FR2828692A1 - Procede d'ingenierie genetique pour le suivi en temps reel de l'activation de proteines specifiques de transduction de signaux cellulaires - Google Patents
Procede d'ingenierie genetique pour le suivi en temps reel de l'activation de proteines specifiques de transduction de signaux cellulaires Download PDFInfo
- Publication number
- FR2828692A1 FR2828692A1 FR0110840A FR0110840A FR2828692A1 FR 2828692 A1 FR2828692 A1 FR 2828692A1 FR 0110840 A FR0110840 A FR 0110840A FR 0110840 A FR0110840 A FR 0110840A FR 2828692 A1 FR2828692 A1 FR 2828692A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- proteins
- genetic engineering
- protein
- activation
- stress
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procédé d'ingénierie génétique visant à suivre en temps réel, au sein d'un micro-organisme génétiquement modifié, l'activation de protéines spécifiques de transduction de signaux cellulaires, lesdites protéines étant susceptibles de lier des molécules de phosphates et/ ou d'être phosphorylées sur des résidus aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'intégration, au niveau de ces protéines, de sondes moléculaires fluorescentes décalées en longueurs d'onde détectables par des techniques de mesure transitoire de fluorescence avec un retour quasi-immédiat du micro-organisme au niveau de base après annulation ou disparition des contraintes environnementales stressantes ou chimiotactiques imposées au micro-organisme. Application à la réalisation de bio-capteurs.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne un procédé d'ingénierie génétique visant à suivre en temps réel l'activation de protéines spécifiques de transduction de signaux cellulaires, chez des micro-organismes génétiquement modifiés, ces protéines étant susceptibles de lier des molécules de nucléosides phosphates et/ou d'être phosphorylées sur des résidus aminés, ledit procédé ayant pour objectif d'optimiser les caractéristiques en termes de réponse de ces transducteurs, afin de permettre la détection, l'identification et la quantification de signaux physiques, ou de substances chimiques différentes, ces signaux et ces substances étant inducteurs de signatures spécifiques de stress ou de chimiotactisme.
Le procédé selon l'invention concerne également l'association de ces mécanismes moléculaires selon les règles de la logique combinatoire booléenne.
Les protéines susceptibles de lier des nucléosides phosphates, les GTPases ou certaines ATPases, sont des interrupteurs moléculaires contrôlant la transduction de signaux cellulaires provenant de récepteurs membranaires et destinés à certaines cibles intracellulaires spécifiques. Dans le cas des GTPases, le mécanisme consiste en une activation par liaison d'une molécule de Guanosine Tri-Phosphate (GTP) en lieu et place d'une molécule de Guanosine Di-Phosphate (GDP) et en une inactivation par hydrolyse du GTP en GDP.
De nombreuses études ont été menées concernant les mécanismes de transduction du signal chez différents organismes procaryotes ou eucaryotes. Mais ces études n'ont apporté aucun élément d'information concernant les perspectives d'utilisation de ces GTPases, et des protéines de phosphorylation associées, à l'amélioration des caractéristiques en termes de réponse de biocapteurs multiparamétriques à signatures spécifiques, permettant la détection, l'identification et la quantification de signaux physiques, ou de substances chimiques différentes, le suivi en temps réel de signature spécifiques de stress ou de
<Desc/Clms Page number 2>
chimiotactisme chez ces organismes, ni d'éléments d'information concernant l'association de ces divers mécanismes moléculaires dans des structures logiques obéissant aux règles de la logique combinatoire booléenne.
La plupart des techniques mises en oeuvre pour l'étude de ces molécules de signalisation cellulaire ont consisté à modifier les gènes codant pour ces protéines de manière à réaliser des fusions de protéines fluorescentes en N-ou Cterminal de ces protéines, de manière à suivre par microscopie, leur translocation au niveau des différents compartiments cellulaires étudiés. En aucun cas, les modifications génétiques considérées n'ont consisté à intégrer au niveau de domaines spécifiques de ces molécules, soumis à des contraintes conformationnelles ou à des phosphorylations sur résidus aminés (Histidine, Tyrosine, Sérine/Thréonine) liés à l'état d'activation des molécules, des structures fluorescentes décalées en longueurs d'onde, permettant le suivi multiparamétrique de mécanismes de signalisation cellulaire spécifiques, la réalisation de biocapteurs multiparamétriques à signatures spécifiques et l'intégration de fonctions logiques combinatoires booléennes associant ces molécules.
Le but de la présente invention est d'optimiser les caractéristiques en termes de sensibilité et de temps de réponse de transducteurs biologiques multiparamétriques à micro-organismes génétiquement modifiés, dans l'objectif de permettre la détection, l'identification et la quantification de signaux physiques ou de substances chimiques différentes et le suivi en temps réel de signatures spécifiques de stress ou de chimiotactisme chez ces micro-organismes.
Un autre but est l'association de ces mécanismes moléculaires selon les règles de la logique combinatoire booléenne.
L'invention a également pour but l'optimisation de la réversibilité des biocapteurs mettant en oeuvre le procédé
<Desc/Clms Page number 3>
selon l'invention, par suite de la suppression des contraintes stressantes ou chimiotactiques.
Pour ce faire, l'invention a pour objet un procédé d'ingénierie génétique visant à suivre en temps réel, au sein d'un micro-organisme génétiquement modifié, l'activation de protéines spécifiques de transduction de signaux cellulaires, lesdites protéines étant susceptibles de lier des molécules de phosphates et/ou d'être phosphorylées sur des résidus aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'intégration, au niveau de ces protéines, de sondes moléculaires fluorescentes décalées en longueurs d'onde détectables par des techniques de mesure transitoire de fluorescence avec un retour quasiimmédiat du micro-organisme au niveau de base après annulation ou disparition des contraintes environnementales stressantes ou chimiotactiques imposées au micro-organisme.
Les sondes moléculaires fluorescentes sont, préférentiellement, des protéines du type GFP (Green Fluorescent Protein) mutées.
De préférence, l'intégration de ces sondes se fait à des GTPases, notamment de la famille Ras.
Elle peut se faire, chez la bactérie Escherichia coli, au niveau de la phosphoprotéine à Sérine/Thréonine UspA, protéine effectrice impliquée dans la transcription de gènes impliqués dans des réponses générales au stress.
L'intégration peut être effectuée également au niveau de la protéine de signalisation cellulaire TypA, une GTPase phosphorylable sur tyrosine activant la protéine UspA.
L'intégration peut s'effectuer simultanément au niveau de plusieurs phosphoprotéines, de manière à permettre un suivi multiparamétrique.
Ce procédé permet également l'intégration dans les mécanismes de transduction cellulaire de structures logiques ou séquentielles obéissant aux règles de l'algèbre de Boole.
<Desc/Clms Page number 4>
Ce procédé présente l'avantage de ne pas faire appel à des techniques de déstabilisation des protéines fluorescentes pour assurer la réversibilité du système, et permet de visualiser directement les variations de fluorescence consécutives à des cycles d'activation ou de désactivation de molécules du type GTPase de la famille Ras exprimées constitutivement au niveau des cellules des organismes considérés. La réversibilité liée à l'inactivation des GTPases est immédiate, et est liée au changement de conformation de la molécule survenant très rapidement et aux variations de fluorescence des sondes moléculaires intégrées à ces GTPases.
Un second avantage de l'invention est de permettre une visualisation rapide des processus de signalisation cellulaire ayant lieu en amont des processus génétiques activés par les effecteurs cellulaires connus pour être activés lors de sollicitations par des contraintes stressantes ou chimiotactiques, et de suivre les variations de fluorescence de sondes protéiques fluorescentes exprimées constitutivement au niveau cellulaire.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description détaillée, non limitative cidessous.
L'invention consiste en l'intégration de fluorophores peptidiques du type de ceux présents dans les protéines GFP décalés en longueurs d'onde d'émission par mutation, au niveau de sites de phosphorylations identifiés ou de domaines soumis à des contraintes conformationnelles, et dans le remplacement de certaines hélices a GTPases par des hélices a provenant des GFP et contenant les fluorophores. Dans les deux cas, les phosphorylations survenant sur certains résidus aminés (Histidine, Tyrosine, ou Sérine/Thréonine) ou les changements de conformation des hélices a échangées dans ces molécules de signalisation cellulaire se traduisent par une variation transitoire de fluorescence directement détectable par un
<Desc/Clms Page number 5>
dispositif de détection. Suivant le site d'intégration de la structure hexamérique du fluorophore des protéines fluorescentes GFP, les molécules ou sondes fluorescentes transformées peuvent conserver leur fonctionnalité pleine et entière, sans altération des processus physiologiques mettant en oeuvre des molécules GTPases.
L'utilisation de structures fluorescentes du même type décalées en longueurs d'onde permet le suivi immédiat et simultané de plusieurs cycles d'activation/désactivation différents, spécifiques des voies de transduction de signaux moléculaires d'intérêt, et la réalisation de biocapteurs multiparamétriques à signatures spécifiques de stress et/ou de chimiotactisme chez des organismes procaryotes ou eucaryotes génétiquement modifiés. Les signaux de fluorescence perçus sont spécifiques de l'activation d'un type particulier de récepteur en réponse à des sollicitations stressantes ou chimiotactiques particulières, en amont de cascades de phosphorylations, ou correspondent à l'intégration de différents signaux de stress ou de chimiotactisme, en aval de cascades de phosphorylations cellulaires, activant des effecteurs généraux de stress ou de chimiotactisme.
Le procédé objet de l'invention permet la mesure de variations transitoires de fluorescence consécutives à l'activation de phosphorylations cellulaires lors de la survenue de contraintes stressantes ou chimiotactiques (phosphorylations de récepteurs spécifiques, de protéines de signalisation cellulaire et d'effecteurs), et l'étude des processus d'intégration des différents signaux cellulaires impliqués dans les réponses étudiées.
Le procédé selon l'invention a été appliqué, chez Escherichia coli, au cas de la phosphoprotéine à Sérine/Thréonine UspA (Universal stress protein A), protéine effectrice impliquée dans la transcription de gènes impliqués dans des réponses générales au stress, et au cas de la protéine de signalisation
<Desc/Clms Page number 6>
cellulaire TypA (Tyrosine phosphorylated protein A), une GTPase phosphorylable sur tyrosine activant la protéine UspA.
Les différentes étapes sont explicitées, à titre d'exemples dans les annexes A. O et B. O, sous les dénominations de procédures A et B.
La procédure A correspond à l'application, chez Escherichia coli, à la phosphoprotéine UspA phosphorylable sur Sérine/Thréonine.
La procédure B correspond à l'application, chez Escherichia coli, à la protéine TypA présentant des modifications structurales dans le cas de liaison à des nucléosides phosphates (GTPases) et des phosphorylations sur tyrosine, et activant la protéine UspA, protéine effectrice, participant à la transcription de gènes de stress spécifiques.
La suite de la description est faite en référence aux dessins annexés.
Sur la figure 1, les cinq régions conservées impliquées dans la liaison du nucléotide guanine sont indiquées, de même que les séquences consensus.
Les régions 1 et 2 sont des régions présentant des différences de conformation significatives dans les états GDP et GTP-liés. Dans ces régions présentant des contraintes conformationnelles majeures et des fluctuations significatives en termes d'interactions chimiques, il est possible d'intégrer un fluorophore susceptible de présenter des variations significatives de sa fluorescence intrinsèque, suivant les variations de son environnement électronique immédiat. Au niveau de ces régions, des phosphorylations spontanées (autophosphorylations) sur résidus aminés (Histidine, Tyrosine, Sérine/Thréonine) peuvent survenir, selon la position du ou des résidu (s) aminé (s) considéré (s) vis-à-vis du phosphate y des Guanosines Tri-Phosphates (GTP) liées, correspondant à l'état activé du domaine G. Ces autophosphorylations peuvent être
<Desc/Clms Page number 7>
mises à profit pour modifier par phosphorylation, et de manière réversible, le fluorophore intégré, hexapeptide susceptible de comprendre des résidus Histidine, Tyrosine ou Sérine/Thréonine, et ainsi de permettre un suivi direct et en temps réel des variations transitoires de fluorescence observées par suite de l'activation du domaine G de ces protéines de transduction de signaux cellulaires.
En positions N ou C-terminales, on trouve différents domaines susceptibles de présenter des phosphorylations sur résidus aminés (Histidine, Tyrosine, Sérine/Thréonine) et servant à la transmission effective de signaux cellulaires. Le positionnement de fluorophores, au niveau de ces sites de phosphorylation, peut permettre de suivre in vivo et en temps réel les variations de fluorescence relatives à l'activation de ces voies de signalisation cellulaires par phosphorylation.
La figure 2 montre que les domaines G des GTPases présentent un cycle à trois états et des variations de conformation entre un état inactif (GDP-lié) et un état actif (GTP-lié).
L'activation apparaît en réponse à des signaux extracellulaires qui favorisent l'échange de nucléotide guanine. Une fois activée, RasGTP interagit avec des cibles cellulaires pour générer des effets en aval et une réponse cellulaire, notamment de stress et de chimiotactisme. Le commutateur moléculaire est inactivé par hydrolyse du GTP. Les GTPases fonctionnent comme des interrupteurs oscillant entre deux états conformationnels différents : un état actif quand le GTP est lié et un état inactif quand le GDP est fixé. En l'absence de régulation, les GTPases resteraient indéfiniment sous forme active après fixation du GTP, s'il n'y avait pas d'autophosphorylation sur résidus aminés. Cependant, dans les cellules, deux autres classes de protéines de signalisation contrôlent l'activité des GTPases en modulant la transition entre les états actif et inactif. Les protéines activatrices de GTPases, dites GAP
<Desc/Clms Page number 8>
(GTPase-Activating-Proteins), inactivent la GTPase en augmentant la vitesse d'hydrolyse du GTP lié. Cet effet régulateur négatif est contrebalancé par les protéines libérant des nucléotides guanine, dites GNRP (Guanine Nucleotide Releasing Protein), qui favorisent l'échange des nucléotides fixés en augmentant la libération du GDP, et la capture ultérieure du GTP à partir du cytosol, et tendent donc à activer la GTPase. Les récepteurs peuvent donc activer la GTPase en activant une GNRP ou en inactivant une GAP. Les récepteurs activés sont susceptibles de se lier directement aux GAP et indirectement aux protéines GNRP. Néanmoins, c'est le couplage indirect aux GNRP qui est habituellement responsable du passage de la GTPase vers son état actif, dans lequel elle fixe du GTP.
Les phosphorylations sur résidus tyrosine sont rapidement inversées par des protéines phosphatases spécifiques des tyrosines, et les protéines GTPases activées s'inactivent elles-mêmes en hydrolysant le GTP qui leur est lié en GDP. Pour stimuler des réactions durables en aval, ces évènements de courte durée doivent être convertis en évènements de plus longue durée, qui peuvent faire durer le signal plus longtemps et le transmettre en aval vers l'appareil nucléaire. Ce système de transmission met en jeu des cascades multiples et interconnectées de phosphorylations sur des résidus Sérine/Thréonine présentant une plus longue durée de vie que les phosphorylations sur tyrosine.
La grande spécificité des tyrosine phosphatases et la courte durée des phosphorylations sur tyrosine entraînent un niveau de phosphorylation sur tyrosine très bas dans la cellule au repos. Les tyrosine phosphatases ne servent pas uniquement à inverser en permanence les effets des tyrosine kinases, leur activité peut aussi être contrôlée de telle sorte qu'elles jouent des rôles spécifiques dans la transmission des signaux dans la cellule et dans le contrôle du cycle cellulaire.
<Desc/Clms Page number 9>
Une des caractéristiques de l'invention est d'intégrer dans les mécanismes de transduction cellulaire des structures logiques ou séquentielles obéissant aux règles de l'algèbre de Boole. Les signaux de phosphorylation peuvent être assimilés à des variables booléennes ou binaires, variables susceptibles de variations, mais qui prises à un instant donné, assument la valeur d'une constante. Ces variables binaires peuvent prendre deux états, 1 ou 0 (molécule activée ou désactivée en logique positive). Selon les règles de l'algèbre de Boole, ces grandeurs peuvent être combinées entre elles, sous forme de sommes et de produits logiques, pour former des fonctions booléennes complexes de plusieurs variables binaires. Des structures combinatoires logiques peuvent ainsi être constituées, telles que des systèmes à basculement, des unités de mémorisation, des dispositifs à décalage, des additionneurs ou compteurs.
En association avec des dispositifs fluorescents décalés en longueur d'onde, intégrés au niveau de domaines spécifiques de ces transducteurs de signaux moléculaires, l'intégration logique de ces divers signaux cellulaires peut être suivie en temps réel dans l'organisme. On peut ainsi, avec un minimum de sondes fluorescentes décalées en longueurs d'onde d'émission, suivre l'activation de multiples voies de signalisation cellulaire.
Un des objectifs de la démarche correspond à l'activation ou la désactivation conditionnée d'effecteurs cellulaires consécutive à des sollicitations de stress ou de chimiotactisme associées ou alternées. L'intégration de différentes voies de signalisation cellulaire selon des mécanismes obéissant aux règles de la logique combinatoire booléenne ouvre la voie à des réponses conditionnées chez ces organismes, suivant la logique d'activation de certains récepteurs spécifiques, par des sollicitations de stress ou de chimiotactisme.
<Desc/Clms Page number 10>
Le capteur correspondant peut être à déclenchement conditionné, si un signal physique ou la substance chimique spécifique détecté par l'organisme est de nature à armer une boucle de mémorisation susceptible de permettre l'activation d'un effecteur cible au niveau cellulaire, en cas d'apparition d'un second signal de nature physique ou chimique.
La figure 3a montre comment l'activation de cette réponse conditionnée se déroule.
On applique à l'organisme, sensible à un signal spécifique Sarm, stressant ou non, ou inducteur ou non d'une réponse chimiotactique, appelé facteur d'armement de la boucle de conditionnement, le signal Sdec stressant ou non, ou inducteur ou non d'une réponse chimiotactique, appelé facteur de déclenchement.
Les signaux Sarm et Sdec sont appliqués à l'organisme pendant une durée T convenable de manière séquentielle, simultanément ou successivement.
La figure 3b montre que le conditionnement est effectif quand l'application du signal Sdec déclenche dans l'organisme une réaction R, telle que la transcription d'un gène spécifique, une activité enzymatique particulière, l'enclenchement d'un processus lytique, obtenue lorsque le signal Sdec est appliqué.
La figure 4 illustre un 1er cas.
Cas 1 : Activation indépendante de deux voies de signalisation cellulaires
Dans ce cas, le fonctionnement d'ensemble de la protéine GTPase phosphorylable sur un résidu aminé [Histidine (H), Tyrosine (Y) ou Sérine/Thréonine (S/T)] se traduit par la transmission de deux signaux cellulaires entrant indépendamment l'un de l'autre, sur le mode d'un circuit monostable avec, dans l'un ou l'autre cas, une persistance de l'activation du domaine
Dans ce cas, le fonctionnement d'ensemble de la protéine GTPase phosphorylable sur un résidu aminé [Histidine (H), Tyrosine (Y) ou Sérine/Thréonine (S/T)] se traduit par la transmission de deux signaux cellulaires entrant indépendamment l'un de l'autre, sur le mode d'un circuit monostable avec, dans l'un ou l'autre cas, une persistance de l'activation du domaine
<Desc/Clms Page number 11>
G de la GTPase et de la phosphorylation sur résidu aminé, variable selon les caractéristiques intrinsèques des domaines considérés et fonction des protéines auxiliaires associées aux mécanismes de signalisation cellulaire [protéines auxiliaires (GDS)] accélérant le remplacement du GDP par du GTP, stimulant l'activité GTPase (GAP) ou inhibant l'échange GDP/GTP (GDI) pour les domaines G des GTPases, kinases et phosphatases spécifiques pour les sites spécifiques de phosphorylation sur résidus aminés.
La figure 5 illustre un 2ème cas.
Cas 2 : Transfert du phosphate y du GTP lié au domaine G de la GTPase (état activé) sur le résidu aminé (H, Y ou S/T) du site de phosphorylation (autophosphorylation) par suite de l'activation par le signal entrant B.
Dans ce cas, le fonctionnement d'ensemble de la protéine GTPase phosphorylable sur un résidu aminé [Histidine (H), Tyrosine (Y) ou Sérine/Thréonine (S/T)] se traduit par la transmission du signal cellulaire B par phosphorylation du résidu aminé H, Y ou S/T, uniquement en cas d'activation du domaine G par le signal entrant A. En d'autres termes, on a une autophosphorylation sur le résidu aminé du site de phosphorylation (signal sortant F), que si la GTPase est activée par le signal entrant A (liaison du GTP) et en présence du signal entrant B. On a affaire ici à un fonctionnement conditionne sur le mode d'un produit logique (opération ET selon les règles de l'algèbre de Boole).
La figure 6 illustre un 3be cas.
Cas 3 : Transfert du Phosphate y du GTP lié au domaine G de la GTPase (état activé) sur le résidu aminé (H, Y ou S/T) du site de phosphorylation (autophosphorylation) ou phosphorylation indépendante du même résidu aminé.
<Desc/Clms Page number 12>
Dans ce cas, le fonctionnement d'ensemble de la protéine GTPase phosphorylable sur un résidu aminé [Histidine (H), Tyrosine (Y) ou Sérine/Thréonine (S/T)] se traduit par la phosphorylation du résidu aminé (H, Y ou S/T) en cas d'activation du domaine G par le signal entrant A (autophosphorylation) ou en cas de phosphorylation indépendante du même résidu aminé en présence du signal entrant B.
En d'autres termes, on a une autophosphorylation sur le résidu aminé du site de phosphorylation (signal sortant F), que si la GTPase est activée par le signal entrant A (liaison du GTP) ou une phosphorylation indépendante du même résidu aminé en présence du signal entrant B. On a affaire ici à un fonctionnement conditionnel sur le mode d'une somme logique (opération OU selon les règles de l'algèbre de Boole).
<Desc/Clms Page number 13>
PROCEDURE A :
Procédure d'intégration de fluorophores dans la protéine UspA 1) Extraction de 1'ADN génomique des souches d'Escherichia coli.
Procédure d'intégration de fluorophores dans la protéine UspA 1) Extraction de 1'ADN génomique des souches d'Escherichia coli.
2) Digestion, de l'ADN Gnomique d'E. coli par renzyme de restriction Pst !, et obtention d'un fragment d'ADN génomique de 5,2 kb de taille contenant le gène uspA.
3) Contrôle sur gel d'agarose à 1 % du clivage Pst.
4) Amplification par PCR du gène uspA grâce aux deux Primers spécifiques :
Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (up)
Primer 2 uspA : 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (down)
5) Contrôle sur gel d'agarose à 1 % de l'amplification d'un fragment de 885 pb contenant 1e gène uspA. 6) Amplification et modification par PCR du gène uspA de manière à lui intégrer un fluorophore hexapeptidique, grâce à deux amorces complémentaires : cf Cas explicités ci-après 7) Transformation des bactéries Escherichia coli compétentes avec 10 ng des produits d'amplification précédents.
Primer 1 uspA : 5'-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3' (up)
Primer 2 uspA : 5'-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3' (down)
5) Contrôle sur gel d'agarose à 1 % de l'amplification d'un fragment de 885 pb contenant 1e gène uspA. 6) Amplification et modification par PCR du gène uspA de manière à lui intégrer un fluorophore hexapeptidique, grâce à deux amorces complémentaires : cf Cas explicités ci-après 7) Transformation des bactéries Escherichia coli compétentes avec 10 ng des produits d'amplification précédents.
8) Isolement sur gélose LB.
9) Visualisation de l'apparition de variations de fluorescence suite à l'apparition ou à la disparition de contraites stressantes pour chacune des colonies isolées.
10) Criblage par PCR de l'ADN des bactéries isolées fluorescentes.
11) Confirmation des transformations par séquençage des fragments de gènes amplifiés par PCR après extraction de l'ADN génomique des bactéries transformées.
12) Congélation à-80 C et lyophilisation des souches transformées pour utilisation ultérieure.
<Desc/Clms Page number 14>
CASA :
Positionnement d'un fluorophore du type FGYGVQ au niveau du site 83-101 de la protéine UspA
Les résidus 83 à 101 de la protéine universelle de stress UspA présentent une homologie de séquence avec le domaine de liaison de récepteurs à tyrosine kinase d'eucaryotes. En particulier la séquence [L/V]xGxGxxGQV[L/I]xxxIKK trouvée dans la protéines UspA d'schenchia coli est spécialement conservée dans plusieurs récepteurs à tyrosine kinase [Partanen J. et al., 1992]
L'opération consiste à intégrer le fluorophore FGYGVQ d'un variant (Ser65 > Gly) de la Green Fluorescent Protéine (GFP) au. niveau du site considéré grace à une amplification PCR du gène uspA avec, en plus des amorces amont et aval spécifiques de la portion d'ADN contenant le gène uspA, deux amorces complémentaires permettant d'intégrer dans le génome les modifications escomptées.
Positionnement d'un fluorophore du type FGYGVQ au niveau du site 83-101 de la protéine UspA
Les résidus 83 à 101 de la protéine universelle de stress UspA présentent une homologie de séquence avec le domaine de liaison de récepteurs à tyrosine kinase d'eucaryotes. En particulier la séquence [L/V]xGxGxxGQV[L/I]xxxIKK trouvée dans la protéines UspA d'schenchia coli est spécialement conservée dans plusieurs récepteurs à tyrosine kinase [Partanen J. et al., 1992]
L'opération consiste à intégrer le fluorophore FGYGVQ d'un variant (Ser65 > Gly) de la Green Fluorescent Protéine (GFP) au. niveau du site considéré grace à une amplification PCR du gène uspA avec, en plus des amorces amont et aval spécifiques de la portion d'ADN contenant le gène uspA, deux amorces complémentaires permettant d'intégrer dans le génome les modifications escomptées.
Lors de l'interaction in vivo de ce récepteur modifié avec la protéine activatrice phosphorylée sur
tyrosine, l'environnement électronique du fluorophore s'en trouve modifié, spécialement lors des modications de la protéine modifiée par phosphorylation au niveau des sites SérinelThréonine (S/T) (et éventuellement de la Tyrosine (Y) du fluorophore) marqués d'une étoile (*). Ces modifications se traduisent par des variations transitoires de fluorescence caractéristiques.
tyrosine, l'environnement électronique du fluorophore s'en trouve modifié, spécialement lors des modications de la protéine modifiée par phosphorylation au niveau des sites SérinelThréonine (S/T) (et éventuellement de la Tyrosine (Y) du fluorophore) marqués d'une étoile (*). Ces modifications se traduisent par des variations transitoires de fluorescence caractéristiques.
Gène UspA :
* * * 250 ACC CTG AGC GGC AGC GGC GAC CTG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Ser Gly Asp Leu Gly Gln Val Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G S G 0 L G Q V L V D A 1 K K Y Consensus : L/V x G x G x x G Q V L/1 x x x 1 K K Gène UspA modifié : * * N. t it)) !))) 250 ACC CTG AGC GGC AGC TTC GGC TAT GGC GTG CAA CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Ser Phe Gly Tyr Gly Val Gln Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G S F. G Y G V Q L V 0 A l K K Y * - > < - > Fluorophore FGYGVQ Amorces utilisées : Amorce up (de 5'vers 3') :
5'-ACC CTG AGC GGC AGC TTC GGC TAT GGC GTG CAA CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC-3' Amorce down (de 3'vers 5') complémentaire de l'amorce up : 3'-TGG GAC TCG CCG TCG AAG CCG ATA CCG CAC GTT GAC CAG CTA CGT TAG TTC TTT ATG-5' Référence :
Partanen J., Armstrong E., Makela T. P., Korhonen J., Sandberg M., Renkonen R-, Knuutila S., HueberK. and Alitalo K., 1992
A novel endothélial cell surface receptor tyrosine kinase with extracellular epidermal growth factor homology domains.
* * * 250 ACC CTG AGC GGC AGC GGC GAC CTG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Ser Gly Asp Leu Gly Gln Val Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G S G 0 L G Q V L V D A 1 K K Y Consensus : L/V x G x G x x G Q V L/1 x x x 1 K K Gène UspA modifié : * * N. t it)) !))) 250 ACC CTG AGC GGC AGC TTC GGC TAT GGC GTG CAA CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Ser Phe Gly Tyr Gly Val Gln Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G S F. G Y G V Q L V 0 A l K K Y * - > < - > Fluorophore FGYGVQ Amorces utilisées : Amorce up (de 5'vers 3') :
5'-ACC CTG AGC GGC AGC TTC GGC TAT GGC GTG CAA CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC-3' Amorce down (de 3'vers 5') complémentaire de l'amorce up : 3'-TGG GAC TCG CCG TCG AAG CCG ATA CCG CAC GTT GAC CAG CTA CGT TAG TTC TTT ATG-5' Référence :
Partanen J., Armstrong E., Makela T. P., Korhonen J., Sandberg M., Renkonen R-, Knuutila S., HueberK. and Alitalo K., 1992
A novel endothélial cell surface receptor tyrosine kinase with extracellular epidermal growth factor homology domains.
Mol. CellBiol. (1992), 12, pg. 1698-1707
<Desc/Clms Page number 15>
CAS B :
Positionnement d'un fluorophore du type SGYGVQ au niveau du site 83-101 de la protéine UspA
Les résidus 83 à 101 de la protéine universelle de stress UspA présentent une homologie de séquence avec le domaine de liaison de récepteurs à tyrosine kinase d'eucaryotes. En particulier la séquence
[L/VjxGxGxxGQVpL/IJxxxIKK trouvée dans la protéines UspA d'Escherichia coli est spécialement conservée dans plusieurs récepteurs à tyrosine kinase [Partanen J. et al., 1992]
L'opération consiste à intégrer le fluorophore SGYGVQ de la Green Fluorescent Protéine (GFP) au niveau du site considéré grace à une amplification PCR du gène uspA avec, en plus des amorces amont et aval
spécifiques de la portion d'ADN contenant le gène uspA, deux amorces complémentaires permettant d'intégrer dans le génome les modifications escomptées.
Positionnement d'un fluorophore du type SGYGVQ au niveau du site 83-101 de la protéine UspA
Les résidus 83 à 101 de la protéine universelle de stress UspA présentent une homologie de séquence avec le domaine de liaison de récepteurs à tyrosine kinase d'eucaryotes. En particulier la séquence
[L/VjxGxGxxGQVpL/IJxxxIKK trouvée dans la protéines UspA d'Escherichia coli est spécialement conservée dans plusieurs récepteurs à tyrosine kinase [Partanen J. et al., 1992]
L'opération consiste à intégrer le fluorophore SGYGVQ de la Green Fluorescent Protéine (GFP) au niveau du site considéré grace à une amplification PCR du gène uspA avec, en plus des amorces amont et aval
spécifiques de la portion d'ADN contenant le gène uspA, deux amorces complémentaires permettant d'intégrer dans le génome les modifications escomptées.
Lors de l'intéraction in vivo de ce récepteur modifié avec la protéine activatrice phosphorylée sur tyrosine, l'environnement électronique du : t1uorophore s'en trouve modifié, spécialement lors des modications de la protéine modifiée par phosphorylation au niveau des sites Sérine/Thréonine (S/T) (et éventuellement de la Tyrosine (Y) du fluorophore) marqués d'une étoile (*). Ces modifications se traduisent par des variations transitoires de fluorescence caractéristiques.
Gène UspA :
* * * 250 ACC CTG AGC GGC AGC GGC GAC CTG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA'TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Ser Gly Asp Leu Gly Gin Val Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G S G D L G Q V LV D A I K K Y Consensus : L/V x G x G x x G Q V L/I x x x I K K Gène UspA modiSé : * * Il ! 1 250 ACC CTG AGC GGC TAC GGC GTC CAG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Tyr Gly Val Gin Gly Gin Val Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G Y G V Q G Q V L V D A I K K Y A A Fluorophore SGYGVQ Amorces utilisées : Amorce up (de 5'vers 3') :
5'-ACC CTG AGC GGC TAC GGC GTC CAG GGC GTG CAR CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC-3' Amorce down (de 3* vers 5") complémentaire de l'amorce up 3'-TGG GAC TCG CCG ATG CCG CAG GTC CCG CAC GTT GAC CAG CTA CGT TAG TTC TTT ATG-5' Référence : Partanen J., Armstrong E., Makela T. P., Korhonen J., Sandberg M., Rsakonen R, Kmmtila S., Hueber K. and Alitalo K., 1992 A novel endothelial cell surface receptor tyrosine kinase with extracellular epidermal growth factor homotogy domains.
* * * 250 ACC CTG AGC GGC AGC GGC GAC CTG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA'TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Ser Gly Asp Leu Gly Gin Val Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G S G D L G Q V LV D A I K K Y Consensus : L/V x G x G x x G Q V L/I x x x I K K Gène UspA modiSé : * * Il ! 1 250 ACC CTG AGC GGC TAC GGC GTC CAG GGC CAG GTT CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC 306 83 Thr Leu Ser Gly Tyr Gly Val Gin Gly Gin Val Leu Val asp Ala Ile Lys Lys Tyr 101 T L S G Y G V Q G Q V L V D A I K K Y A A Fluorophore SGYGVQ Amorces utilisées : Amorce up (de 5'vers 3') :
5'-ACC CTG AGC GGC TAC GGC GTC CAG GGC GTG CAR CTG GTC GAT GCA ATC AAG AAA TAC-3' Amorce down (de 3* vers 5") complémentaire de l'amorce up 3'-TGG GAC TCG CCG ATG CCG CAG GTC CCG CAC GTT GAC CAG CTA CGT TAG TTC TTT ATG-5' Référence : Partanen J., Armstrong E., Makela T. P., Korhonen J., Sandberg M., Rsakonen R, Kmmtila S., Hueber K. and Alitalo K., 1992 A novel endothelial cell surface receptor tyrosine kinase with extracellular epidermal growth factor homotogy domains.
Mol. CeU Bio1. (1992), 12, pg. 1698-1707
<Desc/Clms Page number 16>
PROCEDURE B :
Procédure d'intégration de fluorophores dans la protéine TypA
1) Extraction de l'ADN génomique des souches desclieiichia coli.
Procédure d'intégration de fluorophores dans la protéine TypA
1) Extraction de l'ADN génomique des souches desclieiichia coli.
4 > 2) Amplification par PCR du gène typA grâce à deux Primers spécifiques 3) Contrôle sur gel d'agarose du fragment d'amplification 4) Amplification et modification par PCR du gène typA de manière à lui intégrer un fluorophore hexapeptidique, grâce à deux amorces complémentaires : ci Cas explicites ci-après 5) Transformation des bactéries Escherichia coli compétentes avec 10 ng des produits d'amplification précédents.
6) Isolement sur gélose LB.
7) Visualisation de l'apparition de variations de fluorescence suite à l'apparition ou à la disparition de contraites stressantes pour chacune des colonies isolées.
8) Criblage par PCR de l'ADN des bactéries isolées fluorescentes.
9) Confirmation des transformations par séquençage des fragments de gènes amplifiés par PCR après extraction de l'ADN génomique des bactéries transformées.
10) Congélation à-SO C et lyophilisation des souches transformées pour utilisation ultérieure.
<Desc/Clms Page number 17>
CASA ;
Positionnement d'un fl ùnit u Positionnement d'un fluorophore du type FGYGVQ à proximité du site 74-78 (Feuillet ss2) de la phore du Me FGYGVO à p ! ~- ni e phosphoprotéine TypA autophosphorylable sur Tyrosine
Les résidus 74 à 78 (Feuillet ss2) de la protéine GTPase TypA, activant la protéine de stress UspA en situation de stress, font partie du site de liaison au GTP de la protéine TypA. La tyrosine Y68 est susceptible de
subir une autophosphorylation du fait de la proximité immédiate du GTP. Ce domaine subit des contraintes conformationnelles et d'environnement électronique susceptibles de pouvoir modifier les caractéristiques de fluorescence d'un fluorophore hexapeptidique positionné dans cette région.
Positionnement d'un fl ùnit u Positionnement d'un fluorophore du type FGYGVQ à proximité du site 74-78 (Feuillet ss2) de la phore du Me FGYGVO à p ! ~- ni e phosphoprotéine TypA autophosphorylable sur Tyrosine
Les résidus 74 à 78 (Feuillet ss2) de la protéine GTPase TypA, activant la protéine de stress UspA en situation de stress, font partie du site de liaison au GTP de la protéine TypA. La tyrosine Y68 est susceptible de
subir une autophosphorylation du fait de la proximité immédiate du GTP. Ce domaine subit des contraintes conformationnelles et d'environnement électronique susceptibles de pouvoir modifier les caractéristiques de fluorescence d'un fluorophore hexapeptidique positionné dans cette région.
L'opération consiste à intégrer le fluorophore FGYGVQ d'un variant (Ser65 > Gly) de la Green Fluorescent Protéine (GFP) au niveau du site considéré grace à une amplification PCR du gène typA avec, en plus des amorces amont et aval spécifiques de la portion d'ADN contenant le gène typA, deux amorces complémentaires permettant d'intégrer dans le génome les modifications escomptées.
Lors de l'intéraction in vivo de ce récepteur modifié avec la protéine activatrice phosphory1ée sur
tyrosine, l'environnement électronique du fluorophore s'en trouve modifié, spécialement lors des modications de la protéine modifiée par phosphorylation de la Tyrosine (Y) du fluorophore marqués d'une étoile (*). Ces modifications se traduisent par des variations transitoires de fluorescence caractéristiques.
tyrosine, l'environnement électronique du fluorophore s'en trouve modifié, spécialement lors des modications de la protéine modifiée par phosphorylation de la Tyrosine (Y) du fluorophore marqués d'une étoile (*). Ces modifications se traduisent par des variations transitoires de fluorescence caractéristiques.
Gène TypA :
* Asn Thr Ala Ile Lys Trp Asn Asp Tyr Arg Ile Asn Ile Val Asp Thr Pro Gly His Ala Asp 60 N T A I K W N DY RI NIV D T P G H A D - ------------------------------------------------- > Feuillet ss2 Consensus : D x x G [Q/H/T] Motif PM3 Gène TypA modifié : ! I I I I Asn Thr Ala Ile Lys Trp Phe Gly IM Gly Val Gin Ile Val Asp Thr Pro Gly His Ala Asp 60 N T A NF GYGYQ I V D T P G H A D A A A Fluorophore FGYGVQ' ---.---.-------------------------- > Feuillet ss2
* Asn Thr Ala Ile Lys Trp Asn Asp Tyr Arg Ile Asn Ile Val Asp Thr Pro Gly His Ala Asp 60 N T A I K W N DY RI NIV D T P G H A D - ------------------------------------------------- > Feuillet ss2 Consensus : D x x G [Q/H/T] Motif PM3 Gène TypA modifié : ! I I I I Asn Thr Ala Ile Lys Trp Phe Gly IM Gly Val Gin Ile Val Asp Thr Pro Gly His Ala Asp 60 N T A NF GYGYQ I V D T P G H A D A A A Fluorophore FGYGVQ' ---.---.-------------------------- > Feuillet ss2
<Desc/Clms Page number 18>
CAS B :
Positionnement d'un fluorophore du type FGYGVQ à proximité du site 128-131 (Boucle L6) de la phosphoprotéine TypA autophosphorylable sur Tyrosine
Les résidus 128 à 131 (Boucle L6) de la protéine GTPase TypA, activant la protéine de stress UspA en
situation de stress, font partie du site de liaison au GTP de la protéine TypA. La tyrosine Y119 est susceptible de subir une autophosphorylation du fait de la proximité immédiate du GTP. Ce domaine subit des contraintes conformationnelles et d'environnement électronique susceptibles de pouvoir modifier les caractéristiques de fluorescence d'un fluorophore hexapeptidique positionné dans cette région.
Positionnement d'un fluorophore du type FGYGVQ à proximité du site 128-131 (Boucle L6) de la phosphoprotéine TypA autophosphorylable sur Tyrosine
Les résidus 128 à 131 (Boucle L6) de la protéine GTPase TypA, activant la protéine de stress UspA en
situation de stress, font partie du site de liaison au GTP de la protéine TypA. La tyrosine Y119 est susceptible de subir une autophosphorylation du fait de la proximité immédiate du GTP. Ce domaine subit des contraintes conformationnelles et d'environnement électronique susceptibles de pouvoir modifier les caractéristiques de fluorescence d'un fluorophore hexapeptidique positionné dans cette région.
L'opération consiste à intégrer le fluorophore FGYGVQ d'un variant (Ser65 > Gly) de la Green Fluorescent Protéine (GFP) au niveau du site considéré grace à une amplification PCR du gène typA avec, en plus des amorces amont et aval spécifiques de la portion d'ADN contenant le gène typA, deux amorces complémentaires permettant d'intégrer dans le génome les modifications escomptées.
Lors de l'intéraction in vivo de ce récepteur modifié avec la protéine activatrice phosphorylée sur tyrosine, l'environnement électronique du fluorophore s'en trouve modifié, spécialement lors des modications de la protéine modifiée par phosphorylation de la Tyrosine (Y) du fluorophore marqués d'une étoile (*). Ces modifications se traduisent par des variations transitoires de fluorescence caractéristiques.
Gène TypA :
Arg Phe Val Thr Lys Lys Ala Phe Ala Tyr Gly Leu Lys Pro Ile Val Val Ile Asn Lys Val Asp Arg 110 R F V T K K A F A Y G L K P l V V l N K V D R c > L6 L6 Consensus : [N/T ! K x D Motif G2, G4 Gène TypA modifie : 1 1 1 Arg Phe Val Thr Lys Lys Ala Phe Gly Tyr Gly Val Gin Pro Ile Val Val Ile Asn Lys Val Asp Arg 110 RFVTK X & FGGyQP I VVIN K V 0R A A A A Fluorophore FGYGVQ < --------- > L6
Arg Phe Val Thr Lys Lys Ala Phe Ala Tyr Gly Leu Lys Pro Ile Val Val Ile Asn Lys Val Asp Arg 110 R F V T K K A F A Y G L K P l V V l N K V D R c > L6 L6 Consensus : [N/T ! K x D Motif G2, G4 Gène TypA modifie : 1 1 1 Arg Phe Val Thr Lys Lys Ala Phe Gly Tyr Gly Val Gin Pro Ile Val Val Ile Asn Lys Val Asp Arg 110 RFVTK X & FGGyQP I VVIN K V 0R A A A A Fluorophore FGYGVQ < --------- > L6
Claims (7)
- REVENDICATIONS 1-Procédé d'ingénierie génétique visant à suivre en temps réel, au sein d'un micro-organisme génétiquement modifié, l'activation de protéines spécifiques de transduction de signaux cellulaires, lesdites protéines étant susceptibles de lier des molécules de phosphates et/ou d'être phosphorylées sur des résidus aminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'intégration, au niveau de ces protéines, de sondes moléculaires fluorescentes décalées en longueurs d'onde détectables par des techniques de mesure transitoire de fluorescence avec un retour quasi-immédiat du micro-organisme au niveau de base après annulation ou disparition des contraintes environnementales stressantes ou chimiotactiques imposées au micro-organisme.
- 2 - Procédé d'ingénierie génétique selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes moléculaires fluorescentes, décalées en longueurs d'onde, sont issues des protéines du type GFP mutées.
- 3-Procédé d'ingénierie génétique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les protéines sont des GTPases.
- 4 - Procédé d'ingénierie génétique selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la phosphoprotéine à Sérine/Thréonine UspA de la bactérie Escherichia coli.
- 5-Procédé d'ingénierie génétique selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la phosphoprotéine de signalisation cellulaire TypA de la bactérie Escherichia coli.
- 6- Procédé d'ingénierie génétique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il peut être<Desc/Clms Page number 20>appliqué simultanément à plusieurs phosphoprotéines, de manière à permettre un suivi multiparamétrique.
- 7- Procédé d'ingénierie génétique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il permet l'intégration dans les mécanismes de transduction cellulaire de structures logiques ou séquentielles obéissant aux règles de l'algèbre de Boole.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0110840A FR2828692B1 (fr) | 2001-08-16 | 2001-08-16 | Procede d'ingenierie genetique pour le suivi en temps reel de l'activation de proteines specifiques de transduction de signaux cellulaires |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0110840A FR2828692B1 (fr) | 2001-08-16 | 2001-08-16 | Procede d'ingenierie genetique pour le suivi en temps reel de l'activation de proteines specifiques de transduction de signaux cellulaires |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2828692A1 true FR2828692A1 (fr) | 2003-02-21 |
| FR2828692B1 FR2828692B1 (fr) | 2004-07-09 |
Family
ID=8866552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0110840A Expired - Fee Related FR2828692B1 (fr) | 2001-08-16 | 2001-08-16 | Procede d'ingenierie genetique pour le suivi en temps reel de l'activation de proteines specifiques de transduction de signaux cellulaires |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2828692B1 (fr) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998002571A1 (fr) * | 1996-07-16 | 1998-01-22 | The Regents Of The University Of California | Dosages de proteines kinases faisant appel a des substrats proteiques fluorescents |
| US5958713A (en) * | 1995-01-31 | 1999-09-28 | Novo Nordisk A/S | Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein |
| EP1118618A1 (fr) * | 1998-09-02 | 2001-07-25 | Center for Advanced Science and Technology Incubation, Ltd | Proteine de surveillance servant a mesurer la phosphorylation de proteines |
-
2001
- 2001-08-16 FR FR0110840A patent/FR2828692B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5958713A (en) * | 1995-01-31 | 1999-09-28 | Novo Nordisk A/S | Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein |
| WO1998002571A1 (fr) * | 1996-07-16 | 1998-01-22 | The Regents Of The University Of California | Dosages de proteines kinases faisant appel a des substrats proteiques fluorescents |
| EP1118618A1 (fr) * | 1998-09-02 | 2001-07-25 | Center for Advanced Science and Technology Incubation, Ltd | Proteine de surveillance servant a mesurer la phosphorylation de proteines |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CODY C W ET AL: "CHEMICAL STRUCTURE OF THE HEXAPEPTIDE CHROMOPHORE OF THE AEQUOREA GREEN-FLUORESCENT PROTEIN", BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. EASTON, PA, US, vol. 32, no. 5, 2 February 1993 (1993-02-02), pages 1212 - 1218, XP002030240, ISSN: 0006-2960 * |
| FREESTONE PRIMROSE ET AL: "The universal stress protein, UspA, of Escherichia coli is phosphorylated in response to stasis.", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 274, no. 3, 5 December 1997 (1997-12-05), pages 318 - 324, XP002204152, ISSN: 0022-2836 * |
| FREESTONE PRIMROSE ET AL: "Tyrosine phosphorylation in Escherichia coli.", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 279, no. 5, 26 June 1998 (1998-06-26), pages 1045 - 1051, XP002204153, ISSN: 0022-2836 * |
| NOMANBHOY TYZOON K ET AL: "Investigation of the GTP-binding/GTPase cycle of Cdc42Hs using extrinsic reporter group fluorescence.", BIOCHEMISTRY, vol. 35, no. 14, 1996, pages 4602 - 4608, XP002204151, ISSN: 0006-2960 * |
| POST ET AL: "A genetically engineered, protein base optical biosensor of Myosin II regulatory light chain phosphorylation", J BIOL CHEM, vol. 269, no. 17, 1994, pages 12880 - 12887, XP002204150 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2828692B1 (fr) | 2004-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mayer et al. | Investigation of the interaction between DnaK and DnaJ by surface plasmon resonance spectroscopy | |
| Singh et al. | Xenogeneic silencing and its impact on bacterial genomes | |
| Robinson et al. | A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch | |
| Hecker et al. | SigB-dependent general stress response in Bacillus subtilis and related gram-positive bacteria | |
| Manos et al. | Transcriptome analyses and biofilm-forming characteristics of a clonal Pseudomonas aeruginosa from the cystic fibrosis lung | |
| Jarosch et al. | S-layer gene sbsC of Bacillus stearothermophilus ATCC 12980: molecular characterization and heterologous expression in Escherichia coli | |
| Scalley-Kim et al. | Coevolution of a homing endonuclease and its host target sequence | |
| Bhagirath et al. | Characterization of the direct interaction between hybrid sensor kinases PA1611 and RetS that controls biofilm formation and the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa | |
| Guzzo et al. | Evolution and design governing signal precision and amplification in a bacterial chemosensory pathway | |
| US10093917B2 (en) | Compositions, methods and kits for real-time nucleic acid analysis in live cells | |
| JP2009531034A (ja) | 新規抗生物質開発のための細菌自殺経路の標的化 | |
| Perron-Savard et al. | Dimerization and DNA binding of the Salmonella enterica PhoP response regulator are phosphorylation independent | |
| Shi et al. | The convergent xenogeneic silencer MucR predisposes α-proteobacteria to integrate AT-rich symbiosis genes | |
| Koo et al. | ChxR is a transcriptional activator in Chlamydia | |
| Szczesna et al. | Dedicated bacterial esterases reverse lipopolysaccharide ubiquitylation to block immune sensing | |
| FR2828692A1 (fr) | Procede d'ingenierie genetique pour le suivi en temps reel de l'activation de proteines specifiques de transduction de signaux cellulaires | |
| Goldberg et al. | Identification of a substrate-selective exosite within the metalloproteinase anthrax lethal factor | |
| Utsumi | Bacterial signal transduction: networks and drug targets | |
| Li et al. | Comparative transcriptomics analyses of the different growth states of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii | |
| FR2827292A1 (fr) | Photoproteines mutees et leurs applications | |
| Kharadi et al. | The cyclic di-GMP network is a global regulator of phase-transition and attachment-dependent host colonization in Erwinia amylovora | |
| Abatedaga et al. | Characterization of BLUF-photoreceptors present in Acinetobacter nosocomialis | |
| Nowak-Lovato et al. | DNA binding site analysis of Burkholderia thailandensis response regulators | |
| Lai et al. | The region preceding the C-terminal NWETF pentapeptide modulates baseline activity and aspartate inhibition of Escherichia coli Tar | |
| EP1086377B1 (fr) | Procede d'identification de ligands de la sous-unite sigma (70) de l'arn polymerase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20160429 |