FR2828207A1 - Milieux de reaction pour l'activite thymidylate synthase de la thyx - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour but l'utilisation de milieux de réaction pour l'activité thymidylate synthase de la ThyX et leurs applications. En particulier, elle vise des milieux de réaction pour l'activité thymidylate synthase de la ThyX caractérisés en ce qu'ils comportent des flavines réduites et du CH2 H4 folate.
Description
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Milieux de réaction pour l'activité thymidylate synthase de la ThyX
L'invention se rapporte à une nouvelle famille d'enzymes, désignée THYX, capables de catalyser la synthèse de la thymidine 5'-monophosphate (dTMP).
L'invention se rapporte à une nouvelle famille d'enzymes, désignée THYX, capables de catalyser la synthèse de la thymidine 5'-monophosphate (dTMP).
Dans la demande FR 01 10401 déposée le 2 août 2001, les inventeurs ont montré qu'une famille de polypeptides, désignés THYX, qui sont d'une structure complètement distincte des polypeptides codés par les gènes thyA, possèdent la capacité de synthétiser le dTMP dans les cellules.
En particulier, ils ont montré que des cellules possédant un gène codant pour un polypeptide THYX possédait une activité
thymidylate synthase, en l'absence de gène thyA. Ils ont aussi montré que l'introduction d'une copie d'un gène thyX, codant pour polypeptide THYX dans une cellule auxotrophe pour la thymidine permettait de restaurer, dans cette cellule, la capacité de synthétiser de novo le dTMP et finalement le dTTP (thymidine 5'-triphosphate), utilisé pour la synthèse de l'ADN.
thymidylate synthase, en l'absence de gène thyA. Ils ont aussi montré que l'introduction d'une copie d'un gène thyX, codant pour polypeptide THYX dans une cellule auxotrophe pour la thymidine permettait de restaurer, dans cette cellule, la capacité de synthétiser de novo le dTMP et finalement le dTTP (thymidine 5'-triphosphate), utilisé pour la synthèse de l'ADN.
Les inventeurs ont également montré que les gènes thyX sont retrouvés dans le génome de nombreuses bactéries, bactériophages et virus bactériens ou eucaryotes, mais qu'ils sont absents dans le génome des mammifères, en particulier dans le génome humain.
Le polypeptide THYX comprend la séquence d'acides aminés suivante :
X1HXl (X) 781 dans laquelle : - Xi représente l'acide aminé R (Arginine ou Arg) ou K (Lysine ou Lys), et - (X) 7 est une chaîne de sept acides aminés consécutifs dans laquelle chaque X représente, indépendamment l'un de l'autre, l'un quelconque des 20 acides aminés naturels.
X1HXl (X) 781 dans laquelle : - Xi représente l'acide aminé R (Arginine ou Arg) ou K (Lysine ou Lys), et - (X) 7 est une chaîne de sept acides aminés consécutifs dans laquelle chaque X représente, indépendamment l'un de l'autre, l'un quelconque des 20 acides aminés naturels.
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S représente l'acide aminé Sérine, ou Ser.
Préférentiellement, Xi représente l'acide aminé R.
De préférence, le polypeptide THYX est choisi parmi les polypeptides comprenant les séquences d'acides aminés SEQ ID ? 1 à SEQ ID NO 37.
Les inventeurs ont donc montré que ce polypeptide est utilisable dans un procédé de synthèse in vitro de la thymidine 5'-monophosphate.
Les travaux des inventeurs sur l'activité de ThyX ont permis d'identifier le mécanisme enzymatique et ainsi d'optimiser les conditions de la réaction en mettant en évidence l'importance de l'addition de certains composés dans le milieu réactionnel.
L'invention a donc pour but l'utilisation de tels milieux et leur application.
Elle vise en premier lieu un milieu de réaction pour l'activité thymidylate synthase de la ThyX caractérisé en ce qu'il comporte des flavines réduites et du CH2H4folate.
Plus particulièrement, les flavines réduites de ce milieu sont obtenues par réduction in situ de flavines oxydées. La concentration en flavines oxydées est alors de 50M à lmM, de préférence, 0, 5mM. De préférence, les flavines oxydées sont des flavines mononucléotides (FMN) et/ou de dinucléotides flavine adénine (FAD). La réduction des flavines peut être effectuée par voie chimique, enzymatique, photochimique ou électrochimique et plus particulièrement, avec du NADH (ssnicotinamide adenine dinucléotide) et/ou du NADPH nicotinamide adenine dinucléotide phosphate).
Par ailleurs, la concentration en CH2H4folate est de 50pM à 2mM, de préférence, lmM.
De manière préférentielle, le milieu peut comporter en outre du dUMP (uridine 5'-monophosphate), à une concentration allant de lM à 800M, de préférence, 500jim.
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Lorsque la réduction des flavines est effectuée par du NADH et/ou du NADPH, la concentration en NADH est de 0,1 à lmM, et celle en NADPH, de 0,5 à 5mM.
L'invention vise d'autre part des procédés de criblage. En particulier, elle a pour objet de fournir un procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral in vitro dans un système acellulaire caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer un lysat cellulaire à partir d'une culture de cellules exprimant un polypeptide THYX en l'absence d'un polypeptide codé par un gène thyA et comportant un milieu selon l'invention ; b) ajouter au lysat cellulaire obtenu à l'étape a) le composé inhibiteur à tester ; c) comparer l'activité thymidylate synthase ThyX respectivement dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape a) et dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape b) ; et d) sélectionner les composés candidats pour lesquels une inhibition de l'activité thymidylate synthase
ThyX a été détectée.
ThyX a été détectée.
Dans ce procédé de criblage, on utilise de préférence le dTMP et 3H comme marqueurs de l'activité thymidylate synthase ThyX.
L'invention couvre également des kits ou nécessaires pour le criblage d'un composé inhibiteur de la thymidylate synthase ThyX caractérisé en ce qu'il comprend : a) une composition comprenant un polypeptide THYX ainsi qu'un milieu selon invention, en solution ou sous forme lyophilisée ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.
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De manière alternative, le kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé antibactérien ou antiviral, peut également comprendre : a) un vecteur d'expression recombinant comprenant un acide nucléique codant un polypeptide ThyX sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule hôte dans laquelle son expression est recherchée ou une cellule hôte transfectée avec un tel vecteur recombinant ; b) un milieu selon l'invention ; c) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés, à titre illustratif dans les exemples suivants avec références aux figures.
La figure 1 présente des analyses biochimiques de la ThyX de H. Pylori.
(A) 12% SDS-PAGE et analyses immunoblot de protéine isolée ThyX de H. pylori. 1,5 (Coomassie) et 0,3 (anti-V5) jg de protéine pure ont été détectés respectivement par coloration au Bleu de Coomassie ou utilisation d'anticorps monoclonaux contre un épitope anti-V5 (Invitrogen), par détection chimioluminescente. Le poids moléculaire attendu de la ThyX de H. pylori est de 31, 5 kDa (B) Les analyses spectroscopiques de la ThyX de
H. pylori indiquent que ThyX est une flavoprotéine. Le spectre absolu de 10 M d' enzyme isolée (ligne continue) et de co- facteur après sa libération de la protéine
H. pylori indiquent que ThyX est une flavoprotéine. Le spectre absolu de 10 M d' enzyme isolée (ligne continue) et de co- facteur après sa libération de la protéine
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(ligne pointillée). La fenêtre montre le spectre pour l'enzyme oxydée et la protéine dithionique réduite.
(C) L'activité de libération du Tritium de la protéine ThyX purifiée de H. pylori a été enregistrée en présence (+MTHF) et en l'absence (-MTHF) de CH2H4tétrahydrofolate.
La figure 2 illustre l'activité de formation du dTMP de la protéine ThyX de H. pylori. Les réactions enzymatiques ont été réalisées comme décrit dans le tableau 1, en utilisant du dUMP marqué en position 6. Les produits de réaction ont été analysés en utilisant une colonne à phase inversée C 18 par élution isocratique, en utilisant 10 mM de tampon de phosphate. Les durées d'élution pour dUMP et dTMP ont été déterminées en utilisant les références authentiques.
Exemple 1 : Identification du mécanisme de réaction de ThyX
Pour identifier les réactions biochimiques catalysées par les protéines ThyX, une ThYX de H. pylori portant un marqueur d'histidine sur sa terminaison carboxy a été purifiée à partir d'extraits acellulaires de souche X2913 d'E. coli soumis à une induction par de l'arabinose en chromatographie d'affinité de nickel immobilisé.
Pour identifier les réactions biochimiques catalysées par les protéines ThyX, une ThYX de H. pylori portant un marqueur d'histidine sur sa terminaison carboxy a été purifiée à partir d'extraits acellulaires de souche X2913 d'E. coli soumis à une induction par de l'arabinose en chromatographie d'affinité de nickel immobilisé.
Des cadres de lecture ouverts codant pour des protéines hypothétiques, apparaissant maintenant correspondre aux gènes thyX de P. abyssi (PAB0861) et H. pylori (HP1533), ont été obtenus par PCR, en utilisant des amorces spécifiques et de l'ADN chromosomique de P. abyssi et le clone GHPEH26 (American
Type Culture Collection nO 628507), respectivement, comme matrices. Les produits PCR ont été clonés dans le vecteur IO activé pBAD TOPO TA de topoisomérase (Invitrogen), permettant
Type Culture Collection nO 628507), respectivement, comme matrices. Les produits PCR ont été clonés dans le vecteur IO activé pBAD TOPO TA de topoisomérase (Invitrogen), permettant
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l'expression strictement contrôlée du gène dans E. coli. Tous les clones plasmidiques ont été confirmés par séquençage d'ADN. Les masses moléculaires attendues de PAB0861 et HP1533, comprenant une séquence activatrice de traduction aminoterminale et une région V5 carboxy-terminale et des épitopes d'hexahistidine, sont respectivement de 33,7 et de 31, 5 kDa.
L'expression de la protéine a été induite avec 0, 2% de Larabinose. Les protéines exprimées ont été détectées par utilisation d'anticorps monoclonaux V5-spécifiques (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant.
La protéine ThyX à site antigénique marqué de H. pylori et biologiquement active a été purifiée à partir de 200ml de cultures de pGL2/E. coli X2913 [AthyA (tableau 1)] après 2 heures d'induction par 0, 2% de L-arabinose. Un kit d'expression QIA (Qiagen) sous conditions endogènes standard a été utilisé pour la purification comme indiqué par le fabricant, comprenant 10% (volume/volume) de glycérol dans tous les tampons. Les échantillons de protéine obtenus ont été dialysés contre 50mM d'un tampon de phosphate, à pH 7, 4 et de glycérol à 10% (volume/volume) après élution pour éliminer l'imidazole. La concentration de protéine dans des échantillons purs a été estimée par lecture A2801 justifiant l'absorbance A280 du cofacteur de flavine à liaison non covalente, à 35560 M'cm', calculée par rapport à la séquence connue d'acides aminés, et a été utilisée pour l'apoprotéine ThyX de H. pylori.
Les préparations de protéines obtenues (pureté 95%) contenaient habituellement 1 à 2 mg/ml de protéine, avec une masse moléculaire d'environ 31 kDa sur gels SDS-PAGE (la masse moléculaire attendue de ThyX de H. pylori est de 31, 5 kDa) (Figure 1A), et avaient une couleur jaune clair. La chromatographie par exclusion de taille au Superdex 200 utilisant des marqueurs de poids moléculaire standards, a révélé une masse moléculaire endogène de 111 kDa (r=0, 9874)
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pour cette protéine, suggérant que sa forme active pouvait correspondre à un homotétramère. Des analyses spectroscopiques de la protéine isolée (oxydée) ont montré des caractéristiques d'absorbance typiques d'une flavoprotéine (figure 1B), avec de larges pics à 447,5 et 375 nm. Ces pics d'absorption se sont révélés absents dans l'enzyme réduite au dithionite. Des caractéristiques d'absorption similaires ont été trouvées pour le cofacteur après sa libération de la protéine par dénaturation à la chaleur à 800C pendant 5 minutes. Par chromatographie HPLC, le cofacteur associé à la ThyX de H. pylori a été identifié comme un FAD (flavine-adénine dinucléotide). Il a été estimé que les différentes préparations d'enzyme de ThyX de H. pylori contiennent de 0,4 à 0,5 molécules de FAD par monomère. En tout, ces propriétés spectroscopiques indiquent que la ThyX de H. pylori est une flavoprotéine et/ou utilise les cofacteurs de flavine dans la catalyse.
Dans la formation de dTMP, la perte de tritium du [5H] dUMP dans le solvant est un intermédiaire obligatoire, permettant de quantifier l'activité de la thymidylatesynthétase après élimination des nucléotides radioactifs des mélanges réactionnels (ROBERTS, 1966). Pour aborder le mécanisme biochimique, par lequel la ThyX peut circonvenir l'exigence pour la ThyA dans la synthèse de novo du thymydilate, la protéine ThyX purifiée a été utilisée dans la même mesure.
Exemple 2 : Optimisation des conditions de réaction de ThyX
Le N5, N1o-CH2H4folate a été formé de manière nonenzymatique, par incubation de 2mM d'acide tétrahydrofolique (Sigma@) avec 100 mM de ss-mercaptoéthanol et 20 mM de formol pendant 30 minutes dans l'obscurité et à température ambiante.
Le N5, N1o-CH2H4folate a été formé de manière nonenzymatique, par incubation de 2mM d'acide tétrahydrofolique (Sigma@) avec 100 mM de ss-mercaptoéthanol et 20 mM de formol pendant 30 minutes dans l'obscurité et à température ambiante.
Les dosages de libération de tritium avec une enzyme purifiée
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ont été réalisés dans 50 mM de Tris-Cl, à pH 7,9, comprenant une préparation de 1 mM de CH2H4folate obtenue comme décrit cidessus. Les réactions de contrôle ont été réalisées sous des conditions analogues, sans acide tétrahydrofolique. Les
réactions à 50 gl ont été démarrées par addition de 6 M de [5-3H]dUMP, l'activité spécifique à 16, 2 Ci/mmol (Amersham) et arrêtées après 60 minutes à 370C par deux extractions avec 250ill de charbon actif [10% (poids/volume) de Norit A] dans 2% d'acide trichloroacétique pour éliminer les nucléotides des mélanges réactionnels. La radioactivité rémanente dans le surnageant a été déterminée selon MYLLYKALLIO (2000).
réactions à 50 gl ont été démarrées par addition de 6 M de [5-3H]dUMP, l'activité spécifique à 16, 2 Ci/mmol (Amersham) et arrêtées après 60 minutes à 370C par deux extractions avec 250ill de charbon actif [10% (poids/volume) de Norit A] dans 2% d'acide trichloroacétique pour éliminer les nucléotides des mélanges réactionnels. La radioactivité rémanente dans le surnageant a été déterminée selon MYLLYKALLIO (2000).
Comme l'indique la figure 1C, la ThyX catalyse in vitro la libération de tritium du (5-3H) dUMP en fonction de la concentration en protéine et de manière CH2H4folate dépendante, ce qui démontre l'activité biochimique des protéines ThyX. Des conditions optimisées de réaction sont rapportées dans le tableau 1.
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Tableau 1. Optimisation des conditions de réaction pour la protéine ThyX d'H. pylori
<tb>
<tb> Conditions <SEP> du <SEP> test <SEP> nmol <SEP> de <SEP> H <SEP> libéré/mg <SEP> de <SEP> protéine
<tb> (incubation <SEP> de <SEP> 60 <SEP> minutes)
<tb> ThyX <SEP> de <SEP> H. <SEP> pylori <SEP> :
<tb> Complet <SEP> 63. <SEP> 0 <SEP> (100%)
<tb> Complet, <SEP> - <SEP> protéine <SEP> 0.7 <SEP> (1. <SEP> 1%)
<tb> Complet,-H4folate0. <SEP> 8 <SEP> (1. <SEP> 2%)
<tb> Complet,-NADH,-NADPH,-FMN2. <SEP> 2 <SEP> (3.4%)
<tb> Complet,-FMN2. <SEP> 70 <SEP> (4.3%)
<tb> Complet, <SEP> - <SEP> NADPH <SEP> 37. <SEP> 3 <SEP> (59.2%)
<tb> Complet, <SEP> - <SEP> NADH <SEP> 19. <SEP> 0 <SEP> (30. <SEP> 1 <SEP> %)
<tb> Complet, <SEP> + <SEP> 500 <SEP> f. <SEP> lM <SEP> dUMP <SEP> 9. <SEP> 3 <SEP> (14.8%)
<tb> Complet, <SEP> + <SEP> 500 <SEP> f. <SEP> UMP <SEP> 64. <SEP> 4 <SEP> (102.2%)
<tb>
Le test complet contient 50 mM de Tris-HC1, pH 7.0, 1 mM de préparation de CH2H4folate, 10 mM de Mg12, 2 mM de NADPH, 1 mM de NADH, 0. 5 mM de FMN et 9 M de 3H-dUMP (activité spécifique 1,7357 Cilmmo1). La préparation de CH2H4folate est obtenue par incubation 30 minutes dans l'obscurité de 2 mM de
H-fotate, de 96 mM de 2-mercaptoethanol et de 42 mM de formaldéhyde et de 50 mM de Tris-cl Dans la réaction, le FMN peut être replacée efficacement par du FAD (flavine adénine di-nucléotide). Dans ces conditions de réactions, 20 ! -1M de dUMP et 100 ! -1M de CHI-Lfolate sont suffisant pour saturer l'activité de libération de tritium de la protéine ThyX de H. pylori lors d'une incubation de 60 minutes.
<tb> Conditions <SEP> du <SEP> test <SEP> nmol <SEP> de <SEP> H <SEP> libéré/mg <SEP> de <SEP> protéine
<tb> (incubation <SEP> de <SEP> 60 <SEP> minutes)
<tb> ThyX <SEP> de <SEP> H. <SEP> pylori <SEP> :
<tb> Complet <SEP> 63. <SEP> 0 <SEP> (100%)
<tb> Complet, <SEP> - <SEP> protéine <SEP> 0.7 <SEP> (1. <SEP> 1%)
<tb> Complet,-H4folate0. <SEP> 8 <SEP> (1. <SEP> 2%)
<tb> Complet,-NADH,-NADPH,-FMN2. <SEP> 2 <SEP> (3.4%)
<tb> Complet,-FMN2. <SEP> 70 <SEP> (4.3%)
<tb> Complet, <SEP> - <SEP> NADPH <SEP> 37. <SEP> 3 <SEP> (59.2%)
<tb> Complet, <SEP> - <SEP> NADH <SEP> 19. <SEP> 0 <SEP> (30. <SEP> 1 <SEP> %)
<tb> Complet, <SEP> + <SEP> 500 <SEP> f. <SEP> lM <SEP> dUMP <SEP> 9. <SEP> 3 <SEP> (14.8%)
<tb> Complet, <SEP> + <SEP> 500 <SEP> f. <SEP> UMP <SEP> 64. <SEP> 4 <SEP> (102.2%)
<tb>
Le test complet contient 50 mM de Tris-HC1, pH 7.0, 1 mM de préparation de CH2H4folate, 10 mM de Mg12, 2 mM de NADPH, 1 mM de NADH, 0. 5 mM de FMN et 9 M de 3H-dUMP (activité spécifique 1,7357 Cilmmo1). La préparation de CH2H4folate est obtenue par incubation 30 minutes dans l'obscurité de 2 mM de
H-fotate, de 96 mM de 2-mercaptoethanol et de 42 mM de formaldéhyde et de 50 mM de Tris-cl Dans la réaction, le FMN peut être replacée efficacement par du FAD (flavine adénine di-nucléotide). Dans ces conditions de réactions, 20 ! -1M de dUMP et 100 ! -1M de CHI-Lfolate sont suffisant pour saturer l'activité de libération de tritium de la protéine ThyX de H. pylori lors d'une incubation de 60 minutes.
De manière surprenante, il a été trouvé que l'addition de nucléotides réduits de flavine augmente drastiquement l'activité de libération de tritium de la ThyX de H. pylori (=0,01 mol de H20 formée par min et par mg de protéine, tel que mesuré lors d'expériences supplémentaires de temps d'absorption).
De même, il a été démontré par de simples expériences de compétition, que l'activité de la ThyX n'utilise pas UMP comme
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substrat (tableau 1) et que cette activité est inhibée par des concentrations micromoléculaires de dTMP. L'activité libératoire de tritium de la ThyX de H. pylori est directement liée à la formation de dTMP (figure 2).
Les résultats expérimentaux ont donc clairement établi que les protéines ThyX fonctionnent comme une thymidilatesynthétase dUMP dépendante (figures 1, 2).
Par conséquent, alors que la catalyse par ThyX est dépendante des nucléotides de flavine réduite, la ThyA utilise des électrons du H4folate pour la formation du groupe fonctionnel méthyle. Le CH2H4folate fonctionne dans la réaction catalysée par ThyX uniquement comme donneur d'un carbone, provoquant ainsi la formation de H4folate comme produit de la réaction. Ce mécanisme de réaction explique clairement pourquoi la dihydrofolate-réductase n'est pas indispensable à la formation de thymidylate par les protéines ThyX (tableau 2).
<Desc/Clms Page number 11>
Tableau 2
<tb>
<tb> Espèces <SEP> thyA <SEP> DHFR <SEP> tdk <SEP> thyX <SEP> Commentaires
<tb> Bactéries <SEP> :
<tb> Campylobacter---+ <SEP> Intoxications
<tb> Jejuni <SEP> Alimentaires
<tb> Helicobacter <SEP> pylori---+ <SEP> Formation <SEP> des <SEP> ulcères
<tb> stomacaux
<tb> Rickettsia---+ <SEP> Agent <SEP> causal <SEP> du <SEP> typhus
<tb> prowazekii
<tb> Borrelia---+ <SEP> Impliqué <SEP> dans <SEP> la <SEP> maladie
<tb> burgdorferi <SEP> de <SEP> Lyme
<tb> Treponemapallidum---+ <SEP> Agent <SEP> causal <SEP> de <SEP> la
<tb> Syphylis
<tb> Chlamydia <SEP> (3-±+ <SEP> Pathogène <SEP> intracellulaires
<tb> espèces) <SEP> obligatoires
<tb> Mycobacterium <SEP> + <SEP> ±+ <SEP> Tuberculose
<tb> tuberculosis
<tb> Archaebactéries <SEP> :
<tb> Pyrococcus <SEP> abyssi--+Hyperthermophile
<tb> Pyrococcus---+ <SEP> Hyperthermophile
<tb> horikoshii
<tb> Sufolobus---+ <SEP> Hyperthermophile
<tb> solfaraticus
<tb> Eucaryotes <SEP> :
<tb> Dictyostellium <SEP> N. <SEP> A <SEP> N. <SEP> A. <SEP> + <SEP> Pas <SEP> de <SEP> sequence <SEP> génomique
<tb> complete
<tb> Virus <SEP> :
<tb> Virus <SEP> à <SEP> ADN <SEP> N. <SEP> A <SEP> +
<tb> bactériens <SEP> et
<tb> eucaryotes <SEP> (5
<tb> espèces)
<tb> Tdk <SEP> : <SEP> thymidine <SEP> kinase, <SEP> nécessaire <SEP> à <SEP> la <SEP> recuperation <SEP> de <SEP> thymidine <SEP> exogène.
<tb>
<tb> Espèces <SEP> thyA <SEP> DHFR <SEP> tdk <SEP> thyX <SEP> Commentaires
<tb> Bactéries <SEP> :
<tb> Campylobacter---+ <SEP> Intoxications
<tb> Jejuni <SEP> Alimentaires
<tb> Helicobacter <SEP> pylori---+ <SEP> Formation <SEP> des <SEP> ulcères
<tb> stomacaux
<tb> Rickettsia---+ <SEP> Agent <SEP> causal <SEP> du <SEP> typhus
<tb> prowazekii
<tb> Borrelia---+ <SEP> Impliqué <SEP> dans <SEP> la <SEP> maladie
<tb> burgdorferi <SEP> de <SEP> Lyme
<tb> Treponemapallidum---+ <SEP> Agent <SEP> causal <SEP> de <SEP> la
<tb> Syphylis
<tb> Chlamydia <SEP> (3-±+ <SEP> Pathogène <SEP> intracellulaires
<tb> espèces) <SEP> obligatoires
<tb> Mycobacterium <SEP> + <SEP> ±+ <SEP> Tuberculose
<tb> tuberculosis
<tb> Archaebactéries <SEP> :
<tb> Pyrococcus <SEP> abyssi--+Hyperthermophile
<tb> Pyrococcus---+ <SEP> Hyperthermophile
<tb> horikoshii
<tb> Sufolobus---+ <SEP> Hyperthermophile
<tb> solfaraticus
<tb> Eucaryotes <SEP> :
<tb> Dictyostellium <SEP> N. <SEP> A <SEP> N. <SEP> A. <SEP> + <SEP> Pas <SEP> de <SEP> sequence <SEP> génomique
<tb> complete
<tb> Virus <SEP> :
<tb> Virus <SEP> à <SEP> ADN <SEP> N. <SEP> A <SEP> +
<tb> bactériens <SEP> et
<tb> eucaryotes <SEP> (5
<tb> espèces)
<tb> Tdk <SEP> : <SEP> thymidine <SEP> kinase, <SEP> nécessaire <SEP> à <SEP> la <SEP> recuperation <SEP> de <SEP> thymidine <SEP> exogène.
<tb>
DHFR <SEP> : <SEP> dihydrofolate <SEP> reductase.
<tb>
<tb>
On <SEP> notera <SEP> que, <SEP> dans <SEP> la <SEP> séquence <SEP> de <SEP> Chlamydia, <SEP> le <SEP> résidue <SEP> Sérine <SEP> est <SEP> soit <SEP> absent, <SEP> soit <SEP> localisé <SEP> à
<tb> 1'extrémité <SEP> aminotermina1e <SEP> de <SEP> la <SEP> protéine.
<tb>
<tb> 1'extrémité <SEP> aminotermina1e <SEP> de <SEP> la <SEP> protéine.
<tb>
Les différences dans le mécanisme enzymatique des deux différentes classes de thymidylate-synthétases sont aussi dues à l'absence de motifs de séquence essentiels pour la catalyse dans les protéines ThyA et ThyX. Ces données ont permis d'identifier des analogues de dUMP, de dTMP, de folate et de nucléotides de flavine comme candidats idéaux pour des composés clés pour identifier des composés nouveaux inhibant l'activité de la ThyX.
<Desc/Clms Page number 12>
H. Myllykallio et al., Science 288, 2212 (2000).
D. Roberts, Biochemistry 5, 3546 (1996).
Claims (13)
- REVENDICATIONS 1. Milieu de réaction pour l'activité thymidylate synthase de la ThyX caractérisé en ce qu'il comporte des flavines réduites et du CH2H4folate.
- 2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que les flavines réduites sont obtenues par réduction in situ de flavines oxydées.
- 3. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en flavines oxydées est de cm à 1mM, de préférence, 0, 5mM.
- 4. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en CH2H4folate est de 50, uM à 2mM, de préférence, 1mM.
- 5. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre du dUMP, à une concentration allant de 1PLM à 800 M, de préférence, 500suM.
- 6. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les flavines oxydées sont des flavines mononucléotides et/ou de dinucléotides flavine adénine.
- 7. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la réduction des flavines est effectuée par voie chimique, enzymatique, photochimique ou électrochimique.
- 8. Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la réduction des flavines est effectuée avec du NADH et/ou du NADPH.<Desc/Clms Page number 14>
- 9. Milieu selon la revendication 8, caractérisé en ce que la concentration en NADH est de 0,1 à 1mM, et celle en NADPH, de 0,5 à 5mM.
- 10. Procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral in vitro dans un système cellulaire caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer un lysat cellulaire à partir d'une culture de cellules exprimant un polypeptide THYX en l'absence d'un polypeptide codé par un gène thyA et comportant un milieu selon l'une des revendications précédentes ; b) ajouter au lysat cellulaire obtenu à l'étape a) le composé inhibiteur à tester ; c) comparer l'activité thymidylate synthase ThyX respectivement dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape a) et dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape b) ; et d) sélectionner les composés candidats pour lesquels une inhibition de l'activité thymidylate synthase ThyX a été détectée.
- 11. Procédé de criblage selon la revendication 10, caractérisé en ce que on utilise le dTMP et 3H comme marqueurs de l'activité thymidylate synthase ThyX.
- 12. Kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé inhibiteur de la thymidylate synthase ThyX caractérisé en ce qu'il comprend : a) une composition comprenant un polypeptide THYX ainsi qu'un milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, en solution ou sous forme lyophilisée ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.<Desc/Clms Page number 15>
- 13. Kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé antibactérien ou antiviral, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un vecteur d'expression recombinant comprenant un acide nucléique codant un polypeptide ThyX sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule hôte dans laquelle son expression est recherchée ou une cellule hôte transfectée avec un tel vecteur recombinant ; b) un milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ; c) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.
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| DYNES J L ET AL: "MOLECULAR COMPLEMENTATION OF A GENETIC MARKER IN DICTYOSTELIUM USING A GENOMIC DNA LIBRARY", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 86, no. 20, 1989, pages 7966 - 7970, XP002200055, ISSN: 0027-8424 * |
| MYLLYKALLIO HANNU ET AL: "An alternative flavin-dependent mechanism for thymidylate synthesis.", SCIENCE (WASHINGTON D C), vol. 297, no. 5578, 2002, 5 July, 2002, pages 105 - 107, XP002235740, ISSN: 0036-8075 * |
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