FR2827773A1

FR2827773A1 - Composition pour la regulation negative de l'activite tyrosine kinase des proteines src et analogues, et applications

Info

Publication number: FR2827773A1
Application number: FR0110200A
Authority: FR
Inventors: Zohra Rahmani
Original assignee: INSTITUT NECKER
Current assignee: INSTITUT NECKER
Priority date: 2001-07-30
Filing date: 2001-07-30
Publication date: 2003-01-31
Also published as: WO2003011315A1

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de la protéine APRO4, ou d'une protéine ou fraction protéique équivalente ayant un domaine C-terminal riche en proline, pour la régulation négative de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src, et la préparation de compositions pharmaceutiques contenant une telle protéine ou fraction protéique.Application notamment à la prévention et/ ou au traitement des cancers, en particulier des cancers du côlon, du pancréas et du sein, de l'ostéoporose et des maladies osseuses dérivées, et des ischémies cérébrales et myocardiques.

Description

COMPOSITION POUR LA RÉGULATION NÉGATIVE DE L'ACTIVITÉ
TYROSINE KINASE DES PROTÉINES Src ET ANALOGUES, ET
APPLICATIONS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la biologie. Elle concerne plus particulièrement la régulation négative de l'activité enzymatique tyrosine kinase des protéines Src et analogues, et les applications de cette régulation négative à la sous-régulation de la prolifération, de la différenciation et/ou de la transformation des cellules in vivo ou ex vivo, en particulier pour un traitement amélioré des cancers, de l'ostéoporose et des maladies osseuses dérivées, ainsi que des ischémies cérébrales et myocardiques, entre autres.

ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIOUE DE L'INVENTION
La protéine tyrosine kinase Src, joue un rôle important dans de multiples voies de signalisation régulant plusieurs fonctions cellulaires différentes, notamment la prolifération, la différenciation et la transformation des cellules. L'activité catalytique de la protéine Src est étroitement régulée in vivo et peut être modulée par les interactions de ses domaines SH2 et SH3 avec des ligands à forte affinité.

Les protéines tyrosine kinases de la famille Src ont été initialement découvertes dans des tumeurs sous la forme virale d'un rétrovirus oncogène, le virus du sarcome de Rous. Cette forme, appelée v-Src, est constitutivement active et représente une forme mutée d'une protéine cellulaire, c-Src, exprimée ubiquitairement et très conservée au cours de l'évolution. La recherche de protéines kinases homologues a permis d'isoler 10 membres de la famille Src : Src, Fyn, Yes, Yrk, Blk, Fgr, Yck, Lck, Lyn et Frk. Ces protéines ont une structure moléculaire très similaire avec plusieurs domaines structuraux importants pour leur fonctions : un domaine SH2 qui interagit avec des séquences protéiques contenant une tyrosine phosphorylée, un domaine SH3 qui interagit avec des séquences protéiques riches en proline, un domaine catalytique tyrosine kinase, un domaine C-terminal contenant

une tyrosine phosphorylée qui régule négativement l'activité tyrosine kinase (1).

Pour simplifier, on désignera dans la suite par"la protéine Src"la protéine Src proprement dite, et par"les protéines Src"les protéines de la famille Src susdite ou l'une quelconque d'entre elles.

La protéine Src a été impliquée dans un grand nombre de voies différentes de transduction de signaux conduisant à une prolifération cellulaire ou à une différenciation cellulaire selon le type de cellule concerné (1). Par exemple, la forme oncogénique v-Src, constitutivement active, induit la différenciation de cellules PC12 en cellules analogues à des neurones (2), tandis que la protéine v-Src bloque la différenciation des chondroblastes en chondrocytes (3), ce qui suggère que la protéine Src joue un rôle important dans la différenciation des cellules neuronales et des chondrocytes. En outre, une activité tyrosine kinase élevée de la protéine Src a été associée à une transformation cellulaire (4). La protéine Src exerce également un rôle important dans la régulation du cycle cellulaire, l'adhésion et la migration des cellules, la survie des cellules et l'angiogenèse (1,5), ce qui suggère que la protéine Src joue un rôle critique dans le fonctionnement normal des cellules et que son activité a besoin d'être étroitement régulée. La protéine Src est composée de deux modules peptidiques, appelés domaines SH2 et SH3 (pour Src homology 2 et 3), d'un domaine catalytique, et d'une région Cterminale régulatrice contenant un résidu tyrosine (Y527) régulant négativement l'activité de la protéine Src. L'activité enzymatique de la protéine Src est régulée par des associations intramoléculaires d'une part entre le domaine SH2 et la tyrosine phosphorylée C-terminale et d'autre part entre le domaine SH3 et une petite région qui lie le domaine SH2 au domaine kinase pour donner une conformation enzymatique inactive"fermée" (6).

L'activité catalytique de la protéine Src peut être modulée par trois facteurs, qui sont : la phosphorylation/déphosphorylation de la tyrosine C-terminale ; la compétition pour le domaine SH2 par un ligand contenant une phosphotyrosine de forte affinité ; et la compétition pour le domaine SH3 par un ligand riche en proline de forte affinité (6).

Les protéines dénommées APRO (pour"antiprolifératives") constituent une famille de gènes comportant, selon les connaissances actuelles, au moins huit membres chez les vertébrés : APRO1

(BTG2/TIS21/PC3), APR02 (BTG1), APR03 (PC3B), APR04 (BTG3/ANA), APR05 (Tob2), APR06 (Tob), B9.10, et B9.15 (7-15). Le gène APR04 était dénommé jusqu'ici ANA (pour Abundant in the Neuroepithelium Area).

Tous ces gènes contiennent deux petits domaines conservés dans leur partie N-terminale (boîte A et boîte B), séparés par une séquence de 20-25 acides aminés non-conservés.

Les fonctions biologiques des protéines de la famille APRO susdite sont encore peu claires. Toutefois, plusieurs publications ont montré que, dans des cellules de fibroblastes murins NIH 3T3 (ATCC ? CRL-1658), leur surexpression conduit à l'inhibition de la prolifération cellulaire (8,10-16), suggérant que les protéines APRO peuvent être impliquées dans la régulation négative du cycle cellulaire. Egalement, plus récemment, il a été montré que la protéine APR05 (Tob) régulait négativement la prolifération et la différenciation des ostéoblastes par suppression de l'activité des protéines Smad régulées par le récepteur BMP (Bone Morphogenetic Factor) (17).

La protéine APR04, dont la structure est décrite dans la littérature (12,15), code pour une protéine de 252 acides aminés. La partie aminoterminale de la protéine APR04 est homologue aux protéines APRO caractérisées précédemment, tandis que sa partie C-terminale contient une région riche en proline (11,12). De plus, la protéine APR04, bien qu'étant exprimée de manière ubiquitaire, est très fortement exprimée dans les cellules neuroépithéliales de la zone ventriculaire du système nerveux central en développement, ainsi que dans les cartilages embryonnaires, ce qui suggère que la protéine APR04 pourrait jouer un rôle dans la neurogenèse et dans la prolifération et/ou la différenciation des chondrocytes (12).

L'homme du métier n'était pas pour autant renseigné ou même guidé vers une utilisation, plus spécialement de l'une ou l'autre des protéines APRO susmentionnées. En effet, les résultats jusqu'alors publiés ne faisaient état d'aucune fonction connue pour le domaine C-terminal riche en proline de la protéine APR04, domaine qui fait d'ailleurs la spécificité de la protéine APR04 puisque non présent dans les autres protéines APRO. L'attention s'était jusqu'alors focalisée sur la région N-terminale des différentes protéines APRO, puisqu'elle était commune aux différents membres de la

famille APRO et qu'il avait déjà été montré qu'elle pouvait avoir un rôle négatif sur la prolifération cellulaire notamment dans le cas de la protéine APR01 (18).

Or, il existe encore de nos jours un besoin pour des moyens plus performants de prévention et/ou de traitement des cancers et plus généralement de tous types de prolifération, différenciation et/ou transformation des cellules qui, si elles ne sont pas souhaitées, constituent des dérèglements auxquels il est important de porter remède.

Un objectif de la présente invention est par conséquent de procurer de nouveaux moyens de prévention et/ou de traitement des proliférations, différenciations et/ou transformations cellulaires, notamment en vue d'une meilleure prévention et/ou d'un traitement amélioré des cancers, en particulier des cancers du côlon, du pancréas et du sein, des ostéoporoses et des maladies osseuses dérivées et des ischémies cérébrales et myocardiques.

RÉSUMÉ DE L'INVENTION
Conformément à la présente invention on a maintenant déterminé qu'un matériel biologique ayant une région ou partie C-terminale riche en proline, notamment un matériel biologique comprenant une protéine de type APRO spécifique, procure des fonctionnalités permettant son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des états ayant pour cause ou pour facteurs de développement une prolifération, une différenciation et/ou une transformation cellulaires dues à une augmentation de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src. La présente invention procure également des moyens de prévention et/ou de traitement fondés sur un tel matériel biologique, en particulier sur une telle protéine ou fraction protéique appropriée, définie plus loin.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention sera mieux comprise en référence aux dessins annexés, qui illustrent certains résultats ayant trait aux moyens préconisés selon l'invention et aux résultats obtenus par leur mise en oeuvre, et dans lesquels :
Fig. 1 montre l'interaction in vitro et in vivo de Flag-APR04 avec Srcwt.

Fig. 2 représente les résultats d'essais d'identification des sites de liaison pour APR04 et Src.

Fig. 3 représente la suppression de l'activité tyrosine kinase de Src et de la signalisation Ras/MAP kinase dans des cellules NIH 3T3 par surexpression d'APR04.

Fig. 4 représente l'inhibition de la différenciation de cellules PC12

médiée par le NGF par surexpression d'APR04.

Fig. 5 représente l'activation de la signalisation Ras/MAP kinase et de la différenciation de cellules PC12 par sous-régulation de protéine APR04 endogène.

Dans ces figures annexées : - la Fig. 1 se décompose ainsi : a. Liaison des protéines Flag-APR04, Flag-APR04AC, et Flag-
APR04AN traduites in vitro en présence de méthionine [35S] à des constructions GST-SH3-SH2, GST-SH3 et GST-SH2.

Quantité utilisée : 100% des protéines respectives utilisées dans les réactions de liaison ; GST : billes de GST (Glutathion S- transférase). b. Co-immunoprécipitation de Srcwt avec Flag-APR04 dans des cellules NIH 3T3 co-exprimant Srcwt et Flag-APR04. Les immunoprécipités (IP) ont été analysés par immunoblotting (IB) avec les anticorps anti-Src ou anti-Flag.

Les données indiquées sont représentatives de trois expériences indépendantes.

- la Fig. 2 se décompose comme suit : a, b. X-APR04AN interagissait avec la protéine Srcwt (a), tandis que
Flag-APR04AC n'interagissait pas (b). c-g. Flag-APR04 interagissait in vivo avec

le mutant AI296T de la protéine Src (c), et la forme inactive de la protéine Src (SrcDN) (f), mais ne se fixait pas au mutant du domaine SH2 de la protéine Src (R177K) (d), aux deux mutants du domaine SH3 de la protéine Src (Y133F et Y138F) (e), et à la forme constitutivement active de la protéine Src (Y527F) (g).

Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.

- la Fig. 3 se décompose en :

a. Des essais sur des cellules NIH 3T3 et NIH 3T3ApRQ4 pour l'activité kinase de la protéine Src endogène. b. Des essais sur des cellules NIH 3T3 co-transfectées avec 1 ng de 5x-Gal4-TATA/luciférase, 200 ng de Elk/gal, 1 mg de CMV- ssGa1 et les plasmides d'expression indiqués. L'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1 est reflétée par l'activité luciférase normalisée par rapport à l'activité ssGa1 et a été rapportée en facteur de diminution de l'activité. L'écart type est indiqué (n=3). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. c. Des quantités croissantes de plasmides APR04 ont été co-

transfectées dans des cellules NIH 3T3 avec 1 llg de construction -1745 CDILUC et 1 ig de construction CMV-ssGal. L'activité luciférase normalisée par rapport à l'activité ssGa1 a été rapportée en facteur de diminution de l'activité par rapport à l'activité basale. La construction -22 CDILUC a été utilisée comme témoin négatif. L'écart type est indiqué (n=3). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.

- la Fig. 4 se décompose comme suit : a. Co-immunoprécipitation de la protéine APR04 endogène avec la protéine Src endogène dans des cellules PC12. L'antisérum de souris normal ne donne pas d'immunoprécipité avec la protéine
APR04. b. Co-localisation de Src et d'APR04 dans des cellules PC12 par microscopie confocale. Les aires de co-localisation sont la réunion des aires respectives de localisation de la protéine Src et de la protéine APR04. c, d. Inhibition de la différenciation de cellules PC12 médiée par le
NGF (c) et de l'activité kinase de la protéine Src (d) par surexpression de la protéine APR04. L'activité de la protéine
Src endogène a été testée comme décrit plus haut. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.

e. Inhibition de la signalisation Ras/MAP kinase par surexpression de la protéine APR04. Des cellules PC12 ont été

co-transfectées avec 1 gag de 5x-Gal4-TATA/luciférase, 200 ng de GaI4-Elk-1 (Elk/gal), 1 gag de CMV-pGal et les plasmides d'expression indiqués, et ont été soit laissées sans stimulation, soit stimulées avec du NGF (100 ng/ml) pendant 6 heures.

L'activité luciférase, normalisée par rapport à l'activité ssGal, a été rapportée en facteur de diminution. L'écart type est indiqué (n=3). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.

- la Fig. 5 se décompose ainsi : a. Sous-régulation de la protéine APR04 endogène par vecteur antisens, pAS-APR04. Des cellules PC12 ont été transfectées de manière transitoire avec pAS-APR04 et 200 gag de lysats de cellules entières ont été analysés par immunoblot avec les anticorps indiqués. b. Stimulation de l'activité kinase de la protéine Src dans des cellules PC12 transfectées de manière transitoire avec pAS-
APR04. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. c. Activation de la transcription de la protéine Elk-1 par inhibition

d'expression de la protéine APR04 endogène. Des cellules PC12 ont été co-transfectées de manière transitoire avec 1 gag de 5x- Gal4-TATA/luciférase, 200 ng de Gal4-Elk-l (Elk/gal), 1 tug de CMV-pGal, et pAS-APR04 ou un vecteur vide témoin.

L'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1 reflétée par l'activité luciférase et normalisée par rapport à l'activité ssGal est indiquée en facteur d'augmentation. L'écart type est mentionné (n=4). Les données sont représentatives de quatre expériences indépendantes. d. Induction de la différenciation de cellules PC12 par inhibition

d'expression de la protéine APR04 endogène. Les cellules ont été co-transfectées avec pAS-APR04 et un plasmide rapporteur CMV-pGal et colorées pour l'expression du gène lacZ après 6 jours. On a compté comme neurites les développements qui correspondaient à une taille supérieure à deux diamètres du

corps cellulaire. Les données sont représentatives de quatre expériences indépendantes.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
On a maintenant trouvé de manière inattendue que l'on peut réaliser une composition pharmaceutique utile pour induire une modification conformationnelle des protéines Src, ladite composition comportant au moins un matériel biologique comprenant une région ou partie C-terminale riche en proline. A titre d'exemple non-limitatif d'un tel matériel biologique, on considère dans la suite la protéine APR04.

Un objet de la présente invention est ainsi de procurer une composition pharmaceutique utile, notamment dans les applications mentionnées plus haut.

Un autre objet de la présente invention est de procurer une composition utile pour induire une modification conformationnelle des protéines Src.

Encore un autre objet de l'invention est de procurer une composition pharmaceutique apte à agir comme un régulateur conformationnel de l'activité des protéines Src.

Encore un autre objet de l'invention est de procurer une composition pharmaceutique apte à s'associer aux deux domaines SH2 et SH3 des protéines Src.

Encore un autre objet de l'invention est de procurer une composition pharmaceutique apte à exercer une sous-régulation de l'activité tyrosine kinase des protéines Src et analogues.

D'autres objets, avantages et caractéristiques remarquables de l'invention apparaîtront mieux à la lumière de la description détaillée ciaprès qui, considérée conjointement avec les figures annexées, décrit des modes de réalisation préférés, mais non-limitatifs, de l'invention.

Face aux indéterminations, au stade actuel des connaissances de l'homme du métier, sur les fonctionnalités et les spécificités éventuelles des différentes protéines de la famille APRO susmentionnée, on a maintenant procédé à des investigations et à des travaux de recherche, qui seront relatés ci-après.

Pour déterminer si la protéine APR04 s'associait avec la protéine cSrc, on a effectué des expériences de liaison in vitro (voir détails dans la partie expérimentale, plus loin). Les domaines SH3/SH2 de la protéine c-Src (Swissprot No P12931) ont été exprimés dans des bactéries sous forme de protéines de fusion avec la protéine GST (Genbank No U13852) (GlutathionS-transférase), purifiés jusqu'à homogénéité sur des billes de glutathionagarose, et testés quant à leur aptitude à fixer la protéine Flag-APR04 traduite in vitro dans un système d'expression protéique de réticulocyte de lapin (TINT coupled reticulocyte lysate systems, de la société Promega) en présence de méthionine [35S] (voir Fig. la). L'association de la protéine APR04 nécessitait tant les domaines SH2 que les domaines SH3, ce qui suggérait que le site de liaison était probablement conformationnel et faisait intervenir la totalité de la structure protéique. Une forme mutée de la protéine APR04 dépourvue du domaine carboxy-terminal riche en proline (Flag-APR04AC) ne se fixait pas aux domaines SH3-SH2, alors que la forme mutée de l'APR04 dépourvue du domaine N-terminal (X-APR04AN) se liait, mais moins fortement aux domaines SH3-SH2 de la protéine Src. Ces résultats indiquaient que l'interaction entre les protéines APR04 et Src était médiée par la région riche en proline de la protéine APR04, mais que la totalité de la protéine était nécessaire pour une association stable. Cette interaction a également été établie in vivo dans des cellules NIH 3T3, caractérisées par une expression endogène à peine détectable des protéines APR04 et de Src, par co-expression de la protéine APR04 et de la protéine Srcwt et co-immunoprécipitation, suivies par un immunoblotting des protéines avec des anticorps spécifiques dirigés contre les protéines FlagAPR04 et Src (voir Fig. Ib).

Pour mieux déterminer quels domaines de Src et d'APR04 étaient impliqués dans l'association, on a analysé plusieurs mutants de la protéine Src par co-immunoprécipitation et réalisation d'immunoblot de protéines

avec des anticorps spécifiques pour les protéines APR04 et Src. En premier lieu, la co-expression des protéines X-APR04AN et Srcwt dans des cellules NIH 3T3 a confirmé les données obtenues in vitro, montrant que la région riche en proline de la protéine APR04 était requise pour l'interaction avec la protéine Src (voir Fig. 2a). Comme on le pensait, on a vérifié que la protéine Flag-APR04AC ne se fixait pas à la protéine Src (voir Fig. 2b), ce qui

indiquait que, contrairement à APRO1 (PC3), qui s'est avérée inhiber la croissance cellulaire par le biais de la région N-terminale conservée (18), la protéine APR04 peut exercer un effet antiprolifératif par un mécanisme différent. On pense que ce mécanisme est le suivant : Un fragment de Src Nterminal de 298 acides aminés (AI296T) se liait à la protéine APR04, indiquant que le domaine kinase de la protéine Src n'était pas nécessaire pour que l'interaction ait lieu (voir Fig. 2c).

Etant donné que les domaines aussi bien SH2 que SH3 sont apparus être vraisemblablement impliqués dans la liaison, des mutants de la protéine Src pour le domaine SH2 (R177K) et pour le domaine SH3 (Y133F, Y138F) ont également été co-exprimés et analysés par co-immunoprécipitation. Les résultats ont montré que les deux mutants, respectivement SH2 (voir Fig. 2d) et SH3 (voir Fig. 2e) n'interagissaient pas avec la protéine APR04, ce qui confirmait que les deux domaines étaient nécessaires pour une interaction conformationnelle avec la protéine APR04. On a trouvé que la protéine APR04 se liait au mutant de Src inactif pour son activité kinase (SrcDN) (voir Fig. 2f), mais pas à la forme constitutivement active de la protéine Src (Y527F) (voir Fig. 2g). Ces données indiquaient que la protéine APR04 interagissait préférentiellement avec la forme inactive de la protéine Src et que cette interaction pouvait par conséquent avoir un effet sur son activité catalytique.

Pour établir l'effet de la protéine APR04 sur l'activité de la protéine Src, on a établi une lignée de cellules NIH 3T3 stable, surexprimant la protéine APR04 (NIH 3T3ApRQ4) et on a testé des immunoprécipités de Src endogènes provenant de lysats protéiques de cellules NIH 3T3 et NIH 3T3APR04 pour l'activité kinase de la protéine Src in vitro en présence de [yP] ATP et d'énolase. La protéine APR04 réduisait très fortement l'activité catalytique de la protéine Src. Un essai par immunoblot avec l'anticorps dirigé contre la protéine Src a confirmé pour contrôle que des quantités équivalentes de protéines Src étaient présentes dans les deux réactions d'immunoprécipitation (voir Fig. 3a).

On a pu montrer que la protéine Src est requise pour la mitogenèse induite par le facteur de croissance EGF (Epidermal Growth Factor) et conduit à l'activation de la cascade Ras/Raf/MEK/ERK (19). Afin d'effectuer des investigations sur l'effet de la protéine APR04 sur la voie de

signalisation Ras/MAP kinase, on a testé l'activation des protéines ERKs indirectement, en mesurant la transactivation du gène rapporteur de la luciférase 5x-Gal4-TATA/luciférase par une construction de Ga14-Elkl (Elk/gal) contenant le domaine de transactivation de la protéine Elk-1. Elk-1, un membre de la famille Ets de facteurs de transcription, est un substrat physiologique important des protéines ERKs. Une activation

transcriptionnelle de la protéine Elk-1 dépendante de Src a été inhibée par la protéine APR04 d'une manière dose-dépendante (voir Fig. 3b). Comme l'hypothèse formée le laissait penser, la protéine APR04AC n'inhibait pas l'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1, alors que la protéine APR04AN l'inhibait, ce qui confirmait que l'inhibition était due au domaine riche en proline de la protéine APR04.

La cycline Dl joue un rôle bien établi dans la régulation de la progression dans la phase Gl du cycle cellulaire et dans la promotion de la prolifération cellulaire. Son niveau d'expression s'est avéré être modulé par la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK (20). Afin de déterminer si le promoteur du gène de cycline Dl était affecté par la surexpression de la protéine APR04, on a effectué des études d'expression transitoire en utilisant le promoteur de cycline Dl humain lié au gène rapporteur de la luciférase.

La protéine APR04 régulait négativement de façon significative l'activité du promoteur de cycline Dl, et ce d'une manière dose-dépendante (voir Fig. 3c).

Ces résultats indiquaient donc que la protéine APR04 inhibait la prolifération des cellules NIH 3T3 en sous-régulant la transcription de cycline Dl par le biais d'une régulation négative de la voie Ras/Raf/MEK/ERK.

Pour déterminer si cette interaction pouvait être observée entre protéines mammaliennes endogènes, on a utilisé des cellules PC12 de phéochromocytome de rat (ATCC No CRL-1721), eu égard au constat selon lequel, contrairement aux cellules NIH 3T3, les niveaux d'expression de la protéine APR04 pouvaient être détectés par la technique d'immunoblotting.

Des immunoprécipités de Src endogène et d'antisérum de souris normale issus de lysats protéiques de cellules PC12 ont été analysés par immunoblotting avec un anticorps spécifique purifié par affinité, généré

contre une protéine de fusion GST-APR04 contenant le domaine C-terminal de la protéine APR04 humaine. Les deux protéines Src et APR04 étaient

présentes dans les immunoprécipités de Src, tandis que l'antisérum de souris n'immunoprécipitait pas la protéine APR04 (voir Fig. 4a). En outre, une étude par microscopie confocale a révélé une colocalisation cytoplasmique extensive entre les protéines Src et APR04 dans des cellules PC12 (voir Fig.

4b).

Les cellules PC12 constituent un système modèle pour l'étude de la différenciation des cellules neuronales. La lignée cellulaire PC12 répond au facteur de croissance des cellules nerveuses (NGF) (Nerve Growth Factor) en étendant des neurites et en développant de nombreuses autres propriétés semblables à celles des neurones sympathiques (21).

Afin d'analyser l'effet de la protéine APR04 sur la différenciation des cellules PC12, on a établi une lignée stable de cellules PC12 surexprimant la protéine APR04 (PC12ApRo4)'Après 8 jours d'exposition au NGF, les cellules PC12 développaient de nombreuses neurites, alors que les cellules PC12APR04 ne se différenciaient pas (voir Fig. 4c), ce qui suggère que la surexpression de la protéine APR04 pourrait affecter la cascade de signaux médiés par le NGF. Etant donné que l'expression de la forme oncogène constitutivement active, c'est-à-dire v-Src, est connue pour induire la pousse de neurites dans des cellules PC12 (2), la sous-régulation de l'activité de la protéine Src pourrait avoir un effet sur la différenciation des cellules PC12.

Afin d'évaluer l'effet de la protéine APR04 sur l'activité de la protéine Src, on a testé des immunoprécipités de Src endogène provenant de lysats protéiques de cellules PC12 et PC12APR04 pour l'activité catalytique de la protéine Src in vitro, en présence d'énolase. La protéine APR04 réduisait l'activité catalytique de la protéine Src (voir Fig. 4d). Un essai par immunoblot avec l'anticorps dirigé contre la protéine Src a confirmé pour contrôle que des quantités équivalentes de protéines Src étaient présentes dans les deux réactions (voir Fig. 4d).

La différenciation des cellules PC12 médiée par le NGF a été corrélée à une forte activation de la voie de signalisation Ras/MAP kinase (22). Par conséquent, pour étudier plus avant si la surexpression de la protéine

APR04 dans des cellules PC12 affectait l'activation médiée par le NGF de la voie de signalisation Ras/MAP kinase, on a traité des cellules PC12 transfectées avec du NGF pendant 6 heures et mesuré l'activité transcriptionnelle de la protéine Elk-1 comme décrit précédemment.

L'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1 dépendante de la la protéine Src était réprimée par la protéine APR04 dans les cellules PC12 traitées avec du NGF (voir Fig. 4e). Ces résultats indiquaient que la surexpression de la protéine APR04 inhibait la différenciation des cellules PC12 médiée par le NGF en sous-régulant la voie de signalisation Ras/Map kinase.

Pour rechercher l'importance physiologique de cette interaction dans des cellules PC12, on a inhibé l'expression endogène de la protéine APR04 par expression d'un vecteur antisens (pAS-APR04). Les cellules PC12 ont été transfectées de façon transitoire avec le plasmide pAS-APR04 et les lysats cellulaires ont été analysés par immunoblotting avec un anticorps dirigé contre la protéine APR04 purifié par affinité. Ce vecteur réduisait significativement le niveau d'expression de la protéine APR04 sans affecter l'expression de la protéine Src (voir Fig. 5a). Pour analyser l'effet de la sousrégulation de la protéine APR04 sur l'activité catalytique de la protéine Src, des cellules PC12 ont été transfectées de façon transitoire avec pAS-APR04 et testées pour leur activité tyrosine kinase. L'activité catalytique de la protéine Src était augmentée dans les cellules PC12 transfectées avec pASAPR04 par rapport aux cellules PC12 (voir Fig. 5b). Pour poursuivre les investigations sur l'effet de la protéine APR04 endogène sur la voie de signalisation Ras/MAP kinase, des cellules PC12 ont été co-transfectées avec pAS-APR04, une construction de transactivation Gal4-Elk-l, et le gène rapporteur de la luciférase 5x-Gal4-TATA/luciférase et testées pour leur activité transcriptionnelle de la protéine Elk-1. L'activité transcriptionnelle de la protéine Elk-1 était substantiellement accrue dans les cellules PC12 transfectées avec le plasmide pAS-APR04 par rapport aux cellules témoins PC12 (voir Fig. 5c), ce qui confirmait que la protéine APR04 régulait la voie de signalisation ras/MAP kinase en sous-régulant l'activité tyrosine kinase de la protéine Src.

De plus, pour évaluer l'effet de la protéine APR04 endogène sur la différenciation de cellules PC12, le plasmide pAS-APR04 a été co-transfectée avec un plasmide rapporteur CMV-pGal dans des cellules PC12. Le plasmide CMV-pGal permet de détecter les cellules transfectées qui exprime le gène lacZ par une réaction de coloration en présence de X-Gal. 70% des cellules PC12 co-transfectées avec CMV-ssGal et pAS-APR04 développaient des

neurites après 6 jours (voir Fig. 5d), tandis qu'aucune des cellules PC12 cotransfectées avec Cm-pal et le vecteur témoin non-recombinant ne développait de neurites (données non représentées). Ces résultats indiquaient que, dans des conditions physiologiques, la protéine APR04 était associée avec la protéine Src et requise pour le maintien sous contrôle étroit de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src.

Seules quelques protéines qui régulent négativement l'activité de la protéine Src ont été identifiées à ce jour. La cavéoline, une protéine membranaire intégrale de 22 kDa, qui est un composant majeur de la régulation structurale des membranes de caveolae, s'est avérée se fixer à la protéine Src et supprimer l'activité tyrosine kinase de celle-ci (23). La cavéoline interagit également avec les sous-unités H-Ras et Ga et supprime l'activité de GTPase de Ga (23). Plus récemment, il a été montré que RACK1 (récepteur pour la protéine kinase C activée) et un homologue de la sousunité ss des protéines G se fixait au domaine SH2 de la Src et inhibait son activité catalytique (24). Ces constatations ont suggéré que la cavéoline ainsi que RACK1, en tant que protéines ancrées à la membrane, peuvent non seulement restreindre la localisation sub-cellulaire de la protéine Src, mais également peuvent réduire son activité. D'une autre manière, les résultats présentés ici montrent que l'association de la protéine APR04 avec la protéine Src requiert les deux domaines SH2 et SH3, ce qui suggère que le site de liaison est probablement conformationnel et requiert la totalité de la structure protéique. En outre, la protéine APR04 n'est pas une protéine ancrée à la membrane et peut donc réguler différemment l'activité catalytique de la protéine Src. De fait, l'expression de la protéine APR04 s'est avérée être induite par des changements du potentiel redox dans plusieurs types de cellules (25), suggérant ainsi que la protéine APR04 peut jouer un rôle important durant les réponses induites lors de stress oxydatif. Il a également été montré que l'expression de la protéine APR04 est dépendante du cycle cellulaire (11,12), ce qui suggère que la protéine APR04 peut également être impliquée dans le contrôle négatif du cycle cellulaire par modulation de l'activité catalytique de la protéine Src. Sur la base des données physiologiques fournies ici, on pense que, dans la cellule, la protéine APR04 est liée à la protéine Src et la protège contre une activation non-spécifique, en la maintenant dans sa conformation réprimée inactive. La

protéine APR04 pourrait ainsi agir comme un régulateur conformationnel de l'activité de la protéine Src. En réponse à divers stimuli extracellulaires tels que les facteurs de croissance, l'activation de la protéine Src médiée par des ligands des domaines SH3 ou SH2 à forte affinité pourrait induire une modification conformationnelle, qui pourrait ensuite conduire à la rupture du complexe Src-APR04 et à la libération de la protéine Src. Ainsi, les résultats présentés ici montrent que la protéine APR04 met en oeuvre in vivo ou ex vivo un mécanisme de régulation négative essentiel pour les voies de signalisation impliquant la protéine Src. Etant donné que la protéine Src est impliquée dans de nombreuses réponses biologiques telles que la transformation, la mitogenèse et la différenciation, la protéine APR04 peut exercer un effet marqué sur ces processus physiologiques.

L'invention a ainsi pour premier objet une composition pharmaceutique comportant au moins un matériel biologique comprenant une région ou partie C-terminale riche en proline, notamment une protéine et/ou une fraction protéique ayant une région C-terminale riche en proline, de préférence une protéine APR04, éventuellement dans un support pharmaceutiquement acceptable.

Selon l'invention, ladite protéine ou fraction protéique ayant une région C-terminale riche en proline est avantageusement présente en une quantité thérapeutiquement efficace pour la régulation négative de l'activité tyrosine kinase des protéines Src.

Une telle protéine ou fraction protéique ayant un domaine C-terminal riche en proline peut être d'origine naturelle, et provenir par exemple d'extraits de plantes, de levures, de tissus ou sécrétions d'origine animale, de cultures cellulaires ou encore de milieux de fermentation microbienne. Elle peut également être traitée selon des techniques connues de l'homme du métier pour être rendue plus apte à son utilisation thérapeutique, ou synthétisée à partir de cellules hôtes, d'origine animale ou provenant d'insectes, de bactéries, de levures transformées, qui produisent de façon

stable par génie génétique la protéine APR04 ou un analogue de la protéine APR04 recombinante. On entend ici par analogue toute protéine ou fraction protéique dont la séquence en acides aminés contient une séquence Cterminale riche en proline conservée d'un point de vue phylogénétique.

L'homme du métier pourra vérifier ce caractère d'analogie par des

recherches conventionnelles dans les bases de données à l'aide de programmes bio-informatiques appropriés.

Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un matériel

biologique tel que décrit plus haut, notamment la protéine APR04 et/ou un analogue de la protéine APR04 recombinante, pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour procurer aux animaux à sang chaud, y compris l'homme, une sous-régulation de l'activité de l'enzyme tyrosine kinase Src.

Selon une forme de mise en oeuvre préférée de l'invention, cette utilisation vise le traitement et/ou la prévention des affections choisies parmi les cancers, l'ostéoporose, les maladies osseuses dérivées de l'ostéoporose, et les ischémies cérébrales et myocardiques.

La protéine Src est en effet impliquée dans le développement et la progression de certains types de cancers humains, notamment mais non exclusivement les cancers du côlon, du pancréas et du sein (26). La diminution de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src constitue ainsi une cible thérapeutique pour ces types de cancers, entre autres.

Bien qu'exprimée ubiquitairement, la protéine Src est également très fortement exprimée dans les ostéoclastes. Les ostéoclastes sont des cellules géantes multinucléées impliquées dans la résorption osseuse normale et pathologique (27). Des souris invalidées pour le gène Src présentent une ostéopétrose (ostéoporose généralisée) due à une déficience de l'activité des ostéoclastes dans la résorption osseuse (28,29). L'ostéoporose résulte d'un déséquilibre entre la formation et la résorption osseuse. Ce déséquilibre peut provenir soit d'une diminution de la formation osseuse due à l'âge, soit d'un découplage de l'équilibre résorption/formation osseuse (30). Un moyen pour maîtriser la maladie, ainsi que les maladies osseuses dérivées, consiste à contrôler l'activité des ostéoclastes en inhibant l'activité tyrosine kinase de la protéine Src.

Le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), qui est un facteur angiogénique produit en réponse à une ischémie cérébrale, est un médiateur de la perméabilité vasculaire qui contribue aux oedèmes cérébraux observés lors d'une ischémie cérébrale (31). Il a été montré que la protéine Src régulait la perméabilité vasculaire médiée par le VEGF dans le cerveau de souris après une attaque cérébrale. D'autre part, la suppression

de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src observée chez les souris invalidées pour la protéine Src est à l'origine d'une diminution de la perméabilité vasculaire et en conséquence d'une diminution des dommages cérébraux (32). Ces résultats montrent que lors d'une ischémie cérébrale, l'inhibition de la perméabilité vasculaire médiée par une inhibition de la protéine Src est responsable de l'effet protecteur observé. L'inhibition de l'activité de la protéine Src peut donc avoir un effet protecteur non seulement dans le cas d'une ischémie cérébrale, mais aussi dans le cas d'une ischémie due à un infarctus myocardique.

Pour son application aux situations et aux modalités de prévention et/ou de traitement les plus diverses, l'objet de l'invention peut prendre différentes formes de réalisation.

Selon l'une des formes de réalisation possibles de la présente invention, celle-ci a pour objet une construction vecteur pour l'inhibition de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src, ladite construction vecteur comportant un matériel viral, ne présentant pas de caractère pathogène ou inactivé, c'est-à-dire en pratique modifié et/ou atténué, d'un type choisi de préférence parmi les rétrovirus recombinants, les adénovirus, les virus adéno-associés (AAV) et les lentivirus, et contenant soit la totalité de la séquence codant pour la protéine APR04, soit la partie C-terminale codant pour le domaine riche en résidus proline de la protéine APR04 ou de ses analogues.

Selon une autre forme de réalisation, l'invention a pour objet une construction ou produit de construction plasmidique pour le traitement d'un tissu, ladite construction contenant soit la totalité de la séquence codant pour

la protéine APR04 ou ses analogues, soit la partie C-terminale codant pour le domaine riche en résidus proline de la protéine APR04 ou de ses analogues, avantageusement sous contrôle d'un promoteur spécifique du tissu à traiter. On peut citer, à titre d'exemples, le promoteur de l'alphalactalbumine (hALA) et de la beta-lactoglobuline (oBLG) pour une expression exclusive dans les cellules mammaires (33), le promoteur de l'insuline (34), de l'amylase (35) ou encore de la PAP I (pancreatitisassociated protein 1) (36) pour une expression spécifique dans les tissus pancréatiques et le promoteur de l'antigène carcino-embryonique (pCEA pour carcinoembryonic antigen promoter) (37) pour une expression

spécifique dans le colon. Par ailleurs, il a été montré que dans la plupart des cas de tumeurs du sein, les cellules cancéreuses mammaires continuaient à exprimer des récepteurs de l'OBtrogène. De plus, la plupart des tumeurs solides présentent une hypoxie des tissus due à une vascularisation aberrante du tissu tumoral (38). Aussi, l'utilisation d'un promoteur combinant non seulement des séquences régulatrices dépendantes de l'oestrogène mais aussi des séquences régulatrices de l'hypoxie permettra d'induire sélectivement (par des agents oestrogéniques et hypoxiques) l'expression du gène APR04 ou de ses analogues dans les cellules cancéreuses mammaires.

Sous un autre aspect, la présente invention consiste en l'utilisation de molécules, avantageusement de molécules peptidiques, qui miment l'interaction APR04-Src et qui peuvent être choisies parmi des molécules synthétisées chimiquement à partir de la séquence protéique C-terminale riche en proline définie précédemment, ou peuvent être produites par recombinaison à l'aide d'un vecteur d'expression protéique contenant la séquence codant pour le domaine C-terminal de la protéine APR04 ou de ses analogues, et exprimée dans différents systèmes d'expression, tels que par exemple des bactéries, des levures ou des insectes. Afin d'augmenter leur stabilité et leur résistance aux protéases, ces peptides peuvent, en option, contenir des acides aminés de type D modifiés, tels que la ss-alanine, la diiodotyrosine, l'ornithine, l'hydroxyproline et la ss-naphtylalanine, qui contrairement aux acides aminés naturels de type L ne sont pas reconnus par les enzymes protéolytiques. Ces peptides peuvent en option être également choisis, en partie ou en totalité, par criblage de banques combinatoires de peptides ou de molécules par la technique dite de phage display (39).

Selon encore un autre aspect de la présente invention, on effectue des criblages de molécules agonistes par la technique dite USPS (Ubiquitin-based split-protein sensor), décrite par Johnsson et al. (40). La méthode est fondée sur le fait que l'ubiquitine, qui est une protéine de 76 acides aminés contenant un seul domaine protéique, est clivée in vivo par une protéase ubiquitine spécifique, dénommée USB (pour Ubiquitin specific protease), qui reconnaît la conformation repliée de l'ubiquitine. Un fragment C-terminal de l'ubiquitine (Cub) est exprimé en fusion avec un gène rapporteur, la dihydrofolate réductase (DHFR), et lié au domaine C-terminal de la protéine

APR04 (Cub-APR04c-term). Une banque d'expression codant pour des séquences traduites au hasard est fusionnée au fragment N-terminal de l'ubiquitine (Nub) et criblée à l'aide du Cub-APR04c-term pour des cellules eucaryotes qui expriment le gène rapporteur DHFR actif. Cette technique peut être appliquée aussi bien dans des types cellulaires spécifiques que dans la levure.

Le mode d'administration de la composition pharmaceutique selon l'invention, et les quantités de ladite composition à administrer pour la prévention et/ou le traitement d'états pour lesquels la régulation négative de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src constitue une réponse appropriée, peuvent être choisis par l'homme du métier dans chaque cas d'espèce. En particulier, mais non exclusivement, on peut préconiser une administration de l'un ou plusieurs des inhibiteurs susdits selon l'invention, par voie intraveineuse, ou bien localement (par injection directe dans le parenchyme des organes affectés ou directement dans la tumeur), ou encore par voie orale.

En variante, on peut utiliser des systèmes synthétiques qui encapsulent l'ADN plasmidique ou se complexent avec lui, et le protègent d'une dégradation. Ces systèmes sont fondés sur l'utilisation de lipides cationiques ou de polymères cationiques, tels que par exemple la PLL (polyL-lysine) et/ou la PEI (polyéthylènimine), qui possèdent un groupement hydrophile qui interagit avec l'ADN et un groupement lipophile qui permet au polymère de s'auto-assembler en vésicules ou en structures similaires (41).

L'invention est décrite plus en détail ci-après, en référence à des modes opératoires utilisés pour les expérimentations effectuées tant à des fins d'investigation que pour la réalisation d'essais in vitro et pour l'élaboration de constructions et de plasmides comportant de la protéine APR04 conformément à l'invention.

Modes opératoires Culture des cellules
Des cellules NIH 3T3 (ATCC No CRL-1658) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) complété avec 10% de sérum

bovin foetal. Des cellules PC12 (ATCC No CRL-1721) ont été cultivées dans du DMEM complété avec 10% de sérum de cheval et 5% de sérum bovin foetal. Les cellules NIH 3T3 et les cellules PC12 transfectées de manière stable avec la construction Flag-APR04 (NIH 3T3APR04 et PC12APR04 respectivement) ont été maintenues en présence de G418 (400 ug/ml).

Plasmides et expression de protéines
L'ADNc humain du gène APR04 (Swissprot No Q14201) a été isolé par PCR à partir d'une banque d'ADNc de cerveau humain au moyen d'une amorce 5'contenant un site de restriction EcoRI : 5'-ggaattcATGAAGAATGAAATTGCTGCC-3'et une amorce 3'contenant un site de restriction SalI : 5'-acgcgtcgacTAGTGAGGTGCTAACATGTG-3'. L'ADNc a ensuite été sous- cloné dans les sites EcoRI-XhoI du vecteur PSS-188 portant un promoteur CMV et un marqueur d'épitope Flag N-terminal (petite séquence de 8 acides aminés qui permet la détection d'une protéine donnée in vivo à l'aide d'un anticorps anti-Flag), voir brevets US Nos 4, 703,004 et 4,782, 137) pour produire la construction Flag-APR04. X-APR04AN comprend le domaine Cterminal (acides aminés 145 à 252) de la protéine APR04 et a été sous-cloné dans les sites EcoRI-BamHI du vecteur pcDNA3. 1/hiss (Invitrogen) contenant un marqueur d'épitope Xpress (petite séquence de 8 acides aminés qui permet la détection d'une protéine donnée in vivo à l'aide d'un anticorps

TM anti-Xpress, Invitrogen). Flag-APR04AC (acides aminés 1 à 134) a été isolé par excision d'un fragment d'ADN du site de restriction Apal de la construction Flag-APR04. dI296T, Y133F, Y138F, R177K (fournis par T.

Hunter), Srcwt (Swissprot No P12931), SrcDN, Y527F (fourni par J. Sap) et des constructions du promoteur de la cycline Dl (fournies par C. Albanese et R.

Pestell) ont été décrits précédemment (42,43). pAS-APR04 englobe les nucléotides 1-756 de l'ADNc APR04 clonés dans le vecteur pcDNA3 dans une orientation antisens. La construction GST-SH3-SH2 a été isolée par PCR au moyen d'une amorce 5'contenant un site de restriction BamHI (GEXSH5) : 5'-cgggatccTGACCACCTTTGTGG-3'et une amorce 3'contenant un site de restriction EcoRI (GEX-SH3) : 5'-ggaattcGGGGCACACGGTGGTG-3'. GST-SH3 a été construit au moyen d'une amorce 5' (GEX-SH5) et d'une amorce 3'contenant un site de

restriction EcoRI : 5'-ggaattcGGATGGAGTCGGAGG-3'. La construction GSTSH2 a été obtenue au moyen d'une amorce 5'contenant un site de restriction BamHI : 5'-cgggatccCCGACTCCATCCAGG-3'et d'une amorce 3' (GEX-SH3).

Toutes les constructions ont ensuite été sous-clonées dans les sites BamHI- EcoRI du vecteur pGEX-3X (Pharmacia, Genbank No U13852) et séquencées.

Les constructions GST ont été introduites dans des bactéries DH5a et l'expression des protéines a été induite avec de l'isopropyl-ss-Dthiogalactoside 0, 5 mM (IPTG) à 37 C pendant 3 h. Les bactéries ont été c lysées dans une solution de PBS contenant 1% de Triton-XlOO et de l'EDTA 50 mM. Les lysats ont été soumis à un traitement sonique. Après centrifugation, les lysats devenus limpides ont été incubés avec des billes de glutathion-agarose (Pharmacia) pendant 2 h à 4 C sous agitation. Les billes ont été lavées quatre fois avec une solution de PBS contenant 1% de friton&commat;- X100 et les protéines ont été éluées conformément aux instructions du fabricant.

Traduction in vitro et réaction de liaison avec les protéines de fusion GST
Des plasmides Flag-APR04, Flag-APR04AC et X-APR04AN ont été transcrits et traduits in vitro avec un système d'expression protéique de réticulocyte de lapin (TNT&commat; coupled reticulocyte lysate systems de la société Promega) de lysat de réticulocyte de lapin couplé à TNT en présence de

méthionine [35S] conformément aux instructions du fabricant (Promega). 5 Ilg de protéine de fusion-GST immobilisés sur des billes de glutathion- sépharoseo ont été incubées avec du produit traduit in vitro dans du tampon B (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% de NP-40,1 mM EDTA, 10% de glycérol, 1 mM PMSF) pendant 3 heures à 4 C. Les complexes protéiques ont été lavés quatre fois dans du tampon B et les protéines fixées ont été éluées et analysées par un gel SDS-PAGE et autoradiographie.

Transfection
107 cellules NIH 3T3 ont été co-transfectées de façon transitoire en utilisant de la Lipofectamine (Life Technologies) avec 8 ug de Flag-APR04 et 8 ug des constructions de Src appropriées. Le milieu de transfection a été changé après 6 h et les cellules ont été recueillies 48 h après transfection.

Pour les essais de mesure d'activité du gène rapporteur, on a utilisé 5x-Gal4-

TATA/luciférase et un plasmide codant pour le domaine de transactivation Ga14-Elk-1 (Elk-Gal) (Stratagene) en combinaison avec d'autres plasmides comme indiqué sur les figures. La construction CMV-pGal a été transfectée en tant que contrôle interne de l'expression génique après transfection. Les cellules ont été transfectées comme décrit dans des boîtes de culture de 60 mm de diamètre. 48 h après transfection, les cellules ont été déprivées en sérum pendant 20 h et soit laissées non-traitées, soit traitées avec du NGF (100 ng/ml) pendant la durée indiquée avant d'être recueillies. L'activité de luciférase a été détectée avec un luminomètre à l'aide du système Luciferase Assay System (Promega, voir brevets US Nos 5,283, 179,5, 641,641 et 5,650, 289) et l'expression de ss-Gal a été évaluée par absorbance à Ao. Les résultats ont été normalisés par rapport à l'activité de ss-Gal. Les essais de luciférase ont été réalisés en triple et répétés au moins trois fois dans des expériences de transfection indépendantes.

Immunoprécipitation et immunoblotting
48 h après transfection, on a incubé des cellules NIH 3T3 dans du tampon de lyse L (10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% de NP-40,10% de

glycérol, 1 mM EDTA, 2 mM NaF, 2 mM Na3 V04, 10 g/ml d'aprotinine, 10 ug/ml de leupeptine, 1 mM PMSF) pendant 30 min à 4 C. Les lysats ont été clarifiés par centrifugation à 15. 000 x g pendant 15 min et pré-incubés par incubation avec des billes de protéines G-sépharose (Pharmacia) pendant 1 h à 4 C. Les surnageant ont ensuite été incubés pendant une nuit avec l'anticorps approprié et les billes de protéines G-sépharose, lavés trois fois avec du tampon L et ensuite séparés sur un gel SDS-PAGE, suivi d'un immunoblotting sur une membrane de difluorure de polyvinylidine

(PVDFTM) (Biorad), et traité comme préconisé par le fabricant. Les anticorps ci-après ont été utilisés : anti-Flage NU (Sigma), anti-Xpress (Invitrogen), anti Src MAb 327 (Calbiochem). Un anticorps de lapin polyclonal a été généré contre une protéine de fusion GST-APR04 contenant le domaine Cterminal de la protéine APR04 humaine (acides aminés 145 à 252).

L'anticorps a été purifié par affinité d'abord sur une résine couplée au GST, puis sur une résine couplée à la protéine A. Les protéines ont été détectées par un test de chimioluminescence (ECL Plus) (Amersham).

Mesure de l'activité kinase in vitro
Des immunoprécipités d'anti-Src endogène de cellules NIH 3T3 et de cellules NIH 3T3 APR04 ou de cellules PC12 et de cellules PC12 APR04 ont été lavés deux fois avec du tampon de réaction de kinase (40 mM Hepes, pH

7, 4, 10 mM MgCl2, 3 mM MnCI) et ensuite incubés avec 2, 5 ig d'énolase de 7, 4, e muscle de lapin dénaturée (Sigma), 0,5 M ATP, 1 mM DIT et 10 Ci de [y32p]ATP pendant 15 min à 30 C. Les protéines ont été séparées sur un gel SDS-PAGE et visualisées par autoradiographie avec un écran d'intensification.

Marquage par immunofluorescence et microscopie confocale
L'analyse par microscopie confocale a été réalisée sur un appareil Zeiss LSM510 équipé d'une lentille à immersion 100x Zeiss. Des cellules PC12 ont été fixées dans 3% de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée (PBS) pendant 30 min à température ambiante et ont été perméabilisées en présence d'une solution de PBS contenant 0, 5% de Triton X100 pendant 1 min. La protéine Src a été détectée à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-Src MAb 327 et un anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à l'Alexa 488 (Molecular Probes). La protéine APR04 a été détectée à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-APR04 purifié par affinité et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué au TexasRedO (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Les images ont été recueillies en utilisant des filtres d'excitation et d'émission appropriés.

L'invention ainsi décrite et illustrée trouve une application dans le traitement et/ou la prévention d'états ayant pour cause et/ou pour facteurs de développement une prolifération, une différenciation et/ou une transformation cellulaires, tandis que lesdits états sont corrélés avec une augmentation de l'activité tyrosine kinase des protéines Src de l'organisme affecté ou susceptible d'être affecté par un tel état.

La composition pharmaceutique selon l'invention est dénuée de toxicité pour l'homme et les animaux à sang chaud, étant donné que la protéine APR04 est présente dans leurs organismes sous forme endogène.

Les préconisations de modes d'administration, de quantités à administrer et de doses unitaires peuvent être définies dans chaque cas

d'espèce par l'homme du métier, sur la base de ses connaissances propres et d'éventuels essais de routine. Elles dépendent de l'état du patient et des autres paramètres habituellement pris en compte pour celui-ci en médecine.

Il convient de noter ici que la quantité administrée peut être d'autant mieux adaptée au traitement ou à la prévention recherchés que la substance active des compositions pharmaceutiques selon l'invention présente un effet thérapeutique dose-dépendant.

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Claims

REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique utile pour induire une modification conformationnelle des protéines Src, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un matériel biologique comprenant une région C-terminale riche en proline, éventuellement dans un support pharmaceutiquement acceptable.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit matériel biologique est une protéine et/ou une fraction protéique ayant une région C-terminale riche en proline.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit matériel biologique comprenant une région C-terminale riche en proline est la protéine APR04.
4. Composition pharmaceutique selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite protéine et/ou fraction protéique est présente dans ladite composition en une quantité thérapeutiquement efficace pour la régulation négative de l'activité tyrosine kinase des protéines Src.
5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ladite protéine ou fraction protéique ayant un domaine C-terminal riche en proline est d'origine naturelle.
6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite protéine ou fraction protéique ayant un domaine C- terminal riche en proline est choisie dans le groupe des protéines ou fractions protéiques provenant d'extraits de plantes, de levures, de tissus ou sécrétions d'origine animale, de cultures cellulaires et de milieux de fermentation microbienne.

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7. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que ladite protéine ou fraction protéique ayant un domaine C-terminal riche en proline est obtenue par synthèse à partir de cellules hôtes, d'origine animale ou provenant d'insectes, de bactéries ou de levure transformées, produisant de façon stable par génie génétique la protéine APR04 ou un analogue de la protéine APR04 recombinante.
8. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comporte des peptides qui miment l'interaction APR04-Src, synthétisés chimiquement à partir de la séquence protéique C-terminale de la protéine APR04.
9. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comporte des molécules, avantageusement des molécules peptidiques, qui miment l'interaction APR04-Src, lesdites molécules étant choisies parmi des molécules synthétisées chimiquement à partir d'une séquence C-terminale riche en proline, et des molécules produites par recombinaison à l'aide d'un vecteur d'expression protéique contenant la séquence codant pour le domaine

C-terminal de la protéine APR04 ou de ses analogues, et exprimée dans différents systèmes d'expression, notamment dans des bactéries, des levures et des insectes.
10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite molécule peptidique contient, en outre, des acides aminés de type D modifiés, notamment choisis parmi la ss-alanine, la diiodotyrosine, l'omithine, l'hydroxyproline et la ss-naphtyl-alanine.
11. Utilisation d'un matériel biologique ayant une région C-terminale riche

en proline, notamment la protéine APR04 et/ou un analogue de la protéine APR04 recombinante, pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour procurer aux animaux à sang chaud, y compris l'homme, une sous-régulation de l'activité de l'enzyme tyrosine kinase Src.

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12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite protéine ayant une région C-terminale riche en proline est la protéine

APR04.
13. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12 pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour induire une modification conformationnelle des protéines Src.
14. Utilisation selon l'une des revendications 11 ou 12 pour la préparation d'une composition pharmaceutique apte à s'associer aux deux domaines SH2 et SH3 des protéines Src.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 pour le traitement et/ou la prévention des affections choisies parmi les cancers, l'ostéoporose, les maladies osseuses dérivées de l'ostéoporose, et les ischémies cérébrales et myocardiques.