FR2832508A1 - Procede d'obtention d'une phase de capture et d'une phase de detection d'un materiel biologique cible et utilisation dans des tests elisa - Google Patents

Abstract

Procédé d'obtention d'une phase de capture d'un matériel biologique cible, comprenant une protéine d'intérêt modifiée, capable de se lier audit matériel biologique cible et immobilisée sur une phase d'immobilisation selon lequel :on dispose d'au moins deux séquences peptidiques différentes comprenant la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, et une succession d'au moins six résidus lysine et une succession d'au moins six résidus histidine à leurs extrémités N- etC-terminales, on immobilise chacune des deux séquences peptidiques obtenues sur la phase d'immobilisation,on détermine l'efficacité du couplage entre chacune des deux séquences et la phase d'immobilisation,on choisit comme phase de capture, la séquence peptidique la plus efficacement couplée à la phase d'immobilisation, etprocédé d'obtention d'une phase de détection d'un matériel biologique cible, comprenant une protéine d'intérêt modifiée, capable de se lier audit matériel biologique cible et couplée à un haptène, selon lequel :on dispose d'au moins deux séquences peptidiques différentes, comprenant la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, et une succession d'au moins six résidus lysine et une succession d'au moins six résidus histidine à leurs extrémités N- etC-terminales,on couple chacune des deux séquences peptidiques obtenues à l'haptène,on détermine l'efficacité du couplage de chacune des deux séquences à l'haptène,on choisit comme phase de détection, la séquence peptidique la plus efficacement couplée à l'haptène,et utilisation des phases de capture et de détection obtenues pour la détection d'un matériel biologique cible, en ELISA.

Description

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L'invention concerne des phases de capture et de détection d'un matériel biologique cible à détecter dans un échantillon biologique, et leur mise en oeuvre dans un test ELISA.

Les phases de capture et de détection selon l'invention comportent une protéine modifiée pour optimiser cette technique de détection, en en augmentant la spécificité et la sensibilité.

Une protéine modifiée selon l'invention est une protéine, dite d'intérêt, c'est-à-dire une protéine, ou une partie de cette protéine, qui va interagir avec le matériel biologique cible que l'on cherche à détecter, isoler, quantifier, en diagnostic notamment. La modification consiste en un apport dans ladite séquence, par intercalation et/ou ajout, d'au moins deux successions de résidus d'acides aminés : une succession d'au moins six résidus histidine et une succession d'au moins six résidus histidine, l'une à l'extrémité N-terminale et l'autre à l'extrémité C-terminale. Dans la suite de la description, on utilisera indifféremment les termes succession et tag pour représenter un groupe de résidus d'acides aminés.

Selon le document WO-A-98/59241, les auteurs de la présente invention ont démontré que la modification de la séquence peptidique de la protéine p24 de capside du VIH-1, par insertion d'un tag de six résidus lysine, permet d'augmenter considérablement le rendement de couplage de la protéine sur le copolymère AMVE67. On a ainsi pu atteindre une immobilisation de 50 molécules de protéine modifiée par chaîne de copolymère.

Cependant, dans les techniques de détection comme ELISA, il est essentiel que les phases de capture et de détection conservent l'activité biologique de la protéine immobilisée ou couplée, après purification et immobilisation ou couplage.

Aussi, l'enjeu de l'invention a résidé dans l'obtention d'une phase de capture et d'une phase de détection comprenant chacune une protéine modifiée qui possède au moins toutes les propriétés biologiques de la protéine native, pour lesquelles la protéine modifiée est utilisée, en particulier en détection.

Ainsi, les premiers objets de l'invention sont les suivants :

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un procédé d'obtention d'une phase de capture d'un matériel biologique cible, comprenant une protéine d'intérêt modifiée, capable de se lier spécifiquement, directement ou indirectement, audit matériel biologique cible et immobilisée sur une phase d'immobilisation comportant des groupements réactifs, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : on dispose d'au moins deux séquences peptidiques différentes, comprenant la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, et l'une comprenant une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité C-terminale, l'autre comprenant une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité C-terminale, on immobilise chacune des deux séquences peptidiques obtenues sur la phase d'immobilisation, par réaction covalente entre les groupements amine primaire des séquences peptidiques et les groupements réactifs du support, on détermine l'efficacité du couplage entre chacune des deux séquences et la phase d'immobilisation, on choisit comme phase de capture, la séquence peptidique la plus efficacement couplée à la phase d'immobilisation ; un procédé d'obtention d'une phase de détection d'un matériel biologique cible, comprenant une protéine d'intérêt modifiée, capable de se lier spécifiquement, directement ou indirectement, audit matériel biologique cible et couplée à un haptène, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : on dispose d'au moins deux séquences peptidiques différentes, comprenant la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, l'une comprenant une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité C-terminale, l'autre comprenant une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité C-terminale, on couple chacune des deux séquences peptidiques obtenues à l'haptène, on détermine l'efficacité du couplage de chacune des deux séquences à l'haptène,

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on choisit comme phase de détection, la séquence peptidique la plus efficacement couplée à l'haptène.

Avantageusement, les deux séquences peptidiques au moins comprennent une succession de six résidus lysine et/ou une succession de six résidus histidine ; de préférence encore, elles comprennent une succession de six résidus lysine et une succession de six résidus histidine.

Avant d'exposer les autres objets de l'invention et d'en décrire en détails les caractéristiques et avantages, une définition de certains termes employés dans la description et les revendications est ci-après donnée pour que l'invention et donc l'étendue de la protection soient clairement délimitées.

Une succession ou tag de résidus d'acides aminés est une courte séquence d'acides aminés qui est rapportée dans la séquence peptidique de la protéine native ou originale, en un lieu privilégié, pour permettre à cette succession ou tag d'être exposée de façon pertinente, tout en conservant, voire améliorant, les propriétés biologiques de la protéine native ou originale.

En particulier selon l'invention, la présentation du tag de résidus histidine doit être favorable par rapport à une affinité de ce tag pour des ions métalliques, tels qu'utilisés dans la technique de purification dite IMAC (chromatographie par affinité pour ions métalliques immobilisés), celle du tag de résidus lysine doit être favorable par rapport à sa fixation sur une phase d'immobilisation via une interaction covalente entre le tag et des fonctions réactives présentes sur ou dans ladite phase.

Par intercalation ou insertion d'un tag, on comprend que le tag est introduit à l'intérieur de la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, entre deux acides aminés. Par ajout d'un tag, on comprend que le tag, on entend que le tag est"rabouté"à la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, en l'extrémité N-ou C-terminale de ladite séquence.

En pratique, les protéines modifiées selon l'invention, comporteront souvent des acides aminés qui s'intercaleront entre les tags, et/ou entre les tags et la séquence peptidique de la protéine native ou originale, sans pour autant avoir d'incidence sur la spécificité des tags et sur l'activité biologique de la protéine.

Les résidus d'acides aminés appartenant à un tag selon l'invention sont choisis parmi les acides aminés naturels et les acides aminés chimiquement modifiés. La modification chimique apportée à l'acide aminé naturel doit préserver, voire développer, la spécificité du tag vis-à-vis de son

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rôle dans la fixation. A titre d'exemple, on peut citer le remplacement d'un acide aminé L, par l'acide aminé D correspondant et inversement ; une

modification de la chaîne latérale de l'acide aminé : dans le cas de la lysine, il peut s'agir d'une acétylation du groupe aminé de la chaîne latérale ; une modification des liaisons peptidiques du tag, telles que des liaisons carba, rétro, inverso, rétro-inverso, réduites, méthylène-oxy.

La phase d'immobilisation sur laquelle la fixation de la protéine modifiée est favorisée par l'intermédiaire du tag de résidus lysine peut être un polymère, articulaire ou linéaire, et notamment choisi parmi les homopolymères tels que la polylysin, la polytyrosine ; parmi les copolymères tels que les copolymères d'anhydride maléique, les copolymères de N-vinylpyrrolidone, les polysaccharides naturels ou synthétiques, les polynucléotides et les copolymères d'acides aminés comme les enzymes. Des polymères avantageux sont le copolymère N-vinyl-pyrrolidone 1 N-acryloxysuccinimide, le poly-6-aminoglucose, la peroxydase de raifort (HRP) et la phosphatase alcaline.

La phase d'immobilisation comporte des fonctions réactives qui vont interagir par covalence avec le tag lysine. Ces fonctions réactives sont avantageusement choisies parmi les fonctions ester, acide, halogénocarbonyle, sulfhydrile, disulfure, époxyde, halogénocarbonyle et aldéhyde.

La phase d'immobilisation peut être fixée, directement ou indirectement, sur un support solide, par adsorption passive ou par covalence.

Ce support solide peut se présenter sous toutes formes appropriées telles qu'une plaque, un cône, une bille, la bille étant éventuellement radioactive, fluorescente, magnétique et/ou conductrice, une barrette, un tube de verre, un puits, une feuille, une puce ou analogues. Le matériau du support est de préférence choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrèneméthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose, le verre, le silicium et leurs dérivés.

La phase d'immobilisation de la phase de capture est préférentiellement un polymère présentant, au moins en surface, des

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groupements réactionnels, et en particulier un copolymère d'anhydride maléique tels que ceux choisis parmi le poly (méthylvinyléther-anhydride maléique), le poly (éthylène- anhydride maléique), le poly (styrène- anhydride maléique) et le poly (N-vinylpyrrolidone- anhydride maléique). Comme les exemples le montreront, le poly (méthylvinyléther-anhydride maléique) est préféré.

Au cours de l'étape d'immobilisation, les groupements réactionnels du polymère ou de toute autre phase employée, vont interagir avec les groupements amine présents dans la séquence peptidique de la protéine modifiée, pour former une liaison covalente. Cette étape est avantageusement réalisée, dans un milieu permettant l'hydrolyse partielle, et non totale, des groupements réactifs de ladite phase d'immobilisation. Ces conditions apportent une faculté de contrôle de la teneur en groupements réactionnels de ladite phase. En effet, certains polymères disponibles dans le commerce comportent une teneur excessive en groupements réactionnels qui peut nuire à la régiosélectivité de l'interaction entre la protéine modifiée et la phase d'immobilisation.

Selon le procédé, on détermine l'efficacité du couplage par quantification des groupements amine primaires libres de la séquence peptidique immobilisée et des groupements amine primaires libres de la même séquence peptidique non immobilisée, et déduction des groupements amine ayant interagi avec la phase d'immobilisation. La quantification desdits

groupements est avantageusement réalisée par réaction desdits groupements avec la fluorescamine.

Comme les exemples le mettront en évidence, une phase de capture très sensible, et pouvant être mise en oeuvre dans un test ELISA, pour la détection d'anticorps anti-VIH-1, est obtenue avec une protéine d'intérêt qui est la protéine p24 de la capside du VIH-1, comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, et modifiée par apport dans la séquence peptidique, d'une succession de 6 résidus lysine à son extrémité N-terminale et d'une succession de 6 résidus histidine à son extrémité C-terminale.

Pour l'obtention d'une phase de détection selon l'invention, l'haptène est choisi parmi les hormones, les vitamines et les médicaments. Dans la principale application selon l'invention, à savoir la détection, l'haptène est de préférence la biotine.

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L'efficacité du couplage entre les séquences peptidiques et l'haptène est avantageusement effectuée par spectrométrie de masse.

Comme les exemples le mettront en évidence, une phase de détection très sensible, et pouvant être mise en oeuvre dans un test ELISA, pour la détection d'anticorps anti-VIH-1, particulier en combinaison avec une phase de capture décrite précédemment, est obtenue avec une protéine

d'intérêt qui est la protéine p24 de la capside du VIH-1, comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, et modifiée par apport dans la séquence peptidique d'une succession de 6 résidus histidiine à son extrémité N-terminale et une succession de 6 résidus lysine à son extrémité C-terminale.

Un autre objet de l'invention est un kit pour la détection par ELISA d'un matériel biologique cible, comprenant une phase de capture et une phase de détection telles qu'obtenues selon l'invention.

Les phases de capture et de détection de l'invention, telles que dans un kit défini ci-dessus, trouve une application très intéressant dans un procédé de détection, et éventuellement quantification, d'un matériel biologique cible, dans un échantillon de liquide biologique, en ELISA, qui comprend les étapes suivantes : on dispose d'une phase de capture et d'une phase de détection précitées, on met en contact l'échantillon avec la phase de capture puis la phase de détection, on détecte le complexe phase de capture-matériel biologique cible-phase de détection.

En particulier, lorsque l'haptène de la phase de détection est la biotine, on détecte le complexe phase de capture-matériel biologique ciblephase de détection par addition de streptavidine-peroxydase puis de orthophénylène-diamine.

Les caractéristiques et avantages des différents objets de l'invention sont ci-après illustrés, à l'appui des Exemples 1 à 6 et des Figures 1 à 6, selon lesquelles :
La Figure 1 illustre la protéine native p24 et les différentes protéines modifiées, telles qu'obtenues et utilisées selon la présente invention.

La Figure 2 illustre la comparaison des caractéristiques physicochimiques et de la réactivité entre les protéines décrites à la Figure 1, et les

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conjugués protéine-polymère obtenus par immobilisation desdites protéines sur un support AMVE67.

La Figure 3 représente des histogrammes illustrant la réactivité en ELISA à 492 nm d'une phase de capture consistant en la protéine RH24 ou le conjugué obtenu par couplage de la RK24H au support AMVE67 hydrolysé 48 heures en DMSO 10% H20, vis à vis de 104 sérums HIV négatifs et de 105 sérums HIV positifs.

La Figure 4 illustre, par la représentation en box plot, la distribution des signaux de densité optique obtenus par ELISA en fonction de la nature de la protéine immobilisée sur un support (RH24 seule, noté" 24 " ; RK24H couplée au copolymère AMVE67 hydrolysé 48 heures en DMSO 10% H20 noté"24Po") et en fonction du statut clinique (104 sérums HIV négatifs notés "N", 105 sérums HIV positifs notés"P").

La Figure 5 représente des histogrammes montrant la réactivité en ELISA à 492 nm d'une phase de capture consistant en la protéine RH24 ou le conjugué RK24H - AMVE67 hydrolysé 48 heures en DMSO 10% H2O, vis à vis, d'une part, de sérums provenant de 7 patients HIV séropositifs, en utilisant un titre sérologique élevé ou un titre faible (Figure 5A), d'autre part, avec des sérums provenant de 2 patients HIV séropositifs, collectés séquentiellement durant la période de séroconversion (Figure 5B).

La Figure 6 illustre la comparaison des caractéristiques physicochimiques et de la réactivité biologique de conjugués protéine modifiée par un tag de six résidus lysine-biotine, vis à vis de la protéine de référence RH24.

Exemple 1 : Ensemble de constructions permettant l'obtention de protéines doublement taggées
Schématiquement, les vecteurs permettant l'expression des protéines recombinantes taggées ont été générés à partir du vecteur d'expression pMR24 obtenu par ligation du fragment Ncol-Xbal du pMH24

(Cheynet et al, 1993) contenant le gène de la p24 avec le fragment Ncol-Xbal du pMR-T7 (WO-98/45449, Arnaud et al, 1997) contenant l'ensemble des séquences régulant la réplication du plasmide ainsi que les éléments permettant l'expression du gène inséré. Des adaptateurs oligonucléotidiques adéquats amenant les informations codantes relatives aux tags lysine et/ou histidine ont été insérés entre Clal et Ncol en 5'et Smal et Xbal en 3', pour obtenir une séquence nucléotidique selon l'invention. La portion du gène de la

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p24 codant pour le polypeptide commençant à l'acide aminé 3 (valine) et se terminant à l'acide aminé 224 (proline) est conservée dans toutes les constructions.

Des bactéries compétentes E. coli souche XL 1 ont été transformées par les sept plasmides obtenus à l'Exemple 1, et l'induction de l'expression des protéines est réalisée par addition d'isopropyl-ss-D- thiogalactopyranoside (IPTG), comme précédemment décrit (Cheynet et al, 1993, Arnaud et al, 1997). Les protéines sont extraites, après sonication du culot bactérien, en tampon 50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 10 mM MgCI2, 100 mM NaCI en présence d'anti-protéases (leupeptine 10 ug/ul et aprotinine 1, 25 ug/ul), puis purifiées par IMAC. Les purifications ont été réalisées sur un gel de Sépharose activé avec des ions zinc. Les protéines recombinantes comprenant un tag de 6 résidus histidine sont chélatées par les ions métalliques. Le système chromatographique utilisé est une FPLC (Akta Explorer, Pharmacia Biotech). La boucle de chargement est de 2 ml. Les purifications se font par injection de protéine diluée au 1/2 dans le tampon de lavage qui est un tampon phosphate 67 mM - NaCI 0, 5 M pH7,8. Les protéines d'intérêt sont éluées spécifiquement à pH 4,7 environ par élaboration d'un gradient de pH à l'aide de tampons acétate d'ammonium pH 6,0 et pH 3,0. Les différentes fractions de purification sont collectées. 10 ! JI de chacune de ces fractions sont déposés sur papier Whatman 3MM Chr puis colorés au bleu de Coomassie. Les fractions (protéines non retenues-protéine purifiée) sont ensuite mises à migrer sur gels d'acrylamide 12% après réduction au ss-Me et chauffage 10 minutes à 95 C, puis colorées au bleu de Coomassie. Les fractions les plus concentrées en protéine d'intérêt sont alors rassemblées puis dialysées en cassette de dialyse Slide-A-Lyzer MWCO 10000 PIERCE 1 heure puis 1 nuit à +4 C contre un tampon Phosphate 50 mM pH 7,8. Les concentrations en protéines sont alors définies par un dosage colorimétrique Bradford Coomassie Plus Assay (PIERCE).

Les protéines purifiées sont ensuite caractérisées par spectrométrie de masse couplée à une chromatographie liquide (LC/ESI/MS).

Les analyses ont été réalisées sur un spectromètre de masse simple quadripôle API 100, des pompes 140B et un détecteur 785A (Perkin Elmer).

Les chromatographies liquides en phase inverse ont été réalisées sur une colonne C4 (Vydac Ref 214PT5115, taille des particules 5 pm). Les tampons d'élution sont pour le solvant A : acide formique dans de l'eau 0, 1% (v/v) et

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pour le solvant B : acide formique dans une solution eau/acétonitrile (5 : 95 viv). Un gradient de 40 à 60% de B a été utilisé.

La Figure 1 A décrit la séquence peptidique de la protéine p24 native de capside du VIH-1, isolée de la souche HXB2. Le fragment peptidique 3-224 représente la séquence conservée dans toutes les protéines recombinantes.

La Figure 1 B illustre la structure des trois protéines recombinantes obtenues conformément au protocole ci-dessus, la séquence peptidique conservée étant représentée par une boîte blanche, le tag de 6 résidus histidine étant représenté par une boîte grise, le tag de 6 résidus lysine étant représenté par une boîte noire ; les résidus d'acide aminé précisément indiqués sont des acides aminés spécifiques, hors des trois boîtes précédentes, pouvant varier d'une protéine recombinante à une autre.

Les protéines modifiées recombinantes obtenues sont les suivantes : RH24 codée par le plasmide pRH24, possède un

tag de 6 résidus histidine en position N-terminale, illustrée par SEQ ID NO : 3 ;
RH24K, codée par le plasmide pRH24K, présente un tag de 6 résidus histidine en position N-terminale et un tag de 6 résidus lysine en position C-terminale, illustrée par SEQ ID
NO : 4 ;
RK24H, codée par le plasmide pRK24H, présente un tag de 6 résidus histidine en position C-terminale et un tag de 6 résidus lysine en position N-terminale, illustrée par SEQ ID
NO : 5 ;
Pour chaque protéine recombinante, sont indiqués, sur la Figure 1 B, le nombre d'acides aminés, les masses moléculaires (MM) théoriques (a) déterminées grâce à l'utilisation du logiciel Mac Vector Version 6.5. 3 et les masses moléculaires expérimentales (b) déterminée par spectrométrie de masse couplée à une chromatographie liquide (LC/ESI/MS).

Les résultats montrent que les masses moléculaires déterminées par spectrométrie de masses sont conformes à celles attendues pour les protéines RH24, RH24K et RK24H, et que donc les protéines utilisées correspondent à celles déduites de la traduction du gène modifié.

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De plus, les protéines sont reconnues par des anticorps polyclonaux et monoclonaux anti-p24 en western blot et en ELISA.

Exemple 2 : Obtention de conjugués protéine-polymère
L'immobilisation covalente de protéines sur des polymères se fait par l'établissement d'une liaison amide covalente entre les groupements anhydride du polymère et les amines primaires présentes sur les chaînes latérales des résidus lysine comme illustré dans le schéma (A) ci-dessous. Le polymère n'étant pas hydrosoluble, il est nécessaire de le dissoudre dans du DMSO (diméthylsulfoxyde) anhydre préalablement à la réaction de couplage réalisée en milieu aqueux à 95%. Dans ce milieu aqueux, les fonctions anhydride du polymère subissent une réaction d'hydrolyse, illustrée dans le schéma (B) ci-dessous, qui, en consommant les groupements réactifs du polymère, est en compétition avec la réaction de couplage covalent.

Cette réaction d'hydrolyse est mise à profit pour moduler la réactivité du polymère, en en prédéterminant la teneur en groupements réactifs qui interagiront avec la protéine. Une hydrolyse partielle des polymères est ainsi réalisée pour certaines expériences.

Schéma A : couplage covalent

Schéma B : hydrolyse

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Conditions opératoires :
Tampons de couplage : Phosphate 50 mM pH 7,8,
Polymère : peser 2 mg de copolymère AMVE67 000 (Polysciences INC lot N0427393) et dissoudre doucement dans 2 ml de DMSO anhydre. Les polymères partiellement hydrolysés sont dissous dans du DMSO 10% H20 et conservés pendant 48 heures à l'étuve à 370C préalablement à la réaction de couplage.

Protéine : décongeler doucement dans la glace, la quantité requise pour le couplage
Protocole de couplage :
36 ug de protéines (1,3. 10-9 moles)

5 ! JI de polymère à 1 g/i en DMSO (7, 46. 10-" moles) qsp 105 ut tampon phosphate 1 x La réaction de couplage covalent est réalisée spontanément par incubation pendant 3 heures à 37 C sur agitateur thermique.

Afin d'étudier l'influence de l'hydrolyse du polymère sur la réactivité du conjugué, le polymère est dissous 48 heures préalablement à la réaction de couplage, en DMSO anhydre additionné de 10% d'eau puis conservé à l'étude à 37OC.

Les conjugués sont ensuite caractérisés comme suit.

Les échantillons sont filtrés dans des tubes Ultrafree Millex HV 0, 45 um (Millipore) puis analysés par chromatographie d'exclusion stérique sur colonne Shodex Protein KW 803. Le système chromatographique est une HPLC Kontron comprenant une pompe 422, un injecteur automatique 465 et une DAD (Diode Array Detector). L'élution est réalisée en tampon phosphate 0,1 M pH 6,8 + 0,5% SDS (m/m) avec un flux de 0,5 ml/min. La détection est réalisée par mesure de l'absorbance à 280 (à la concentration utilisée, le polymère n'absorbe pas).

Le ratio de l'air du pic correspondant à la protéine couplée au polymère versus la somme des deux pics correspondants aux protéines couplées et non couplées (c'est-à-dire la quantité totale des protéines impliquées dans la réaction) donne la valeur du rendement de couplage (Y).

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Le nombre de protéines par chaîne de polymère est défini par la relation suivante : N = n. Y/n' ou n et n'représentent respectivement le nombre de moles de protéines et le nombre de chaînes de polymère dans le milieu réactionnel.

Les résultats en terme d'efficacité de couplage des protéines sur le polymère sont les suivants :
100% pour la RH24K immobilisée sur le polymère AMVE67 non hydrolysé et hydrolysé, et
100 et 94% pour la RK24H immobilisée sur le polymère AMVE67 non hydrolysé et hydrolysé respectivement.

De tels rendements de couplage démontrent qu'il subsiste qu'une très faible proportion de protéines libre (non couplées), et qu'il est donc permis de s'affranchir de tout processus de purification du conjugué protéinepolymère.

Exemple 3 : Comparaison des caractéristiques physicochimiques et de la réactivité biologique de conjugués protéines-polymère par rapport aux mêmes protéines non couplées, en fonction de la position du tag sur la protéine et de la réactivité du polymère
Diverses combinaisons de conjugués protéines-polymère, comme décrit dans l'exemple 2, sont analysées.

La position du tag dans la protéine et la réactivité du polymère liée au nombre de groupements réactifs qu'il possède et donc de son caractère hydrolysé ou non sont les principales variables pouvant influencer la réactivité des conjugués.

On a montré que la reconnaissance par des anticorps monoclonaux en phase homogène, de conjugués protéines-polymère, pouvait être altérée dans deux configurations essentiellement : - lorsque le tag se trouve dans une région trop proche du site actif (épitope), ou - lorsque le polymère est trop réactif (non hydrolysé versus hydrolysé)
Deux tests ont permis de sélectionner le conjugué pour lequel (i) la protéine est dans une configuration la plus proche possible de la protéine native, c'est-à-dire une configuration selon laquelle la position du tag est telle

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qu'aucune altération de reconnaissance n'est observée et (ii) la réactivité du conjugué est maximale.

Afin d'objectiver quel conjugué présente en solution les caractéristiques physico-chimiques les plus proches de la contrepartie protéique non couplée, on a évalué le taux de modification des amines primaires par la fluorescamine, selon le protocole suivant.

Le taux de modification des amines primaires est évalué par utilisation de fluorescamine (Arcos Réf. 19167-5000-FW 278,26) comme décrit précédemment (Ganachaud F et al., 1995). Un excès molaire de

fluorescamine est utilisé par rapport à la quantité d'amines primaires. A 90 ut d'une solution protéique à 0, 34 g/) (soit 195 mmol/ml d'amines primaires représentées par 10 lysines internes de la p24 et 6 lysines du tag) en tampon phosphate 50 mM pH7, 8, sont ajoutés 30 u) de fluorescamine à 0, 4 gil en DMSO anhydre (ou à 90 ut d'une solution protéique à 0,095 gli sont ajoutés 30 ut de fluorescamine à 0,4 gil en DMSO anhydre).

Le schéma réactionnel entre la fluorescamine et une amine primaire est illustré ci-dessous.

Flurorescamine non fluorescente Fluorescamine fluorescente
La réaction a lieu pendant 20 minutes à l'obscurité et la fluorescence est mesurée sur un fluorimètre LS 50 (Perkin Elmer). L'intensité de fluorescence a été déterminée à une longueur d'onde d'excitation de 416 nm et une longueur d'onde d'émission de 477 nm.

Comme décrit ci-dessus, la fluorescamine réagit avec les amines primaires conduisant à la formation de composés fluorescents. En

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conséquence, plus il y aura d'amines primaires initialement disponibles sur la protéine, plus le signal de fluorescence sera important.

Cette technique permet donc de comparer le taux d'amines primaires disponibles sur les protéines avant et après immobilisation sur les polymères. Par déduction, on détermine le pourcentage de groupements amine primaire de la protéine immobilisée sur le polymère, ayant réagi, par rapport à la même protéine libre. Ce pourcentage est appelé pourcentage de modification, il est 0% pour la protéine libre. Ce pourcentage de modification est donné par la formule suivante :
100- [ fluorescence de la protéine de l'essai x 100] fluorescence de référence
Afin d'objectiver quel conjugué présente, après adsorption sur une phase solide, la réactivité biologique la plus proche de la contrepartie protéique ou du système de référence RH24 (Janvier et al., 1993), on a effectué un test ELISA en coating d'antigène 1 anticorps polyclonal de lapin. Le protocole a été réalisé comme suit :
100 plipuits de protéines p24 ou de conjugué protéine-polymère dilué à 0, 25 ug/ml en tampon PBS sont immobilisés en fond de microplaque 96 puits (Nunc ImmunoTM Plate MaxisorpTM surface) par incubation d'une nuit à température ambiante. Les sites non spécifiques sont alors saturés pendant 2 heures à 37 C par 200 ut/puits d'une solution de PBS-1% RégilaitTM (piv). Les puits sont alors lavés 3 fois en PBS-tween 0,05%. L'anticorps polyclonal de lapin (bioMérieux lot 970304BLL01 à 8,93 g/l) dilués à la dilution appropriée en tampon PBS-tween 0,05%-0, 2% RégilaitTM sont alors incubés 1 heure à 37 C. Après 3 lavages en PBS-tween 0, 05%, le conjugué anti-lapin marqué à la peroxydase (Jackson ImmunoResearch) dilué au 1/2000 en PBS-Tween 0, 05%-1% RégilaitTM est incubé 1 heure à 37 C. Trois lavages en PBS-Tween 0, 05% sont réalisés avant la révélation au cours de laquelle 100 pu d'une solution contenant une pastille d'OPD 30 mg diluée dans 10 ml de tampon substrat buffer 0,03% H202 (Sanofi) sont incubés 10 min à l'obscurité à température ambiante. La réaction est alors bloquée par addition de 100

ui/puits de H2SO4 1 N, puis les valeur d'absorbance sont lues au spectrophotomètre à 492 nm.

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Les données de la figure 2 illustrent le taux de modification des amines primaires par la fluorescamine et la DO observée en ELISA, comme suit : (a) Protéines Lys6- (RH24) et protéines Lys+ (RH24K et RK24H) non couplées et couplées au copolymère AMVE67 non hydrolysé (non hyd. ) et hydrolysé 48 heures en DMSO 10%
H20 (hyd.) (b) Mesure de la présence de groupements amine libres par émission de fluorescence générée par la réaction chimique entre la fluorescamine et les amines primaires (c) Le pourcentage de modification de la protéine couplée est calculé à partir du signal de la même protéine de référence non couplée, à l'aide de la formule suivante :
100- fluorescence de la protéine non couplée x 100] fluorescence de la protéine couplée (d) La détection en ELISA a été réalisée en utilisant un anticorps polyclonal de lapin (e) Ratio déterminé à partir de la DO du conjugué testé (DOET) et la DO obtenue avec la protéine RH24 classiquement utilisée en immunoessais (DORH24). NA signifie Non
Applicable
L'analyse de la mesure de la présence de groupements amine libres pour les différents conjugués protéine-polymère montre que la RK24H immobilisée sur le polymère d'AMVE67 hydrolysé présente les caractéristiques physico-chimiques les plus proches de celles de son homologue non couplé.

De même, le signal ELISA le plus important est celui obtenu avec le conjugué dans lequel la RK24H est immobilisée sur le polymère hydrolysé.

Exemple 4 : Evaluation d'un bioconjugué protéine-polymère en phase de capture d'anticorps vis à vis de sérums humains.

Le conjugué évalué est celui présentant les meilleures performances, en phase homogène d'une part et en phase de capture dans un test ELISA d'autre part, à savoir le conjugué RK24H/AMVE67 hydrolysé. Ses performances en tant que phase de capture d'anticorps pour des sérums humains ont été testées et comparées à celles de la protéine de référence

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RH24 non couplée au polymère, suivant le protocole ci-après : 100 ul/puits de protéines p24 ou de conjugué protéine-polymères dilués à 1 ug/ml en tampon PBS sont immobilisés en fond de microplaque 96 puits (Nunc immunol Plate MaxisorpTM surface) par incubation une nuit à température ambiante. Les sites non spécifiques sont alors saturés pendant 2 heures à 37 C par 200 ul/puits d'une solution de PBS-10% sérum de chèvre (v/v)-0, 2% RégilaitM (p/v)-150 mM NaCI. Les puits sont alors lavés 3 fois en PBS-Tween 0,05%. Les sérums (HIV positifs ou contrôles négatifs) sont alors dilués à la dilution appropriée en

tampon PBS-10% sérum de chèvre (v/v)-0, 2% RégilaitTM (p/v)-0, 1% Tween 20-300 mM NaCI puis 100 pl par puits sont mis à incuber une heure à 37 C. Les plaques sont alors lavées 3 fois en PBS-Tween 0, 05%. 100 ul de conjugué goat anti-humain (anti Fc) dilué en PBS-sérum de chèvre 10%-0, 2% RégilaitM-0, 1% Tween-150 mM NaCI au 1/10 000ème sont incubés 1 heure à 37 C. Trois lavages en PBS-tween 0, 05% sont réalisés avant la révélation au cours de laquelle 100 pI d'une solution contenant une pastille d'OPD 30 mg diluée dans 10 ml de tampon sustrat buffer 0.03% H202 (Sanofi) sont incubés 10 min à l'obscurité à température ambiante. La réaction est alors bloquée par addition de 100 ul/puits de H2S04 1 N, puis les valeurs d'absorbance sont lues au spectrophotomètre à 492 nm.

Les signaux en ELISA à 492 nm des 105 sérums HIV positifs et 104 sérums HIV négatifs sur une phase de capture constituée de la RH24 (système de référence, barres grises) ou de la RK24H-AMVE67 hydrolysé (système de l'essai, barres noires) sont représentés en figure 3. Une analyse comparative de la valeur diagnostique du système de référence et de l'essai a été réalisée suivant la méthodologie dite du"Receiver-Operating Characteristic" (ROC) (Greiner M et al., 2000). Selon le protocole ROC, chacun des échantillons testés est représenté par sa valeur d'absorbance en ELISA pour la référence et pour l'essai. A partir de cette valeur, les nombres de vrais et faux positifs sont déduits, permettant par la suite un calcul de sensibilité et de spécificité pour chacun de ces points.

La sensibilité des deux formats de test a été évaluée pour des valeurs de spécificité comprises entre 99 et 100%. Pour la référence RH24, des sensibilités de 84,8 et 68,6% sont trouvées, respectivement associées aux spécificités de 99 et 100%. Pour l'essai RK24H-AMVE67 hydrolysé, des sensibilités de 86,7 et 81,9% sont trouvées, respectivement associées aux spécificités de 99 et 100%. Les sensibilités observées pour l'essai sont donc

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supérieures à celles observées pour la référence, à spécificité comparable. On observe que l'intervalle situé entre les bornes 99 et 100% de spécificité contient 20 échantillons pour la référence et seulement 7 pour l'essai.

Ces résultats conduisent à analyser plus en détail la distribution des signaux obtenus pour chacun des 2 systèmes. Une analyse en box plot a été réalisée et les graphiques obtenus sont représentés dans la Figure 4, comme suit :
Distribution des signaux de densité optique obtenus par ELISA en fonction de la nature de la protéine immobilisée sur la phase solide (RH24 seule notée" 24" ou RK24H couplée au copolymère AMVE67 hydrolysé 48 heures en DMSO 10% H20 notée"24Po"), et en fonction du statut clinique

0 (HIV négatif noté"N"ou HIV positif noté"P").

Sur la Figure 4A, les box plots déterminés à l'aide du logiciel StatView Il indiquent, pour chaque groupe, la distribution et le signal médian. Les cinq lignes horizontales dans les boites sont exprimées en percentiles

1 0ème, ème eme exprimant les 10ère, 25, 50, 75' et 90'percentites. Les valeurs au dessus et en dessous des 10ème et 90ème percentiles sont représentées sous forme de points (cerles vides). 104 sérums HIV négatifs et 105 sérums HIV positifs ont été testés pour cette étude.

Sur la Figure 4B, les faibles valeurs de DO (comprises entre 0 et 0,5) ont été amplifiées afin de mieux visualiser la distribution des échantillons négatifs ainsi que les sérums de patients positifs présentant une faible réactivité.

On constate sur ces graphiques un déplacement des signaux vers les valeurs saturantes lorsque la phase de capture est une protéine taggée 6 lysines en position N-terminale RK24H immobilisée sur le polymère AMVE67 hydrolysé. En effet, avec le système de référence, la médiane (valeur de DO pour laquelle 50% des signaux sont au dessus et 50% sont en dessous) est proche de 1 avec le système de référence alors qu'elle est saturante (au-delà de 4) avec l'essai. Ainsi, le conjugué protéine-polymère testé permet de détecter des concentrations plus faibles d'anticorps dans les sérums que le système de référence.

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Exemple 5 : Evaluation d'un bioconjugué protéine-polymère en phase de capture d'anticorps vis à vis de sérums humains contenant de très faibles taux d'anticorps
Les résultats décrits dans l'exemple 4 ont conduit les auteurs à étudier les deux systèmes de capture sur des sérums présentant des titres d'anticorps variables (élevés ou faibles), en utilisant soit des sérums dilués, soit des sérums provenant de patients en phase de séroconversion. Les résultats sont représentés sur la Figure 5 comme suit :
Densités optiques déterminées par ELISA en fonction de la nature de la phase de détection et de la concentration en anticorps anti-p24 dans les sérums.

Sur la Figure 5A, la détection ELISA a été réalisée sur des sérums provenant de 7 patients HIV séropositifs (s58 à slV), en utilisant un titre sérologique élevé (dilution au 1/500ème barres rayées) ou un titre faible (dilutions du 1/1 000ème au 1/200 000ème, barres pleines). Les phases de capture sont la RH24 utilisée comme référence (barres rayées et pleines grises) et la RK24H immobilisée sur l'AMVE67 hydrolysé 48 heures en DMSO 10% H20 (barres rayées et pleines noires). Les traits horizontaux noir et gris représentent un eut off fixé à"moyenne plus trois écart-types" et déterminé à partir des conditions de titre élevées obtenus avec les 104 contrôles négatifs du panel de la Figure 3 pour respectivement, la RH24 et la RK24H couplée au polymère hydrolysé.

Sur la Figure 5B, la détection ELISA a été réalisée avec des sérums dilués au 1/20 provenant de patients HIV séropositifs, collectés séquentiellement durant la période de séroconversion (panel N'l, jours 1 à 28 après le 1"prélèvement et panel N02, jours 32 à 145 après le 1 er prélèvement).

Les phases de capture sont la RH24 utilisée comme référence (barres grises)

et la RK24H immobilisée sur l'AMVE67 hydrolysé 48 heures en DMSO 10% H20 (barres noires). Les traits horizontaux noir et gris représentent le eut off déterminé à partir de 7 sérums de contrôles HIV négatifs dilués au 1/20, pour la RH24 et la RK24H couplée au polymère hydrolysé.

Les résultats de la figure 5A nous montrent qu'aux faibles dilutions

(1/500ème), quel que soit le système de capture, les signaux obtenus en ELISA sont saturants, excepté pour l'échantillon s58 pour lequel un faible signal est obtenu lorsque la phase de capture est une protéine RH24 seule.

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Au contraire, aux fortes (1/1000ère) voire très fortes (1/200 oooème) dilutions, c'est-à-dire lorsque les taux d'anticorps sont faibles, le signal obtenu avec le système de référence est faible ou nul, alors qu'il reste très élevé ou saturant avec l'essai protéine-polymère. Les cut off calculés pour les 104 sérums HIV négatifs dilués au 1/500ème précédemment testés, peuvent être appliqués à ces échantillons plus fortement dilués. Pour la référence RH24, avec un cut off fixé à 0,2387, un sérum est positif (s7, avec un ratio signal sur cut-off de 4,53), 3 sérums sont faiblement ou très faiblement supérieurs au cut off (s58, s27 et s28, avec des ratios signal sur cut-off de 1,51, 1,05 et 1,14, respectivement) et 3 sérums sont négatifs (sil, slll et sIV). Pour l'essai RK24HAMVE67 hydrolysé, pour un cut off fixé à 0,3818, les 7 sérums HIV positifs testés sont très largement au dessus de ce seuil, avec des ratios signal sur cut-off variant de 4,98 (sll) à 10,32 (s27 et s28).

Cette aptitude du système protéine-polymère à détecter de très faibles quantités d'anticorps dans les sérums a conduit les auteurs l'expérimenter sur des panels de séroconversion. Les résultats présentés sur le graphique de la figure 5B sont ceux obtenus pour 2 panels de séroconversion dont les sérums ont été dilués au 1/20ème. Parallèlement, 7 sérums HIV négatifs dilués eux aussi au 1/20ème ont été testés sur les 2 systèmes afin de déterminer les cut-off correspondant à la moyenne des témoins négatifs plus 3 écart-type. Ils sont de 0,6 pour la référence RH24 et de 0,69 pour l'essai RK24H-AMVE67 hydrolysé. La phase de séroconversion, déterminée à l'aide de tests commerciaux de seconde génération, est située entre les prélèvements J3 et J17 pour le panel 1 et J47 et J84 pour le panel 2.

En ce qui concerne le panel N'l, seul le système conjugué protéine-polymère est capable de détecter le premier échantillon positif à J17, avec un signal très fort proche de la saturation, et de ce fait très au dessus de la valeur du cut-off. Au contraire, le panel ? 2 ne montre pas de différences significatives entre les deux formats de test. Ceci est vraisemblablement dû à l'écart de temps entre les 2 prélèvements autour de la séroconversion, proche de 40 jours (alors que ce même intervalle est de 14 jours dans le panel 1), les sérums présentant alors des concentrations d'anticorps fortes facilement détectables par les deux systèmes.

Le conjugué protéine-polymère permet donc, contrairement à la protéine de référence, de détecter des taux très faibles d'anticorps dans les sérums de patients et donc de confirmer une séropositivité plus tôt.

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Exemple 6 : Evaluation d'un bioconjugué protéine recombinante-biotine en phase de détection d'anticorps dans un test ELISA en sandwich antigène
L'immobilisation de biotine sur les protéines a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessous : les protéines p24 (RH24, RH24K et RK24H) ont été préalablement dialysées contre un tampon carbonate 100 mM pH8,3. Cinq moles de biotine (biotin long chain NHS, Roche Ref 1008-960,10 mg/ml en DMSO) ont été incubées avec 1 mole de protéine p24,1 heure sous agitation à 18-25 C. La réaction a été bloquée avec 5 moles d'une solution de lysine 10 mM. Le milieu réactionnel a ensuite été dialysé contre un tampon phosphate salin (PBS) contenant du NaN3. Les conjugués ont ensuite été quantifiés par la technique du BCA (PIERCE).

Enfin, le nombre de biotines par molécule de p24 a été évalué par spectrométrie de masse MALDI TOF.

L'utilisation de ces conjugués en phase de détection d'anticorps a été réalisée dans un test en sandwich antigène selon le protocole suivant : 100 ! -lI/puits de la protéine RH24 dilués en PBS à 0, 25 ! -lg/ml ont été déposés en fond de plaque de microtitration 96 puits (Nunc ImmunoTM Plate Maxisorp surface) par incubation 1 nuit à température ambiante. La plaque est ensuite lavée 3 fois en PBS-Tween 0,05%, puis passivée 1 heure à 37 C par 200 ! -lI/puits en tampon de passivation (Tris 200 mM - NaCl 150 mM-Acide maléique 200 mM-NaOH 150 mM-Tween 20 0, 05%-pH 6,1). 3 lavages au PBS-Tween 0,05% sont effectués avant incubation avec les anticorps polyclonaux de lapin à la dilution choisie en tampon d'incubation de l'Ac (Tris 100 mM - NaCl 300 mM - Tween 5% - Régilait 0, 2%-BSA 2%-Ajuster pH 7,0 avec HCI)-100 gl/puits pendant 2 heures à 37 C. 3 lavages au PBS-T 0,05% permettent d'éliminer les anticorps n'ayant pas réagi, puis 100 l/puits de protéine p24-biotinylée diluée à 1 ! -lg/ml en tampon PBS-Lait 2,5 g/l Tween 0,05% (RH24-biotine, RH24K-biotine ou RK24H-biotine) sont mis en incubation 1 heure à 37 C. Trois nouveaux lavages au PBS-T 0,05% sont réalisés avant addition de la streptavidine-peroxydase (Jackson Immunoresearch) diluée au 1/5000ème en PBS-Lait 2,5 gil Tween 0,05%, 100 l/puits pendant 1 heure à 37 C. Après 3 derniers lavages au PBS-Tween 0,05%, 100 l/puits du substrat OPD de la peroxydase (1 pastille 30 mg diluée dans 10 ml tampon substrate buffer 0,03% H202 (Sanofi)) sont mis en

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incubation 10 minutes à l'obscurité. La réaction colorée est neutralisée par addition de H2S04 1 N au bout de 10 minutes-100, ul/puits et les valeurs de DO sont lues au spectrophotomètre à 492 nm.

Les caractéristiques des conjugués protéine-biotine et leur réactivité en ELISA sont illustrées en Figure 6 comme suit : (a) Protéines Lys6- (RH24) et Lys6 + (RH24K et
RK24H) biotinylées (b) Détermination du nombre de biotines par protéines par analyse par spectrométrie de masse (MALDI TOF) (c) La détection en ELISA a été réalisée en utilisant une gamme de dilution en anticorps polyclonal. Deux points extrêmes de concentration ont été retenus 1 et 0,125 p-g/ml (d) Ratio déterminé à partir de la DO du conjugué testé (DOET) et de la DO obtenue avec la protéine de référence
RH24 biotinylée (DORH24-biot).

La présence d'un tag 6 lysines permet d'immobiliser une plus grande quantité de biotine sur les protéines. En effet, en moyenne, 4 biotines sont couplées sur une RH24,7 sur une RH24K et 5 sur une RK24H.

L'évaluation de ces 3 conjugués p24-biotine en phase de détection montre que les signaux obtenus avec les protéines taggées biotinylées sont supérieurs à ceux de la protéine non taggée RH24 biotinylée, la plus efficace en phase de détection étant la RH24K-biotinylée. Celle-ci permet, à faible concentration en anticorps polyclonal, d'améliorer le signal de 66% par rapport à la protéine de référence RH24 biotinylée. La protéine RK24H biotinylée permet, quant à elle, d'améliorer le signal de 22% pour une même dilution de l'anticorps monoclonal et par rapport à la protéine de référence.

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Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'obtention d'une phase de capture d'un matériel biologique cible, comprenant une protéine d'intérêt modifiée, capable de se lier spécifiquement, directement ou indirectement, audit matériel biologique cible et immobilisée sur une phase d'immobilisation comportant des groupements réactifs, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : on dispose d'au moins deux séquences peptidiques différentes, comprenant la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, et l'une comprenant une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité C-terminale, l'autre comprenant une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité C-terminale, on immobilise chacune des deux séquences peptidiques obtenues sur la phase d'immobilisation, par réaction covalente entre les groupements amine primaire des séquences peptidiques et les groupements réactifs du support, on détermine l'efficacité du couplage entre chacune des deux séquences et la phase d'immobilisation, on choisit comme phase de capture, la séquence peptidique la plus efficacement couplée à la phase d'immobilisation.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les deux séquences peptidiques au moins comprennent une succession de six résidus lysine eVou une succession de six résidus histidine.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les deux séquences peptidiques au moins comprennent une succession de six résidus lysine et une succession de six résidus histidine.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on immobilise les séquences peptidiques sur la phase d'immobilisation, dans un milieu hydrolysant partiellement les groupements réactifs de ladite phase d'immobilisation.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on détermine l'efficacité du couplage par quantification des groupements amine primaires libres de la séquence peptidique immobilisée et des groupements amine primaires libres de la même séquence peptidique non immobilisée, et

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déduction des groupements amine ayant interagi avec la phase d'immobilisation.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on quantifie les groupements amine primaire libres par réaction desdits groupements avec la fluorescamine.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d'immobilisation est un copolymère d'anhydride maléique choisi parmi le poly (méthylvinyléther-anhydride maléique), le poly (éthylène- anhydride maléique), le poly (styrène- anhydride maléique) et le poly (N-vinylpyrrolidone- anhydride maléique).

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le copolymère est le poly (méthylvinyléther-anhydride maléique).

9. Procédé selon les revendications 1 et 8, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est la protéine p24 de la capside du VIH-1, et en ce que la séquence peptidique de la protéine d'intérêt modifiée comprend la séquence SEQ ID NO : 2, une succession de 6 résidus lysine à son extrémité N-terminale et une succession de 6 résidus histidine à son extrémité C-terminale.

10. Procédé d'obtention d'une phase de détection d'un matériel biologique cible, comprenant une protéine d'intérêt modifiée, capable de se lier spécifiquement, directement ou indirectement, audit matériel biologique cible et couplée à un haptène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : on dispose d'au moins deux séquences peptidiques différentes, comprenant la séquence peptidique de la protéine d'intérêt, l'une comprenant une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité C-terminale, l'autre comprenant une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité C-terminale, on couple chacune des deux séquences peptidiques obtenues à l'haptène, on détermine l'efficacité du couplage de chacune des deux séquences à l'haptène, on choisit comme phase de détection, la séquence peptidique la plus efficacement couplée à l'haptène.

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11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les deux séquences peptidiques au moins comprennent une succession de six résidus lysine et/ou une succession de six résidus histidine.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les deux séquences peptidiques au moins comprennent une succession de six résidus lysine et une succession de six résidus histidine.

13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'haptène est la biotine.

14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on détermine l'efficacité du couplage entre les séquences peptidiques et l'haptène est effectuée par spectrométrie de masse.

15. Procédé selon les revendications 10 et 13, caractérisé en ce

que la protéine d'intérêt est la protéine p24 de la capside du VIH-1, et en ce que la séquence peptidique de la protéine d'intérêt modifiée comprend la séquence SEQ ID NO : 2, une succession de 6 résidus histidiine à son extrémité N-terminale et une succession de 6 résidus lysine à son extrémité Cterminale.

16. Kit pour la détection par ELISA d'un matériel biologique cible, comprenant une phase de capture obtenue selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et une phase de détection obtenue selon l'une quelconque des revendications 10 à 15.

17. Procédé de détection, et éventuellement quantification, d'un matériel biologique cible, dans un échantillon de liquide biologique, en ELISA, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : on dispose d'une phase de capture obtenue selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et d'une phase de détection obtenue selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, on met en contact l'échantillon avec la phase de capture puis la phase de détection, on détecte le complexe phase de capture-matériel biologique cible-phase de détection.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en la phase de capture est obtenue par le procédé selon la revendication 9, la phase de détection est obtenue par le procédé selon la revendication 15, et on détecte le complexe phase de capture-matériel biologique cible-phase de détection par addition de streptavidine-peroxydase puis de orthophénylène-diamine.