FR2831887A1

FR2831887A1 - Coculture nerf-muscle contractile transportable

Info

Publication number: FR2831887A1
Application number: FR0114397A
Authority: FR
Inventors: Jean Claude Laurent; Remy Steinschneider
Original assignee: BIO EXPERTISE TECHNOLOGIES BET
Current assignee: BIO EXPERTISE TECHNOLOGIES BET
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2003-05-09
Anticipated expiration: 2021-11-07
Also published as: WO2003040300A2; EP1442116A2; FR2831887B1; WO2003040300A3; AU2002360163A1

Abstract

La présente invention concerne des co-cultures miniaturisées nerf-muscle contractiles et leurs utilisations, à des fins de recherche, criblage de molécule, études biologiques, thérapeutiques, de toxicité, de pharmacogénomique, etc. L'invention décrit également de nouvelles méthodes de culture miniaturisée nerf-muscle contractile dans des dispositifs de dimensions réduites, typiquement en puits de microplaques. Elle décrit également des dispositifs et kits adaptés à la réalisation de telles co-cultures, à leur conservation, leur transport et leurs utilisations.

Description

COCULTURE NERF-MUSCLE CONTRACTILE TRANSPORTABLE La présente invention concerne des cultures mixtes, leur préparation et leurs utilisations.

Elle concerne plus particulièrement des co-cultures miniaturisées nerf-muscle contractiles et leurs utilisations, à des fins de recherche, criblage de molécule, études biologiques, thérapeutiques, de toxicité, de pharmacogénomique, etc. L'invention décrit également de nouvelles méthodes de culture miniaturisée nerf-muscle contractile dans des dispositifs de dimensions réduites, typiquement en puits de microplaques. Elle décrit également des dispositifs et kits adaptés à la réalisation de telles co-cultures, à leur conservation, leur transport et leurs utilisations.

Les cultures cellulaires, pour qu'elles soient de bons outils pour être utilisées comme modèle d'analyse, doivent être homogènes d'une culture à l'autre. Les lignées cellulaires permettent de diminuer la variabilité des cultures d'un récipient de culture à un autre car le système est très homogène de par l'origine des cellules (tumeur) et leur multiplication est quasiment indéfinie de par leur propriété d'immortalité liée à leur origine tumorale.

Dans les modèles de cultures de cellules normales nécessitant l'utilisation des cellules proches de leur état d'origine, les cellules ne sont pas tumorales et ne possèdent donc pas les propriétés de multiplication indéfinie. Ceci constitue donc un handicap majeur lorsque l'on veut faire des études de reproductibilité. Ce type de problème se pose avec les cultures de cellules de types différents, pour toutes applications.

La présente invention concerne des cultures mixtes cellulaires utilisables comme modèles d'études. Il s'agit plus spécifiquement de cultures mixtes nerf-muscle contractiles. Ces cultures sont essentiellement basées sur l'utilisation de cellules primaires, et n'utilisent donc généralement pas des lignées immortalisées. Jusqu'à ce jour, les co-cultures de cellules nerveuses avec les cellules cibles comme les cellules musculaires striées, ont été rendues possibles uniquement dans des dispositifs ou surfaces de culture importants, typiquement dans des boites de culture dont la surface minimale est généralement de l'ordre de 10 cm2 au moins. Ce type de culture implique donc l'utilisation d'un nombre important de cellules musculaires et d'explants (de l'ordre de 5). Ce type de culture ne permet pas de préparer un grand nombre de cultures homogènes vu le nombre d'animaux

à utiliser, vu le nombre d'embryons à isoler et le nombre d'explants à ensemencer et vu le temps de travail que cela nécessite. D'autre part, ce modèle de culture n'est pas transportable car les boites de culture utilisées ne peuvent pas être fermées de façon étanche.

La présente demande propose maintenant des co-cultures nerf-muscle contractiles adaptées à un usage comme modèle d'études biologiques diverses. En particulier, la présente demande décrit des co-cultures nerf-muscle contractiles miniaturisées et homogènes dans un nombre important de puits permettant la réalisation d'essais biologiques comparatifs importants. La présente demande montre ainsi que des cultures nerf-muscle peuvent être réalisées dans un format miniaturisé, tout en conservant leur capacité de contraction. La présente demande montre également qu'il est possible de réaliser de telles cultures miniaturisées, que ces cultures se contractent dans des conditions physiologiques, et que les contractions n'induisent pas un arrachement de la culture, contrairement à ce qui pouvait être attendu. La demande montre en outre que ces cultures sont transportables et possèdent une capacité de survie de plusieurs mois. Elle décrit en outre des dispositifs adaptés au transport et/ou à la conservation des co-cultures, permettant ainsi leur usage pour diverses études biologiques.

Un premier objet de la présente demande réside donc dans un tissu neuro-musculaire contractile reconstitué in vitro. Ce tissu (ou culture mixte ou co-culture) comprend typiquement des cellules musculaires innervées par des cellules nerveuses dans des conditions assurant la propriété de contraction du tissu, et comporte avantageusement une superficie globale inférieure à environ 5 cm2. Le tissu reconstitué comprend avantageusement des cellules musculaires organisées en myofibres, typiquement sous forme d'une monocouche à la surface d'un support. Les cellules nerveuses, typiquement des neurones, par exemple des motoneurones et/ou des neurones sensitifs, innervent (e. g., interagissent de manière fonctionnelle avec) les fibres musculaires, typiquement en émettant des prolongements nerveux au niveau desdites fibres musculaires. Le tissu peut comprendre d'autres types cellulaires, bien que cela ne soit pas nécessaire. Le support peut être plan ou non, et réalisé en tout matériau compatible avec la culture de cellules, comme par exemple un polymère, plastique, verre, corail, etc. Un exemple typique de

support est un puits d'une (micro) plaque multipuits, par exemple d'une plaque 12,24, 48 ou 96 puits. Le puits (ou le support) peut être de forme variée (par exemple carrée, rectangulaire, circulaire, ovale, etc. ). Bien que cela ne soit pas préféré, le support peut également être une lame sur laquelle plusieurs tissus sont reconstitués. Comme il sera indiqué dans la suite du texte, le support est avantageusement recouvert d'une matrice biologique assurant une adhésion des cellules musculaires.

Un objet particulier de l'invention réside dans une co-culture miniaturisée (ou dans un tissu reconstitué) nerf-muscle, caractérisée en ce qu'elle comprend, sur un support ayant une surface de culture inférieure à environ 5 cm2, des cellules musculaires innervées par des neurones, en ce qu'elle possède la propriété de se contracter. Typiquement, les cellules musculaires sont d'origine humaine et les cellules nerveuses d'origine animale, par exemple de rongeur.

Un autre objet particulier réside dans une co-culture miniaturisée (ou dans un tissu reconstitué) nerf-muscle contractile telle que définie ci-avant, caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules musculaires cultivées avec un ou deux explants de moelle épinière et de ganglion rachidien dans un puits de microplaque de culture de 12,24, 48 ou 96 puits.

Un autre objet de l'invention réside dans un kit comprenant une pluralité de co-cultures nerf-muscle contractiles telles que définies ci-avant, dans un support (miniaturisé) adapté. Le support du kit (ou le conteneur) est avantageusement constitué d'une plaque multi-puits, chacun ou plusieurs desdits puits de la plaque comprenant une co-culture telle que définie ci-avant. Les kits de l'invention comprennent donc un conteneur, composé d'une plaque multipuits, de préférence 24 ou 48 puits, chaque puit contenant un tissu reconstitué contractile de l'invention préparé à partir du même matériel biologique (cultures cellulaires, animaux, biopsies, etc. ). Préférentiellement, les kits de l'invention comportent en outre des moyens de fermeture étanche des puits des plaques permettant le transport des co-cultures. Les moyens de fermeture sont préférentiellement composés d'un ou plusieurs éléments couvercle étanches. Les kits de l'invention peuvent comprendre en outre des milieux de culture, des réactifs de dosage, etc.

Un kit de co-culture nerf (e. g., explant de moelle épinière) /cellules musculaires comprend avantageusement une microplaque de culture de 12,24, 48 ou 96 puits comprenant les tissus mixtes contractiles recouverts de milieu de culture adapté pour le transport et fermé hermétiquement par un couvercle. Ce milieu peut être un milieu d'innervation décrit ci-après, ou du milieu de culture adapté à la survie des cellules en atmosphère classique ne contenant pas 5 % de C02, comme du milieu de Leibovitz, par exemple. Avantageusement, le kit comprend, en plus des microplaques de culture, du milieu de culture permettant d'entretenir les cultures après le transport.

Un autre objet particulier de l'invention réside dans un dispositif de fermeture étanche de puits d'une microplaque. Le dispositif selon l'invention comprend avantageusement un ensemble d'éléments solidaires les uns des autres, avantageusement disposés sur un même plan, permettant d'obstruer de manière étanche plusieurs puits d'une microplaque, notamment d'une microplaque 12,24 ou 48 puits. Ce dispositif peut être réalisé en tout matériau adapté (polymère, verre, plastique, etc. ), et comporte avantageusement un ou plusieurs alignements, typiquement de 6 éléments au moins, destinés à obstruer, chacun, un puits d'une microplaque de culture. Il est entendu que le dispositif peut comporter un ou plusieurs alignements de 2,3 ou 4 éléments, ou plus encore. Les éléments sont espacés les uns des autres d'une distance correspondant à l'espacement des puits d'une microplaque. Typiquement, le dispositif est composé d'une plaque ou d'une lame, sur laquelle sont fixés lesdits éléments. Pour une plaque 12 puits, un seul dispositif comportant deux alignements de 6 éléments permet d'assurer l'étanchéité de l'ensemble des puits. Pour une plaque 24 puits, on utilise typiquement deux dispositifs, etc. Chaque élément possède une forme adaptée à celle des puits (c'est-à-dire généralement circulaire) et possèdent un diamètre extérieur légèrement inférieur au diamètre des puits, permettant, par frottement, d'assurer une étanchéité. Préférentiellement, chaque élément est composé de deux cylindres concentriques espacés l'un de l'autre, l'espace ménagé entre les cylindres permettant de recouvrir et de s'emboîter sur le rebord d'un puits.

Ainsi, dans un mode particulier, chaque élément est composé d'un cylindre interne, généralement plein, destiné à obstruer l'ouverture du puits, ledit cylindre interne ayant un diamètre extérieur légèrement inférieur au diamètre du puits (permettant ainsi par

frottement d'assurer l'étanchéité), et d'un cylindre externe, concentrique avec le cylindre interne et entourant celui-ci en laissant un espace libre entre les deux cylindres, le diamètre intérieur dudit cylindre externe étant légèrement supérieur au diamètre externe du puits. La profondeur de chaque élément peut être variable, typiquement inférieure à la moitié de la profondeur du puits. En outre, les éléments (notamment le cylindre interne) peuvent être percés d'un trou de diamètre varié (0, 1 mm à 5 mm) permettant, lors de la fermeture des puits, de chasser l'air sans créer de surpressions. Ces trous sont, par la suite, obstrués par un film autocollant stérile.

Un autre objet de la présente demande réside dans un procédé de préparation d'un tissu neuromusculaire contractile tel que défini ci-avant. Le procédé comprend une première étape de culture de cellules musculaires, sur un support et dans des conditions assurant l'adhésion des cellules musculaires et la formation de fibres musculaires, et une deuxième étape d'innervation des cellules musculaires par ajout de cellules nerveuses et culture dans des conditions permettant l'émission de prolongements nerveux en direction des cellules musculaires.

Les cellules musculaires utilisées peuvent être des cellules satellites, des myoblastes, etc., isolées à partir de prélèvements de muscles striés humains ou de muscles striés de rongeur ou de muscles striés de tout autre animal vertébré ou invertébré. Ces cellules peuvent être d'origine saine ou provenir de prélèvements de muscle de patients atteints de maladies neuromusculaires (par exemple d'amyotrophie spinale) ou de souris génétiquement modifiées ou de tout autre animal vertébré ou invertébré génétiquement modifié. Ces cellules peuvent être obtenues par dissection mécanique et/ou digestion enzymatique, suivie (s) éventuellement d'une étape d'amplification. Les cellules musculaires (e. g., satellites) sont ensemencées à une densité variable (comprise en général entre 2 000 cellules par cm2 et 100 000 cellules par cm2) dans un milieu de culture adapté et elles sont maintenues en culture dans des conditions adaptées à leur développement, typiquement dans une étuve à 37 C environ, de préférence dans une atmosphère saturée en humidité contenant de 2 à 10 % de C02. L'observation des cultures montre que les cellules satellites, après avoir atteint la confluence, sont capables de fusionner en myotubes (structure pluri-nucléée).

Au stade de la fusion des cellules satellites en myotubes, des cellules nerveuses (typiquement un à deux explants de moelle épinière contenant au moins un ganglion rachidien) sont déposées dans chaque puits. Le tapis cellulaire contenant les explants de moelle épinière est incubé dans une étuve, généralement à 37 C environ, de préférence dans une atmosphère saturée en humidité contenant de 2 à 10 % de C02. Les résultats obtenus montrent que les neurones contenus dans les explants de moelle épinière et dans les ganglions rachidiens se développent dans les conditions de culture et émettent des prolongements en direction des cellules musculaires, visibles dès les premières vingt quatre heures de culture.

En microscopie optique, les premières contractions des fibres musculaires sont observées après cinq à six jours de co-culture. Après trois semaines de co-culture, les fibres musculaires striées au voisinage de l'explant qui se contractent ont toutes les caractéristiques des cellules musculaires matures.

De manière avantageuse et surprenante, les co-cultures de cellules musculaires/nerveuses de l'invention peuvent être transportées dès le début de la co-culture, par exemple après un jour de co-culture, sans altérer la culture et le développement des jonctions neuromusculaires. Ceci est rendu possible également par les dispositifs utilisés, tels que les microplaques de culture de 12,24, 48 ou 96 puits. Le transport est avantageusement réalisé à une température comprise entre 4 et 37 C. Pour le transport des microplaques de culture, un couvercle (e. g., de polyéthylène) a été développé par les demandeurs, permettant de réaliser l'étanchéité de chaque puits. Ce couvercle est appliqué sur la microplaque de culture, le tout étant ensuite éventuellement recouvert par le couvercle de la microplaque et, typiquement, l'ensemble est fermé par un ruban adhésif ou tout autre moyen adapté (élastique, pinces, etc. ). A la réception des co-cultures, le couvercle permettant l'étanchéité des puits est enlevé. Le couvercle de la microplaque peut être appliqué. La microplaque est incubée dans une étuve, par exemple à 37 C environ, de préférence dans une atmosphère saturée en humidité contenant de 2 à 10 % de CO2.

De manière particulière, les co-cultures nerf-muscle contractiles de l'invention sont réalisées dans des dispositifs de surface inférieure à environ 5 cm2, par exemple des microplaques de 12,24, 48 ou 96 puits, typiquement de 12 à 48 puits. Le nombre d'explants nécessaires est faible (de 1 à 2 explants par puits) et le nombre de puits préparés est important, permettant d'obtenir des cultures homogènes d'un puits de culture à un autre d'une même boite, en utilisant un nombre restreint d'animaux.

Les cultures mixtes sont utilisables pour la réalisation de diverses études biologiques, telles que par exemple des études d'efficacité, de toxicité, des analyses génétiques, des criblages, etc. L'invention permet donc, pour la première fois, la réalisation d'analyses comparatives fiables, et reproductibles, sur des cultures mixtes contractiles, dans des conditions physiologiques.

Ces différents aspects de l'invention sont décrits plus en détails dans la suite du texte.

Co-Cultures Les cultures mixtes selon l'invention sont des cultures nerf-muscle. Le terme culture mixte désigne également un tissu ou une préparation cellulaire composite reconstitué in vitro, comprenant au moins deux types cellulaires en interaction fonctionnelle. Les deux types cellulaires sont des cellules musculaires et des cellules nerveuses, et l'interaction fonctionnelle permet la contraction des cellules musculaires. Les cellules musculaires sont avantageusement organisées, au moins pour une partie d'entre-elles, en myotubes ou fibres, qui sont innervées par les terminaisons nerveuses des cellules nerveuses, permettant ainsi leur contraction. Les cellules musculaires forment généralement une monocouche, bien que des couches supplémentaires ou toute autre organisation fonctionnelle soit possible.

Les cultures selon l'invention sont réalisées dans des dispositifs présentant une surface de culture généralement inférieure à environ 5 cm2. L'invention montre en effet qu'il est possible de reconstituer un tissu biologique fonctionnel contractile dans un système miniaturisé. Il s'agit typiquement de plaques présentant des puits d'une surface cultivable

inférieure ou égale à environ 5 cm2, par exemple de puits d'une plaque 12 puits (surface cultivable comprise entre 4 cm2 et 3,5 cm2), 24 puits (surface cultivable comprise entre 2 de 1,7 car'), 48 puits (surface cultivable comprise entre 1 de 0,79 cm2) et 96 puits (surface cultivable compris entre 0,35 et 0,30 cm2). On préfère des cultures réalisées dans des dispositifs possédant une surface cultivable comprise entre 0,5 et 5 cm2, plus préférentiellement entre 0,5 et 4 cm2. De manière typique, on utilise des puits de plaques 12,24 ou 48 puits. De telles plaques sont disponibles dans le commerce, et présentent des dimensions générales standards (typiquement 12,7 cm x 9,4 cm). Il est entendu que la culture peut être réalisée dans tout autre dispositif présentant une surface de culture adaptée, quelle que soit sa forme (circulaire, ovale, carrée, rectangulaire, etc. ), qu'elle soit plane ou non.

D'autre part, les demandeurs ont développé un système de fermeture permettant de rendre étanche les puits de culture et donc de pouvoir transporter les microplaques de culture jusqu'à leurs utilisateurs.

Dans un mode particulier de réalisation, le système de fermeture adapté à une microplaque de 24 puits est réalisé en polymère, tel que du polystyrène, ou en toute autre matière adaptée, et comporte un ou plusieurs alignements d'éléments (ou de structures) circulaires destinés à obstruer les puits, lesdits éléments circulaires alignés possédant les caractéristiques suivantes : un cylindre interne, généralement plein, destiné à obstruer l'ouverture du puits, ledit cylindre interne ayant un diamètre extérieur légèrement inférieur au diamètre du puits, typiquement de 15 à 17 mm de diamètre interne et, plus préférentiellement, de 16,1 mm de diamètre interne, et un cylindre externe, concentrique avec le cylindre interne et entourant celui-ci en laissant un espace libre entre les deux cylindres, le diamètre intérieur dudit cylindre externe étant légèrement supérieur au diamètre externe du puits, typiquement de 20 à 17 mm de diamètre externe et, plus préférentiellement, de 18,1 mm de diamètre externe. Dans un mode particulier, chaque élément possède une profondeur inférieure à environ 5 mm, par exemple de l'ordre de 4 mm. Les éléments peuvent par ailleurs comporter des rainures, notamment la paroi externe du cylindre interne, facilitant l'interaction avec les parois du puits, par exemple

de 1 mm d'épaisseur. L'espacement des éléments peut être variable, selon le support de culture utilisé. Dans un mode de réalisation adapté aux plaques 24 puits, les éléments sont espacés de 20,7 mm. Un tel dispositif comporte avantageusement deux alignements de 6 éléments, et peut ainsi se fixer sur 12 puits de culture d'une microplaque de culture de 24 puits. Chaque élément (notamment le cylindre interne plein) peut être percé (en son centre) d'un trou de diamètre compris entre 0,1 à 5 mm et préférentiellement de 1 mm.

Ces trous permettent d'enfoncer les couvercles sans créer de surpression au niveau des cellules et d'éliminer les bulles d'air afin de transporter les cultures en immersion totale.

Ces trous sont obstrués, à la fin de cette opération, par un film autocollant stérile déposé sur le système de fermeture en polystyrène. Par microplaque de 24 puits peuvent se fixer deux couvercles d'étanchéité. Le dispositif d'étanchéité de l'invention, adapté à une plaque 12 ou 24 puits, présente typiquement les dimensions de 126 mm de longueur, de 42 mm de largeur et de 5 mm d'épaisseur.

Cultures de cellules musculaires Les cultures de muscles peuvent être obtenues à partir de biopsies ou par tout autre protocole permettant d'isoler des cellules satellites ou des myoblastes, par exemple par migration cellulaire, par dissociation chimique ou mécanique à partir de fragments de tissu musculaire strié humain ou animal. Une méthodologie utilisable est décrite par Askanas et Engel (Askanas V, Engel WK. Neurology 1975 ; 25 : 58-67). Typiquement, les biopsies sont traitées mécaniquement (e. g., scalpel, ciseaux, etc. ) et/ou enzymatiquement (e. g., collagénase, etc. ) pour en extraire les cellules. Les cellules musculaires peuvent être isolées à partir de muscles normaux ou pathologiques de vertébrés ou d'invertébrés, de préférence de mammifères, en particulier d'origine humaine, ou préparées à partir de cellules souches de vertébrés ou d'invertébrés, de préférence de mammifères, en particulier d'origine humaine, qui sont capables dans des conditions de cultures adaptées de se multiplier et de fusionner pour former des myofibres musculaires. Les prélèvements peuvent être issus de donneurs sains, ou de patients atteints de pathologies affectant le tissu musculaire, le tissu nerveux, et/ou les mécanismes de contraction des muscles striés, par exemple. On peut citer notamment des donneurs atteints de pathologies neurodégénératives ou neuromusculaires. Les prélèvements peuvent provenir également

de souris ou de tout vertébré ou invertébré atteint de pathologies induites de manière expérimentale ou par mutation génétique affectant les mécanismes des contractions des muscles striés.

Les cellules musculaires ainsi isolées (e. g., cellules satellites, myoblastes, etc. ) peuvent être subcultivées plusieurs fois pour amplifier le nombre de cellules satellites dans un milieu de culture adapté à leur développement. Cette culture peut également permettre d'enrichir la population cellulaire en cellules musculaires désirées, lorsque le matériel de départ comporte potentiellement d'autres types cellulaires. Le milieu utilisé peut être tout type de milieu de culture favorisant le développement des cellules satellites. Il peut s'agir typiquement de milieux commerciaux (e. g., Ham, MEM, DMEM, M199, MEM D-VAL, etc. ), éventuellement combinés et/ou supplémentés par des antibiotiques, acides aminés, sérum, etc. A titre d'exemple de milieux adaptés développés par le demandeur, on peut citer le milieu Ham F 14 (Askanas et Engel, 1975) complémenté avec 10 ng/ml de EGF (Epidermal Growth Factor), 10 ng/ml de FGFb (Fibroblast Growth Factor basic), 10 llg/ml d'insuline, d'une solution d'antibiotique 100 X à 1 % ainsi que 10 % de SVF (sérum de veau foetal). Le milieu peut être également un mélange de MEM et de M 199 complété avec 10 ng/ml de EGF, 10 ng/ml de FGFb, 10 llg/ml d'insuline, ainsi que 10 % SVF. Le milieu peut être également du MEM D-VAL complété par 15 % de SVF et d'une solution d'antibiotique 100 X à 1 %. Il est entendu que la composition précise du milieu peut être ajustée par l'homme du métier selon les cellules utilisées, leur nombre, la durée des cultures, etc. Cette sub-culture peut être effectuée dans tout dispositif approprié (boite, flasque, poche, tube, etc.).

Grace à cette étape d'amplification, il est possible de réaliser un nombre élevé de cultures mixtes de l'invention à partir de peu d'échantillons.

Pour la préparation du tissu contractile selon l'invention (et donc permettre la culture mixte et l'innervation des cellules musculaires), les cellules satellites sont ensemencées dans un dispositif de culture tel que défini ci-avant, dont une partie au moins de la surface cultivable est recouverte d'une matrice biologique permettant l'adhésion des cellules satellites et favorisant la fusion de ces cellules en myotubes sans qu'ils ne se

détachent du support. Typiquement, l'ensemble de la surface cultivable destinée à la culture des cellules musculaires est recouvert d'une telle matrice. Typiquement, le support de culture (e. g., les puits des microplaques de culture) est traité préalablement à la culture par ladite matrice. Il s'agit avantageusement d'un film de gélatine et/ou comprenant du collagène, du matrigel, du plasma sanguin ou tout type de matrice biologique permettant une bonne adhésion des cellules satellites et une bonne fusion de ces cellules en myotubes. De manière particulièrement préférée, on utilise un film de gélatine, par exemple à la concentration de 1,5 % à 0,05 % et, de façon préférentielle, de 0,5 à 0,1 %. La densité cellulaire étant dépendante du temps de doublement de chaque primo culture et de la programmation de l'innervation, les cellules sont ensemencées à des densités cellulaires variables comprises en général entre 2 000 cellules par cm2 et 100 000 cellules par cm2, par exemple entre 2 000 et 15 000. Il est entendu que la densité peut être adaptée par l'homme du métier en fonction du type de cellules. Les cellules sont cultivées dans les milieux de culture utilisés pour les sub-cultures décrites ci-avant.

Au stade sub-confluent, les cellules satellites vont fusionner en myotubes, structure plurinucléée, mais ne possédant pas la capacité à se contracter. Afin d'accélérer la fusion des cellules, il est avantageux, dans certaines conditions de culture, de diminuer la quantité de SVF à la confluence.

L'innervation des cellules par les cellules nerveuses (explants de moelle épinière) peut alors être réalisée, préférentiellement dans les 5 jours après l'apparition des premiers myotubes dans les cultures de cellules satellites à sub-confluence.

Innervation des cellules musculaires Au stade de fusion des cellules satellites en myotubes, des explants de moelle épinière contenant les ganglions rachidiens sont déposés sur la (mono) couche cellulaire, à raison de 1 à 2 explants par culture.

Les explants de moelle épinière et de ganglion rachidien sont issus d'embryons de rat ou de souris ou de d'autre type de vertébrés ou d'invertébrés. Il s'agit préférentiellement

d'explants provenant de mammifères non-humains. Ces animaux peuvent être sains ou peuvent être porteurs de pathologies génétiques ou induites neurodégénératives ou porteurs de pathologies pouvant toucher l'activité contractile des muscles striés. Il s'agit typiquement d'embryons de rat ou de souris de 12 à 21 jours et, préférentiellement, de 13 à 14 jours.

On appelle explant de moelle épinière un morceau de moelle épinière auquel est attaché un ganglion rachidien dans lequel sont localisés les corps cellulaires de motoneurones et de neurones sensitifs, et capable de générer à sa périphérie un réseau neuritique allant innerver le support cellulaire constitué de cellules musculaires. Comme indiqué, les explants peuvent être issus de tissus normaux ou pathologiques, d'embryons ou de tissus adultes ou de cellules souches. Les explants peuvent également être prélevés sur des mammifères non-humains (e. g., rats) nouveaux nés ou sur des structures de moelles épinières adultes.

Des motoneurones et des neurones sensitifs purifiés peuvent également être utilisés. On appelle motoneurone toute cellule nerveuse ayant comme finalité l'innervation des cellules musculaires striées et la formation de jonctions neuromusculaires. On appelle neurone sensitif toute cellule nerveuse donnant des informations aux motoneurones et aux centres nerveux supérieurs sur le degré de contraction des cellules musculaires striées.

Des motoneurones et des neurones sensitifs issus de cellules souches peuvent aussi être utilisés. On appelle cellule souche toute cellule d'origine embryonnaire ou adulte de vertébré ou d'invertébré ayant la potentialité de se différencier en une cellule adulte.

Les neurones, explants de moelle et ganglions rachidiens peuvent être prélevés ou obtenus par des techniques classiques connues de l'homme du métier (Tissue culture methods for the study ofmyelination. Naomi Kleitman, Patrick M. Wood and Richard P.

Bunge. Culture nerve cells, Banker and Goslin editors, 1991, 337-371).

Le milieu d'innervation peut être du Ham-F-12, un mélange de MEM et M 199, du MEM D VAL ou tout autre milieu de base. Ces milieux sont complétés par du SVF préférentiellement à la concentration de 5 %, de 10 p. g par ml d'insuline et de 1 % d'une solution d'antibiotiques. Ces milieux peuvent être également du milieu chimiquement défini.

Après 4 à 5 jours de culture, dans ces conditions, les premières contractions musculaires peuvent apparaître. Après trois semaines de co-culture, les fibres musculaires ont les caractéristiques de fibres musculaires matures. Ces cultures peuvent être entretenues en culture pendant 6 mois.

Après 1 jour de co-culture et préférentiellement après 15 jours de co-culture, les microplaques de culture de 12,24, 48 et 96 puits peuvent être transportées dans des laboratoires extérieurs équipés en matériel permettant d'entretenir les cultures. Ce transport est possible grâce à un couvercle étanche développé par les demandeurs, permettant d'isoler les puits de culture. Ce couvercle peut être en polyéthylène ou en toute autre matière pouvant être stérilisée (polymère, plastique, verre, etc. ). Ces couvercles permettent d'obstruer l'ensemble des puits des microplaques 12,24, 48 et 96 puits ou une partie de ces puits. Le transport de culture peut être réalisé à une température compris entre 18 C et 37 C, et de façon préférentielle à 37 C. La durée du transport peut être comprise entre 24 et 72 h.

Une fois le transport terminé, le couvercle étanche est retiré et les cultures sont placées dans une étuve à 37 C en atmosphère saturée en humidité contenant entre 2 à 10 % de CO2, et préférentiellement 5 % de CO2.

Applications des co-cultures nerf-muscle miniaturisées Les cultures mixtes de l'invention sont utilisables pour la réalisation de diverses études biologiques, telles que par exemple des études d'efficacité, de toxicité, des analyses génétiques, des criblages, etc.

Les co-cultures nerfs-muscles de l'invention peuvent être utilisées pour étudier l'effet de drogues sur la synaptogénèse et la myogénèse dans des conditions normales ou pathologiques.

Comme les muscles se contractent spontanément après innervation, cette co-culture nerfmuscle est un modèle parfaitement adapté pour étudier l'influence de différentes molécules sur la mise en place et le fonctionnement de l'unité motrice, en mesurant par exemple, la fréquence de contractions musculaires, la superficie des zones d'innervation au niveau des muscles, le dénombrement et la longueur des neurites, etc.

Cette co-culture en microplaque de culture de 12,24, 48 et 96 puits est un modèle parfaitement adapté pour le criblage de produits ayant des propriétés myostimulantes ou myorelaxante. Cette étude peut se faire en comptant la fréquence de contraction sous microscope inversé. Cette analyse peut être automatisée par l'utilisation d'un analyseur d'images.

Les surnageant de culture peuvent également être récupérés dans les puits de culture des microplaques de culture de 12,24, 48 et 96 puits afin de réaliser des dosages.

Les cellules peuvent être marquées directement dans les puits avec des anticorps ou autres sondes et analysées avec des méthodes classiques (immuno-marquages). Il est possible de faire de l'analyse d'images en microscopie optique après marquage fluorescent pour analyser le degré d'innervation, avec possibilité d'automatisation des analyses grâce aux platines motorisées assistées par ordinateurs.

Il est possible à partir de ces cultures, d'augmenter le nombre de points par essai et d'automatiser les analyses.

Un objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une co-culture telle que définie ci-avant pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, notamment sur la contraction musculaire, l'activité des synapses, l'innervation, etc.

L'invention est particulièrement adaptée à la sélection, l'identification, la caractérisation

ou l'optimisation de composés myostimulants ou myorelaxants. De tels composés présentent des applications pour le traitement de conditions pathologiques variées, comme les maladies neurodégénératives, musculaires, motrices, etc. On peut citer les myopathies, scléroses, amyotrophies, plasticités nerveuses, etc.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une co-culture telle que définie ci-avant pour l'évaluation de la toxicité ou d'effets secondaires d'une molécule.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une co-culture telle que définie ci-avant pour l'évaluation des mécanismes de signalisation induits par une molécule ou pour l'étude des gènes induits ou régulés par une molécule.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une co-culture telle que définie ci-avant et la détermination de l'activité de cette molécule sur ladite co-culture. L'activité peut être déterminée en mesurant, par exemple, la fréquence des contractions musculaires, la superficie des zones d'innervation au niveau des muscles, le nombre et la longueur des neurites, la présence de facteurs (e. g., neurotransmetteurs) dans le surnageant des cultures, la présence de marqueurs à la surface des cellules, etc.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour l'évaluation de la toxicité de composés, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une co-culture telle que définie ci-avant et la détermination de la toxicité de cette molécule sur ladite co-culture.

La toxicité peut être évaluée en mesurant, par exemple, la fréquence des contractions musculaires, la superficie des zones d'innervation au niveau des muscles, le nombre et la longueur des neurites, la présence de facteurs (e. g., neurotransmetteurs) dans le surnageant des cultures, la présence de marqueurs à la surface des cellules, etc.

Un autre objet de l'invention réside dans les molécules identifiées, sélectionnées, caractérisées ou optimisées par les méthodes décrites ci-avant, ainsi que les homologues de ces molécules et leurs utilisations thérapeutiques. L'invention concerne également un

procédé de préparation d'un composé d'intérêt, comprenant (i) la mise en contact de composés avec une co-culture telle que définie ci-avant, (ii) la sélection de composés actifs ou présentant les propriétés souhaitées, (iii) la production du ou des composés sélectionnés ou d'un analogue structural de ceux-ci.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'un médicament, comprenant (i) la mise en contact de composés avec une co-culture telle que définie ciavant, (ii) la sélection de composés actifs ou présentant les propriétés souhaitées, (iii) la production du ou des composés sélectionnés ou d'un analogue structural de ceux-ci et (iv) le mélange dudit composé avec un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.

D'autres avantages et aspects de la présente demande apparaîtront à la lecture des

exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Exemple 1 : culture nerf-muscle contractile A-Culture de cellules musculaires
1-Traitement des biopsies fraîches Les cultures primaires de cellules satellites sont obtenues à partir d'explants provenant de biopsies musculaires humaines selon le protocole décrit par Askanas et Engel (1975).

Une fois prélevée la biopsie est conservée dans un récipient contenant du milieu HBSS (milieu de Hanks) contenant du calcium et du magnésium ainsi qu'un mélange d'antibiotiques. Une fois débarrassée des gaines des tendons, la biopsie est découpée en petits fragments qui sont ensuite mis à incuber une nuit à 37 C dans une atmosphère saturé en humidité contenant 5 % C02 dans du milieu M199 supplémenté de 37,5 % de sérum de veau foetal et de 1,25 % d'antibiotiques 100 X.

Les explants sont ensuite découpés en fragments de 0,5 à 1 cm de longueur et mis en culture. Cette étape permet d'épuiser les fragments en cellules fibroblastiques. Les

explants sont déposés dans un mélange composé de plasma humain et de milieu de culture composé de M199 complété par 37,5 de SVF et de 1,25 % d'antibiotique 100 X.

Au bout de 8 jours les fibroblastes sortent des explants et forment une couronne. Les explants sont retirés du coagulum en prenant soin d'éliminer la couronne de fibroblastes.

2-Explantation Les explants sont alors découpés en petits fragments de 0,5 à 1 mm de côté et déposés dans des boites pétri pré-revêtue d'un mélange de plasma humain et de gélatine à 1,5 %, à raison de 1 à 2 fragments pour 2 cm2 de surface cultivable. Ils sont incubés pendant 5 à 10 jours dans un mélange de 75 % de milieu MEM et de 25 % de milieu 199 complété par 10 % de SVF, de 1 % d'antibiotiques 100 X, de 10 gg/ml d'insuline, de 1 % de glutamine 100 X, de 5 ng/ml de FGFb et de 10 ng/ml de EGF.

Du milieu HAM F14 (Askanas et Engel, 1975) avec les mêmes additifs peut être utilisé ou tout autre milieu permettant le développement des cellules satellites.

Après 5 à 10 jours de culture, les explants sont retirés. Après 2 à 5 jours de culture, les espaces laissés libres par les explants sont colonisés par des cellules satellites.

Les explants peuvent être ré-explantés une deuxième fois et une troisième fois selon la même méthode pour obtenir les cellules satellites.

3-Subculture des cellules satellites Les cellules satellites issues de ces biopsies sont récupérées par dissociation enzymatique et ensemencées à raison de 2 000 à 20 000 cellules par cm2 dans des boites de culture de 100 mm de diamètre préalablement traitées avec une solution de 1 à 0,05 % de gélatine et cultivées dans un mélange de milieu composé de 75 % de MEM et de 25 % de milieu 199 complété par 10 % de SVF, de 1 % d'antibiotiques, de 10 tg/ml d'insuline, de 1 % de glutamine, de 5 tg/ml de FGFb et de 10 u. g/ml de EGF.

Du milieu HAM F14 peut être utilisé ou tout autre milieu permettant le développement des cellules satellites.

Quand les cellules sont à confluence, elles sont détachées et dissociées par une solution de trypsine à 0,025 % en solution saline. Elles sont ensuite soit sub-cultivées dans le même du milieu à la densité de 2 000 à 20 000 cellules par cm2 soit congelées dans du milieu de culture MEM contenant 20 % de SVF et 10 % DMSO.

B-Innervation Les cellules satellites sont ensemencées entre 2 000 à 100 000 cellules par cm2 dans des puits de microplaques de culture de 12,24, 48 ou 96 puits préalablement traités par de la gélatine à la concentration de 1 % à 0,1 %.

Elles sont cultivées dans un mélange de milieu composé de 75 % de MEM et de 25 % de milieu 199 complété par 10 % de SVF, de 1 % d'antibiotiques, de 10 g/ml d'insuline, de 1 % de glutamine, de 5 ug/ml de FGFb et de 10 ug/ml de EGF.

Du milieu HAM F14 (Askanas et Engel, 1975) peut être utilisé ou tout autre milieu permettant le développement des cellules satellites.

Après 1 jour à 15 jours de culture, les cellules satellites vont devenir confluentes et quelques cellules satellites vont fusionner en myotubes (structures plurinucléées). La durée de culture est dépendante de la densité cellulaire.

A ce stade de la confluence et de la fusion, le milieu de culture est retiré et des explants de moelle épinière contenant les ganglions rachidiens d'embryon de rat de 12 à 19 jours et préférentiellement 13 à 14 jours sont déposés sur la monocouche cellulaire à raison de un à deux explants par puits. Après adhésion des explants, du milieu de culture composé d'un mélange de 75 % de MEM et de 25 % de milieu 199 complété par 5 à 10 % de SVF, de 1 % d'antibiotiques, de 10 ug/ml d'insuline, de 1 % de glutamine est déposé dans les puits de culture. Ce milieu doit être changé de une à deux fois par semaine.

Le milieu de culture peut être remplacé par du milieu de culture défini. Il est possible de remplacer ces explants par des explants d'embryons d'autres origines (souris, homme ou autre vertébré ou invertébré) ou par d'autres cellules nerveuses ou par des cellules souches de différentes origines.

Dans ces conditions, dès vingt quatre (24) heures de co-culture, la croissance des neurites est visible en dehors de l'explant de moelle épinière. Les premières contractions des fibres musculaires sont observées après cinq (5) à six (6) jours de co-culture, et après trois (3) semaines les fibres musculaires au voisinage des explants se contractent. A ce stade, ces fibres musculaires sont striées et possèdent des jonctions neuromusculaires différenciées (Martinuzzi et al., J. Neurochem 1990 ; 54 (1) : 223-229). Ces cultures peuvent être gardées plusieurs mois sans que les cellules musculaires perdent leur activité contractile.

C-Transport Après un jour et préférentiellement après 15 jours de co-culture, les microplaques de culture peuvent être transportées pendant 24 à 72 heures à une température de 18 à 37 C.

Pour le transport, les puits de culture sont remplis de milieu de culture composé d'un mélange de 75 % de MEM et de 25 % de milieu 199 complété par 5 à 10 % de SVF, de 1 % d'antibiotiques, de 10 ug/ml d'insuline, de 1 % de glutamine. Ce milieu de culture peut être remplacé par du milieu Leibovitz complété par 5 à 10 % de SVF, de 1 % d'antibiotiques, de 10 u. g/ml d'insuline, de 1 % de glutamine. Ce dernier milieu permet de limiter les fluctuations de pH pendant le transport.

Le couvercle d'étanchéité est alors inséré sur les puits de cultures des microplaques. Le couvercle de culture classique est ensuite posé par-dessus et solidarisé par un film adhésif. Les microplaques de culture sont alors prêtes à être transportées. Elles sont présentées sous forme de kit comprenant une notice explicative sur la manipulation des cultures et le changement de milieu de culture ainsi que le milieu de culture nécessaire à l'entretien des co-cultures pour une période de une semaine à deux mois.

Exemple 2 : Analyses des co-cultures miniaturisées en microplaques nerf-muscle contractiles Ce modèle miniaturisé et transportable permet de réaliser des criblages de plusieurs molécules soit dans le laboratoire où ont été réalisées les co-cultures soit dans le laboratoire ayant reçu les co-cultures.

Les molécules testées peuvent avoir des effets sur la maturation, la différenciation, la récupération de propriétés des motoneurones et des cellules musculaires, des propriétés myostimulantes ou myorelaxantes ou d'autres propriétés touchant le mécanisme de l'activité contractile des muscles striés.

Sur ces co-cultures nerf-muscle, après un jour de culture : 'peut être réalisé le dénombrement des neurites et la mesure de leur longueur à différents temps. Le dénombrement est réalisé en comptant les fibres émergeant de l'explant par observation au microscope à contraste de phase. C'est le reflet du nombre de motoneurones étendant leur axone par explant. Ce comptage peut être réalisé après 1 jour de culture sur plusieurs puits en présence de différentes molécules soit dans le laboratoire où à été réalisé les co-cultures soit dans un autre laboratoire ayant reçu les co-cultures.

Il est possible de quantifier l'innervation : Cela correspond au pourcentage d'explants ayant réussi à innerver les cellules musculaires dans plusieurs puits de culture des microplaques en présence de différentes molécules.

'II est possible de doser, par des techniques ELISA, la libération de cytokines ou de facteurs de croissance dans le surnageant de culture 'II est possible de marquer les cellules dans les puits avec des anticorps et d'analyser la fixation des anticorps ou autres sondes par des méthodes classiques (immuno- marquages).

* Il est possible de faire de l'analyse d'images en microscopie optique après marquage fluorescent pour analyser le degré d'innervation.

* Il est possible de compter les contractions musculaires et ainsi d'étudier l'influence de l'environnement sur ces contractions.

* Il est possible d'automatiser les dosages et analyses précédentes grâce aux platines motorisées montées sur microscopes à statifs inversés : dosages ELISA, analyses d'images, comptage de contractions.

Les résultats obtenus ont montré qu'il était possible de cultiver des cellules musculaires et des explants de moelle épinière dans des puits de micro plaque de culture de 12,24, 48 et 96 puits et que les cellules musculaires étaient capables de présenter des contractions.

Les premières contractions des fibres musculaires ont été observées après cinq (5) à six (6) jours de co-culture et après trois (3) semaines, toutes les fibres musculaires innervées par les neurones moteurs issus des explants se contractent. A ce stade, ces fibres musculaires sont striées et possèdent des jonctions neuromusculaires différenciées. Les cellules musculaires innervées peuvent survivre et se contractent pendant plusieurs mois.

Les résultats obtenus montrent également que ce modèle peut être transporté grâce à un système de couvercle d'étanchéité dès le premier jour de co-culture.

Des études fonctionnelles d'activité ont également été réalisées et ont permis de montrer que des produits telles que la tétrodotoxine (TTX) étaient capables d'inhiber de façon réversible la contraction musculaire, confirmant la fonctionnalité des tissus contractiles de l'invention.

Le tableau n 1 ci-après donne la fréquence de contraction en fonction de la concentration de tétrodotoxine (TTX). L'étude a été réalisée, pour chaque condition, sur 5 fibres musculaires sélectionnées dans des puits de culture différents de plaque 24 puits.

<tb>
<tb> tétrodotoxine <SEP> (TTX) <SEP> fréquence <SEP> des <SEP> contractions
<tb> % <SEP> +/-écart <SEP> type
<tb> Contrôle <SEP> (0 <SEP> mM <SEP> TTX) <SEP> 100+/-0
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> mM102+/-23
<tb> 1, <SEP> 00 <SEP> mM <SEP> 59 <SEP> +/-17
<tb> 10, <SEP> 00 <SEP> mM <SEP> 0+/-0
<tb>

Ces résultats confirment donc que les tissus miniaturisés selon l'invention sont fonctionnels, transportables, stables dans le temps et reproductifs des conditions physiologiques de la contraction et des jonctions neuro-musculaires. Ils constituent donc des modèles très avantageux pour la réalisation d'étude biologiques variées.

Claims

Revendications

1. Co-culture miniaturisée nerf-muscle, caractérisée en ce qu'elle comprend, sur un support ayant une surface de culture inférieure à environ 5 cm2, des cellules musculaires innervées par des neurones, en ce qu'elle possède la propriété de se contracter.

2. Co-culture selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support de culture est un puits d'une plaque multi-puits.

3. Co-culture selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support de culture est un puits d'une plaque de culture de 12, 24, 48 ou 96 puits.

4. Co-culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la surface du support de culture est recouverte d'une matrice biologique permettant l'adhésion des cellules musculaires.

5. Co-culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les cellules musculaires sont des cellules isolées à partir de muscles normaux ou pathologiques de vertébrés ou d'invertébrés, de préférence de mammifères, en particulier d'origine humaine, ou préparées à partir de cellules souches de vertébrés ou d'invertébrés, de préférence de mammifères, en particulier d'origine humaine, qui sont capables dans des conditions de cultures adaptées de se multiplier et de fusionner pour former des myofibres musculaires.

6. Co-culture selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les cellules nerveuses proviennent d'explants de moelle épinière et de ganglion rachidien de mammifères non-humains sains ou pathologiques.

7. Co-culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les cellules nerveuses comprennent des motoneurones.

8. Co-culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les cellules nerveuses comprennent des neurones sensitifs.

9. Co-culture miniaturisée nerf-muscle contractile selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules musculaires cultivées avec un ou deux explants de moelle épinière et de ganglion rachidien dans un puits de microplaque de culture de 12, 24, 48 ou 96 puits.

10. Kit, caractérisé en ce qu'il comprend, dans un support adapté, une pluralité de co-cultures selon l'une des revendications 1 à 9.

11. Kit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une plaque multipuits, chacun ou plusieurs desdits puits de la plaque comprenant une co-culture.

12. Kit selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comporte un couvercle étanche permettant le transport des co-cultures.

13. Utilisation d'une co-culture selon l'une des revendications 1 à 9 ou d'un kit selon l'une des revendications 10 à 12 pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, notamment sur la contraction musculaire.

14. Utilisation d'une co-culture selon l'une des revendications 1 à 9 ou d'un kit selon l'une des revendications 10 à 12 pour l'évaluation de la toxicité ou des effets secondaires d'une molécule.

15. Méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une co-culture selon l'une des revendications 1 à 9 ou un kit selon l'une des revendications 10 à 12 et la détermination de l'activité de cette molécule sur ladite co-culture.

16. Méthode pour l'évaluation de la toxicité de composés, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une co-culture selon l'une des revendications 1 à 9 ou un kit selon l'une des revendications 10 à 12 et la détermination de la toxicité de cette molécule sur ladite co-culture.