FR2829709A1 - Dispositif de transfert de fluide pour essais in vitro - Google Patents

Abstract

Le dispositif de transfert de fluide selon l'invention comprend un support de distribution comprenant au moins un puits de distribution 1, un adaptateur 2 comprenant au moins un orifice 5, un support de réception comprenant au moins un puits de réception 1' situé en face du puits de distribution, et éventuellement un cornpartiment de filtration 3. Les supports peuvent être des microplaques multipuits. L'invention a également pour objet l'adaptateur en tant que tel. Le dispositif selon l'invention permet de réaliser des essais impliquant des transferts de fluide sans pipetage, et permet également de réaliser plusieurs mesure successives sur un même échantillon.

Description

<Desc/Clms Page number 1>

DISPOSITIF DE TRANSFERT DE FLUIDE POUR ESSAIS IN VITRO L'invention concerne un dispositif ou outil de laboratoire pour effectuer des essais in vitro impliquant un ou plusieurs transferts de fluide, adaptable à tout support d'essais, qu'il soit monopuits ou multipuits.

Différents dispositifs ont été développés afin de faciliter la réalisation d'essais in vitro. En plus d'une augmentation du nombre d'essais simultanés, on cherche également à réduire les sources d'erreur de mesure, le temps de manipulation lors d'un essai, et à améliorer l'automatisation des mesures.

Ainsi, on utilise de manière courante dans les laboratoires des plaques multipuits qui permettent de réaliser le même essai simultanément sur plusieurs échantillons, par exemple des plaques de 96 puits. De telles plaques ont été développées afin d'augmenter sensiblement la vitesse de traitement d'un nombre élevé d'échantillons, c'est-à-dire le débit.

On connaît également des dispositifs appelés kits de diagnostic, utilisés très largement que ce soit en cosmétologie, dans l'industrie pharmaceutique, ou en toxicologie cellulaire et moléculaire, notamment pour évaluer l'innocuité de molécules ou produits finis, ainsi qu'un certain nombre de dispositifs multipuits comprenant un moyen de filtration.

On citera en particulier le brevet EP 408 940 qui décrit un dispositif de filtration comprenant une membrane formant filtre pouvant être séparée du reste du dispositif pour être analysée, postérieurement à la filtration.

On peut également citer le brevet EP 403 679 qui décrit un appareil de filtration, comprenant une première

<Desc/Clms Page number 2>

plaque dont les puits sont ouverts d'un côté et comprennent un filtre à membrane de l'autre côté, une deuxième plaque dont les puits (placés en face de ceux de la première plaque) comprennent dans leur extrémité fermée un trou muni d'un bec verseur de taille et forme particulières de façon à contrôler le passage de liquide en fonction de la pression, ainsi qu'un réceptable de réception.

Enfin, on citera la demande de brevet W099/51349 qui décrit un dispositif permettant le transfert de petits volumes de liquide, à haut débit, d'une microplaque à une membrane ou à une autre microplaque, en particulier des plaques de 1536 puits. Dans ce dispositif, les plaques sont maintenues serrées par utilisation d'un moyen d'attache ou de serrage, tel qu'un système de vis et d'écrous.

Ces outils ou dispositifs ont permis d'augmenter le débit de réalisation des tests et de limiter les risques d'erreur.

Cependant, certains problèmes subsistent, qui peuvent être liés à des difficultés de manipulation, à la durée de réalisation de l'essai, au manque de reproductibilité, à l'existence de source d'erreur dans la mesure, à un risque de contamination, etc. En particulier, dans beaucoup d'essais, il est nécessaire d'effectuer une opération de pipettage ou de filtration à un moment ou un autre du mode opératoire.

De plus, les dispositifs actuellement sur le marché ne permettent pas toutes les mesures à partir d'un même échantillon. Dans le cadre d'essais de toxicologie par exemple, ils ne permettent pas de mesurer à partir d'un même échantillon les produits présents dans le milieu

<Desc/Clms Page number 3>

extracellulaire et ceux présents dans le milieu intracellulaire.

Après de nombreux essais, la Demanderesse a développé un nouvel outil, permettant de s'affranchir des inconvénients de l'art antérieur.

L'outil ou dispositif de transfert de fluide pour essais in vitro selon l'invention permet de réaliser sans pipettage des essais impliquant un ou plusieurs transferts de fluide ou liquide. De plus il permet de réaliser plusieurs mesures successives à partir d'un échantillon unique. Il est par ailleurs simple à assembler et à utiliser.

D'autres avantages sont obtenus. Le transfert d'une fraction ou de la totalité d'un fluide peut être effectué en une seule étape. Le dispositif permet, en limitant les opérations manuelles et en simplifiant la mise en oeuvre, de réduire les risques d'erreur et d'obtenir un gain de temps appréciable. Il limite la création d'aérosols, protégeant ainsi le manipulateur, et protégeant également l'expérimentation des contaminations croisées susceptibles d'être générées d'un puits à l'autre dans le cas d'un support multipuits. Il peut être utilisé à haut débit. Il permet d'obtenir plusieurs mesures à partir d'un échantillon unique : d'une part, des produits relargués ou synthétisés dans le milieu extracellulaire et, d'autre part, des produits contenus ou retenus dans le milieu intracellulaire.

D'une manière générale, il peut être utilisé par exemple dans le cadre de culture cellulaire, immunotitration, HTS ( high throughput screening ou criblage à haut débit), fluorescence, Deepwell, stockage, PCR ( Polymerase Chain Reaction ou Amplification en Chaîne par Polymérase).

<Desc/Clms Page number 4>

Le dispositif selon l'invention est utilisable avec tout type de support d'essais, que ce soit des tubes, des microplaques ou autres, qu'il soit mono ou multipuits.

A titre d'exemple, il peut être utilisé avec des plaques de 6,12, 24,96, 384,1536 et 3072 puits. Le dispositif selon l'invention est particulièrement adapté pour être utilisé avec des plaques multipuits, par exemple les plaques 96 puits couramment utilisées. Les puits du support peuvent présenter des sections de toute forme appropriée, par exemple ronde ou carrée ; à fond plat, en U, en V ou à filtre.

Dans la présente demande de brevet, le terme puits désigne un compartiment fermé à une extrémité et ouvert à l'autre extrémité, et pouvant contenir l'échantillon qui fait l'objet de l'essai ou un réactif. Le support d'essais peut être monopuits, par exemple un tube, ou multipuits, par exemple une microplaque. Afin d'atteindre un débit intéressant, il est préférable d'utiliser des supports multipuits, un nombre élevé de puits permettant de réaliser un nombre élevé d'essais simultanés. On peut par exemple utiliser dans certains cas des plaques à 1536 puits.

Le dispositif de transfert de fluide selon l'invention comprend un support de distribution comprenant au moins un puits de distribution, un adaptateur, et un support de réception comprenant au moins un puits de réception. Lorsque le dispositif est assemblé, un puits de distribution, un orifice de l'adaptateur et un orifice de réception sont situés en face l'un de l'autre, l'orifice de l'adaptateur étant entre le puits de distribution et le puits de réception et les extrémités ouvertes du puits de distribution et du puits de réception se faisant face. Si l'on utilise des supports multipuits, chaque puits de

<Desc/Clms Page number 5>

réception est de préférence situé en face de chaque orifice d'adaptateur et de chaque puits de distribution.

Les supports de distribution et de réception peuvent être tout type de support d'essais, comme on l'a précisé plus haut. On citera à titre d'exemples de supports de distribution ou de réception les microplaques 96 puits pour culture cellulaire (Référence 003599 COSTAR), ou les microplaques 96 puits d'immunotitration (Référence 650101 COSTAR).

L'adaptateur est une pièce particulière, nouvelle, qui permet d'assurer l'assemblage et l'étanchéité entre chaque puits de distribution et chaque puits de réception et qui permet la mise en oeuvre du dispositif selon l'invention. L'invention a également pour objet l'adaptateur. L'adaptateur pour dispositif de transfert de fluide comprend un support comprenant au moins un orifice ouvert aux deux extrémités, ledit orifice étant muni à chaque extrémité d'un rebord. Le nombre d'orifices peut être égal aux nombres de puits des supports de distribution et de réception. A titre d'exemple, l'adaptateur peut comprendre 6,12, 24,96, 384 ou 3072 orifices.

Les rebords de chaque orifice permettent d'obtenir un assemblage sensiblement étanche entre le support de distribution et l'adaptateur, d'une part, et l'adaptateur et le support de réception, d'autre part.

Dans un mode de réalisation, le ou les orifices de l'adaptateur sont d'un diamètre ou section légèrement inférieur (e) à celui ou celle des puits du support, de façon à ce que chaque orifice de l'adaptateur puisse être inséré à l'intérieur de chaque puits des supports de distribution et de réception lors de l'assemblage. Dans un autre mode de réalisation, chaque orifice de l'adaptateur

<Desc/Clms Page number 6>

est de section ou diamètre sensiblement identique à celle de chaque puits, mais les rebords dudit orifice sont de section ou diamètre légèrement inférieur pour permettre l'insertion. Le matériau utilisé pour l'adaptateur peut être un matériau rigide, tel que par exemple le polyéthylène, le polystyrène, ou le polypropylène, ou un matériau non rigide c'est-à-dire déformable, tel que par exemple le silicone, le latex, le PVC ou le polyuréthane. On peut aussi envisager un adaptateur en un matériau rigide excepté pour les rebords du ou des orifices, en un matériau non rigide. Dans le cas de rebords en un matériau déformable, il n'est pas utile que le diamètre ou section des rebords de l'orifice soit inférieur à celui du puits, il peut être égal ou sensiblement égal, voire même supérieur : le caractère déformable du matériau permet l'insertion, et l'étanchéité peut même être renforcée si le diamètre ou section est égal ou un peu supérieure. L'homme de l'art saura déterminer les diamètres ou sections relatives afin de permettre un assemblage sensiblement étanche.

Les dimensions du support de l'adaptateur sont dans un mode de réalisation égales ou sensiblement égales aux dimensions des supports de distribution et de réception, elles-mêmes égales ou sensiblement égales entre elles.

Dans un autre mode de réalisation, le dispositif selon l'invention comprend en outre un compartiment de filtration, c'est-à-dire un compartiment pourvu d'un moyen de filtration, positionné entre l'adaptateur et le support de réception. Le moyen de filtration peut être une membrane de filtration.

<Desc/Clms Page number 7>

On citera à titre d'exemple de compartiment de filtration les microplaques 96 puits à filtre (Références 3504,3505, 3510 ou 3511 CORNING).

Le transfert de fluide se fait de chaque puits de distribution vers chaque puits de réception, sans pipettage. Il peut se faire par tout moyen approprié, par exemple par centrifugation, ou par aspiration ou dépression sur ou depuis la membrane de filtration de porosité adaptée.

Un puits de réception ou de distribution ou un orifice de l'adaptateur peut être traité au préalable et contenir un réactif, de façon à générer une réaction spécifique, par exemple une réaction de détection, d'amplification ou de quantification, pendant ou après la phase de transfert, ou de façon à créer un milieu particulier.

Dans le cadre de la présente demande de brevet, le terme réactif désigne le ou les composé (s) et/ou la ou les solution (s) réactionnelle (s) nécessaire (s) à l'utilisation envisagée du dispositif. Il peut s'agir par exemple d'une solution d'amplification, d'un principe actif plus ou moins dilué dans une solution ou dans un tampon, d'un tampon de lyse, d'un milieu de culture, d'un colorant, d'un tampon phosphate, de cellules, de liposomes, etc., ou d'une combinaison de l'un ou l'autre de ces exemples.

Dans le cadre de la présente demande, le terme fluide désigne le contenu des puits ou orifices des supports et de l'adaptateur du dispositif, c'est-à-dire le réactif et/ou l'échantillon à tester, que ce soit un liquide, un fluide, un liquide ou fluide contenant des particules telles que des cellules ou fragments de cellules ou réactif solide, un réactif solide, etc.

<Desc/Clms Page number 8>

Lorsque l'on effectue plusieurs mesures successives, le support de réception de la mesure n peut devenir le support de distribution de la mesure n+1.

La mesure objet de l'essai peut être faite dans chaque puits de réception. Elle dépendra bien entendu de l'essai effectué et de l'utilisation envisagée. En effet, le dispositif selon l'invention peut être utilisé dans tous les tests biologiques et biochimiques mettant en oeuvre l'évaluation qualitative ou quantitative d'un composé et dans les cultures cellulaires, nécessitant une ou plusieurs étapes de transfert de fluide. Le composé faisant l'objet de la mesure peut être par exemple relargué, accumulé ou synthétisé par des cellules adhérentes ou en suspension, ou par tout autre système organique s'apparentant à des cellules (liposomes, bactéries, virus, etc. ). On pourra par exemple mesurer en une étape unique un composé dans le liquide extracellulaire et/ou dans le liquide intracellulaire, ou mesurer le composé dans une première étape dans le liquide extracellulaire puis dans une deuxième étape, après avoir lysé les cellules, dans le liquide intracellulaire.

Les cellules ou le système organique s'apparentant à des cellules peuvent être placées dans le puits de distribution, ou au niveau de la membrane de filtration, du côté de l'adaptateur.

La membrane de filtration peut également être utilisée comme matrice pour réaliser des cultures cellulaires tridimensionnelles en gel (agarose, alginate, collagène, méthylcellulose) ou en éponge.

L'invention a également pour objet un adaptateur selon l'invention comprenant dans au moins un orifice un réactif maintenu dans ledit orifice grâce à un moyen de

<Desc/Clms Page number 9>

fermeture approprié, tel qu'un film plastique ou un film d'aluminium, collé ou thermosoudé.

L'invention a également pour objet un kit comprenant le dispositif selon l'invention, dans lequel au moins un puits ou un orifice contient au moins un réactif, maintenu dans le puits ou l'orifice grâce à un moyen de fermeture approprié, tel qu'un film plastique ou un film d'aluminium, collé ou thermosoudé. La nature, la quantité et la localisation du réactif dépend de l'utilisation du kit.

L'invention a également pour objet une méthode d'analyse in vitro dans laquelle : a) on retire si nécessaire le moyen de fermeture d'un support de distribution comprenant au moins un puits de distribution et/ou d'un adaptateur comprenant au moins un orifice et/ou d'un support de réception comprenant au moins un orifice de réception, pouvant former un dispositif ou kit selon l'invention, b) on place un ou plusieurs échantillons à analyser dans un ou plusieurs puits du support de distribution ou du support de réception, contenant éventuellement un réactif approprié, c) on assemble le support de distribution, l'adaptateur et le support de réception pour former le dispositif selon l'invention, le ou les orifices et/ou puits contenant éventuellement un réactif approprié, d) on procède au transfert de fluide par tout moyen approprié, sans pipettage, e) on désassemble le dispositif, f) on effectue la mesure souhaitée dans le ou les puits de réception.

<Desc/Clms Page number 10>

L'étape c) peut de surcroît comprendre l'incorporation d'un compartiment de filtration lors de l'assemblage.

L'étape d) peut se faire notamment par centrifugation, ou dépression ou aspiration sur ou depuis une plaque à filtre, ou tout autre moyen approprié.

Lors de l'assemblage, qui est très rapide, compte tenu des très faibles volumes manipulés et du faible diamètre des puits, en particulier pour les supports de type plaques 96,384 puits et plus, les liquides (parfois visqueux) sont en fait adsorbés au fond des puits et ne coulent donc pas, même en cas de retournement du support/adaptateur les contenant. Pour les supports à puits plus grands, si l'on observe des risques d'écoulement, on peut utiliser un compartiment de filtration ou moyen de filtrage.

Dans un mode de réalisation particulier, on effectue plusieurs mesures successives sur le même échantillon, et le support de réception d'une mesure n devient le support de distribution de la mesure n+1.

Dans un mode de réalisation, les rebords de chaque orifice de l'adaptateur servent de moyen d'ouverture du ou des moyens de fermeture du support de réception (en fait des puits du support de réception) et/ou du support de distribution (en fait des puits du support de distribution), permettant leur ouverture automatique lors de l'assemblage.

Les rebords des orifices peuvent être droits ou sensiblement droits, c'est-à-dire parallèles à l'axe passant par le centre de l'orifice et perpendiculaire au support. Ils peuvent également comprendre une partie droite, qui assure l'étanchéité, et une partie formant un

<Desc/Clms Page number 11>

angle avec ledit axe, qui assure l'ouverture du puits correspondant lors de l'assemblage.

A titre d'exemples non limitatifs d'essais réalisables avec le dispositif, kit et adaptateur selon l'invention, on citera le test de lyse des globules rouges, le dosage de la lactate déshydrogénase, le dosage du glutathion, le dosage du malonaldéhyde, le dosage d'acides aminés comme la glutamine, le dosage de la phosphatase acide ou tout autre dosage à partir de surnageant de culture ou de lysat cellulaire.

On peut également utiliser le dispositif, le kit et l'adaptateur selon l'invention dans toute méthode d'étude de la cytotoxicité, telle que les méthodes fondées essentiellement sur la perturbation de la perméabilité membranaire et les méthodes fondées sur des altérations de la prolifération qui utilisent des colorants (colorants d'exclusion tels que le bleu trypan, l'éosine Y,... ; colorants d'inclusion tels que le rouge neutre, le vert janus,... ; ou colorants nécessitant une étape de métabolisation tels que la fluorescéine, le Formazan,...), réalisées en milieu liquide ou solide (gel ou éponge).

Le dispositif, kit ou adaptateur selon l'invention peut également être utilisé pour les étapes de lavages lors de tests ELISA, et dans des technique d'extraction ou de purification d'acides nucléiques ou protéines.

Le dispositif, kit ou adaptateur selon l'invention peut également être utilisé pour réaliser la culture conjointe de plusieurs types cellulaires. Par exemple, l'atteinte embryolétale ou tératogène d'un composé peut être évalué en pharmacologie par des méthodes d'études de cytotoxicité sur des co-cultures de cellules hépatiques et de cellules embryonnaires. Pour cela, le produit suspect est mis en contact, d'une part, avec des cellules

<Desc/Clms Page number 12>

embryonnaires seules, et, d'autre part, avec cellules embryonnaires en co-culture avec des cellules hépatiques.

La mise en contact avec des cellules en co-culture peut être effectuée de la façon suivante. Un premier type de cellules est ensemencé dans une plaque multipuits, par exemple une plaque 96 puits, et un second type de cellules est ensemencé dans une autre plaque multipuits, par exemple une plaque 96 puits. Après adhésion des cellules au support de culture, le produit à l'essai est mis au contact des cellules puis les deux plaques multipuits sont assemblées à l'aide de l'adaptateur. Le dispositif complet est ensuite fixé sur un mélange rotateur (par exemple A19000 ou A94251 de Fischer Bioblock Scientific) placé à l'intérieur d'un incubateur à C02. Grâce au dispositif, le transfert du milieu de culture, contenant entre autre le produit à tester, est permis de façon cyclique entre les deux populations cellulaires.

L'invention a donc également pour objet l'utilisation de l'adaptateur, de dispositif ou du kit selon l'invention dans une méthode d'analyse in vitro. La méthode d'analyse in vitro peut être notamment choisie parmi toutes les méthodes citées dans la présente demande, à savoir culture et co-culture cellulaire, immunotitration, HTS, fluorescence, Deepwell, stockage, PCR, cytotoxicité, test de lyse des globules rouges, dosage de la lactate déshydrogénase, dosage du glutathion, dosage du malonaldéhyde, dosage d'acides aminés, dosage de la phosphatase acide ou tout autre dosage à partir de surnageant de culture ou de lysat cellulaire, lavages lors de tests ELISA, extraction ou purification d'acides nucléiques ou protéines, etc.

L'invention sera décrite plus en détails en référence aux figures jointes, dans lesquelles :

<Desc/Clms Page number 13>

- la figure 1 représente schématiquement un dispositif selon l'invention, dans deux modes de réalisation, - la figure 2 représente schématiquement, en perspective, un adaptateur selon l'invention, - les figures 3a et 3b représentent schématiquement un adaptateur selon l'invention, - les figures 4a et 4b représentent schématiquement un adaptateur selon l'invention, - la figure 5 représente les résultats de l'exemple
1.

Le dispositif représenté en\ figure 1 comprend un support comprenant un puits de distribution 1, un adaptateur 2 comprenant un orifice 5 muni de rebords 6 droits, et un support comprenant un puits de réception 1'.

Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif selon l'invention comprend en outre un compartiment de filtration 3 pourvu d'une membrane.

La figure 2 représente un adaptateur 2 selon l'invention. Dans le mode de réalisation représenté, cet adaptateur comprend une plaque 4 qui correspond en dimensions aux plaques utilisées comme support, munie de 96 orifices 5 qui seront chacun positionnés, une fois le dispositif selon l'invention assemblé, entre un puits de distribution et un puits de réception, afin de permettre le transfert de fluide d'un puits vers l'autre.

L'étanchéité du dispositif d'essais selon l'invention comprenant l'adaptateur selon l'invention est assuré au moyen de rebords 6 présents au niveau des deux extrémités ouvertes de chaque orifice de l'adaptateur.

Les figures 3 représentent schématiquement, vu de dessus (3a) et en coupe (3b), un adaptateur 2 selon l'invention comprenant 96 orifices 5 munis de rebords 6,

<Desc/Clms Page number 14>

qui peut donc être utilisé avec une plaque connue de 96 puits. Les orifices de cet adaptateur sont de section circulaire.

Les figures 4 représentent schématiquement, vu de dessus (4a) et en coupe (4b), un adaptateur 2 selon l'invention comprenant 384 orifices 5 munis de rebords 6, qui peut donc être utilisé avec une plaque connue de 384 puits. Les orifices de cet adaptateur sont de section carrée.

D'autres modes de réalisation de l'adaptateur selon l'invention peuvent être envisagés, non représentés ici.

Les avantages du dispositif selon l'invention sont illustrés par les exemples ci-après.

Exemple 1 :
Test de lyse des globules rouges
L'atteinte membranolytique d'un produit à l'essai est évaluée par le test de lyse des globules rouges. Le taux de dommages occasionnés par le produit à l'essai sur la membrane des hématies est quantifié par densité optique (DO) à 540 nm contre 690 nm par la mesure, d'une part, de l'hémoglobine relarguée et, d'autre part, de l'hémoglobine retenue suite à un temps de contact avec le produit à l'essai, par comparaison avec les dommages occasionnés par une solution de tampon (0% de dommages) et par une solution de lyse (100% de dommages). De plus, grâce à la deuxième mesure permise par le dispositif selon l'invention (mesure de l'hémoglobine retenue), il est possible de détecter une éventuelle dénaturation des protéines.

Il est ainsi possible d'encadrer de façon quantitative la dose du produit à l'essai entrainant une hémolyse de 0%, 50% et 100%.

<Desc/Clms Page number 15>

Première mesure :
Les hématies sont placées dans les puits du support de distribution (microplaque 96 puits de titration). Le produit à l'essai est dilué en tampon physiologique et placé dans les puits du support de réception (microplaque 96 puits de titration). On assemble les deux supports grâce à l'adaptateur. Le dispositif ainsi formé subit une centrifugation, provoquant le mélange des hématies et du produit en solution dans les puits de l'un des supports, qui devient un support de distribution. On assemble ledit support de distribution avec un adaptateur, un compartiment de filtration et un support de réception contenant une solution d'amplification. On effectue une nouvelle centrifugation. Les hématies non lysées sont retenues par la membrane de filtration, et les puits de réception recueillent le mélange produit en solution-solution d'amplificationhématies lysées. La mesure de la DO de ce mélange permet de mesurer le taux d'hémoglobine relarguée. Une mesure de DO à 540 nm contre 690 nm est réalisée pour chaque puits.

A titre d'étalonnage, la DO moyenne de chaque puits ayant reçu uniquement la solution de lyse correspond à une hémolyse de 100%, et la DO moyenne de chaque puits ayant reçu la solution de tampon sans produit à l'essai correspond à une hémolyse de 0%.

Deuxième mesure :
Le compartiment de filtration ayant retenu les hématies non lysées est assemblé avec un support de distribution comprenant un tampon de lyse, un adaptateur et un support de réception comprenant un tampon d'amplification pour former un nouveau dispositif. Ce dispositif subit une centrifugation, et la DO de la solution obtenue dans les puits du support de réception

<Desc/Clms Page number 16>

peut être mesurée pour obtenir le taux d'hémoglobine retenue par les hématies non lysées de la première mesure. Une mesure de DO à 540 nm contre 690 nm est réalisée pour chaque puits.

A titre d'étalonnage, la DO moyenne de chaque puits ayant reçu la solution de tampon correspond à une hémolyse de 100%, et la DO moyenne de chaque puits ayant reçu la solution de lyse correspond à une hémolyse de 0%.

Plusieurs échantillons contenant des concentrations différentes du produit à l'essai sont testés.

On calcule une valeur de DO corrigée correspondant à la DO moyenne de l'essai moins la DO moyenne du tampon (pour la mesure de 1'hémoglobine relarguée) ou la DO moyenne de lyse (pour la mesure de l'hémoglobine retenue). Le pourcentage d'hémoglobine relarguée correspond au rapport de la DO corrigée de l'essai sur la DO corrigée de la solution de tampon, multiplié par 100.

Le pourcentage d'hémoglobine retenue correspond au rapport de la DO corrigée de l'essai sur la DO corrigée de la solution de lyse, multiplié par 100.

Les courbes du pourcentage d'hémoglobine relarguée et du pourcentage d'hémoglobine retenue en fonction de la concentration en produit à l'essai (en g/l) sont tracées. Le point d'intersection des deux courbes correspond à l'HC50 du produit, c'est-à-dire à la teneur du produit induisant 50% d'hémolyse.

Exemple 2 : Dosage de la lactate deshydrogénase (LDH) extracellulaire et intracellulaire (Selon Bergmeyer coll. : Methods of enzymat analysis. Academic Press NY USA 1965 736-743).

<Desc/Clms Page number 17>

L'activité lactino-deshydrogénase est déterminée selon la réaction suivante : Pyruvate + NADH + F ---7 L-lactate + NAD+ Première mesure : On place dans un support de distribution des cellules en suspension. On assembla le support de distribution, un adaptateur et un support de réception. Le dispositif assemblé subit une centrifugation. Le surnageant est récupéré dans le support de réception.

On place un mélange réactionnel comprenant pyruvate de sodium, NADH et tampon phosphate dans un autre support de distribution. On assemble le support de réception comprenant le surnageant, un adaptateur et le support de distribution comprenant le mélange réactionnel pour former un dispositif qui est soumis à une centrifugation. Le surnageant et le mélange réactionnel sont récupérés dans le support de réception. On peut mesurer la DO 366 dans chaque puits dudit support de réception, qui correspond au dosage de la LDH extracellulaire.

Deuxième mesure : On assemble un support de réception dans lequel ont été fixées des cellules, un adaptateur et un support de distribution comprenant du tampon phosphate. Le dispositif subit une première centrifugation, à l'issue de laquelle le tampon phosphate est amené dans le support de réception ; puis une deuxième centrifugation à l'issue de laquelle le tampon phosphate est récupéré dans le support de distribution. Le support de réception comprenant les cellules est assemblé avec un adaptateur et un support de distribution comprenant du TritonxlOO. Après incubation pendant 15 minutes à température ambiante, on assemble le support de réception comprenant les cellules lysées avec

<Desc/Clms Page number 18>

un adaptateur et un support de distribution comprenant le mélange réactionnel (pyruvate de sodium, NADH et tampon phosphate) ; on soumet le dispositif à une centrifugation et on récupère le support de réception comprenant les cellules lysées et le mélange réactionnel. On mesure la DO 366 dans chaque puits du support de réception, qui correspond au dosage de la LDH intracellulaire.

Exemple n03
Méthodes de diagnostic sérobiologiques faisant appel à la technique de déviation du complément, comme le diagnostique de la Brucelose, de la Syphilis, de la Blennoragie et tous les diagnostics des maladies virales (grippe, oreillons, varicelle, zona, herpès, rougeole, hépatites, SIDA,...)
Le complément ne peut se fixer que sur un complexe antigène-anticorps (Ag-Ac) et non sur un anticorp (Ac) seul. Cette fixation entraîne des lésions sur la membrane des hématies provoquant la libération d'hémoglobine (hémolyse). Le but de la méthode de diagnostic est de mettre en évidence et de quantifier des anticorps, par une réaction en 3 temps.

Temps 1 :
L'antigène hépatique est mis en présence du sérum suspect décomplémenté (contenant ou non l'anticorps correspondant) et du complément (c'). Si l'ancticorps est présent, il se forme un complexe Ag-Ac-c'. Si l'Ac est absent, c'reste libre.

Temps 2 :
On ajoute au mélange précédent du sérum antihématie décomplémenté et des hématies (= complexe hémolytique CH).

L'hémoglobine relarguée est séparée puis recueillie par centrifugation (ou dépression sur membrane)

<Desc/Clms Page number 19>

et transférée au travers d'une membrane comme décrit dans l'exemple n01 pour être quantifiée à 540 nm contre 690 nm.

Si le complexe Ag-Ac-c's'est formé au temps 1, alors c'ne peut se fixer sur CH. Il n'y a pas d'hémolyse, la réaction est positive. Si par contre le complexe Ag-Acc'ne s'est pas formé au temps 1, c'est libre de se fixer au CH. Il y a hémolyse, la réaction est négative.

Temps 3 :
Une solution de lyse est ajoutée à tous les essais afin de libérer l'hémoglobine retenue, qui est quantifiée comme déjà décrit à 540 nm contre 690 nm.

Le dispositif selon l'invention permet de réaliser les deux mesures d'hémoglobine sur chaque échantillon.

Cela permet d'éviter les problèmes rencontrés avec les méthodes actuelles et liés à la quantité et à l'activité du complément (variable d'un lot à l'autre) ou à un excès d'antigène.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Dispositif de transfert de fluide comprenant un support de distribution comprenant au moins un puits de distribution 1, un adaptateur 2 comprenant un support 4 comprenant au moins un orifice 5 ouvert aux deux extrémités et muni à chaque extrémité d'un rebord 6, et un support de réception comprenant au moins un puits de réception 1'.

2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel un puits de distribution, un orifice de l'adaptateur et un puits de réception sont situés en face l'un de l'autre, l'orifice de l'adaptateur étant entre le puits de distribution et le puits de réception et les extrémités ouvertes du puits de distribution et du puits de réception se faisant face.

3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2 comprenant en outre un compartiment de filtration 3.

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le compartiment de filtration 3 comprend une membrane de filtration.

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le support de distribution et le support de réception sont des supports multipuits, notamment des microplaques.

6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'adaptateur

<Desc/Clms Page number 21>

comprend autant d'orifices que les supports comprennent de puits.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le diamètre ou la section des rebords 6 de l'orifice 5 de l'adaptateur 2 est légèrement inférieur au diamètre ou à la section du puits de distribution et du puits de réception.

8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le diamètre ou la section des rebords 6 de l'orifice 5 de l'adaptateur 2 est égal ou sensiblement égale ou supérieur au diamètre ou à la section du puits de distribution et du puits de réception, et les rebords sont en un matériau déformable.

9. Adaptateur pour utilisation dans un dispositif de transfert de fluide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant un support 4 comprenant au moins un orifice 5 ouvert aux deux extrémités et muni à chaque extrémité d'un rebord 6.

10. Adaptateur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend 6,12, 24,96, 384,1536 ou 3072 orifices.

11. Adaptateur selon l'une ou l'autre des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que les rebords du ou des orifices sont en un matériau déformable.

12. Adaptateur selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il contient dans au moins un orifice 5 au moins un réactif maintenu dans ledit orifice par un moyen de fermeture approprié,

<Desc/Clms Page number 22>

par exemple un film plastique ou un film d'aluminium collé ou thermosoudé.

13. Kit comprenant un dispositif selon l'une ou l'autre des revendications 1 à 8, dans lequel au moins un puit ou un orifice comprend au moins un réactif, maintenu dans le puit ou l'orifice par un moyen de fermeture approprié.

14. Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce que le moyen de fermeture approprié est un film plastique ou un film d'aluminium, collé ou thermosoudé.

15. Méthode d'analyse in vitro dans laquelle : a) on retire si nécessaire un moyen de fermeture d'un support de distribution comprenant au moins un puits et/ou d'un adaptateur comprenant au moins un orifice et/ou d'un support de réception comprenant au moins un puits, pouvant former un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou un kit selon l'une ou l'autre des revendications 13 et 14, b) on place un ou plusieurs échantillons à analyser dans un ou plusieurs puits du support de distribution ou du support de réception, contenant éventuellement un réactif approprié, c) on assemble le support de distribution, l'adaptateur et le support de réception pour former le dispositif selon l'invention, le ou les orifices et/ou puits contenant éventuellement un réactif approprié, d) on procède au transfert de fluide par tout moyen approprié, sans pipettage, e) on désassemble le dispositif,

<Desc/Clms Page number 23>

f) on effectue la mesure souhaitée dans le ou les puits de réception.

16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'ouverture du ou des moyens de fermeture du support de distribution et/ou du support de réception est effectuée au moyen des rebords du ou des orifices de l'adaptateur.

17. Méthode selon l'une ou l'autre des revendications 15 et 16, caractérisée en ce que l'on effectue plusieurs mesures successives sur le même échantillon et en ce que le ou les puits de réception d'une mesure n sont utilisés comme puits de distribution de la mesure n+1.

18. Utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, de l'adaptateur selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, ou du kit selon l'une ou l'autre des revendications 13 et 14, dans une méthode d'analyse in vitro.

19. Utilisation selon la revendication 18, dans laquelle la méthode d'analyse in vitro est choisie parmi culture et co-culture cellulaire, immunotitration, HTS, fluorescence, Deepwell, stockage, PCR, cytotoxicité, test de lyse des globules rouges, dosage de la lactate déshydrogénase, dosage du glutathion, dosage du malonaldéhyde, dosage d'acides aminés, dosage de la phosphatase acide ou tout autre dosage à partir de surnageant de culture ou de lysat cellulaire, lavages lors de tests ELISA, extraction ou purification d'acides nucléiques ou protéines.