FR2827612A1 - New nucleic acid encoding G protein coupled receptor, useful for identifying modulators, potentially useful for treating e.g. diabetes or Parkinson's disease - Google Patents

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Jean Pierre Galizzi
Francis Coge
Herve Rique
Jean Albert Boutin
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

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Abstract

Nucleic acid (I) having a 1038 bp sequence (S1), fully defined in the specification, and encoding a G protein coupled receptor (GPCR) (II) is new. Independent claims are also included for the following: (1) nucleic acid (Ia) that hybridizes to (I) under stringent conditions and encodes a protein with essentially the same properties as (II); (2) nucleic acid (Ib) deduced from a 345 amino acid (aa) sequence (S2), fully defined in the specification; (3) antisense nucleic acid (Ic) that inhibits expression of (I)-(Ib) and comprises a single strand able to hybridize to them under stringent conditions; (4) recombinant vector containing (I)-(Ib); (5) host cell transformed with the vector of (4); (6) polypeptide (IIa) encoded by (I)-(Ib) and its fragments; (7) primers for amplification of a sequence encoding (II); (8) hybridization probe for specific detection of (I)-(Ib) containing a fragment of at least 50 nucleotides (nt) from (I)-(Ib); (9) antibodies (Ab) specific for (IIa) or proteins encoded by (I)-(Ib); (10) detecting presence of agonists of GPCR; (11) screening for agonists or antagonists of a GPCR; (12) identifying pathological alleles of a gene encoding GPCR; (13) identifying species homologs of (I); (14) kit for diagnosis, prognosis or monitoring of patients with, or at risk of developing, diseases associated with over- or under-expression of (I)-(Ib); (15) DNA chip containing (I)-(Ib); (16) kit for detecting abnormal structures of GPCR containing Ab or (IIa); and (17) protein chip containing Ab or (IIa).

Description

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L'invention porte sur l'identification d'un nouveau récepteur couplé aux protéines liant le GTP ou protéines G. Elle porte en particulier sur l'identification d'une séquence d'acides nucléiques codant ce récepteur ainsi que sur les vecteurs recombinants comportant ces séquences et les cellules hôtes contenant les vecteurs. Les utilisations des cellules hôtes pour le criblage de molécules agonistes ou antagonistes du récepteur couplé aux protéines G font également partie de l'invention.  The invention relates to the identification of a novel receptor coupled to GTP or G protein-binding proteins. It relates in particular to the identification of a nucleic acid sequence encoding this receptor as well as to recombinant vectors comprising these sequences and the host cells containing the vectors. The uses of the host cells for the screening of G protein-coupled receptor agonist or antagonist molecules are also part of the invention.

Par récepteurs couplés aux protéines G , on entend des protéines membranaires monomériques, dimériques ou multimériques exprimées à la surface des cellules, capables de recevoir un signal extracellulaire et de le transmettre à la cellule via leur interaction avec des protéines hétérotrimériques spécifiques auxquelles ils sont associés et appelées protéines G. Les protéines G hétérotrimériques sont composées d'une sous-unité a et d'un dimère ssy indissociable. La sous-unité a porte un nucléotide GDP ou GTP. Les protéines G sont des protéines sous-membranaires associées à la membrane par des lipides. Schématiquement, le mécanisme d'activation d'un récepteur couplé aux protéines G par une molécule agoniste se résume ainsi : lorsqu'un agoniste se lie à un récepteur couplé aux protéines G, ledit récepteur s'associe à la forme GDP de la protéine G hétérotrimérique.  By G protein-coupled receptors is meant monomeric, dimeric or multimeric membrane proteins expressed on the surface of cells, capable of receiving an extracellular signal and transmitting it to the cell via their interaction with specific heterotrimeric proteins to which they are associated and The heterotrimeric G proteins are composed of an α-subunit and an indissociable ssy dimer. The α subunit carries a GDP or GTP nucleotide. G-proteins are sub-membrane proteins associated with the membrane by lipids. Schematically, the mechanism of activation of a G protein-coupled receptor by an agonist molecule can be summarized as follows: when an agonist binds to a G protein-coupled receptor, said receptor associates with the GDP form of the G protein heterotrimeric.

Celle-ci perd alors son GDP qui est remplacé par un GTP, à la suite d'un état transitoire. This then loses its GDP which is replaced by a GTP, following a transitional state.

La fixation du GTP provoque la dissociation des trois partenaires, le récepteur, la sous-

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unité a et le dimère ssy de la protéine G. La sous-unité a et le dimère ssy sont ensuite capables de stimuler un ou plusieurs effecteurs. L'hydrolyse du GTP, parfois stimulée par l'effecteur, marque la fin de l'activation de l'effecteur par la sous-unité a. The binding of the GTP causes the dissociation of the three partners, the receptor, the sub-
Figure img00010001

a unit and the ssy dimer of the G protein. The subunit a and the ssy dimer are then able to stimulate one or more effectors. The hydrolysis of the GTP, sometimes stimulated by the effector, marks the end of the activation of the effector by the subunit a.

Parmi les différentes familles des récepteurs membranaires intervenant dans les communications cellulaires, la famille des récepteurs couplés aux protéines G est la plus nombreuse.  Among the different families of membrane receptors involved in cellular communications, the family of G-protein coupled receptors is the most numerous.

Elle se répartit en cinq sous-groupes distincts selon la structure moléculaire et la fonction : (i) les récepteurs aux hormones peptidiques (somatostatine, TRH, etc..) ; (ii) les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, FSH, etc..) ; (iii) les récepteurs aux hormones peptidiques de type sécrétine ; (iv) les récepteurs olfactifs et (v) les récepteurs aux bioamines (sérotonine, adrénergique). Les récepteurs couplés aux protéines G sont ainsi impliqués dans la réception des stimuli extérieurs (vision, goût, odeur), les fonctions  It is divided into five distinct subgroups according to molecular structure and function: (i) peptide hormone receptors (somatostatin, TRH, etc.); (ii) glycoprotein hormone receptors (TSH, LH, FSH, etc.); (iii) secretin peptide hormone receptors; (iv) olfactory receptors and (v) bioamine receptors (serotonin, adrenergic). G protein-coupled receptors are thus involved in the reception of external stimuli (vision, taste, smell), the functions

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endocrines (pituitaire et adrénales), les fonctions exocrines (pancreas), certaines fonctions neurologiques, la fonction cardiaque, la lipolyse et le métabolisme des carbohydrates (pour revues, Wilson S. et al., British Journal of Pharmacology 1998 125 : 1387-1392 ; Stadel JM et al., TIPS 1997 18 : 430-437).  endocrine (pituitary and adrenal), exocrine functions (pancreas), certain neurological functions, cardiac function, lipolysis and carbohydrate metabolism (for reviews, Wilson S. et al., British Journal of Pharmacology 1998 125: 1387-1392 Stadel JM et al., TIPS 1997 18: 430-437).

Considérant l'importance et la diversité des systèmes de communication contrôlés par les récepteurs couplés aux protéines G, et notamment leur implication dans de nombreuses pathologies, on comprend l'intérêt de rechercher d'éventuelles séquences susceptibles de coder ces récepteurs afin de les isoler, de vérifier qu'elles correspondent à des nouveaux gènes, d'exprimer leur produit et de construire les outils pour identifier leur (s) ligand (s).  Considering the importance and the diversity of the communication systems controlled by the G-protein coupled receptors, and in particular their implication in many pathologies, we understand the interest of looking for possible sequences likely to code these receptors in order to isolate them, to verify that they correspond to new genes, to express their product and to build the tools to identify their ligand (s).

La recherche et l'identification de nouveaux récepteurs couplés aux protéines G reposent notamment sur l'analyse des séquences d'ADN génomique issues des différents projets de séquençage de génomes de mammifères actuellement en cours, et stockées dans des bases de données généralement accessibles par le réseau internet. On citera notamment les données issues du séquençage du génome à haut débit (high throughput genome sequencing) qui sont disponibles via la base de données GenBank.  The search and identification of new G-protein coupled receptors is based notably on the analysis of genomic DNA sequences from the various mammalian genome sequencing projects currently in progress, and stored in databases generally accessible by the internet network. These include high throughput genome sequencing data that is available through the GenBank database.

En général, les séquences déposées initialement dans les bases de données sont des séquences dites brutes ou non annotées. La phase d'annotation qui consiste à repérer, à l'aide d'outils bio-informatiques, les séquences signifiants , et notamment les séquences codantes potentielles, est réalisée ultérieurement. Sachant que dans le génome humain, seulement 1 à 2 % des séquences sont codantes, une des difficultés consiste au repérage des phases codantes parmi les séquences génomiques brutes disponibles dans les bases de données.  In general, the sequences initially deposited in the databases are so-called raw or non-annotated sequences. The annotation phase which consists of identifying, using bioinformatic tools, the signifying sequences, and in particular the potential coding sequences, is carried out subsequently. Knowing that in the human genome, only 1 to 2% of the sequences are coding, one of the difficulties is the identification of the coding phases among the raw genomic sequences available in the databases.

En outre, il faut préciser que les séquences d'ADN génomique disponibles sont susceptibles d'être la juxtaposition de séquences partielles non ordonnées issues de différents clones séquencés. Ceci peut donc constituer un obstacle supplémentaire dans l'identification des séquences codantes.  In addition, it should be noted that the available genomic DNA sequences are likely to be the juxtaposition of unordered partial sequences from different sequenced clones. This can therefore be an additional obstacle in the identification of coding sequences.

On a alors recours à l'analyse informatique des séquences à l'aide de différents logiciels disponibles et appropriés pour la recherche des phases ouvertes de lecture (ORFs)  We then resort to the computer analysis of the sequences using various software available and appropriate for the research of the open reading phases (ORFs)

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potentielles. Le choix et le paramétrage des logiciels utilisés sont déterminants pour l'identification de séquences potentiellement codantes. Il est cependant important de souligner que l'identification d'une ORF potentielle à l'aide de programmes bioinformatiques (in silico) n'est qu'une première étape dans l'identification d'un nouveau gène fonctionnel. L'homme du métier doit ensuite vérifier que l'ORF potentielle identifiée in silico correspond à un gène effectivement exprimé et fonctionnel dans la cellule. On sait par exemple qu'il existe des pseudo-gènes, reliquat de l'évolution, dont des portions de séquences sont homologues à certains gènes, cependant ces pseudo-gènes ne sont pas exprimés dans la cellule.  potential. The choice and configuration of the software used is decisive for the identification of potentially coding sequences. It is important to note, however, that identifying a potential ORF using bioinformatic programs (in silico) is only a first step in identifying a new functional gene. Those skilled in the art must then verify that the potential ORF identified in silico corresponds to a gene actually expressed and functional in the cell. It is known for example that there exist pseudo-genes, evolutionary residue, of which portions of sequences are homologous to certain genes, however these pseudo-genes are not expressed in the cell.

Les inventeurs ont maintenant identifié, par l'analyse informatique de la banque de données des séquences issues du séquençage du génome à haut-débit (HTGS), une phase ouverte de lecture potentielle dont la séquence protéique déduite présente une homologie avec des récepteurs couplés aux protéines G. La séquence déduite possède en effet les critères structuraux typiques des récepteurs couplés aux protéines G, incluant 7 domaines qui contiennent chacun environ 20-30 acides aminés hydrophobes et le motif DRY présent dans le troisième domaine trans-membranaire.  The inventors have now identified, by computer analysis of the database of the sequences resulting from the high-throughput genome sequencing (HTGS), a potential open reading phase whose deduced protein sequence has homology with receptors coupled to The deduced sequence has indeed the structural criteria typical of the G-protein coupled receptors, including 7 domains which each contain about 20-30 hydrophobic amino acids and the DRY motif present in the third trans-membrane domain.

Par une analyse RT-PCR, les inventeurs ont révélé une expression tissulairespécifique de la séquence identifiée. Par RT-PCR, on entend une amplification PCR sur les fragments d'ADNc obtenus par rétrotranscription du transcriptome. Ils ont ainsi montré que la séquence identifiée par l'analyse bio-informatique correspondait effectivement à une séquence d'un gène exprimé. Ils ont en outre montré que le gène codant le nouveau récepteur identifié est principalement exprimé dans le rein, la prostate, l'intestin, la rate, le cerveau et en particulier dans l'hippocampe, le noyau caudé, l'amygdale et la substance noire.  By RT-PCR analysis, the inventors revealed specific tissue expression of the identified sequence. By RT-PCR is meant a PCR amplification on the cDNA fragments obtained by retrotranscription of the transcriptome. They thus showed that the sequence identified by the bioinformatic analysis actually corresponded to a sequence of an expressed gene. They have furthermore shown that the gene encoding the newly identified receptor is mainly expressed in the kidney, prostate, intestine, spleen, brain and in particular in the hippocampus, the caudate nucleus, the amygdala and the substance. black.

L'ADNc codant le récepteur complet a été cloné après amplification par RT-PCR à partir d'ARN de cerveau total humain, puis séquencé.  The cDNA encoding the complete receptor was cloned after amplification by RT-PCR from human total brain RNA and sequenced.

La séquence nucléotidique obtenue par le séquençage de l'ADNc est présentée à la figure 1 (SEQ ID NO 1).  The nucleotide sequence obtained by sequencing the cDNA is shown in Figure 1 (SEQ ID NO: 1).

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La séquence d'acides aminés déduite de la séquence de la figure 1 est présentée en figure 2 (SEQ ID NO 2).  The amino acid sequence deduced from the sequence of Figure 1 is shown in Figure 2 (SEQ ID NO 2).

L'invention a ainsi pour objet une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G, caractérisée par la séquence de la figure 1.  The subject of the invention is thus a nucleic acid sequence encoding a G protein-coupled receptor, characterized by the sequence of FIG.

Une séquence d'acides nucléiques selon l'invention comprend notamment : une séquence d'ADN génomique, caractérisée par la séquence de la figure 1, - une séquence d'ARN messager, produit de transcription de la séquence d'ADN génomique, ou une séquence d'ADNc, produit de la transcription inverse de la séquence d'ARN messager.  A nucleic acid sequence according to the invention comprises in particular: a genomic DNA sequence, characterized by the sequence of FIG. 1, a messenger RNA sequence, a transcript of the genomic DNA sequence, or a cDNA sequence, product of the reverse transcription of the messenger RNA sequence.

Par séquence d'acides nucléiques , il doit être compris une séquence nucléotidique isolée de son contexte naturel. Il s'agit notamment de séquences isolées, amplifiées et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique.  By nucleic acid sequence, it must be understood a nucleotide sequence isolated from its natural context. These include isolated sequences, amplified and / or purified and possibly modified by genetic engineering.

On entend par ADNc ou ADN complémentaire , un acide nucléique résultant de la transcription inverse d'un ARN messager.  By cDNA or complementary DNA is meant a nucleic acid resulting from the reverse transcription of a messenger RNA.

Les inventeurs ont observé que la séquence codante d'ADN génomique du récepteur couplé aux protéines G selon l'invention était identique à la séquence d'ADNc isolée et par conséquent ne comportait pas d'introns.  The inventors have observed that the genomic DNA coding sequence of the G protein-coupled receptor according to the invention was identical to the isolated cDNA sequence and therefore did not contain introns.

Une séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut être aisément isolée par amplification spécifique par RT-PCR à partir d'extraits d'ARN messager de cellules du cerveau humain, ou par amplification d'ADN génomique de l'homme, par exemple à l'aide du couple d'amorces ci-dessous : 5'-ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3'
5'-TATATGTTCAGAAAACAAATTCATGGTTGCTG-3'
L'invention concerne aussi des variants de la séquence d'acides nucléiques de la figure 1.
A nucleic acid sequence according to the invention can be easily isolated by specific amplification by RT-PCR from messenger RNA extracts of cells of the human brain, or by amplification of human genomic DNA, for example using the primer pair below: 5'-ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3 '
TATATGTTCAGAAAACAAATTCATGGTTGCTG 5'-3 '
The invention also relates to variants of the nucleic acid sequence of Figure 1.

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Les variants de la séquence d'acides nucléiques sont notamment : - des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une séquence d'acides nucléiques de la figure 1 ou une séquence complémentaire de celle-ci, et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le récepteur codé par la séquence de la figure 1 ; les séquences d'acides nucléiques déduites de la séquence d'acides aminés de la figure 2, selon le code génétique, des formes alléliques pathologiques de la séquence de la figure 1 ; ou encore, - des séquences d'une espèce de mammifère homologues à la séquence de la figure 1 isolée chez l'Homme.  The variants of the nucleic acid sequence are in particular: sequences capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleic acid sequence of FIG. 1 or a sequence complementary thereto, and coding a polypeptide having essentially the same properties as the receiver coded by the sequence of FIG. 1; the nucleic acid sequences deduced from the amino acid sequence of Figure 2, according to the genetic code, pathological allelic forms of the sequence of Figure 1; or else sequences of a mammalian species homologous to the sequence of FIG. 1 isolated in humans.

Par conditions stringentes , on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65 C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5% SDS, 5X Denhardt's solution et 100 tg d'ADN carrier non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65 C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0, 1% SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C) + 16,6Log (concentration en cations)-0, 63 (% formamide)- (600/nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).  By stringent conditions are meant the conditions which allow the specific hybridization of two single-stranded DNA sequences at about 65 ° C. for example in a solution of 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt's solution and 100 μg of DNA. Nonspecific carrier DNA or other equivalent ionic strength solution and after washing at 65 C, for example in a solution of at most 0.2 x SSC and 0.1% SDS or other equivalent ionic strength solution. The parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm). For sequences comprising more than 30 bases, Tm is defined by the relation: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C) + 16.6Log (cation concentration) -0.63 (% formamide) - ( 600 / number of bases). For sequences of length less than 30 bases, Tm is defined by the relation: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). The stringency conditions can therefore be adapted by those skilled in the art depending on the size of the sequence, the GC content and any other parameter, in particular according to the protocols described in Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).

On entend par formes alléliques pathologiques , toute séquence isolée chez l'homme correspondant à une forme mutée de la séquence de la figure 1, et dont les mutations sont impliquées dans une pathologie spécifique. Ces mutations peuvent être un ou plusieurs changement (s) nucléotidique (s) ou une ou plusieurs délétion (s) ou insertion (s) de fragments de séquences nucléotidiques.  Pathological allelic forms are understood to mean any isolated sequence in humans corresponding to a mutated form of the sequence of FIG. 1, and whose mutations are involved in a specific pathology. These mutations may be one or more nucleotide change (s) or one or more deletion (s) or insertion (s) of nucleotide sequence fragments.

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On entend par séquences homologues de la séquence d'acides nucléiques de la figure 1 , une séquence de structure similaire à la séquence de la figure 1 et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés chez des espèces de mammifères non-humains, notamment les primates, le rat ou la souris. Le pourcentage d'identité entre deux séquences homologues dans les régions fonctionnelles est en général supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%.  Sequences homologous to the nucleic acid sequence of FIG. 1 are understood to mean a sequence of structure similar to the sequence of FIG. 1 and encoding a polypeptide having essentially the same properties in non-human mammalian species, especially primates. , the rat or the mouse. The percentage identity between two homologous sequences in the functional regions is generally greater than 80%, preferably greater than 90%.

Les séquences homologues sont notamment utiles pour la réalisation de modèles animaux pour l'étude fonctionnelle du récepteur couplé aux protéines G et ses variants pathologiques.  The homologous sequences are particularly useful for the production of animal models for the functional study of the G-protein coupled receptor and its pathological variants.

L'invention porte ainsi sur un procédé d'identification de formes alléliques pathologiques d'un gène humain codant un récepteur couplé aux protéines G, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'isolement d'une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention à partir d'acides nucléiques totaux (ARN ou
ADN) issus de patients atteints d'une pathologie et de sujets sains ; b) le séquençage des acides nucléiques isolés en a), et, c) la détection d'une ou de plusieurs mutations communes aux acides nucléiques issus des patients atteints d'une pathologie, la ou les dite (s) mutation (s) n'étant pas présente (s) sur les acides nucléiques issus des sujets sains.
The invention thus relates to a method of identifying pathological allelic forms of a human gene encoding a G-protein coupled receptor, said method comprising the steps of: a) isolating a nucleic acid sequence encoding a G-protein coupled receptor G-protein coupled receptor according to the invention from total nucleic acids (RNA or
DNA) from patients with pathology and healthy subjects; b) the sequencing of the nucleic acids isolated in a), and, c) the detection of one or more mutations common to nucleic acids derived from patients suffering from a pathology, the said mutation (s) n not being present on nucleic acids from healthy subjects.

L'invention porte également sur un procédé d'identification de séquences homologues de la séquence d'acides nucléiques de la figure 1 dans une espèce non humaine comprenant les étapes suivantes : a) l'incubation dans des conditions stringentes d'une sonde d'hybridation constituée d'au moins 50 nucléotides de la séquence de la figure 1, de préférence entre 150 et 250 nucléotides, avec de l'ADN génomique ou des extraits d'ARN totaux d'espèces de mammifère non-humain ; b) la détection d'une réaction d'hybridation ; et,  The invention also relates to a method of identifying sequences homologous to the nucleic acid sequence of Figure 1 in a non-human species comprising the following steps: a) incubating under stringent conditions a probe of hybridization consisting of at least 50 nucleotides of the sequence of Figure 1, preferably between 150 and 250 nucleotides, with genomic DNA or total RNA extracts of non-human mammalian species; b) detecting a hybridization reaction; and,

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c) l'isolement de la séquence d'acides nucléiques homologue et codant un récepteur couplé aux protéines G à partir de l'ADN génomique des espèces pour lesquelles une réaction d'hybridation a été détectée.  c) isolating the homologous nucleic acid sequence encoding a G-protein coupled receptor from the genomic DNA of species for which a hybridization reaction has been detected.

Les sondes d'hybridation pour la reconnaissance spécifique des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention font également partie de l'invention. De telles sondes sont caractérisées en ce qu'elles correspondent à un fragment d'une longueur d'au moins 50 nucléotides, de préférence entre 150 et 250 nucléotides d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Ces sondes sont notamment utiles dans la mise en oeuvre des procédés de l'invention mentionnés ci-dessus.  Hybridization probes for the specific recognition of nucleic acid sequences encoding a G-protein coupled receptor according to the invention also form part of the invention. Such probes are characterized in that they correspond to a fragment having a length of at least 50 nucleotides, preferably between 150 and 250 nucleotides of a nucleic acid sequence according to the invention. These probes are particularly useful in carrying out the methods of the invention mentioned above.

Les sondes peuvent être couplées directement ou indirectement avec un marqueur radioactif ou non-radioactif, on peut citer notamment le 32p ou le 35S parmi les composés radio-actifs ou encore la biotine, l'avidine et la streptavidine ou tout type de composés fluorescents ou bioluminescents ou chimioluminescents parmi les composés non radioactifs. The probes may be coupled directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive label, mention may be made in particular of 32p or 35S among the radioactive compounds or else biotin, avidin and streptavidin or any type of fluorescent or bioluminescent or chemiluminescent among the non-radioactive compounds.

L'invention fournit également des amorces utiles pour l'amplification et l'isolement des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention. Des amorces pour l'amplification d'une séquence codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention comprennent notamment les séquences suivantes :
5'-ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3'
5'-TATATGTTCAGAAAACAAATTCATGGTTGCTG-3'
Les amorces peuvent comprendre en outre dans leur partie 5'des séquences non spécifiques du gène, notamment des sites de restriction pour faciliter le clonage des séquences amplifiées dans un vecteur, ou encore des séquences codant des étiquettes, épitopes ou séquences signal pour faciliter l'expression et/ou la purification des polypeptides. Des amorces comprenant une séquence étiquette et des sites de restriction appropriés pour le clonage du produit d'amplification dans un plasmide sont aussi décrites dans l'exemple 1.
The invention also provides primers useful for the amplification and isolation of nucleic acid sequences encoding a G-protein coupled receptor according to the invention. Primers for the amplification of a sequence encoding a G protein-coupled receptor according to the invention comprise, in particular, the following sequences:
ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG 5'-3 '
TATATGTTCAGAAAACAAATTCATGGTTGCTG 5'-3 '
The primers may further comprise in their part 5 'nonspecific sequences of the gene, in particular restriction sites for facilitating the cloning of the amplified sequences in a vector, or else coding sequences for labels, epitopes or signal sequences to facilitate the expression and / or purification of the polypeptides. Primers comprising a tag sequence and restriction sites suitable for cloning the amplification product into a plasmid are also described in Example 1.

L'invention a trait également aux séquences d'acides nucléiques susceptibles d'être obtenues par l'amplification à l'aide des amorces définies ci-dessus.  The invention also relates to the nucleic acid sequences that can be obtained by amplification using the primers defined above.

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Les méthodes d'amplification à l'aide des amorces de l'invention sont connues de l'homme du métier et sont en particulier la méthode PCR qui comprend l'utilisation d'une polymérase thermostable ou la méthode RT-PCR qui permet l'amplification d'ADN à partir d'un échantillon d'ARN messager en effectuant préalablement à l'amplification une étape de transcription inverse. Il existe en outre de nombreuses techniques alternatives à la PCR. Citons à titre d'exemple, les méthodes d'amplification isotherme telles que la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid sequence based amplification), la 3SR (self sustained sequence replication) ou l'amplification par déplacement de brin (strand displacement amplification).  The amplification methods using the primers of the invention are known to those skilled in the art and are in particular the PCR method which comprises the use of a thermostable polymerase or the RT-PCR method which allows the amplification of DNA from a sample of messenger RNA by performing a reverse transcription step prior to amplification. There are also many alternative techniques to PCR. For example, isothermal amplification methods such as TMA (transcription mediated amplification), NASBA (nucleic acid sequence based amplification), 3SR (self-sustained sequence replication) or strand displacement amplification ( strand displacement amplification).

L'invention concerne aussi un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Par vecteur, il faut comprendre tout type de vecteur permettant l'introduction de la séquence d'acides nucléiques dans une cellule hôte et éventuellement l'expression du polypeptide codé par la séquence d'acides nucléiques dans la cellule hôte.  The invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence according to the invention. By vector, it is necessary to understand any type of vector allowing the introduction of the nucleic acid sequence into a host cell and possibly the expression of the polypeptide encoded by the nucleic acid sequence in the host cell.

Un tel vecteur est par exemple le plasmide pS3524 déposé à la CNCM le 13 juillet 2001 sous le numéro 1-2702.  Such a vector is, for example, the plasmid pS3524 deposited at the CNCM on July 13, 2001 under the number 1-2702.

Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend des séquences d'ADN nécessaires à l'expression du récepteur couplé aux protéines G dans une cellule hôte. Ces séquences sont notamment des séquences promotrices appropriées pour l'expression des gènes dans les cellules hôtes et des séquences terminatrices en aval de la séquence codante qui incluent un site de polyadénylation. Des exemples de séquences promotrices sont la séquence du promoteur du cytomégalovirus (CMV) ou encore la séquence du promoteur SV40 qui permettent une expression constitutive et forte des séquences codantes placées en aval respectivement dans les cellules de mammifères et les cellules d'insecte.  In a preferred embodiment, the recombinant vector according to the invention is characterized in that it comprises DNA sequences necessary for the expression of the G protein-coupled receptor in a host cell. Such sequences include promoter sequences suitable for gene expression in host cells and terminator sequences downstream of the coding sequence that include a polyadenylation site. Examples of promoter sequences are the cytomegalovirus (CMV) promoter sequence or the SV40 promoter sequence which allows constitutive and strong expression of the downstream coding sequences respectively in mammalian cells and insect cells.

Il existe un grand nombre de vecteurs d'expression utilisables. De tels vecteurs d'expression comprennent, entre autres, des vecteurs chromosomiques, épisomiques ou dérivés de virus, en particulier, des vecteurs dérivés des plasmides bactériens, des bactériophages, des transposons, des plasmides et chromosomes de levure, des virus tels que les baculovirus, les papovirus et en particulier SV40, les adénovirus, et les rétrovirus et  There are a large number of usable expression vectors. Such expression vectors comprise, inter alia, chromosomal, episomal or virus-derived vectors, in particular vectors derived from bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, yeast plasmids and chromosomes, viruses such as baculoviruses. , papoviruses and in particular SV40, adenoviruses, and retroviruses and

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des vecteurs dérivés de leurs combinaisons, notamment les cosmides et les phagemides. Parmi les vecteurs d'expression particulièrement préférés pour l'expression hétérologue de récepteurs membranaires dans les cellules de mammifères, on citera les vecteurs pCI-neo

Figure img00090001

(promega ; N'accession U47120) et pCDNA3 comprenant le promoteur du CMV, le vecteur bicistronique pIRESneo/pIREShyg (Clontech NO cat 6061-1) ou encore le vecteur pSG5 (Stratagène) comprenant le promoteur SV40. vectors derived from their combinations, in particular cosmids and phagemids. Among the particularly preferred expression vectors for the heterologous expression of membrane receptors in mammalian cells are the pCI-neo vectors.
Figure img00090001

(promega; accession U47120) and pCDNA3 comprising the CMV promoter, the piresneo / pIREShyg bicistronic vector (Clontech NO cat 6061-1) or the vector pSG5 (Stratagene) comprising the SV40 promoter.

Pour permettre la sécrétion des protéines traduites dans la lumière du réticulum endoplasmique des cellules eucaryotes ou dans l'espace périplasmique des bactéries ou dans tout autre environnement extra-cellulaire, les vecteurs peuvent comprendre des séquences codant les signaux de sécrétion appropriés sur le polypeptide exprimé.  To allow secretion of translated proteins into the endoplasmic reticulum lumen of eukaryotic cells or into the periplasmic space of bacteria or any other extracellular environment, the vectors may comprise sequences encoding the appropriate secretion signals on the expressed polypeptide.

L'invention porte aussi sur les cellules hôtes transformées par les vecteurs recombinants. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules hôtes sont des bactéries, telles que, par exemple, E. coli, les streptococci, les staphylococci, Streptomyces et B. subtilis, de préférence Escherichia coli. La transformation de cellules hôtes bactériennes est en particulier utile pour l'amplification et le stockage des vecteurs recombinants de l'invention.  The invention also relates to host cells transformed with the recombinant vectors. In a particular embodiment, the host cells are bacteria, such as, for example, E. coli, streptococci, staphylococci, Streptomyces and B. subtilis, preferably Escherichia coli. Transformation of bacterial host cells is particularly useful for the amplification and storage of the recombinant vectors of the invention.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules hôtes sont des cellules eucaryotes. Des cellules hôtes eucaryotes utilisables sont notamment des cellules de levures telles que S. cerevisiae ou de champignons filamenteux tels que Aspergillus, des cellules d'insectes telles que les cellules S2 de Drosphila ou Sf9 de spodoptera, ou encore des cellules de plantes.  In another embodiment of the invention, the host cells are eukaryotic cells. Usable eukaryotic host cells include yeast cells such as S. cerevisiae or filamentous fungi such as Aspergillus, insect cells such as S2 cells of Drosphila or Sf9 spodoptera, or plant cells.

De manière préférée, les cellules hôtes eucaryotes sont des cellules de mammifères et en particulier des lignées cellulaires de mammifères, notamment les cellules CHO, COS, HeLa, C127,3T3, HepG2, L (TK-) et de manière encore préférée, les lignées CHO-K1 ou HEK 293.  Preferably, the eukaryotic host cells are mammalian cells and in particular mammalian cell lines, in particular the CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HepG2, L (TK-) cells and, more preferably, the lines CHO-K1 or HEK 293.

Il est ainsi possible d'exprimer le récepteur couplé aux protéines G dans une cellule hôte appropriée, de préférence une cellule hôte eucaryote, par l'introduction dans la cellule hôte du vecteur recombinant de l'invention.  It is thus possible to express the G-protein coupled receptor in a suitable host cell, preferably a eukaryotic host cell, by introducing into the host cell the recombinant vector of the invention.

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L'homme du métier sait aussi purifier ledit récepteur à partir des cellules eucaryotes l'exprimant. Différentes méthodes de purification des récepteurs couplés aux protéines G sont décrites dans l'état de la technique (Eckard CP et Beck-sickinger AG, Curr Med Chem 2000 7 : 897-910 ; Ohtaki T et al., J Biol Chem 1998 273 : 15464-15473 ; Hayashi MK, Haga TJ, Biochem (tokyo) 1996 120 : 1232-1238). Citons à titre d'exemple, les purifications par précipitation au sulfate d'ammonium ou à l'éthanol, sur colonne de chromatographie à échange d'ions, par chromatographie d'affinité, par chromatographie d'exclusion par la taille, par chromatographie en phase inverse ou encore par chromatographie liquide à haute performance. Il est aussi envisageable de purifier le récepteur de l'invention à l'aide des techniques électrophorétiques de séparation des protéines selon leur taille et/ou leur charge.  Those skilled in the art can also purify said receptor from the eukaryotic cells expressing it. Various methods for purifying G protein-coupled receptors are described in the state of the art (Eckard CP and Beck-sickinger AG, Curr Med Chem 2000 7: 897-910, Ohtaki T et al., J Biol Chem 1998 273: 15464-15473, Hayashi MK, Haga TJ, Biochem (Tokyo) 1996 120: 1232-1238). For example, purifications by ammonium sulfate or ethanol precipitation, ion exchange chromatography column, affinity chromatography, size exclusion chromatography, chromatography, reverse phase or by high performance liquid chromatography. It is also conceivable to purify the receptor of the invention using electrophoretic protein separation techniques according to their size and / or charge.

La méthode de chromatographie d'affinité consiste en particulier à exprimer dans une cellule hôte, un récepteur recombinant présentant un épitope ou une séquence étiquette (tag) spécifique en amont ou en aval de la séquence codante, à récupérer les protéines membranaires ou les protéines totales de la cellule hôte puis à purifier les récepteurs sur colonne d'affinité fixant les protéines exprimant l'épitope ou tag spécifique. Selon ce mode de purification particulier, le vecteur d'expression comprend en plus les séquences étiquette (tag) pour la purification du polypeptide exprimé dans les cellules hôtes.  The method of affinity chromatography consists in particular in expressing in a host cell, a recombinant receptor presenting a specific epitope or tag (tag) sequence upstream or downstream of the coding sequence, in recovering the membrane proteins or the total proteins. of the host cell and then to purify the affinity column receptors fixing the proteins expressing the specific epitope or tag. According to this particular purification mode, the expression vector further comprises tag (tag) sequences for the purification of the polypeptide expressed in the host cells.

L'invention concerne également un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence d'acides nucléiques selon la séquence de la figure 1 (SEQ ID NO 1) ou par tout variant selon l'invention de la séquence de la figure 1.  The invention also relates to a polypeptide characterized in that it is encoded by a nucleic acid sequence according to the sequence of FIG. 1 (SEQ ID No. 1) or by any variant according to the invention of the sequence of FIG. .

En particulier, l'invention concerne un polypeptide comportant la séquence d'acides aminés de la figure 2 (SEQ ID NO 2).  In particular, the invention relates to a polypeptide having the amino acid sequence of Figure 2 (SEQ ID NO 2).

L'invention porte aussi sur les fragments de ce polypeptide présentant une activité de récepteur couplé aux protéines G, en particulier, les fragments de ce polypeptide comprenant les sept domaines transmembranaires.  The invention also relates to fragments of this polypeptide exhibiting G protein-coupled receptor activity, particularly fragments of this polypeptide comprising the seven transmembrane domains.

Il est en outre connu que certains fragments des récepteurs couplés aux protéines G sont capables de stimuler directement la protéine G indépendamment de la présence d'un agoniste. Par exemple, Hebert et al. ont montré que la deuxième et troisième boucle  It is further known that certain fragments of G-protein coupled receptors are capable of directly stimulating G protein independently of the presence of an agonist. For example, Hebert et al. showed that the second and third loop

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intracellulaire du récepteur couplé aux protéines G HT1AR permettent le couplage dudit récepteur aux protéines G et leur stimulation (Hebert TE et al., J Biol Chim 1996 271 : 16384-16392). Ainsi, l'invention porte sur les fragments du polypeptide décrit plus haut, lesdits fragments étant capables de stimuler directement les protéines G, et de mimer ainsi l'activité du récepteur couplé aux protéines G en présence d'un agoniste.  Intracellular receptors coupled to G HT1AR proteins allow the coupling of said G protein receptor and their stimulation (Hebert TE et al., J Biol Chim 1996 271: 16384-16392). Thus, the invention relates to the fragments of the polypeptide described above, said fragments being capable of directly stimulating the G proteins, and thus to mimic the activity of the G protein-coupled receptor in the presence of an agonist.

Inversement, les fragments du récepteur couplé aux protéines G délétés de tout ou partie des régions impliquées dans la dimérisation du récepteur ou dans l'interaction avec les protéines G peuvent être utilisés avantageusement afin d'inhiber l'action d'un agoniste (Varrault A. et al., J Biol Chem 1994 269 : 16720-16725). Par conséquent, l'invention porte aussi sur les fragments du polypeptide décrit plus haut, capables d'inhiber l'action d'un agoniste. Ainsi, selon les modes de réalisations de l'invention, les fragments de séquences polypeptidiques de l'invention sont compris dans un des 7 domaines transmembranaires ou dans la partie intracytoplasmique (première, deuxième et troisième boucle intracellulaire) ou encore dans la partie extérieure à la cellule (partie N-terminale ou première, deuxième ou troisième boucle extracellulaire).  Conversely, G protein-coupled receptor fragments deleted from all or part of the regions involved in receptor dimerization or in the interaction with G proteins can be used to advantage in order to inhibit the action of an agonist (Varrault A et al., J Biol Chem 1994 269: 16720-16725). Therefore, the invention also relates to the fragments of the polypeptide described above, capable of inhibiting the action of an agonist. Thus, according to the embodiments of the invention, the fragments of polypeptide sequences of the invention are included in one of the 7 transmembrane domains or in the intracytoplasmic part (first, second and third intracellular loop) or in the outer part of the invention. the cell (N-terminal portion or first, second or third extracellular loop).

Les polypeptides ou fragments de polypeptides de l'invention sont sous la forme des protéines natives ou font partie d'une protéine de fusion de taille plus importante. En particulier, les polypeptides de l'invention sont fusionnés à des séquences d'acides aminés supplémentaires qui contiennent les signaux nécessaires à la traduction, la stabilité, la sécrétion et/ou la purification de la protéine recombinante correspondante.  The polypeptides or polypeptide fragments of the invention are in the form of native proteins or are part of a larger fusion protein. In particular, the polypeptides of the invention are fused to additional amino acid sequences which contain the signals necessary for the translation, stability, secretion and / or purification of the corresponding recombinant protein.

Les anticorps dirigés contre les polypeptides et fragments de polypeptides décrits plus haut font également partie de l'invention. Ces anticorps trouvent leur intérêt pour détecter et/ou quantifier l'expression des récepteurs à la surface des cellules. Lorsque les anticorps sont spécifiquement dirigés contre le site de reconnaissance du ligand du récepteur couplé aux protéines G, ces anticorps peuvent aussi être utilisés en tant qu'antagonistes du récepteur.  The antibodies directed against the polypeptides and polypeptide fragments described above are also part of the invention. These antibodies are of interest for detecting and / or quantifying the expression of receptors on the surface of cells. When the antibodies are specifically directed against the G-protein coupled receptor ligand recognition site, these antibodies can also be used as receptor antagonists.

L'invention vise à la fois les anticorps polyclonaux et monoclonaux.  The invention is directed to both polyclonal and monoclonal antibodies.

Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par l'immunisation d'un hôte vivant approprié avec lesdits polypeptides purifiés ou leurs fragments contenant les  The polyclonal antibodies can be obtained by immunizing an appropriate living host with said purified polypeptides or fragments thereof.

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épitopes que l'on souhaite identifier et/ou quantifier. Les anticorps formés à partir d'un sérum de l'hôte immunisé sont ensuite récupérés notamment par la mise en contact des sérums avec les polypeptides purifiés et par la récupération de ces anticorps à partir des complexes antigène-anticorps formés.  epitopes that one wishes to identify and / or quantify. The antibodies formed from a serum of the immunized host are then recovered, in particular by bringing the sera into contact with the purified polypeptides and by recovering these antibodies from the antigen-antibody complexes formed.

Les anticorps monoclonaux sont notamment obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes de Kohler et Milstein.  The monoclonal antibodies are obtained in particular according to the conventional hybridoma culture method of Kohler and Milstein.

Les anticorps selon l'invention peuvent aussi être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés ou des fragments Fab ou F (ab'') 2. Il est en particulier possible, de cloner les gènes codant les deux chaînes des anticorps monoclonaux produits par des hybridomes, ceux-ci pouvant être manipulés in vitro et réintroduits ensuite dans des cellules secrétrices, telles des lignées lymphoïdes ou autres, après leur réinsertion dans les vecteurs d'expression appropriés aux cellules choisies. De nouveaux anticorps monoclonaux sont ainsi construits avec des régions variables de souris ou de rats et des régions constantes humaines. Différents types d'immunoglobulines peuvent être obtenus.  The antibodies according to the invention can also be chimeric antibodies, humanized antibodies or Fab or F (ab '') 2 fragments. In particular it is possible to clone the genes encoding the two chains of the monoclonal antibodies produced by hybridomas. these can be manipulated in vitro and then reintroduced into secretory cells, such as lymphoid lines or the like, after being reinserted into the expression vectors appropriate to the cells chosen. New monoclonal antibodies are thus constructed with variable regions of mouse or rat and human constant regions. Different types of immunoglobulins can be obtained.

Leur spécificité dans tous les cas sera la même que celle des régions variables utilisées mais ils posséderont les propriétés effectrices des immunoglobulines humaines suivant l'isotype choisi dans la construction. Their specificity in all cases will be the same as that of the variable regions used but they will have the effector properties of human immunoglobulins according to the isotype chosen in the construction.

Les anticorps de l'invention peuvent aussi être reconstitués (Reshaped antibodies) (Riechmann et al. (1988), Nature 332 : 323-327). Schématiquement, le point de départ de cette approche est l'observation que les sites de contact des anticorps avec les épitopes des antigènes qu'ils reconnaissent sont localisés sur certaines séquences des régions variables dites hypervariables. La technique consiste à greffer les régions hypervariables d'une immunoglobuline murine appelée"région déterminant la complémentarité avec l'antigène" ou"CDR"sur les régions variables d'une immunoglobuline de classe G humaine.  The antibodies of the invention may also be reconstituted (Reshaped antibodies) (Riechmann et al (1988), Nature 332: 323-327). Schematically, the starting point of this approach is the observation that the sites of contact of the antibodies with the epitopes of the antigens that they recognize are located on certain sequences of the so-called hypervariable variable regions. The technique involves grafting the hypervariable regions of a murine immunoglobulin called "antigen complementarity determining region" or "CDR" onto the variable regions of a human class G immunoglobulin.

Les anticorps selon l'invention sont aussi susceptibles d'être couplés à un autre composé, notamment un marqueur, afin d'obtenir un signal détectable ou quantifiable.  The antibodies according to the invention are also capable of being coupled to another compound, in particular a marker, in order to obtain a detectable or quantifiable signal.

Les cellules hôtes exprimant le récepteur couplé aux protéines G selon l'invention peuvent être avantageusement utilisées pour le criblage de composés qui se fixent au  The host cells expressing the G-protein coupled receptor according to the invention can be advantageously used for screening compounds which bind to the

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récepteur et l'active (agonistes de ce récepteur) ou qui inhibent l'activation dudit récepteur (antagoniste).  receptor and activates it (agonists of this receptor) or which inhibit the activation of said receptor (antagonist).

L'invention porte ainsi sur un procédé de criblage pour l'identification de molécules agonistes du récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G ; b) la mise en contact des cellules hôte en culture avec un composé candidat ; c) la détermination d'un signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines
G en présence du composé candidat.
The invention thus relates to a screening method for the identification of G protein-coupled receptor agonist molecules, characterized in that it comprises the following steps: a) the cultivation of eukaryotic host cells transformed by a recombinant vector according to the invention; invention for expression of the G-protein coupled receptor; b) contacting the cultured host cells with a candidate compound; c) the determination of a potential signal generated by the protein-coupled receptor
G in the presence of the candidate compound.

Selon les modes de réalisation du procédé, le signal à déterminer, généré par l'activation du récepteur couplé aux protéines G par le composé candidat peut être une stimulation ou une inhibition de l'adénylate cyclase, une liaison du 35SGTPy, une activité MAP kinase ou encore une augmentation de l'inositol triphosphate intracellulaire, et plus généralement tout type de signal susceptible d'être modulé positivement ou négativement par les protéines G.  According to the embodiments of the method, the signal to be determined, generated by the activation of the G-protein coupled receptor by the candidate compound, may be stimulation or inhibition of adenylate cyclase, binding of 35SGTPy, MAP kinase activity. or an increase in intracellular inositol triphosphate, and more generally any type of signal likely to be modulated positively or negatively by G proteins.

Dans un mode de réalisation préféré, le signal généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence d'un de ses agonistes est déterminé à l'aide d'un système rapporteur comprenant l'utilisation d'une cellule recombinante exprimant la sous-unité a de la protéine G16 de manière stable ou transitoire et la quantification de la concentration en calcium intracellulaire. L'expression constitutive de la sous-unité a de la protéine G16 permet que toute réponse antagoniste se traduise essentiellement par une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire.  In a preferred embodiment, the signal generated by the G-protein coupled receptor in the presence of one of its agonists is determined using a reporter system comprising the use of a recombinant cell expressing the subunit has G16 protein stably or transiently and quantifying the intracellular calcium concentration. Constitutive expression of the α-subunit of G16 protein allows any antagonistic response to result essentially in an increase in intracellular calcium concentration.

Ainsi, l'invention porte sur un procédé de criblage pour l'identification de molécules agonistes comprenant les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G,  Thus, the invention relates to a screening method for the identification of agonist molecules comprising the following steps: a) the cultivation of eukaryotic host cells transformed with a recombinant vector according to the invention allowing the expression of the G protein-coupled receptor; ,

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lesdites cellules hôtes exprimant en plus une sous-unité a de la protéine G de manière constitutive ; b) la quantification de la concentration en calcium intracellulaire dans les cellules en culture en présence et en absence des molécules à cribler ; c) la sélection des molécules en présence desquelles la concentration en calcium intracellulaire est augmentée.  said host cells additionally expressing an α-subunit of the G protein constitutively; b) the quantification of the intracellular calcium concentration in the cells in culture in the presence and absence of the molecules to be screened; c) the selection of the molecules in the presence of which the concentration of intracellular calcium is increased.

Dans le procédé ci-dessus, les cellules hôtes sont modifiées de telle manière que toute activation du récepteur conduit à une élévation de la concentration en calcium intracellulaire. On utilisera par exemple des cellules COS7, CHO ou HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire la sous-unité Gai 6. La concentration de calcium intracellulaire est déterminée à l'aide d'un marqueur, notamment un marqueur fluorescent.  In the above method, the host cells are modified in such a way that any activation of the receptor leads to an elevation of the intracellular calcium concentration. For example, COS7, CHO or HEK293 cells stably or transiently express the Ga1 subunit. The intracellular calcium concentration is determined using a marker, in particular a fluorescent marker.

L'invention porte également sur un procédé d'identification de la présence de molécules antagonistes comprenant les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un plasmide recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G en présence d'un agoniste ; b) la mise en contact des cellules hôtes en culture avec un composé candidat ; c) la détermination d'une diminution du signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence du composé candidat et de l'agoniste par rapport au signal généré avec l'agoniste seul.  The invention also relates to a method for identifying the presence of antagonistic molecules comprising the following steps: a) the cultivation of eukaryotic host cells transformed with a recombinant plasmid according to the invention allowing the expression of the G protein-coupled receptor in presence of an agonist; b) contacting the cultured host cells with a candidate compound; c) determining a decrease in the potential signal generated by the G-protein coupled receptor in the presence of the candidate compound and the agonist relative to the signal generated with the agonist alone.

Les agonistes et antagonistes identifiés par un tel procédé sont également visés par l'invention.  The agonists and antagonists identified by such a method are also covered by the invention.

L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes d'un récepteur couplé aux protéines G.  The invention also relates to the use of a nucleic acid sequence encoding a G protein-coupled receptor according to the invention for the screening of agonist and antagonist molecules of a G protein-coupled receptor.

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Elle concerne également l'utilisation des cellules hôtes ci-dessus mentionnées pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes d'un récepteur couplé aux protéines G.  It also relates to the use of the above-mentioned host cells for the screening of agonist and antagonist molecules of a G protein-coupled receptor.

Les polypeptides codés par les séquences d'acides nucléiques de l'invention sont impliqués dans différentes fonctions biologiques, et éventuellement certaines pathologies.  The polypeptides encoded by the nucleic acid sequences of the invention are involved in different biological functions, and possibly certain pathologies.

En particulier, la mise en évidence par les inventeurs de l'expression du récepteur couplé aux protéines G spécifiquement dans l'hippocampe, l'amygdale, le noyau caudé, la substance noire, la rate, les reins, la prostate ou les intestins suppose un rôle du récepteur dans les fonctions liées à ces structures et éventuellement dans certaines pathologies liées à une anomalie dans l'expression dudit récepteur, en particulier dans ces tissus. In particular, the demonstration by the inventors of the expression of the G-protein coupled receptor specifically in the hippocampus, amygdala, caudate nucleus, substantia nigra, spleen, kidneys, prostate or intestines assumes a role of the receptor in the functions related to these structures and possibly in certain pathologies related to an abnormality in the expression of said receptor, in particular in these tissues.

Par conséquent, l'invention vise également les méthodes de diagnostic, de pronostic ou de suivi de l'évolution d'une pathologie liée à une expression anormale du récepteur dans un tissu.  Therefore, the invention also relates to methods for diagnosing, prognosticating or monitoring the course of a pathology related to an abnormal expression of the receptor in a tissue.

Par expression anormale, il faut comprendre toute expression qualitativement ou quantitativement différente entre un individu malade et un individu sain.  By abnormal expression, one must understand any qualitatively or quantitatively different expression between a sick individual and a healthy individual.

Dans un premier mode de réalisation particulier, la méthode de diagnostic consiste à comparer la séquence codant le récepteur dans les cellules d'un tissu particulier chez un individu malade et un individu sain et à détecter une forme allélique particulière de la séquence chez l'individu malade par rapport au sujet sain.  In a first particular embodiment, the diagnostic method consists in comparing the sequence encoding the receptor in the cells of a particular tissue in a sick individual and a healthy individual and in detecting a particular allelic form of the sequence in the individual. sick in relation to the healthy subject.

Dans un second mode de réalisation particulier, la méthode consiste à comparer l'expression de l'ARN messager codant le récepteur dans les cellules d'un tissu particulier chez un individu malade et un individu sain et détecter une expression anormale dudit ARN messager chez l'individu malade par rapport au sujet sain.  In a second particular embodiment, the method consists in comparing the expression of the messenger RNA encoding the receptor in the cells of a particular tissue in a sick individual and a healthy individual and detecting an abnormal expression of said messenger RNA in the patient. sick individual in relation to the healthy subject.

Les techniques de quantification de l'expression d'un ARN messager sont bien connues de l'homme du métier. On citera en particulier la technique du Northern Blot ou de RT-PCR quantitative.  Techniques for quantifying the expression of a messenger RNA are well known to those skilled in the art. In particular, mention may be made of Northern blotting or quantitative RT-PCR.

Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de diagnostic, de pronostic ou de suivi de l'évolution d'une pathologie liée à une expression anormale du récepteur et  More particularly, the invention relates to a method for diagnosing, prognosticating or monitoring the evolution of a pathology related to an abnormal expression of the receptor and

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comprenant la détection de l'expression anormale de l'ARN messager du récepteur à l'aide de puces à ADN.  comprising detecting the abnormal expression of messenger RNA from the receptor using DNA chips.

L'invention vise des kits de mesure quantitative et/ou qualitative de l'expression du gène codant le récepteur couplé aux protéines G dans des tissus ou des cellules d'un tissu particulier. De tels kits peuvent être utilisés pour le diagnostic, le pronostic ou le suivi thérapeutique de patients présentant, ou susceptibles de présenter une pathologie liée à une surexpression ou une sous-expression de la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.  The invention provides kits for quantitatively and / or qualitatively measuring the expression of the gene encoding the G protein-coupled receptor in tissues or cells of a particular tissue. Such kits can be used for the diagnosis, prognosis or therapeutic follow-up of patients presenting or likely to have a pathology related to overexpression or under-expression of the nucleic acid sequence according to the invention.

Un kit selon l'invention comprend : soit des amorces selon l'invention, en particulier pour l'amplification RT-PCR du gène codant le récepteur et la quantification de l'ADNc amplifié ; soit une sonde selon l'invention, en particulier pour la quantification en
Northem Blot de l'ARN messager codant le récepteur couplé aux protéines G.
A kit according to the invention comprises: either primers according to the invention, in particular for the RT-PCR amplification of the gene encoding the receptor and the quantification of the amplified cDNA; a probe according to the invention, in particular for the quantification in
Northem Blot of messenger RNA encoding the G-protein coupled receptor.

Avantageusement, l'expression du transcrit codant le récepteur couplé aux protéines G dans des cellules ou des tissus est étudié par hybridation des ADNc ou ARNm dans des kits constitués de puces à ADN , ou micro-réseaux ou macro-réseaux sur lesquels sont fixés des sondes spécifiques du gène de l'invention dont l'expression est recherchée.  Advantageously, the expression of the transcript encoding the G protein-coupled receptor in cells or tissues is studied by hybridization of cDNAs or mRNAs in kits consisting of DNA chips, or microarrays or macro-networks on which are fixed probes specific for the gene of the invention whose expression is sought.

Par puce à ADN , il faut comprendre tout type de support permettant la fixation stable d'une quantité d'acides nucléiques, l'hybridation des acides nucléiques fixés sur le support avec une séquence contenue dans un extrait d'ADN ou d'ARN préalablement marqué, puis la quantification de l'hybridation. Les technologies des puces à ADN sont en particulier décrites par Sambrook et al. (voir plus haut).  By DNA chip, it is necessary to understand any type of support allowing the stable attachment of a quantity of nucleic acids, the hybridization of the nucleic acids fixed on the support with a sequence contained in a DNA or RNA extract beforehand. labeled, and then quantification of hybridization. Microarray technologies are in particular described by Sambrook et al. (see above).

De même, des kits permettant la détection de formes anormales du récepteur couplé aux protéines G font également partie de l'invention. Ces tests peuvent être de nature immunologique comprenant l'utilisation d'anticorps spécifiques de régions du récepteur susceptibles de contenir des structures anormales.  Similarly, kits allowing the detection of abnormal forms of the G-protein coupled receptor are also part of the invention. These tests may be of an immunological nature comprising the use of antibodies specific for regions of the receptor likely to contain abnormal structures.

Ces kits peuvent également être une puce à protéines constituée d'un support sur lequel est fixée une séquence d'acides aminés selon l'invention ou un anticorps ou  These kits may also be a protein chip consisting of a support on which is fixed an amino acid sequence according to the invention or an antibody or

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fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'invention. De telles puces à protéines permettent la détection à grande échelle de structures anormales de plusieurs protéines, ou la détection des interactions particulières du récepteur avec d'autres molécules.  antibody fragment directed against a polypeptide or polypeptide fragment according to the invention. Such protein chips allow the large-scale detection of abnormal structures of several proteins, or the detection of particular interactions of the receptor with other molecules.

L'invention vise également des méthodes de traitements thérapeutiques de pathologies liées à une expression anormale, excessive ou insuffisante du récepteur couplé aux protéines G codé par les séquences de l'invention, en particulier dans l'hippocampe, la substance noire, le noyau caudé, l'amygdale, les intestins, les reins, la rate et la prostate caractérisées en ce qu'elles comprennent l'administration d'une dose thérapeutique efficace d'un agoniste ou d'un antagoniste du récepteur couplé aux protéines G codé par les séquences de l'invention.  The invention also provides methods for the therapeutic treatment of pathologies related to an abnormal, excessive or insufficient expression of the G protein-coupled receptor encoded by the sequences of the invention, in particular in the hippocampus, the substantia nigra, the caudate nucleus. , amygdala, intestines, kidneys, spleen and prostate characterized by comprising administering an effective therapeutic dose of a G-protein coupled receptor agonist or antagonist encoded by sequences of the invention.

En particulier, l'invention porte sur une séquence nucléotidique anti-sens, capable d'inhiber l'expression des séquences d'acides nucléiques selon l'invention, et caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acides nucléiques simple brin capable de s'hybrider dans des conditions stringentes au brin codant d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Elle porte en outre sur l'utilisation de ces séquences pour le traitement thérapeutique de pathologies liées à une expression excessive du récepteur couplé aux protéines G.  In particular, the invention relates to an antisense nucleotide sequence capable of inhibiting the expression of the nucleic acid sequences according to the invention, and characterized in that it corresponds to a single-stranded nucleic acid sequence. capable of hybridizing under stringent conditions to the coding strand of a nucleic acid sequence according to the invention. It also relates to the use of these sequences for the therapeutic treatment of pathologies related to excessive expression of the G protein-coupled receptor.

Un fonctionnement anormal de l'hippocampe, la substance noire, le noyau caudé, l'amygdale, les intestins, les reins, la rate et la prostate peut entraîner un certain nombre de désordres ou pathologies, on citera notamment l'obésité, la boulimie, l'anorexie, la maladie de Parkinson, l'hypertrophie prostatique, l'insuffisance rénale, l'asthme, l'allergie, l'hypotension, l'hypertension et les désordres psychotiques et neurologiques tels que l'anxiété, la schizophrénie, la maniaco-dépression, le delirium, la démence, l'épilepsie, la migraine, l'insomnie, les désordres du rythme circadien et l'atténuation des performances cognitives. On citera aussi les infections par les bactéries et les virus particulièrement le HIV-I et HIV-2.  Abnormal functioning of the hippocampus, black substance, caudate nucleus, amygdala, intestines, kidneys, spleen and prostate can lead to a number of disorders or pathologies, including obesity, bulimia , anorexia, Parkinson's disease, prostatic hypertrophy, renal failure, asthma, allergy, hypotension, hypertension and psychotic and neurological disorders such as anxiety, schizophrenia, manic depression, delirium, dementia, epilepsy, migraine, insomnia, circadian rhythm disorders and cognitive impairment. Other infections include bacteria and viruses, particularly HIV-1 and HIV-2.

Par conséquent, l'invention porte aussi sur l'utilisation des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides selon l'invention pour le criblage de molécules actives dans le traitement de l'obésité, la boulimie, l'anorexie, la maladie de Parkinson, l'hypertrophie  Therefore, the invention also relates to the use of the nucleic acid sequences and the polypeptides according to the invention for the screening of molecules that are active in the treatment of obesity, bulimia, anorexia, Parkinson's disease. , hypertrophy

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prostatique, l'insuffisance rénale, l'asthme, l'allergie, l'hypotension, l'hypertension et des désordres psychotiques et neurologiques tels que l'anxiété, la schizophrénie, la maniacodépression, le delirium, la démence, l'épilepsie, la migraine, l'insomnie, les désordres du rythme circadien et l'atténuation des performances cognitives. On citera aussi les infections par les bactéries et les virus particulièrement le HIV-1 et HIV-2.  Prostatic, renal failure, asthma, allergy, hypotension, hypertension and psychotic and neurological disorders such as anxiety, schizophrenia, manic depression, delirium, dementia, epilepsy, migraine, insomnia, circadian rhythm disorders and cognitive performance attenuation. Other infections include bacteria and viruses, particularly HIV-1 and HIV-2.

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DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G (Seq 3524).  DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1: Sequence of nucleic acids encoding a G-protein coupled receptor (Seq 3524).

(SEQ ID NO 1) Figure 2 : Séquence d'acides aminés du récepteur couplé aux protéines G.  (SEQ ID NO: 1) Figure 2: Amino acid sequence of the G protein-coupled receptor.

(SEQ ID NO 2) Figure 3 : Profil hydrophile de la protéine codant le récepteur couplé aux protéines G.  (SEQ ID NO: 2) Figure 3: Hydrophilic profile of the protein encoding the G protein-coupled receptor.

Figure 4 : Expression tissulaire. Figure 4: Tissue expression.

Exemple 1-Identification et isolement d'une séquence d'acides nucléiques codant un nouveau récepteur couplé aux protéines G
Des séquences présentant des homologies avec les séquences codant des récepteurs couplés aux protéines G ont été recherchées parmi les séquences de la banque HTGS (high throuput genome sequencing). Pour cette recherche, le logiciel de comparaison de séquence Lassap V2 (de la société Gene-IT) a été utilisé. Ce logiciel s'appuie sur un algorithme de type Blast 2.
Example 1 Identification and Isolation of a Nucleic Acid Sequence Encoding a New G-protein Coupled Receptor
Sequences having homologies with the G-protein coupled receptor coding sequences were searched for among the high throuput genome sequencing (HTGS) sequences. For this research, the Lassap V2 sequence comparison software (from Gene-IT) was used. This software is based on a Blast 2 algorithm.

Le criblage a permis d'identifier un fragment de séquence d'ADN génomique codant potentiellement un récepteur couplé aux protéines G. L'analyse de la séquence a permis de reconstituer une phase ouverte de lecture théorique contenant un codon d'initiation et un codon stop.  The screening made it possible to identify a genomic DNA sequence fragment potentially encoding a G protein-coupled receptor. The analysis of the sequence made it possible to reconstitute a theoretical open reading phase containing an initiation codon and a stop codon. .

La traduction de la séquence nucléotidique théorique en acides aminés produit une séquence en protéine de 345 acides aminés. Cette séquence possède un certain nombre de critères structuraux typiques des récepteurs couplés aux protéines G : incluant 7 domaines transmembranaires contenant chacun environ 20-30 acides aminés hydrophobes et le motif DRY présent dans le troisième domaine transmembranaire.  The translation of the theoretical nucleotide sequence into amino acids produces a protein sequence of 345 amino acids. This sequence has a number of structural criteria typical of G-protein coupled receptors: including 7 transmembrane domains each containing about 20-30 hydrophobic amino acids and the DRY motif present in the third transmembrane domain.

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En outre, la comparaison de cette séquence avec les séquences accessibles dans les banques de données à l'aide de l'algorithme Clustal W révèle une d'identité de 30% avec le récepteur sérotoninergique 5HT-4.  In addition, the comparison of this sequence with the sequences available in the databases using the Clustal W algorithm reveals an identity of 30% with the 5HT-4 serotoninergic receptor.

Un ADNc a été isolé par RT-PCR à partir d'ARNm de cerveau à l'aide des amorces

Figure img00200001

sens 5'-CACCATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3'et une amorce anti sens 5'TTATCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTATATGTTCAGAAAACAAATTCAT GGTTGCTG-3'. Ces amorces ont été définies à partir de la séquence théorique obtenue, et contiennent en plus la séquence CACC (soulignées dans la séquence d'oligonucléotides) permettant un clonage orienté dans le vecteur d'expression nommé pcDNA3. 1 TOPO (Invitrogen). L'amorce anti sens contient aussi une séquence en phase avec celle codant pour le récepteur et codant pour le peptide DYKDDDDK. CDNA was isolated by RT-PCR from brain mRNA using primers
Figure img00200001

sense 5'-CACCATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3 'and an antisense primer 5'TTATCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTATATGTTCAGAAAACAAATTCAT GGTTGCTG-3'. These primers were defined from the theoretical sequence obtained, and additionally contain the CACC sequence (underlined in the oligonucleotide sequence) allowing directed cloning in the expression vector named pcDNA3. 1 TOPO (Invitrogen). The antisense primer also contains a sequence in phase with that coding for the receptor and encoding the DYKDDDDK peptide.

La séquence amplifiée par RT-PCR a été insérée dans le vecteur d'expression pcDNA3. 1 TOPO puis la séquence nucléotidique a été déterminée à partir d'une réaction de terminaison de chaîne et en utilisant un séquenceur d'ADN automatique ABI 377 (Applied Biosystems).  The amplified sequence by RT-PCR was inserted into the pcDNA3 expression vector. 1 TOPO then the nucleotide sequence was determined from a chain termination reaction and using an ABI 377 automated DNA sequencer (Applied Biosystems).

La séquence nucléotidique (Seq 3524) ainsi obtenue est présentée dans la figure 1 (SEQ ID NO 1). La séquence d'acides aminés, déduite de la séquence nucléotidique est présentée dans la figure 2 (SEQ ID NO 2). L'analyse du profil hydrophile de la séquence à l'aide de la méthode de Kyte et Doolittle est présentée en figure 3. Elle confirme l'existence de sept domaines transmembranaires hydrophobes ainsi que la présence du motif DRY dans le troisième domaine transmembranaire. Ces résultats attestent que la séquence d'acides nucléiques isolée code pour un nouveau récepteur couplé aux protéines G.  The nucleotide sequence (Seq 3524) thus obtained is shown in Figure 1 (SEQ ID NO 1). The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in Figure 2 (SEQ ID NO 2). The analysis of the hydrophilic profile of the sequence using the method of Kyte and Doolittle is presented in FIG. 3. It confirms the existence of seven hydrophobic transmembrane domains as well as the presence of the DRY motif in the third transmembrane domain. These results demonstrate that the isolated nucleic acid sequence encodes a novel G protein-coupled receptor.

Exemple 2-Etude de l'expression tissulaire de l'ARNm codant le nouveau récepteur
Afin d'une part de vérifier que la séquence identifiée correspond effectivement à une séquence transcrite dans des conditions physiologiques normales et d'autre part de connaître les tissus dans lesquels la séquence est plus particulièrement transcrite, une analyse de l'expression tissulaire a été réalisée par RT-PCR et hybridation des produits
Example 2-Study of Tissue Expression of the mRNA Encoding the New Receptor
In order partly to verify that the identified sequence does correspond to a sequence transcribed under normal physiological conditions and, secondly, to know the tissues in which the sequence is more particularly transcribed, an analysis of the tissue expression has been performed. by RT-PCR and hybridization of products

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amplifiés spécifiques.  amplified specific.

Quatre microgrammes d'ARN totaux sont dénaturés pendant 10 minutes à 65 C puis immédiatement placés dans la glace. La réaction de réversion des ARNm en premier brin d'ADNc s'effectue dans un volume final de 17 u. l durant lhl5 à 37 C en présence de tampon First Strand cDNA kit IX (Amersham Phannacia) supplémenté de 1 mM final de DTT, de 50 ng d'oligonucléotides dT et 25 ng de random primers selon le protocole décrit par le fournisseur. Cinq minutes à 65 C sont nécessaires pour inactiver l'enzyme.  Four micrograms of total RNA are denatured for 10 minutes at 65 ° C and immediately placed in the ice. The mRNA first-mRNA reversion reaction is carried out in a final volume of 17 μ. during 1 hr at 37 ° C. in the presence of First Strand cDNA buffer kit IX (Amersham Phannacia) supplemented with a final 1 mM of DTT, 50 ng of dT oligonucleotides and 25 ng of random primers according to the protocol described by the supplier. Five minutes at 65 C are required to inactivate the enzyme.

Les réactions de PCR sont effectuées en présence d'un couple d'oligonucléotides situé en 5' (5'-CTGGTAGCAAGACAGAATCATCCTC-3') et 3' (5'GTATCCTGAACTTCGTCTATACAACTGC-3') de la séquence théorique obtenue (Seq 3524). Deux microlitres de la réaction de transcription inverse sont amplifiés avec l'enzyme Ampli Taq Gold kit (Perkin Elmer) dans un volume de 100 pu en présence de tampon lx, de 0,2 mM de dNTP, de 0, 2 M de chaque oligonucléotide, 10% v/v de DMSO et de 2,5 Unités de Taq polymérase. Le programme d'amplification est le suivant : une étape de dénaturation à 94 C pendant 9 min précède 30 cycles de dénaturation (1 min. à 94 C), d'hybridation (2 min. à 58 C) et d'élongation (2 min. à 72 C). La PCR se termine par une élongation finale de 8 min. à 72 C.  The PCR reactions are carried out in the presence of a pair of oligonucleotides located in 5 '(5'-CTGGTAGCAAGACAGAATCATCCTC-3') and 3 '(5'GTATCCTGAACTTCGTCTATACAACTGC-3') of the obtained theoretical sequence (Seq 3524). Two microliters of the reverse transcription reaction are amplified with the Ampli Taq Gold kit enzyme (Perkin Elmer) in a volume of 100 μl in the presence of 1 × buffer, 0.2 mM of dNTP, 0.2 M of each oligonucleotide , 10% v / v of DMSO and 2.5 units of Taq polymerase. The amplification program is as follows: a denaturation step at 94 ° C. for 9 minutes precedes 30 cycles of denaturation (1 min at 94 ° C.), hybridization (2 min at 58 ° C.) and elongation (2 min. at 72 ° C). The PCR ends with a final elongation of 8 min. at 72 C.

Les produits de PCR sont ensuite séparés par gel d'électrophorèse d'agarose (1%, poids/volume) et transférés sur membranes de nylon Hybon W (Amersham). Les membranes sont hybridées avec un oligonucléotide (5'CCTCAGAGAGTTACAAAGCCAGAGTG-3') marqué avec du adCTP 32p (3000

Figure img00210001

Ci/mmol, NEN). L'hybridation se prolonge à 42 C toute la nuit sous agitation. La membrane est ensuite soumise à 2 lavages en tampon SSC 2X/SDS 0, 1% à température ambiante, puis à 2 lavages à 42 C pendant 30 min et enfin à un lavage à 50 C pendant 30 min. Entourée de film plastique Saran Wrap, la membrane est mise en présence d'un film autoradiographique X-Omat (Kodak) et le film est révélé dans une développeuse Hyperprocessor (Amersham). The PCR products are then separated by agarose electrophoresis gel (1%, w / v) and transferred to Hybon W nylon membranes (Amersham). The membranes are hybridized with an oligonucleotide (5'CCTCAGAGAGTTACAAAGCCAGAGTG-3 ') labeled with 32p adCTP (3000
Figure img00210001

Ci / mmol, NEN). The hybridization is prolonged at 42 ° C. overnight with stirring. The membrane is then subjected to 2 washes in 2 × SSC buffer / 0.1% SDS at room temperature, followed by 2 washes at 42 ° C. for 30 minutes and finally washing at 50 ° C. for 30 minutes. Surrounded by Saran Wrap plastic film, the membrane is placed in the presence of an X-Omat autoradiographic film (Kodak) and the film is revealed in a Hyperprocessor processor (Amersham).

Les résultats présentés dans la figure 4 indiquent l'expression de l'ARN messager dans les différents tissus. Le récepteur codé par la séquence Seq 3524 de la figure 1 est  The results presented in Figure 4 indicate the expression of messenger RNA in the different tissues. The receiver encoded by Seq sequence 3524 of FIG.

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principalement exprimé dans les reins, la prostate, les intestins, la rate, le cerveau et en particulier l'hippocampe, le noyau caudé, l'amygdale et la substance noire.  mainly expressed in the kidneys, prostate, intestines, spleen, brain and in particular the hippocampus, caudate nucleus, amygdala and substantia nigra.

Exemple 3 - Vecteur recombinant et lignées cellulaires exprimant de façon stable la séquence codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention
L'ADNc tel qu'isolé dans l'exemple 1 a été cloné dans le vecteur d'expression pcDNA3.1 TOPO. Ce vecteur, nommé pS3524, comprend une origine de réplication bactérienne permettant de multiplier le plasmide recombinant pcDNA3-S3524 flag obtenu en grand nombre de copies. Le vecteur comprend en outre un gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection des clones bactériens, un gène de résistance à la généticine (G418) permettant la sélection de clones de cellules eucaryotes ayant incorporés l'ADNc S3524 codant pour le récepteur couplé aux protéines G. Enfin, les séquences clonées dans le vecteur sont sous le contrôle du promoteur du CMV qui permet une expression forte du gène cloné dans la cellule hôte eucaryote.
Example 3 - Recombinant vector and cell lines stably expressing the sequence encoding a G-protein coupled receptor according to the invention
The cDNA as isolated in Example 1 was cloned into the pcDNA3.1 TOPO expression vector. This vector, called pS3524, comprises a bacterial origin of replication for multiplying the recombinant plasmid pcDNA3-S3524 flag obtained in large number of copies. The vector further comprises an ampicillin resistance gene for the selection of bacterial clones, a geneticin resistance gene (G418) for the selection of eukaryotic cell clones having incorporated the S3524 cDNA encoding the conjugated receptor. Finally, the cloned sequences in the vector are under the control of the CMV promoter which allows strong expression of the cloned gene in the eukaryotic host cell.

Le plasmide recombinant décrit ci-dessus est introduit dans les cellules CHO-K1 (American type culture collection, CCL61) maintenues dans un milieu Ham-F12 avec 10% de sérum de veau foetal, 2mM de glutamine, 500 IU/ml de pénicilline et 500 tg/ml de streptomycine en utilisant la méthode de transfection à la lipofectamine comme décrit par le fournisseur (Life Technologies, France). Les clones exprimant le récepteur sont sélectionnés avec 500 jug/ml de G418 et testés pour l'expression du récepteur pS3524flag, par une technique d'immunofluorescence, en utilisant un anticorps IgG reconnaissant le peptide DYKDDDDK. Ces expériences permettent de confirmer l'expression du récepteur dans la cellule CHO-K1.  The recombinant plasmid described above is introduced into CHO-K1 cells (American type culture collection, CCL61) maintained in Ham-F12 medium with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 500 IU / ml penicillin and 500 μg / ml streptomycin using the lipofectamine transfection method as described by the supplier (Life Technologies, France). Clones expressing the receptor are selected with 500 μg / ml G418 and tested for expression of the pS3524flag receptor, by an immunofluorescence technique, using an IgG antibody recognizing the DYKDDDDK peptide. These experiments make it possible to confirm the expression of the receptor in the CHO-K1 cell.

Exemple 4 - Procédé de criblage par l'identification de molécule agoniste d'un récepteur couplé aux protéines G Mesure du calcium intracellulaire au FLIPR Les cellules CHO-K1 exprimant le produit du gène codé par la séquence de la figure 1 et la sous-unité a de la protéine G16 sont dissociées la veille de l'expérience et ensemencées  Example 4 - Screening method by the identification of agonist molecule of a G protein-coupled receptor Measurement of intracellular calcium FLIPR CHO-K1 cells expressing the product of the gene encoded by the sequence of Figure 1 and the subunit a G16 protein are dissociated the day before the experiment and seeded

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(45000 cellules/puits) sous un volume de 100 jjl/puits dans des plaques de culture 96 puits (costar) noires à fond clair.  (45,000 cells / well) in a volume of 100 μl / well in culture plates 96 wells (costar) black brightfield.

Le jour de l'expérience, 100ill de kit calcium (Molecular Devices), 2,5mM final de probénécide et 10 mM final de tampon Hépès sont ajoutés dans chaque puits et les cellules sont incubées pendant 1 heure à 37 C. Les plaques de cellules sont ensuite placées dans un fluorimètre de type FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader). L'expérience est réalisée à température ambiante. Le temps d'exposition (0,4 sec) et l'intensité du laser (15 à 18 ampères) sont ajustés afin d'obtenir des valeurs basales de fluorescence entre 5000 et 10000 unités. La mesure de la fluorescence est effectuée sur toute la plaque toutes les secondes pendant les 60 premières secondes puis toutes les 6 secondes pendant 1 minute. On the day of the experiment, 100 μl of calcium kit (Molecular Devices), 2.5 μM final probenecid and 10 μM final Hepes buffer are added to each well and the cells are incubated for 1 hour at 37 ° C. The cell plates are then placed in a fluorimeter FLIPR type (Fluorometric Imaging Plate Reader). The experiment is carried out at room temperature. Exposure time (0.4 sec) and laser intensity (15 to 18 amperes) are adjusted to obtain basal fluorescence values between 5000 and 10000 units. The fluorescence measurement is performed on the entire plate every second for the first 60 seconds and then every 6 seconds for 1 minute.

Des ligands de différentes catégories, préalablement solubilisés et répartis à une concentration définie sur des plaques 96 puits, sont mis en contact avec les cellules.

Figure img00230001
Ligands of different categories, previously solubilized and distributed at a defined concentration on 96-well plates, are brought into contact with the cells.
Figure img00230001

1.1.

1 L'addition des produits à tester s'effectue en cours d'expérience à 10 secondes grâce à un dispositif de distribution comprenant 96 cônes noirs (50 1 d'une solution [x5] sont ajoutés dans chaque puits à la vitesse de 70 ul/sec et une hauteur de 200 ill). La réponse calcique se caractérise par une augmentation transitoire de la fluorescence immédiatement après l'addition des ligands actifs. Des solutions d'ATP 10 jM et de tampon HBSS sont incluses dans chaque plaque de ligands et servent respectivement de contrôle positif et négatif de la réponse calcique.1 The addition of the products to be tested is carried out during the experiment at 10 seconds by means of a dispensing device comprising 96 black cones (50 1 of a solution [x 5] are added to each well at a rate of 70 μl / sec and a height of 200 ill). The calcium response is characterized by a transient increase in fluorescence immediately after addition of the active ligands. 10 μM ATP and HBSS buffer solutions are included in each ligand plate and serve respectively as a positive and negative control of the calcium response.

Claims (46)

REVENDICATIONS 1. Séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G, caractérisée par la séquence suivante (SEQ ID NO 1) : 5'-ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGGTGGCTGTGCAGCTGTGCTACGCGAACGTGAAT GGGTCCTGTGTGAAAATCCCCTTCTCGCCGGGATCCCGGGTGATTCTGTACATAGTGTTTG GCTTTGGGGCTGTGCTGGCTGTGTTTGGAAACCTCCTGGTGATGATTTCAATCCTCCATTT CAAGCAGCTGCACTCTCCGACCAATTTTCTCGTTGCCTCTCTGGCCTGCGCTGATTTCTTG GTGGGTGTGACTGTGATGCCCTTCAGCATGGTCAGGACGGTGGAGAGCTGCTGGTATTTTG GGAGGAGTTTTTGTACTTTCCACACCTGCTGTGATGTGGCATTTTGTTACTCTTCTCTCTT TCACTTGTGCTTCATCTCCATCGACAGGTACATTGCGGTTACTGACCCCCTGGTCTATCCT ACCAAGTTCACCGTATCTGTGTCAGGAATTTGCATCAGCGTGTCCTGGATCCTGCCCCTCA TGTACAGCGGTGCTGTGTTCTACACAGGTGTCTATGACGATGGGCTGGAGGAATTATCTGA TGCCCTAAACTGTATAGGAGGTTGTCAGACCGTTGTAAATCAAAACTGGGTGTTGACAGAT TTTCTATCCTTCTTTATACCTACCTTTATTATGATAATTCTGTATGGTAACATATTTCTTG TGGCTAGACGACAGGCGAAAAAGATAGAAAATACTGGTAGCAAGACAGAATCATCCTCAGA GAGTTACAAAGCCAGAGTGGCCAGGAGAGAGAGAAAAGCAGCTAAAACCCTGGGGGTCACA GTGGTAGCATTTATGATTTCATGGTTACCATATAGCATTGATTCATTAATTGATGCCTTTA TGGGCTTTATAACCCCTGCCTGTATTTATGAGATTTGCTGTTGGTGTGCTTATTATAACTC AGCCATGAATCCTTTGATTTATGCTTTATTTTACCCATGGTTTAGGAAAGCAATAAAAGTT ATTGTAACTGGTCAGGTTTTAAAGAACAGTTCAGCAACCATGAATTTGTTTTCTGAACATA TATAA-3' 2. Séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence de la revendication 1 et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le récepteur codé par la séquence de la revendication 1. <Desc/Clms Page number 25> 3. Séquence d'acides nucléiques déduite selon le code génétique de la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO 2) :CLAIMS 1. A nucleic acid sequence encoding a G protein-coupled receptor, characterized by the following sequence (SEQ ID NO 1): 5'-ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGGTGGCTGTGCAGCTGTGCTACGCGAACGTGAAT GGGTCCTGTGTGAAAATCCCCTTCTCGCCGGGATCCCGGGTGATTCTGTACATAGTGTTTG GCTTTGGGGCTGTGCTGGCTGTGTTTGGAAACCTCCTGGTGATGATTTCAATCCTCCATTT CAAGCAGCTGCACTCTCCGACCAATTTTCTCGTTGCCTCTCTGGCCTGCGCTGATTTCTTG GTGGGTGTGACTGTGATGCCCTTCAGCATGGTCAGGACGGTGGAGAGCTGCTGGTATTTTG GGAGGAGTTTTTGTACTTTCCACACCTGCTGTGATGTGGCATTTTGTTACTCTTCTCTCTT TCACTTGTGCTTCATCTCCATCGACAGGTACATTGCGGTTACTGACCCCCTGGTCTATCCT ACCAAGTTCACCGTATCTGTGTCAGGAATTTGCATCAGCGTGTCCTGGATCCTGCCCCTCA TGTACAGCGGTGCTGTGTTCTACACAGGTGTCTATGACGATGGGCTGGAGGAATTATCTGA TGCCCTAAACTGTATAGGAGGTTGTCAGACCGTTGTAAATCAAAACTGGGTGTTGACAGAT TTTCTATCCTTCTTTATACCTACCTTTATTATGATAATTCTGTATGGTAACATATTTCTTG TGGCTAGACGACAGGCGAAAAAGATAGAAAATACTGGTAGCAAGACAGAATCATCCTCAGA GAGTTACAAAGCCAGAGTGGCCAGGAGAGAGAGAAAAGCAGCTAAAACCCTGGGGGTCACA GTGGTAGCATTTATGATTTCATGGTTACCATATAGCATTGAT TCATTAATTGATGCCTTTA TGGGCTTTATAACCCCTGCCTGTATTTATGAGATTTGCTGTTGGTGTGCTTATTATAACTC AGCCATGAATCCTTTGATTTATGCTTTATTTTACCCATGGTTTAGGAAAGCAATAAAAGTT ATTGTAACTGGTCAGGTTTTAAAGAACAGTTCAGCAACCATGAATTTGTTTTCTGAACATA TATAA-3 '2. A nucleic acid sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the sequence of claim 1 and encoding a polypeptide having substantially the same properties as the receptor encoded by the sequence of claim 1. <Desc / Clms Page number 25> 3. Nucleic acid sequence deduced according to the genetic code of the following amino acid sequence (SEQ ID NO 2): 5 10 15 Met Ser Ser Asn Ser Ser Leu Leu Val Ala Val Gln Leu Cys Tyr5 10 15 Ser Ser Ser Asn Ser Ser Leu Leu Val Leu Val Gln Leu Cys Tyr 20 25 30 Ala Asn Val Asn Gly Ser Cys Val Lys Ile Pro Phe Ser Pro Gly20 25 30 Ala Asn Val Asn Gly Ser Cys Val Lys Pro Island Phe Ser Pro Gly 35 40 45 Ser Arg Val Ile Leu Tyr Ile Val Phe Gly Phe Gly Ala Val Leu35 40 45 Ser Arg Val Ile Leu Tyr Val Phe Island Gly Phe Gly Ala Val Leu 50 55 60 Ala Val Phe Gly Asn Leu Leu Val Met Ile Ser Ile Leu His Phe50 55 60 Ala Val Phe Gly Asn Leu Leu Val Met Ile Ile Ile Leu His Phe 65 70 75 Lys Gln Leu His Ser Pro Thr Asn Phe Leu Val Ala Ser Leu Ala65 70 75 Lys Gln Leu His Ser Pro Asn Phe Leu Leu Val Ala Ser Leu Ala 80 85 90 Cys Ala Asp Phe Leu Val Gly Val Thr Val Met Pro Phe Ser Met80 85 90 Cys Ala Asp Phe Leu Val Val Gly Val Thr Met Met Pro Phe Ser Met 95 100 105 Val Arg Thr Val Glu Ser Cys Trp Tyr Phe Gly Arg Ser Phe Cys95 100 105 Val Arg Thr Val Glu Ser Cys Trp Tyr Phe Gly Arg Ser Phe Cys 110 115 120 Thr Phe His Thr Cys Cys Asp Val Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Leu110 115 120 Thr Phe His Thr Cys Cys Asp Val Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Leu 125 130 135 Phe His Leu Cys Phe Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Val Thr125 130 135 Phe His Leu Cys Phe Ser Island Asp Asp Arg Tyr Island Ala Val Thr 140 145 150 Asp Pro Leu Val Tyr Pro Thr Lys Phe Thr Val Ser Val Ser Gly140 145 150 Asp Pro Leu Val Tyr Pros Thr Lys Phe Thr Val Ser Val Ser Gly 155 160 165 Ile Cys Ile Ser Val Ser Trp Ile Leu Pro Leu Met Tyr Ser Gly155 160 165 Ile Cys Ile Ser Ser Val Ser Trp Ile Leu Leu Pro Met Tyr Ser Gly 170 175 180 Ala Val Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Asp Asp Gly Leu Glu Glu Leu170 175 180 Ala Val Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Asp Asp Gly Leu Glu Glu Leu 185 190 195 Ser Asp Ala Leu Asn Cys Ile Gly Gly Cys Gln Thr Val Val Asn185 190 195 Ser Asp Ala Leu Asn Cys Island Gly Gly Cys Gln Thr Val Val Asn 200 205 210 Gln Asn Trp Val Leu Thr Asp Phe Leu Ser Phe Phe Ile Pro Thr 200 205 210 Gln Asn Trp Val Leu Thr Asp Phe Leu Ser Phe Phe Pro Island Thr <Desc/Clms Page number 26> <Desc / Clms Page number 26> 215 220 225 Phe Ile Met Ile Ile Leu Tyr Gly Asn Ile Phe Leu Val Ala Arg215 220 225 Phe Ile Met Ile Ile Leu Tyr Gly Asn Ile Phe Leu Val Ala Arg 230 235 240 Arg Gln Ala Lys Lys Ile Glu Asn Thr Gly Ser Lys Thr Glu Ser230 235 240 Arg Gln Ala Lily Lys Glu Island Asn Thr Gly Ser Lys Thr Glu Ser 245 250 255 Ser Ser Glu Ser Tyr Lys Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Arg Lys245 250 255 Ser Ser Glu Ser Tyr Lys Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Arg Lys 260 265 270 Ala Ala Lys Thr Leu Gly Val Thr Val Val Ala Phe Met Ile Ser260 265 270 Ala Ala Lys Thr Leu Gly Thr Val Val Val Ala Phe Met Ser Island 275 280 285 Trp Leu Pro Tyr Ser Ile Asp Ser Leu Ile Asp Ala Phe Met Gly275 280 285 Trp Leu Pro Ser Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Ala Phe Met Gly 290 295 300 Phe Ile Thr Pro Ala Cys Ile Tyr Glu Ile Cys Cys Trp Cys Ala290 295 300 Phe Thr Island Pro Ala Cys Island Tyr Glu Island Cys Cys Trp Cys Ala 305 310 315 Tyr Tyr Asn Ser Ala Met Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Phe Tyr305 310 315 Tyr Tire Asn Ser Ala Met Asn Pro Leu Tyr Island Ala Leu Phe Tyr 320 325 330 Pro Trp Phe Arg Lys Ala Ile Lys Val Ile Val Thr Gly Gln Val320 325 330 Pro Trp Phe Arg Lys Ala Island Lys Val Island Val Thr Gly Gln Val 335 340 345 Leu Lys Asn Ser Ser Ala Thr Met Asn Leu Phe Ser Glu His Ile *** 4. Séquence d'acides nucléiques anti-sens capable d'inhiber l'expression d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acides nucléiques simple brin, capable de s'hybrider dans des conditions stringentes au brin codant de la séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3. 335 340 345 Leu Lys Asn Ser Ser Ala Thr Asn Met Leu Phe Ser Glu His Ile *** 4. Antisense nucleic acid sequence capable of inhibiting the expression of a nucleic acid sequence according to one of the following: claims 1 to 3, characterized in that it corresponds to a single-stranded nucleic acid sequence capable of hybridizing under stringent conditions to the coding strand of the nucleic acid sequence according to one of claims 1 to 3. 5. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Recombinant vector characterized in that it comprises a nucleic acid sequence according to one of claims 1 to 3. 6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide comprenant les séquences nécessaires à l'expression du récepteur couplé aux protéines G dans une cellule hôte. Recombinant vector according to claim 5, characterized in that the vector is a plasmid comprising the sequences necessary for the expression of the G-protein coupled receptor in a host cell. <Desc/Clms Page number 27> <Desc / Clms Page number 27> 7. Vecteur recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séquences nécessaires à l'expression du récepteur couplé aux protéines G comprennent une séquence du promoteur du cytomégalovirus (CMV) ou une séquence du promoteur Recombinant vector according to claim 6, characterized in that the sequences necessary for the expression of the G-protein coupled receptor comprise a cytomegalovirus (CMV) promoter sequence or a promoter sequence. SV40. SV40. 8. Plasmide pS3524 déposé à la CNCM le 13 juillet 2001 sous le n I-2702. 8. Plasmid pS3524 deposited at the CNCM on July 13, 2001 under number I-2702. 9. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par le vecteur recombinant selon l'une des revendications 5 à 8. 9. Host cell characterized in that it is transformed by the recombinant vector according to one of claims 5 to 8. 10. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une bactérie. 10. Host cell according to claim 9, characterized in that said host cell is a bacterium. Il. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule eucaryote. He. Host cell according to claim 9, characterized in that said host cell is a eukaryotic cell. 12. Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite cellule hôte provient d'une lignée CHO-K1 (American type culture collection, CCL61). 12. Host cell according to claim 11, characterized in that said host cell is from a CHO-K1 line (American type culture collection, CCL61). 13. Cellule hôte selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite cellule hôte exprime en plus la sous-unité a de la protéine G de manière stable ou transitoire. 13. Host cell according to claim 12, characterized in that said host cell further expresses the α-subunit of the G protein stably or transiently. 14. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3. 14. Polypeptide characterized in that it is encoded by a nucleic acid sequence according to one of claims 1 to 3. 15. Polypeptide selon la revendication 14 comportant la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO 2) : The polypeptide of claim 14 having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 2): 5 10 15 Met Ser Ser Asn Ser Ser Leu Leu Val Ala Val Gln Leu Cys Tyr 5 10 15 Ser Ser Ser Asn Ser Ser Leu Leu Val Leu Val Gln Leu Cys Tyr 20 25 30 Ala Asn Val Asn Gly Ser Cys Val Lys Ile Pro Phe Ser Pro Gly 20 25 30 Ala Asn Val Asn Gly Ser Cys Val Lys Pro Island Phe Ser Pro Gly 35 40 45 Ser Arg Val Ile Leu Tyr Ile Val Phe Gly Phe Gly Ala Val Leu 35 40 45 Ser Arg Val Ile Leu Tyr Val Phe Island Gly Phe Gly Ala Val Leu <Desc/Clms Page number 28> <Desc / Clms Page number 28> 50 55 60 Ala Val Phe Gly Asn Leu Leu Val Met Ile Ser Ile Leu His Phe 50 55 60 Ala Val Phe Gly Asn Leu Leu Val Met Ile Ile Ile Leu His Phe 65 70 75 Lys Gln Leu His Ser Pro Thr Asn Phe Leu Val Ala Ser Leu Ala 65 70 75 Lys Gln Leu His Ser Pro Asn Phe Leu Leu Val Ala Ser Leu Ala 80 85 90 Cys Ala Asp Phe Leu Val Gly Val Thr Val Met Pro Phe Ser Met 80 85 90 Cys Ala Asp Phe Leu Val Val Gly Val Thr Met Met Pro Phe Ser Met 95 100 105 Val Arg Thr Val Glu Ser Cys Trp Tyr Phe Gly Arg Ser Phe Cys 95 100 105 Val Arg Thr Val Glu Ser Cys Trp Tyr Phe Gly Arg Ser Phe Cys 110 115 120 Thr Phe His Thr Cys Cys Asp Val Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Leu 110 115 120 Thr Phe His Thr Cys Cys Asp Val Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Leu 125 130 135 Phe His Leu Cys Phe Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Val Thr 125 130 135 Phe His Leu Cys Phe Ser Island Asp Asp Arg Tyr Island Ala Val Thr 140 145 150 Asp Pro Leu Val Tyr Pro Thr Lys Phe Thr Val Ser Val Ser Gly 140 145 150 Asp Pro Leu Val Tyr Pros Thr Lys Phe Thr Val Ser Val Ser Gly 155 160 165 Ile Cys Ile Ser Val Ser Trp Ile Leu Pro Leu Met Tyr Ser Gly 155 160 165 Ile Cys Ile Ser Ser Val Ser Trp Ile Leu Leu Pro Met Tyr Ser Gly 170 175 180 Ala Val Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Asp Asp Gly Leu Glu Glu Leu 170 175 180 Ala Val Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Asp Asp Gly Leu Glu Glu Leu 185 190 195 Ser Asp Ala Leu Asn Cys Ile Gly Gly Cys Gln Thr Val Val Asn 185 190 195 Ser Asp Ala Leu Asn Cys Island Gly Gly Cys Gln Thr Val Val Asn 200 205 210 Gln Asn Trp Val Leu Thr Asp Phe Leu Ser Phe Phe Ile Pro Thr 200 205 210 Gln Asn Trp Val Leu Thr Asp Phe Leu Ser Phe Phe Pro Island Thr 215 220 225 Phe Ile Met Ile Ile Leu Tyr Gly Asn Ile Phe Leu Val Ala Arg 215 220 225 Phe Ile Met Ile Ile Leu Tyr Gly Asn Ile Phe Leu Val Ala Arg 230 235 240 Arg Gln Ala Lys Lys Ile Glu Asn Thr Gly Ser Lys Thr Glu Ser 230 235 240 Arg Gln Ala Lily Lys Glu Island Asn Thr Gly Ser Lys Thr Glu Ser 245 250 255 Ser Ser Glu Ser Tyr Lys Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Arg Lys 245 250 255 Ser Ser Glu Ser Tyr Lys Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Arg Lys 260 265 270 Ala Ala Lys Thr Leu Gly Val Thr Val Val Ala Phe Met Ile Ser 260 265 270 Ala Ala Lys Thr Leu Gly Thr Val Val Val Ala Phe Met Ser Island 275 280 285 Trp Leu Pro Tyr Ser Ile Asp Ser Leu Ile Asp Ala Phe Met Gly 275 280 285 Trp Leu Pro Ser Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Ala Phe Met Gly <Desc/Clms Page number 29> <Desc / Clms Page number 29> 290 295 300 Phe Ile Thr Pro Ala Cys Ile Tyr Glu Ile Cys Cys Trp Cys Ala290 295 300 Phe Thr Island Pro Ala Cys Island Tyr Glu Island Cys Cys Trp Cys Ala 305 310 315 Tyr Tyr Asn Ser Ala Met Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Phe Tyr305 310 315 Tyr Tire Asn Ser Ala Met Asn Pro Leu Tyr Island Ala Leu Phe Tyr 320 325 330 Pro Trp Phe Arg Lys Ala Ile Lys Val Ile Val Thr Gly Gln Val320 325 330 Pro Trp Phe Arg Lys Ala Island Lys Val Island Val Thr Gly Gln Val 335 340 345 Leu Lys Asn Ser Ser Ala Thr Met Asn Leu Phe Ser Glu His Ile *** 16. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15 et en ce qu'il présente une activité de récepteur couplé aux protéines G. 335 340 345 Leu Lys Asn Ser Ser Ala Thr Met Asn Leu Phe Ser Glu His Ile *** 16. Polypeptide characterized in that it corresponds to a fragment of a polypeptide according to one of claims 14 or 15 and in that that it exhibits a G-protein coupled receptor activity. 17. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15, et en ce qu'il est capable de stimuler directement les protéines G. 17. A polypeptide characterized in that it corresponds to a fragment of a polypeptide according to one of claims 14 or 15, and in that it is capable of directly stimulating G proteins. 18. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15, et en ce qu'il est capable d'inhiber l'action d'un agoniste. 18. Polypeptide characterized in that it corresponds to a fragment of a polypeptide according to one of claims 14 or 15, and in that it is capable of inhibiting the action of an agonist. 19. Amorces pour l'amplification d'une séquence codant un polypeptide selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisées en ce qu'elles comprennent les séquences suivantes : 19. Primers for the amplification of a sequence encoding a polypeptide according to one of claims 14 to 16, characterized in that they comprise the following sequences: 5'-ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3' ATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG 5'-3 ' 5'-TATATGTTCAGAAAACAAATTCATGGTTGCTG-3' 20. Sonde d'hybridation pour la reconnaissance spécifique des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à un fragment d'une 5'-TATATGTTCAGAAAACAAATTCATGGTTGCTG-3 '20. Hybridization probe for the specific recognition of nucleic acid sequences encoding a G protein-coupled receptor according to one of claims 1 or 3, characterized in that it corresponds to a fragment a <Desc/Clms Page number 30><Desc / Clms Page number 30> longueur d'au moins 50 nucléotides, de préférence entre 150 et 250 nucléotides, d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 ou 3.  length of at least 50 nucleotides, preferably between 150 and 250 nucleotides, of a nucleic acid sequence according to one of claims 1 or 3. 21. Anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé : soit contre un polypeptide codé par une séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ; - soit contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 14 à 18. 21. Antibody characterized in that it is directed either against a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 3; or against a polypeptide according to any one of claims 14 to 18. 22. Anticorps selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps monoclonal. 22. Antibody according to claim 21, characterized in that it is a monoclonal antibody. 23. Procédé d'identification de la présence de molécules agonistes du récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 6,7 ou 8 ; b. la mise en contact des cellules hôte en culture avec un composé candidat ; c. la détermination d'un signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence du composé candidat. 23. A method for identifying the presence of agonist molecules of the G-protein coupled receptor, characterized in that it comprises the following steps: a. culturing eukaryotic host cells transformed with a recombinant vector according to one of claims 6, 7 or 8; b. contacting the cultured host cells with a candidate compound; c. determining a possible signal generated by the G-protein coupled receptor in the presence of the candidate compound. 24. Procédé de criblage d'un agoniste d'un récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôte selon la revendication 13 en présence ou en absence d'une ou de plusieurs molécules à cribler ; b. la quantification de la concentration en calcium intracellulaire dans les cellules en culture en présence et en absence des molécules à cribler ; c. la sélection des molécules en présence desquelles la concentration en calcium intracellulaire est augmentée. 24. A method for screening an agonist of a G protein-coupled receptor, characterized in that it comprises the following steps: a. the host cell culture of claim 13 in the presence or absence of one or more molecules to be screened; b. quantifying the intracellular calcium concentration in cells in culture in the presence and absence of the molecules to be screened; c. the selection of molecules in the presence of which the concentration of intracellular calcium is increased. 25. Procédé d'identification de la présence de molécules antagonistes comprenant les étapes suivantes : 25. A method for identifying the presence of antagonistic molecules comprising the following steps: <Desc/Clms Page number 31><Desc / Clms Page number 31> a. la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 5 à 8 dans des conditions permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G en présence d'un agoniste ; b. la mise en contact des cellules hôtes en culture avec un composé candidat ; c. la détermination d'une diminution du signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence du composé candidat et de l'agoniste par rapport au signal généré avec l'agoniste seul.  at. culturing eukaryotic host cells transformed with a recombinant vector according to one of claims 5 to 8 under conditions permitting the expression of the G-protein coupled receptor in the presence of an agonist; b. contacting the cultured host cells with a candidate compound; c. determining a decrease in the potential signal generated by the G-protein coupled receptor in the presence of the candidate compound and the agonist relative to the signal generated with the agonist alone. 26. Procédé d'identification de formes alléliques pathologiques d'un gène codant un récepteur couplé aux protéines G, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. l'isolement d'une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'une des revendications 1 ou 3 à partir d'acides nucléiques totaux (ARN ou ADN) issus de patients atteints d'une pathologie et de sujets sains ; b. le séquençage des acides nucléiques isolés en a) ; c. la détection d'une ou plusieurs mutation (s) commune (s) aux acides nucléiques issus des patients atteints d'une pathologie, la ou lesdite (s) mutation (s) n'étant pas présente (s) sur les acides nucléiques issus des sujets sains. 26. A method of identifying pathological allelic forms of a gene encoding a G-protein coupled receptor, said method comprising the steps of: a. the isolation of a nucleic acid sequence encoding a G protein-coupled receptor according to one of claims 1 or 3 from total nucleic acids (RNA or DNA) derived from patients with a pathology and subjects healthy; b. sequencing isolated nucleic acids in a); c. detecting one or more mutations common to nucleic acids derived from patients suffering from a pathology, the said mutation (s) not being present (s) on the nucleic acids derived from healthy subjects. 27. Procédé d'identification de séquences homologues de la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 1 dans une autre espèce comprenant les étapes suivantes : a. l'incubation dans des conditions stringentes d'une sonde d'hybridation selon la revendication 20 avec de l'ADN génomique ou des extraits d'ARN totaux d'espèces de mammifère non-humain ; b. la détection d'une réaction d'hybridation ; A method of identifying sequences homologous to the nucleic acid sequence of claim 1 in another species comprising the steps of: a. incubating under stringent conditions a hybridization probe according to claim 20 with genomic DNA or total RNA extracts of non-human mammalian species; b. detecting a hybridization reaction; <Desc/Clms Page number 32><Desc / Clms Page number 32> c. l'isolement de la séquence d'acides nucléiques homologue à partir de l'ADN génomique des espèces pour lesquelles une réaction d'hybridation a été détectée.  c. isolating the homologous nucleic acid sequence from the genomic DNA of species for which a hybridization reaction has been detected. 28. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3 pour le criblage d'un agoniste d'un récepteur couplé à la protéine G. 28. Use of a nucleic acid sequence according to one of claims 1 to 3 for the screening of an agonist of a G protein-coupled receptor. 29. Utilisation des cellules hôte selon la revendication 13 pour le criblage d'un agoniste d'un récepteur couplé aux protéines G. 29. Use of the host cells according to claim 13 for the screening of an agonist of a G protein-coupled receptor. 30. Kit pour le diagnostic, le pronostic ou le suivi thérapeutique de patients présentant, ou susceptibles de présenter, une pathologie liée à une surexpression ou une sous- expression de la séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend : 30. Kit for the diagnosis, prognosis or therapeutic monitoring of patients presenting or likely to present a pathology related to overexpression or under-expression of the nucleic acid sequence according to one of claims 1 to 3, characterized in that it comprises:
Figure img00320001
Figure img00320001
soit des amorces selon la revendication 19 ; soit une sonde selon la revendication 20.  either primers according to claim 19; a probe according to claim 20. 31. Puce à ADN contenant des séquences selon l'une des revendications 1 à 3. 31. DNA chip containing sequences according to one of claims 1 to 3. 32. Kit pour la détection d'une structure anormale du récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend : 32. Kit for the detection of an abnormal structure of the G-protein coupled receptor, characterized in that it comprises:
Figure img00320002
Figure img00320002
soit des anticorps selon l'une des revendications 21 ou 22 ; soit des polypeptides selon l'une des revendications 14 à 18. 33. Puce à protéine contenant un anticorps selon l'une des revendications 21 ou 22 ou un polypeptide selon l'une des revendications 14 à 18. either antibodies according to one of claims 21 or 22; or polypeptides according to one of claims 14 to 18. 33. Protein chip containing an antibody according to one of claims 21 or 22 or a polypeptide according to one of claims 14 to 18.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2001036473A2 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Pharmacia & Upjohn Company Human g protein-coupled receptors

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BOROWSKY B ET AL: "Trace amines: Identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 98, no. 16, 31 July 2001 (2001-07-31), pages 8966 - 8971, XP002185201, ISSN: 0027-8424 *
DATABASE EMBL [online] 6 July 2001 (2001-07-06), BOROWSKY B. ET AL: "Homo sapiens trace amine receptor 4 (TA4) gene, complete cds.", XP002198912, retrieved from EBI Database accession no. AF380192 *

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