des protéines. En effet, les phospholipides sont les principaux composants des membranes cellulaires et celles-ci ne présentent pas d'adsorption non spécifique.

Il faut cependant souligner qu'à l'heure actuelle aucune surface capable de prévenir totalement l'adsorption non-spécifique des protéines n'est connue.

- La promotion d'une adsorption sélective des protéines :
La promotion d'une adsorption sélective des protéines consiste à modifier les surfaces de façon à ce qu'elles adsorbent sélectivement des protéines présentant une activité biologique favorable à la diminution du caractère thrombogène de la surface. Afin de favoriser la bio-compatibilité d'un matériau, il a été envisagé de modifier ses propriétés de surface, notamment en les rendant antiadhésives, anticoagulantes directes ou indirectes ou encore fibrinolytiques.

- Surface à activité antiadhésive
L'albumine, du fait de ses propriétés antiadhésives vis-à-vis des cellules (6), est utilisée pour rendre la surface de biomatériaux antiadhésive.

- Surface à activité anticoagulante * Action directe
Une surface anticoagulante peut notamment être obtenue par blocage du processus de coagulation en fixant à sa surface des substances biologiques anticoagulantes, telles que l'héparine ou l'hirudine.

L'héparine peut être fixée sur une surface par l'intermédiaire de liaisons covalentes ou ioniques. L'héparine présente une grande affinité pour l'antithrombine III. protéine plasmatique, qui constitue le principal inhibiteur physiologique de la thrombine. Des surfaces héparinisées présentent donc des propriétés anticoagulantes (7).

L'hirudine, inhibiteur direct de la thrombine, a également été utilisé

afin de rendre une surface anticoagulante.

* Action indirecte
Des essais ont également été conduits par greffage de peptides comprenant la séquence Phénylalanine-Proline-Arginine (FPR) qui est capable de se fixer au site actif de la thrombine. Le matériau devrait donc avoir une activité antithrombique (1).

Surface à activité fibrinolytique
Pour obtenir une surface à activité fibrinolytique, il a été proposé de développer une surface adsorbant préférentiellement le plasminogène et l'activateur tissulaire du plasminogène (tissue plasminogen-activator, t-PA) ; La conversion du plasminogène en plasmine entraîne la dissolution du caillot tant qu'il se présente dans des proportions microscopiques et qu'il est encore inoffensif.

Il est décrit dans la littérature des matériaux conçus pour fixer préférentiellement la plasmine ou son zymogène le plasminogène.

Woodhouse et Brash, ont introduit des groupes sulfonate ou des groupes sulfonamide lysinés afin d'augmenter la capacité de liaison du plasminogène sur la silice (8) et sur les polyuréthannes (9) . Selon ces auteurs, l'affinité du plasminogène est plus importante sur la silice lysinée que sur la silice standard ou sulfonatée en milieu tamponné. Il ressort d'une autre publication (10), que le polyuréthanne couplé par du BDDS (acide 4,4'-diaamino 2,2'-biphényl-disulphonique) et contenant une grande proportion de lysine (BBDS-1.4-LYS) présente une affinité de liaison avec le plasminogène légèrement augmentée par rapport à son précurseur sulfonaté.

Selon Marconi et al. (11), la capacité d'adsorption du plasminogène est plus grande pour le polyuréthanne carboxylé (PEUA) ou possédant des groupes amino libres (PEUTEPA) que pour le polyuréthanne neutre (PEU) ou le polyuréthanne carboxylé et amidé par de l'acide s-aminocaproïque (PEUCAP). La quantité de plasminogène adsorbé est favorisée par le caractère hydrophile du polymère. De plus, les polyuréthannes contenant des groupements lysine superficiels semblent capables de lier plus de plasminogène.

Selon Warkentin (12), une surface de carboxyméthyldextrane présente une faible capacité de liaison avec le plasminogène. Cependant, une fois que cette surface est modifiée par de la L-cystéine-L-lysine, la capacité de liaison avec le plasminogène est augmentée de façon spectaculaire.

Fowers et Kopecek (13) confirment également qu'une surface de silice lysinée présente une plus grande affinité pour le plasminogène que des surfaces sulfonatées ou sulfonatées et lysinées.

Plus récemment, McClung et al. (14) ont démontré qu'une surface comportant de nombreux résidus lysines dans lesquels les groupements s-amino sont libres, est capable de fixer une quantité substantielle de plasminogène après contact avec du plasma.

Concernant l'activation du plasminogène en plasmine, Brash et al. considèrent que la silice, modifiée ou non par des groupements sulfonate ou lysine, n'induit pas la formation d'une molécule "plasmin-like" à partir du plasminogène adsorbé (15). On considère qu'une activité "plasmin-like" correspond à l'activité enzymatique développée par le plasminogène adsorbé après modification de sa conformation et sans perte de sa forme monocaténaire. Mais ils soulignent une plus forte activité plasmine associée à la surface lysinée comparativement au matériau sulfonaté. Cependant, cette activité reste inférieure à celle de la plasmine libre. Ils montrent également que du plasminogène fixé sur une surface de polyuréthanne est capable de se convertir en plasmine en présence de t-PA et son activité augmente avec une densité croissante en lysine (14).

Il ressort de ce qui précède que les études pour obtenir un matériau présentant une surface fibrinolytique se sont surtout orientées vers la fixation favorisée de plasminogène à la surface dudit matériau préalablement modifiée chimiquement, particulièrement par l'adjonction de résidus lysine qui apparaissent comme favorisant la fixation du plasminogène. Il ressort également que le plasminogène ainsi fixé à la surface du matériau a conservé sa capacité à s'activer en plasmine et donc à pouvoir dégrader la fibrine.

Il n'en demeure pas moins que si la voie des surfaces fibrinolytiques semble d'un grand intérêt. leur préparation apparaît souvent comme nécessitant des réactions chimiques qui peuvent s'avérer longues, difficiles à mettre en #uvre et à contrôler. De plus, la répartition des fonctions fibrinolytiques peut s'avérer être inhomogène lorsque le matériau présente des formes compliquées.

Les Inventeurs ont mis au point un procédé de préparation d'un matériau implantable dans l'organisme, à activité fibrinolytique, facile à mettre en #uvre, peu coûteux et spécifique. Ce procédé vise à recouvrir la surface d'un matériau implantable de fibrinogène oxydé électrochimiquement ce qui permet d'augmenter son affinité pour les constituants du système fibrinolytique, notamment pour le

plasminogène ayant conservé sa capacité à s'activer en plasmine, éventuellement sous l'effet d'un activateur, éventuellement du t-PA, et ainsi de dégrader la fibrine responsable de la formation du caillot sanguin. Le procédé selon l'Invention permet d'induire la lyse des caillots sanguins en formation à la surface du matériau. Il en résulte une exaltation locale du processus fibrinolytique.

Ainsi l'Invention a pour objet un procédé de préparation d'un matériau conducteur d'électricité à activité fibrinolytique, implantable dans l'organisme, caractérisé en ce que : - dans une première étape on met en contact ledit matériau conducteur d'électricité et une solution A comprenant au moins du fibrinogène pendant un temps suffisant à l'adsorption spontanée du fibrinogène sur ledit matériau ; - dans une deuxième étape, on soumet ledit matériau recouvert de fibrinogène adsorbé à un traitement électrochimique dans une solution d'électrolyse B par application d'un potentiel électrique positif audit matériau utilisé comme électrode, par rapport à une électrode de référence, pendant un temps suffisant pour oxyder le fibrinogène.

Selon un mode de mise en #uvre de l'Invention, le matériau conducteur d'électricité est soit un matériau intrinsèquement conducteur d'électricité comme par exemple le carbone, soit un matériau non-conducteur d'électricité préalablement recouvert dudit matériau intrinsèquement conducteur d'électricité.

Le carbone est un matériau couramment utilisé comme implant du fait de sa bonne tolérance et du fait que sa corrosion chimique, son abrasion mécanique ou ses interactions avec l'organisme, ne génère pas de toxicité notoire.

Comme biomatériau, le carbone est notamment utilisable sous forme homogène ou sous forme composite carbone/carbone, comme valvule cardiaque ou implant osseux ou odontologique (dents sur pivot). à l'état de filets (péritoine artificiel) ou de tresses cylindriques (stents).

Ainsi selon l'Invention, le matériau intrinsèquement conducteur d'électricité est préférentiellement du carbone, particulièrement sous la forme de barreaux de graphite ou de carbone pyrolytique.

Selon un autre mode de mise en #uvre de l'Invention, la solution A peut être une solution physiologique telle que le plasma ou une solution aqueuse saline tamponnée à pH compris entre 5,5 et 9,5 et de force ionique proche de celle du plasma, comme par exemple une solution de Tris-HCl ou du tampon phosphate.

Selon une disposition particulière de l'Invention, le fibrinogène est à une concentration comprise entre 8.10-8M et 8.10-2M et de préférence comprise entre 8.10-8M et 8.10-5 M dans la solution A et très préférentiellement à la concentration plasmatique, soit 8,82.10-6M.

Selon une autre disposition particulière de l'Invention, la solution A est à un pH de préférence au voisinage du pH physiologique (pH = 7,4).

Selon un mode particulier de mise en #uvre de l'Invention, la solution A est une solution composée de tampon Tris-HCl à une concentration comprise entre 0,10 M et 0,20 M et de préférence égale à 0,15 M.

Selon une disposition avantageuse de mise en #uvre de l'Invention, la solution A peut, en outre, comprendre un ou plusieurs autres actifs biologiques impliqués dans les processus de fibrinolyse comme par exemple le plasminogène, la plasmine, l'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA)...

Selon une autre disposition de l'Invention, la solution A est du plasma, particulièrement du plasma humain.

Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux de l'Invention, le matériau conducteur d'électricité et la solution A sont mis en contact pendant un temps suffisant à l'adsorption spontanée du fibrinogène sur le matériau c'est à dire pendant au moins 5 secondes et préférentiellement entre 10 minutes et 1 heure.

Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux de l'Invention, ledit matériau recouvert de fibrinogène adsorbé est soumis à un traitement électrochimique par application d'un potentiel électrique audit matériau utilisé comme électrode, par rapport à une électrode de référence, dans une solution d'électrolyse B, identique à la solution aqueuse saline tamponnée A, sans fibrinogène.

Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux de l'Invention, l'électrode de référence peut être une électrode argent/chlorure d'argent (Ag/AgCI) ou encore une électrode au calomel saturé. De préférence l'électrode de référence est une électrode au calomel saturé.

Le potentiel électrique applicable audit matériau est fonction du potentiel fixé par l'électrode de référence. Dans le cas où l'électrode de référence est une électrode au calomel saturé, son potentiel est de +0,24 V par rapport à l'électrode normale à hydrogène (ENH).

Avantageusement, le potentiel électrique est un potentiel constant,

positif/oxydant, ayant une intensité comprise entre +0,5V et +6V, de préférence entre +lVet+4V.

Selon un mode de mise en #uvre de l'Invention, le temps suffisant pour oxyder le fibrinogène est d'au moins 10-3 secondes, et préférentiellement de 60 secondes.

L'Invention a également pour objet un matériau conducteur d'électricité à activité fibrinolytique implantable dans l'organisme, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé précédemment décrit. Ledit matériau peut être utilisé pour la fabrication de tout produit implantable dans l'organisme, comme par exemple pour la fabrication de valvules cardiaques ou d'implants osseux ou odontologiques (dents sur pivot), ou de filets (péritoine artificiel) ou de tresses cylindriques (stents).

Ainsi l'Invention a également pour objet une valvule cardiaque ou un implant osseux ou odontologique ou un filet ou une tresse, éventuellement cylindrique fabriqué dans le matériau selon l'Invention.

Il est bien entendu que le procédé selon l'Invention s'applique aussi bien au matériau implantable sous sa forme brute, c'est-à-dire avant sa transformation en objet implantable, qu'audit objet constitué du matériau transformé sous sa forme implantable.

Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions et avantages qui ressortiront des exemples qui sont illustratifs de l'Invention et ne la limitent aucunement, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : - la Figure 1 représente l'activité enzymatique de la plasmine mesurée 100 minutes après activation du plasminogène adsorbé sur graphite modifié par une couche de fibrinogène oxydé à différents potentiels et en présence de t-PA.

- la Figure 2 représente le dosage ELISA du fibrinogène/fibrine et des fibrinopeptides A (FPA) adsorbés sur graphite après différent potentiels appliqués.

- la Figure 3 représente : - en A, le dosage ELISA du fibrinogène adsorbé en sous-couche sur graphite et à différents potentiels ; - en B le dosage ELISA du plasminogène adsorbé sur les surfaces précédentes.

Exemple 1 : Matériels et Méthodes
Les solutions sont préparées avec de l'eau ultra-pure obtenue avec le système Milli QS de chez Millipore (Bioblock, France).

1.1Tampon Tris-HCI
La solution Tris (hydroxyméthyl) aminoéthane (Tris) (Prolabo) 0,15
M utilisée est tamponnée à pH 7,4 avec du HC1 37 %.

1. 2 Protéines
La solution mère de fibrinogène humain purifié à 8,82 10-6M (concentration plasmatique) est obtenue après dissolution de la poudre lyophilisée (Hyphen Biomed, France) dans le tampon Tris-HCI pH 7,4. Ce fibrinogène est certifié libre de plasminogène.

1.3 Substrat chromogène
L'activité amidolytique de la plasmine obtenue après activation du plasminogène est mesurée à 405 nm en présence du substrat chromogène spécifique S- 2403 (pyroGlu-Phe-Lys p-nitroaniline, HC1) (Chromogenix, France). La solution mère à 4,45 mM est préparée par dissolution de la poudre lyophilisée dans de l'eau ultrapure. Cette concentration est contrôlée par spectrophotométrie UV à 316 nm (s = 1,27
104 1. mol-1.cm-1).

1.4 Solution pour les tests ELISA
Ce test utilise un tampon TBS (Tris Buffer Saline) 0,05 M, NaCI 0,15 M à pH 7.4.

La solution chromogène est composée de diéthanolamine 10%, de MgCl2 0,5 mM et de paranitrophénylphosphate (PNPP) 2 mg/ml.

' Dosage du fibrinogène
La solution de saturation de pH 7,4 est préparée à partir de TBS additionné de lait écrémé en poudre (3% poids/volume) et de Tween 20 (0,3% volume/volume).

L'anticorps primaire de lapin anti-fibrinogène humain provient de chez DAKO. Il est dilué pour le test au 1/5000ème dans la solution de saturation.

L'anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à de la phosphatase alcaline provient de chez SIGMA. Il est dilué au 1/20000ème dans la solution de saturation.

# Dosage des fibrinopeptides A
La solution de saturation de pH 7,4 est préparée à partir de TBS additionné de lait écrémé en poudre (3% poids/volume) et de Tween 20 (0,3% volume/volume).

L'anticorps primaire de lapin anti-FPA humain (Hyphen Biomed, France) est dilué pour le test au 1/5000ème dans la solution de saturation.

L'anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à de la phosphatase alcaline (SIGMA) est dilué au 1 /20000ème dans la solution de saturation.

' Dosage du plasminogène
La solution de saturation est constituée de TBS pH 7,4 et d'albumine bovine à la concentration finale 4 mg/ml.

L'anticorps primaire de chèvre anti-plasminogène humain, dilué au 1/3000ème dans la solution de saturation (16).

L'anticorps secondaire de singe anti-IgG de chèvre conjugué à la phosphatase alcaline (SIGMA) est dilué au 1/10000ème dans la solution de saturation.

1. 5 Solutions pour électrophorèse en mode SDS-PAGE # Tampon de résolution : Tris-HCl 1,5 M et SDS 0,4 % (p/v) à pH 8,8 # Tampon de concentration (ou tampon supérieur) : Tris-HCl 0,5 M et SDS 0,4 % (p/v). à pH 8,3 -Tampon de migration : Tris-HCl 0,1 M, SDS 0,1 % (p/v) et glycine 0,15 M à pH .Bleu de charge (ou solution de solubilisation) : Tris-HCl 0,5 M de pH 6,8, SDS 4,3 % (p/v), glycérol 22 % (p/v), bleu de bromophénol 0,0025 % et 200 ul/ml de (3-mercaptoéthanol.

1. 6 Solutions pour le Western-blot ' Tampon de saturation : pH 7,4 préparée à partir de TBS additionné de lait écrémé en poudre (3% poids/volume) et de Tween 20 (0.1% volume/volume).

' Tampon de transfert : Tris-HCl 25 mM de pH 8,3, glycine à 192 mM et méthanol 20 %.

1.7 Graphite

Le graphite utilisé provient de la société Le Carbone Lorraine, Genneviliers, France.

1.8 Modification du graphite par le fibrinogène
L'adsorption du fibrinogène est réalisée par immersion du barreau dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 150 (il de la solution de fibrinogène 8,82 M pendant 10 minutes. La surface ainsi modifiée est de 85 5 mm2.

1.9 Traitement électrochimique
Les surfaces de graphite, modifiées ou non par adsorption de fibrinogène, sont traitées, sauf indication contraire, par application d'un potentiel constant compris entre-6 et +6 V/ECS pendant 60 s dans le tampon Tris pH 7,4 et mesurés, au moyen d'un potentiostat EG&G, modèle 283A (Princeton Applied Research) connecté à un ordinateur, par rapport à l'électrode de référence au calomel saturé. Le traitement est contrôlé par le tracé de la courbe du courant en fonction du temps obtenue par le logiciel de traitement de données ECHEM (Princeton Applied Research).

1.10 Immobilisation du plasminogène
Le plasminogène du plasma est adsorbé avec d'autres protéines par immersion du barreau de graphite modifié par le fibrinogène oxydé pendant 3 heures dans un Eppendorf de 1,5 ml contenant 150 l de plasma humain.

Après l'immobilisation, un rinçage est opéré dans le tampon Tris pH 7,4.

1.11 Mesure de l'activité enzymatique :
Les activités enzymatiques se produisent à la surface du matériau qui supporte les protéines. Pour les suivre, il a été nécessaire de réaliser un dispositif permettant des mesures en phase hétérogène. Ainsi, le matériau est fixé à un dispositif tournant EDI 101relié à un moteur CTV 101(Radiometer S.A, France) dont la vitesse est fixée à 500 tours par minute. L'activité catalytique de surface de la plasmine adsorbée est déterminée en présence de substrat spécifique S 2403 (CHROMOGENIX). en suivant par spectrophotométrie (spectrophotomètres UVIKON 941) à 405 nm la vitesse d'hydrolyse du substrat (variation de l'absorbance #A en fonction du temps) à température constante ( 0,5 C) fixée par un cryothermostat à fluide circulant LAUDA RM6.

1.12 Dosage par ELISA du fibrinogènes immobilisé sur le graphite :

La quantité de fibrinogène adsorbé est dosée en utilisant un anticorps primaire dirigé contre le fibrinogène. Un anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline permet de quantifier la réaction par lecture directe de la plaque
ELISA (Nunc Immunosorbent) à 405 nm après ajout de la solution de révélation.

1.12.1 Réalisation de la gamme étalon
L'étalonnage est réalisé par dépôt, dans chacun des puits de la plaque, d'une quantité connue de fibrinogène de 1400 ng/ml à 35 ng/ml contenu dans 200 l L'adsorption sur les parois des puits est réalisée pendant 30 minutes à température ambiante. Des puits témoins, sans fibrinogène, sont disposés en bord et milieu de plaque pour tenir compte des contaminations éventuelles. Toutes les mesures sont triplées.

1. 12.2 Rinçage et blocage des sites actifs libres des puits et des barreaux de graphite
Les puits de la gamme étalon sont rincés deux fois pendant 3 minutes avec la solution de saturation. Tous les puits, ainsi que les tiges de graphite, sont ensuite saturés pendant 20 minutes avec la solution de saturation. Deux rinçages immédiats sont alors réalisés avec la même solution.

1.12.3 Incubation avec l'anticorps primaire
200 l de la solution d'anticorps primaire sont déposés dans chacun des puits. Les tiges de graphite sont déposées dans leur puits respectif et la plaque est alors incubée pendant 45 minutes à 37 C.

1.12.4 Rinçages
Les puits et les surfaces sont rincés 3 fois pendant 4 minutes avec la solution de saturation.

1.12.5 Incubation avec l'anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline
200 l de l'anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline sont ajoutés dans chacun des puits. Les tiges de graphite sont à nouveau déposées dans leurs puits respectifs et la plaque est incubée pendant 45 minutes à 37 C.

1.12.6 Rinçages
Les puits et les surfaces sont rincés avec la solution de saturation, une première fois pendant 4 minutes, et deux fois par simple immersion. Deux

rinçages avec la solution de TBS sont ensuite réalisés.

1.12.7 Révélation du test
200 lde la solution chromogène sont versés dans chaque puits. Les surfaces de graphite sont à nouveau introduites dans leurs puits respectifs et la plaque est incubée à 37 C pendant environ 20 minutes (temps nécessaire pour que les puits les moins concentrés en fibrinogène virent au jaune). Toutes les absorbances sont lues sur un lecteur de plaque à 405 nm, les barreaux étant retirés au moment de la lecture.

Pour tracer la courbe de calibration, on retranche la moyenne des six témoins de la moyenne des trois points de la gamme étalon.

Exemple 2 : Résultats :
2.1. Optimisation des propriétés fibrinolytiques du matériau : Influence du potentiel électrique appliqué à la sous-couche de fibrinogène sur l'adsorption et/ou l'activation du plasminogène
L'activité enzymatique produite par l'activation du plasminogène adsorbé est suivie en présence de t-PA après application de potentiels constants et croissants à la sous-couche de fibrinogène, selon la méthode spectrophotométrique précédemment décrite. Le plasminogène provient d'un contact prolongé (3 heures d'adsorption) du matériau traité avec du plasma.

En rapportant les activités mesurées à 100 minutes, la Figure 1 montre que l'application de potentiels inférieurs à +0,5 V au fibrinogène déposé ne déclenche aucune activité enzymatique à la surface. En revanche, cette dernière augmente brusquement au-delà de ce seuil pour passer par une valeur maximale au voisinage de 2 V puis décroît jusqu'à atteindre un plateau constant jusque + 6 V.

L'importance de la sous-couche de fibrinogène a été démontrée en suivant l'effet du potentiel appliqué au matériau avant adsorption de la protéine. Les résultats indiquent l'existence d'un effet mais l'augmentation de l'activité enzymatique mesurée n'est que de 10 % comparée à celle observée en présence de la sous-couche de fibrinogène. Elle apparaît aussi à +2 V.

La sous-couche de fibrinogène oxydé est principalement responsable de l'exaltation de l'activité fibrinolytique.

Il a été examiné si l'application d'un potentiel au fibrinogène est susceptible d'entraîner une modification de l'agrégation du fibrinogène, ou la formation de fibrine. Pour cela, la quantité de fibrinogène/fibrine ainsi que la quantité

de fibrinopeptides A (FPA) adsorbés après application de différents potentiels oxydants ont été dosées en parallèle par ELISA. L'existence d'une différence de quantité indiquerait la perte de FPA et donc la formation d'un réseau de fibrine.

Le dosage du fibrinogène indique que l'application d'un potentiel oxydant induit le relargage partiel de fibrinogène. Les résultats exposés à la Figure 2 démontrent que la diminution de FPA avant et après application d'un potentiel correspond à la diminution de la quantité de fibrinogène/fibrine dosée dans les mêmes conditions.

Il n'y a donc pas formation d'un réseau de fibrine mais uniquement modification de l'état du fibrinogène adsorbé.

Ainsi le traitement électrochimique du matériau après adsorption spontanée de fibrinogène conduit à l'obtention d'un état de surface plus favorable à l'adsorption et/ou à l'activation du plasminogène.

Les proportions de fibrinogène et de plasminogène adsorbés ont ensuite été comparées par ELISA à l'activité enzymatique observée (Figure 3).

Aux potentiels inférieurs à 2 V, la quantité de fibrinogène adsorbé est constante. Au-delà de cette valeur, elle diminue de plus de 50 % (Figure 3-A). En parallèle, c'est aussi au voisinage de 2 V que la quantité de plasminogène adsorbé augmente (Figure 3-B). C'est aussi à ce seuil que l'activité enzymatique est maximale (Figure 1). Ainsi, même si la quantité de plasminogène adsorbé augmente avec le potentiel, l'activité amidolytique est plus faible au-delà de 2 V ce qui signifie qu'une certaine quantité de plasminogène est dégradée.

Les propriétés fibrinolytiques optimales sont observées avec un matériau modifié par du fibrinogène oxydé à un potentiel spécifique de + 2 V/ECS.

2.3. Identification des principales protéines plasmatiques adsorbées sur la surface de graphite modifié.

L'identification de certaines des protéines présentes sur la surface du matériau modifié après immersion dans du plasma est réalisée par électrophorèse (gels SDS-PAGE) et Western-blot sur la solution obtenue après immersion de la surface dans le tampon de solubilisation réducteur. En effet, l'affinité ou non de la surface optimisée pour certaines protéines constitue un facteur déterminant pour la thrombogénicité du matériau en contact avec le sang.

La présence de fibrinogène (concentration plasmatique de 3 g/1) sur

la surface est confirmée par la présence de ses trois bandes caractéristiques. Le Westem-blot indique l'absence de vitronectine (concentration plasmatique de 350 mg/1) sur la surface. De même pour la fibronectine (concentration plasmatique de 300 mg/1) où seules des traces sont détectées par l'anticorps.

Ceci constitue un avantage supplémentaire du procédé selon l'Invention puisque ces deux glycoprotéines présentent des sites de fixation spécifiques aux plaquettes. Leur absence est susceptible d'entraîner un abaissement de la thrombogénicité de la surface en diminuant l'adhésion plaquettaire.

Les gels d'électrophorèse révèlent une forte concentration d'albumine (concentration plasmatique, 40 g/1).

La présence de cette protéine est aussi de nature à favoriser l'adsorption de plasminogène par l'intermédiaire de ses sites de fixation à la lysine (Lysine Binding Sites : LBS), les autres sites étant occupés par l'albumine.

Par ailleurs, l'albumine passive la surface en limitant l'adhésion et l'activation plaquettaire.

Des électrophorèses ont également été réalisées après rinçage du matériau modifié dans une solution de chlorure de sodium concentré, jusqu'à 0,15 M..

Après rinçage, les protéines identifiées sont les mêmes mais plus diluées. Ceci indique que les protéines sont adsorbées de façon irréversible sur la surface du matériau modifié.

Les protéines identifiées sur la surface en contact avec le plasma contribuent à diminuer la thrombogénicité du matériau optimal.

Références (1) Brash J. L. (2000): J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Il(11), 1135-1146.

(2) Jeon S.L, Lee H., Kopecek J., Andrade J. D. and de Gennes P.G. (1991) : J. Colloid Interface Sci., 142,149.

(3) Wang R. L.C., Kreuzer H. J. and Grunze M. (1997) : J. Phys. Chem. B, 101, 9767-9773.

(4) Harder P., Grunze M., Dahint R., Whitesides G.M. and Laibinis P. E. (1998) : J.

Chem. Phys. B, 102, 426-436.

(5) Osterberg E., Bergstrom K., Holmberg K., Schuman T. P., Riggs J.A., Bums N. L., van Alstine J.M. and Harris J.M. (1995) : J. Biomed. Mater. Res., 29,741-747..

(6) Skaira G.A, Kinlough-Rathbone R. L., Perry D. W., Rubens F. D. and Brash J.L.

(1997) : J. Biomed. Mater. Res., 34,427-438.

(7) Pasche B., Elgue G., Olsson P., Riesenfeld J. and Rasmuson A. (1991) : Artif.

Organs, 15,481-491.

(8) Woodhouse K. A. and Brash J. L. (1994): J. Colloid Interface Sci., 164, 40-47.

(9) Woodhouse K. A. and Brash J.L. (1992) : Biomaterials, 13, 1103-1108.

(10) Woodhouse K.A., Wojciechowski P. W., Santerre J. P. and Brash J.L. (1992) : J.

Colloid Interface Sci., 152, 60-69.

(11) Marconi W., Plozzi A. and Romoli D. (1996): J. Biomater. Sci. Polymer Edn, 8, 237-249.

(12) Warkentin P.H. (1998) : Biomaterials, 19,1753-1761.

(13) Fowers K. D. and Kopecek J. (1997):Biointerfaces, 9, 315-330.

(14) McClung W.G.,Clapper D. L., Hu S. -P and Brash J.L. (2000) : J. Biomed. Mater.

Res., 49,409-414.

(15) Woodhouse K. A., Weitz J.I. and Brash J.L. (1994) : J. Biomed. Mater. Res., 28, 407-415.

(16) Soulat T., Loyau S., Baudouin V., Maisonneuve L., Hurtaud-Roux M-F., Schlegel N., Loirat C., Anglès-Cano E. (2000). Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 20, 575-584.

Claims

REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'un matériau conducteur d'électricité à activité fibrinolytique implantable dans l'organisme, caractérisé en ce que : - dans une première étape on met en contact un matériau conducteur d'électricité et une solution A comprenant au moins du fibrinogène pendant un temps suffisant à l'adsorption spontanée du fibrinogène sur le matériau ; - dans une deuxième étape, on soumet ledit matériau recouvert de fibrinogène adsorbé à un traitement électrochimique dans une solution d'électrolyse B par application d'un potentiel électrique positif audit matériau utilisé comme électrode, par rapport à une électrode de référence, pendant un temps suffisant pour oxyder le fibrinogène.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériau conducteur d'électricité est soit un matériau intrinsèquement conducteur d'électricité soit un matériau non-conducteur d'électricité préalablement recouvert d'un matériau intrinsèquement conducteur d'électricité.
3) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le matériau intrinsèquement conducteur d'électricité est du carbone.
4) Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le carbone est du graphite ou du carbone pyrolytique.
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution A est une solution physiologique telle que le plasma, ou une solution aqueuse saline tamponnée à pH compris entre 5,5 et 9,5 et de force ionique proche de celle du plasma.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution A est à un pH au voisinage du pH physiologique (pH=7,4).
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution A est une solution composée de tampon Tris-HCl à une concentration comprise entre 0,10 M et 0,20 M et de préférence égale à 0,15 M.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le fibrinogène est à une concentration comprise entre 8.10-8M et

<Desc/Clms Page number 17>

8.10-2M et de préférence comprise entre 8.10-gM et 8.10-5 M dans la solution A et très préférentiellement à la concentration plasmatique, soit 8,82.10-6M.
9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution A peut, en outre, comprendre un ou plusieurs autres actifs biologiques impliqués dans les processus de fibrinolyse.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les autres actifs biologiques sont choisis parmi le plasminogène, la plasmine, l'activateur tissulaire du plasminogène.
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans la solution A est du plasma, particulièrement du plasma humain.
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le matériau conducteur d'électricité et la solution A sont en contact pendant au moins 5 secondes et préférentiellement entre 10 minutes et 1 heure.
13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution d'électrolyse B est identique à la solution aqueuse saline tamponnée A sans fibrinogène.
14) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'électrode de référence peut être une électrode argent/chlorure d'argent (Ag/AgCl) ou encore une électrode au calomel saturé, de préférence une électrode au calomel saturé.
15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le potentiel électrique applicable audit matériau est fonction du potentiel fixé par l'électrode de référence.
16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que lorsque l'électrode de référence est une électrode au calomel saturé, son potentiel est de +0,24 V par rapport à l'électrode normale à hydrogène (ENH).
17) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le temps suffisant pour oxyder le fibrinogène est d'au moins 10-3 secondes, et préférentiellement de 60 secondes.
18) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le potentiel électrique appliqué est un potentiel constant, positif/oxydant, ayant une intensité comprise entre +0,5V et +6V, de préférence entre

<Desc/Clms Page number 18>

+lVet+4V.
19) Matériau conducteur d'électricité à activité fibrinolytique implantable dans l'organisme, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
20) Utilisation du matériau selon la revendication 19 pour la fabrication de produits implantables dans l'organisme.
21) Valvule cardiaque ou implant osseux ou odontologique ou filet ou tresse, éventuellement cylindrique, fabriqué dans le matériau selon la revendication 19.