FR2808526A1 - Nouveaux polypeptides constituants de recepteurs de pheromones chez le rat, leur clonage et leur application - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à des nouveaux polypeptides constituants de récepteurs de phéromones chez le rat, leur clonage et au séquençage des gènes codant pour ces polypeptides ainsi qu'à leur utilisation.La présente invention concerne des nouveaux polypeptides constituants de récepteurs de phéromones chez le rat, ainsi que les gènes codant ces polypeptides. L'invention se rapporte aussi à l'utilisation de ces polypeptides pour la détection d'arômes, le contrôle de qualité, l'analyse d'échantillons, l'analyse ou la comparaison de parfums, la détection de substances toxiques, ou le piégeage d'odeurs.

Description

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NOUVEAUX POLYPEPTIDES CONSTITUANTS DE RECEPTEURS DE PHÉROMONES CHEZ LE RAT, LEUR CLONAGE ET LEUR APPLICATION.

La présente invention se rapporte à des nouveaux polypeptides constituants de récepteurs de phéromones chez le rat, à leur clonage et au séquençage des gènes codant pour ces polypeptides ainsi qu'à leur utilisation.

Chez les mammifères, l'organe voméronasal (OVN) est l'un des organes du système olfactif. Cette structure paire, tubulaire, située à la base du septum nasal, en avant de l'épithélium olfactif, détecte des signaux chimiques appelés phéromones. Ces phéromones, synthétisées et libérées par un animal, procurent aux autres individus de la même espèce des informations sur son genre, son statut de dominance et de reproduction, entraînant des modifications considérables des comportements sexuels et sociaux ainsi que des fonctions neuro-endocrines (Halpern 1987; Wysocki 1989).

L'OVN est constitué d'un épithélium sensoriel, dont les neurones projettent leur axone dans une région spécifique du bulbe olfactif, le bulbe olfactif accessoire.

Celui-ci est ensuite connecté via l'amygdale à certains noyaux de l'hypothalamus qui déclenchent le programme stéréotypé de comportements sexuels et sociaux et des sécrétions hormonales caractéristiques de la réponse aux phéromones. Dans l'état actuel des connaissances, il semble

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que ce circuit neuronal ait la particularité de ne pas être connecté à une quelconque zone cognitive du cerveau.

De récentes recherches en biologie moléculaire ont permis la caractérisation de deux grandes familles de récepteurs de phéromones couplés à une protéine G, les VlRs (Dulac et Axel, 1995 chez le rat ; et al., 1998, chez la souris) et les V2Rs (Herrada et Dulac, 1997 chez le rat ; Matsunami et Buck, 1997 chez la souris ; Ryba et Tirindelli, 1997 chez le rat et la souris) probablement impliqués dans la détection des phéromones.

Une quarantaine de récepteurs putatifs de phéromones appartenant aux deux classes V1R et V2R ont été clonés chez les mammifères.

La demande de brevet international WO 9714790 décrit les séquences nucléotidiques de sept récepteurs putatifs de phéromones de rat, VN1, VN2, VN3, VN4, VN5, VN6 et VN7, ainsi que les correspondances séquences peptidiques.

La présente invention se rapporte à des nouvelles séquences nucléotidiques partielles codant pour des polypeptides constituants de récepteurs de phéromones chez le rat et représentées sur la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No : 1 à SEQ ID No : 33 ainsi qu'aux dérivés de ses séquences. On entend par dérivé des séquences ci-dessus, des séquences capables de s'hybrider avec celles-ci dans des conditions d'hybridation

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standard. Ces séquences dérivés codant pour des séquences polypeptidiques selon l'invention.

L'invention concerne également le clonage de nouveaux polypeptides constituants de récepteurs de phéromones appartenant à la classe V1Rs chez le rat.

La comparaison des séquences peptidiques déduites par traduction directe à partir des nouvelles séquences nucléotidiques partielles de l'invention, avec les séquences protéiques des banques de données du NCBI, en utilisant le programme BLAST fait apparaître une forte similarité entre lesdites séquences et des séquences peptidiques de récepteurs d'odeurs précédemment rapportées. Cette comparaison les classe sans ambiguïté dans la même superfamille de récepteurs à sept domaines transmembranaires.

L'invention concerne donc plus particulièrement un polypeptide purifié constitué par ou comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi celles représentées sur la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No : 34, à SEQ ID No : ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celles-ci. On entend par dérivé équivalent de ces séquences, les séquences comprenant une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés mais conservant environ 75% et de préférence au moins 95% d'homologie avec la séquence dont elle est dérivée. Les polypeptides constituants de protéines constituant des récepteurs de phéromones de

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l'invention présentent des régions très conservées et des régions très hétérogènes. On considère que les régions très conservées sont celles conférant à la protéine son caractère de récepteur, alors que les régions très hétérogènes sont celles qui confèrent à chaque récepteur sa spécificité. Ainsi, selon l'application envisagée, il est possible de préparer des dérivés des polypeptides constituants des récepteurs de l'invention dont la spécificité est modifiée mais qui restent dans le cadre de la présente invention.

L'invention a également pour objet les anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins un polypeptide de l'invention, un dérivé ou un fragment de ceux-ci. Ces anticorps peuvent être préparés par les méthodes décrites dans la littérature. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection des protéines, extraites à partir d'épithélium ou produite par transformation génétique d'un hôte, à des animaux, puis récupération des antisérums et des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité. Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rates d'animaux préalablement immunisés à l'aide des récepteurs de l'invention. Ces anticorps sont utiles pour rechercher de nouveaux récepteurs de phéromones ou les homologues de ces récepteurs chez d'autres mammifères ou encore pour étudier la parenté entre des récepteurs de différents individus ou espèces.

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L'invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour un polypeptide tel que défini précédemment.

Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence choisie parmi celles représentées sur la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No : à SEQ ID No : lesquelles codent pour des polypeptides constituants de récepteurs dont les séquences en acides aminés sont représentées sur la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No : 34 à SEQ ID No : 67.

L'invention concerne, bien entendu, aussi les séquences nucléotidiques dérivées des séquences SEQ ID No : 34 à SEQ ID No : 67 ci-dessus, par exemple du fait de la dégénérescence du code génétique, et qui codent pour des polypeptides appartenant à des protéines présentant des caractéristiques et propriétés de récepteurs de phéromones.

L'invention concerne également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptées, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'un polypeptide de l'invention ou d'un fragment de celui-ci. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des polypeptides de l'invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.

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A titre d'exemple, un procédé de production d'un polypeptide selon l'invention consiste : - à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production du polypeptide constituant du récepteur, - à isoler, par tout moyen approprié lesdits polypeptides.

A titre d'exemple, un procédé d'expression d'un polypeptide selon l'invention consiste : - à transférer une molécule d' acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression desdites polypeptides à la surface de l'hôte.

L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.

L'expression dans des cellules eucaryotes est préférable pour que les polypeptides constituants de récepteurs de phéromones puissent subir les modifications post-transductionnelles nécessaires à leur fonction.

Une molécule d'acide nucléique codant pour un polypeptide ou un vecteur selon l'invention peuvent aussi

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être utilisés pour transformer des animaux et établir une lignée d'animaux transgéniques.

Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré ; peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide.

L'invention concerne donc aussi les hôtes cellulaires exprimant des polypeptides obtenus conformément aux procédés précédents.

L'invention concerne également les sondes nucléiques et oligonucléotides préparés à partir des molécules d'acide nucléique de l'invention.

Ces sondes, avantageusement marquées, sont utiles pour la détection par hybridation de séquences similaires de récepteurs de phéromones chez d'autres individus ou espèces. Le marqueur utilisé est, de préférence, choisi parmi un marqueur enzymatique, un marqueur radioactif, un marqueur fluorescent ou un marqueur colorimétrique. Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique.

Différentes techniques d'hybridation peuvent être mises en #uvre telles que l'hybridation sur taches (Dot-blot) ou l'hybridation sur répliques (technique de Southern et de Northern) ou autres techniques telles que les biopuces à ADN. De préférence, l'hybridation s'effectue sur un support de silicium. De telles sondes constituent des outils permettant de détecter rapidement des séquences similaires dans les gènes codant pour des récepteurs de phéromones ce qui permet d'étudier la présence, l'origine et la conservation de ces protéines.

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Les oligonucléotides sont utiles pour des expériences de PCR par exemple pour rechercher des gènes dans d'autres espèces ou dans un but de diagnostic.

La présente invention concerne ainsi l'utilisation desdites séquences pour la conception de biocapteurs. Les récepteurs de phéromones sont des protéines à sept domaines transmembranaires couplées aux protéines G. La fixation d'un ligand sur le récepteur entraîne un changement de conformation du récepteur et, à l'intérieur de la cellule, ce signal est transduit par l'intermédiaire de seconds messagers. En conséquence, l'invention a pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de constituer des ligands agonistes ou antagonistes des récepteurs décrits précédemment consistant à mettre en contact un composé et un ou plusieurs desdits polypeptides constituants des récepteurs de phéromones et à mesurer par tout moyen approprié l'affinité entre ledit composé et ledit polypeptide.

La mise en contact entre le composé à tester et le ou les polypeptides de l'invention peut être réalisée soit en utilisant directement les polypeptides de l'invention, soit des hôtes décrits précédemment et exprimant à leur surface au moins l'un desdits polypeptides. Dans ce dernier cas, il peut s'agir d'une lignée de cellules immortalisées olfactives ou non, transfectée par un vecteur portant l'ADNc permettant d'exprimer à sa surface et à un niveau élevé un polypeptide constituant d'un récepteur de phéromones recombinant fonctionnel. Si le composé testé constitue un ligand, agoniste ou antagoniste, sa mise en contact avec des

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cellules transformées, induit des signaux intracellulaires qui découlent de la fixation dudit composé sur le récepteur.

Cette mise en contact des composés à tester avec les polypeptides de l'invention peut être réalisée en fixant par tout moyen un ou plusieurs polypeptides, ou un ou plusieurs hôtes sur un support. Ce support peut être souple ou rigide, poreux ou non poreux. Parmi les supports susceptibles d'être utilisés, peuvent être cités les membranes constituées de polymères tels que le fluorure de polyvinylidène (PVDF), le nylon@ ou le chlorure de polyvinyle (PVC), de nitrocellulose, de fibres de verre, de verre, de silicium ou ses équivalents, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Dans un tel système, il est possible de visualiser en temps réel des interactions entre le composé testé et le récepteur. L'un des partenaires du couple récepteur/ligand est fixé sur une interface qui peut contenir une matrice recouverte de chaînes aliphatiques. Cette matrice hydrophobe peut être facilement recouverte d'une couche lipidique par fusion spontanée de liposomes injectés à son contact. Des polypeptides constituants des récepteurs de phéromones insérés dans des liposomes ou des vésicules peuvent ainsi être intégrés à des biocapteurs.

Les ligands sont ainsi analysés vis-à-vis d'un ou plusieurs polypeptides constituants de récepteurs de phéromones différents.

Selon un mode de réalisation préféré l'invention se rapporte à des systèmes de détection de

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phéromones ayant une sensibilité et une spécificité accrues permettant de résoudre les inconvénients liés aux détecteurs physico-chimiques actuellement disponibles lesquels se sont révélés peu fiables et sont limités à quelques molécules.

Selon un autre mode de réalisation préféré, l'invention met en oeuvre des polypeptides associés à des membranes artificielles comprenant des cellules transfectées avec une ou plusieurs séquences de l'invention choisies parmi SEQ ID No : 1 à SEQ ID No : 33. Lesdits polypeptides sont utilisés dans différents biocapteurs disposés en parallèle, chaque biocapteur possédant un polypeptide constituant d'un type particulier de récepteur.

Selon un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à un ensemble de biocapteurs distincts, du type capteur bioélectronique, dont la gestion est assurée par un logiciel de réseaux de neurones formels pour former un système de détection de type "nez électronique".

Les méthodes ci-dessus permettent de déterminer si un composé active ou inhibe les récepteurs. Dans ce mode de réalisation, il est avantageux de disposer d'un ligand connu qui permet des mesures par compétition.

L'invention se rapporte donc aussi à un composé non encore connu constituant un ligand d'un récepteur de phéromones, identifié et sélectionné par le procédé cidessus.

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Les méthodes ci-dessus permettent de - détecter des molécules volatiles (odeurs, parfums, arômes, résidus industriels) - contrôler des populations de ravageurs.

- contrôler l'alimentation.

- détecter des drogues.

- détecter des polluants dans l'atmosphère et les liquides.

- identifier des humains.

- développer des parfums.

- identifier des molécules déclenchant l'appétit, la fuite, l'attraction ainsi que divers comportements humains et animaux.

- accélérer ou réduire la fertilité.

Les récepteurs de l'invention trouvent des applications dans des domaines très variés comme : - L'industrie agroalimentaire, pour la détection d'arômes, le contrôle de qualité, l'analyse d'échantillons.

- La parfumerie, pour l'analyse ou la comparaison de parfums.

- L'environnement, pour la détection de substances toxiques, comme des gaz ou le piégeage d'odeurs.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'identification et le clonage de ces nouveaux récepteurs de phéromones de rat.

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1 - Clonage des récepteurs.

Des ARN messagers ont été extraits d'organes voméronasaux (OVN) d'un mâle et d'une femelle. Ils ont été convertis en leur ADN complémentaire (ADNc), par transcription inverse.

Les fragments d'ADNc ainsi obtenus ont été copiés et amplifiés par une réaction en chaîne avec une polymérase (Polymerase chain reaction, PCR), en utilisant des amorces dégénérées synthétisées à partir de régions conservées des récepteurs de phéromones de la classes VlRs.

Ces fragments ont été ensuite clonés dans des bactéries puis séquencés.

Les étapes expérimentales ayant conduit à l'isolement et le clonage des récepteurs sont les suivantes
1- Les organes voméronasaux (OVN) sont disséqués et homogénéisés à -80 C.

2- Les ARN messager (ARNm) poly A des OVN sont isolées au moyen d'une trousse Micro-fast Track commercialisée par Invitrogen
3- Le dosage desdits ARNm est effectué au moyen d'une trousse DNA Dipstick commercialisée par Invitrogen.

4- La reaction de transcription inverse (RT) est effectué au moyen d'une trousse cDNA Cycle@ commercialisée par Invitrogen et est suivie d'une extraction phénolique.

5- L'amplification des fragments ainsi obtenus est effectuée par une réaction PCR. Les amorces utilisées pour la PCR sont des oligonucléotides dégénérés construits

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à partir de la boucle intracellulaire i2 et du domaine transmembranaire VII.

Les amorces utilisées sont les suivantes : - Amorce sens Dl : TCC TGT TTA (G/A)CA A(A/C)(G/A) T(T/A)(CT) AAA (C/T)AT - Amorce antisens F1 : AAC A(C/G) (A/C) AA(A/T) G(G/A)G CT (G/T) A(C/T/G)(T/A/G) GT(G/A) GCA TA
La réaction PCR a été effectuée au moyen d'un thermocycleur (Hybaid#, Omnigene, USA) selon le programme de cycles suivant : cycle à 94 C pendant 90 sec ; cycles à 94 C pendant 20 sec, 50 C pendant 25 sec, et 72 C pendant 90 sec ; etun cycle à 72 C pendant 120 sec.

6- Un volume de 5 1 du produit issu de la réaction PCR est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 2% et les bandes d'ADNc sont visualisées sous lampe U. V. Lorsque le résultat est positif, une électrophorèse préparative sur gel d'agarose 2% est ensuite réalisée avec la totalité, 45 1, du produit restant issu de la reaction PCR. Les portions du gel contenant les fragments ayant la longueur attendue sont découpées sous lampe U. V de faible énergie.

7- Les fragments ainsi identifiés sont extraits, puis purifiés au moyen d'une trousse Hybaid Recovery Gel Extraction.

8- Les fragments sont ensuite ligaturés dans le vecteur T pMOSBlue. Lors de la réaction PCR, la polymérase utilisée ajoute un résidu adénine à l'extrémité 3' des produits de PCR. Le vecteur T pMOSBlue utilisé possède deux extrémités adhésives thymidine pour faciliter la ligature de l'ADNc.

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9- Les fragments ligaturés sont ensuite soumis à une transformation bactérienne.

10- La culture et sélection des colonies est effectuée dans un milieu de culture Luria-Bertani (LB) auquel on ajoute de l'ampicilline 0,2g/l, de l'Xgal 26ug/ml, de l'IPTG 260ug/ml.

11- La vérification de la présence des fragments est effectuée au moyen d'une réaction PCR sur les colonies, en utilisant des amorces T7 et U19 qui s'hybrident sur le vecteur de chaque côté de l'insert.

Le programme de cycles appliqué dans cette étape est le suivant : 1 cycle à 94 C pendant 270 sec ; cycles à 94 C pendant 30 sec, 480C pendant 30 sec, et 72 C pendant 50 sec ; 1 cycle à 72 C pendant 120 sec.

Une fois la réaction PCR achevée, une analyse par électrophorèse permet de vérifier la présence ou pas du fragment de taille attendue dans les clones de bactéries.

Les clones positifs sont repiqués sur des boîtes de pétri contenant un milieu de culture LB et de l'ampicilline 0,lg/l .

12- Les fragments contenus dans les plasmides sélectionnés sont ensuite extraits et purifiés avec une trousse Wizard Dipstick.

13- Lesdits fragments purifiés sont soumis à un séquençage automatique par fluorescence selon la méthode de Sanger .

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2 - Identification des séquences partielles.

Trente trois séquences partielles de récepteurs de phéromones différents ont été clonées et séquencées à partir d'organes voméronasaux (OVN) de femelle et de mâle de rat Rattus norvegicus (WISTAR). Parmi celles-ci, vingttrois nommées Fl, F4, F5, F6, F9, F10, Fil, F14, F15, F17, F19, F21, F22, F23, F24, F25, F26, F28, F30, F31, F32, F33 et F36 ont été clonées chez la femelle et neuf, nommées Ml, M2, M6, M7, Mil, M12, M14, M16, et M18 ont été clonées chez le mâle. La trente troisième séquence a été trouvée identique chez le mâle et la femelle, il s'agit des séquences nommées M17 et F3.

Le Tableau I ci-dessous indique le pourcentage d'identité entre les séquences en acides aminés des récepteurs putatifs de phéromones clonés chez la femelle (F1 à F36) et chez le mâle (Ml à M18).

Les calculs ont été effectués avec le logiciel CLUSTALW 1.6
La séquence partielle M17 chez le mâle est identique à la séquence partielle F3 chez la femelle, comme le montre le Tableau I. Par conséquent, elles sont toutes les deux identifiées sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2.

L'invention porte donc sur trente-trois séquences partielles nouvelles différentes, identifiées par les numéros SEQ ID No : 1 à SEQ ID No : 33.

Ces trente-trois séquences partielles nouvelles ont été caractérisées et correspondent à des récepteurs de phéromones appartenant à la superfamille des récepteurs à sept domaines transmembranaires.

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La séquence nucléotidique M14 identifiée sur la liste de séquences en annexe avec le numéro SEQ ID No : 31 possède un codon stop (TAA) en position 103-105. Sa traduction directe conduit à deux séquences peptidiques. La première séquence peptidique, comprenant 34 acides aminés, correspond à la traduction des nucléotides occupant les positions 1 à 102 et est identifiée sous le numéro SEQ ID No : 64 sur la liste de séquences en annexe.

La seconde séquence peptidique, comprenant 135 acides aminés, correspond à la traduction des nucléotides occupant les positions allant de 105 à 512 et est identifiée sous le numéro SEQ ID No : 65 sur la liste de séquences en annexe.

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Séquences M1 M2 M6 M7 M11 M12 M14 M16 M17 M18 identifiées (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID No:25) No:26) No:27) No:28) No:29) No:30) No:31) No :32) No :2) No:33) fl 52 53 54 54 48 55 54 48 99 98 ab leau 1 (SEQ ID No:1) F3 52 54 53 54 49 55 54 48 100 98 (SEQ ID No:2) F4 52 53 54 54 48 54 53 47 98 97 (SEQ ID No:3) F5 98 64 63 61 88 60 99 60 52 51 (SEQ ID No :4) F6 82 60 59 57 76 57 82 54 54 52 (SEQ ID F9 No:5) 61 84 85 99 57 97 58 77 54 53 (SEQ ID No:6) F10 Nô :7) 52 54 54 54 49 55 54 47 98 98 F11 52 54 54 54 48 54 53 47 98 97 (SEQ ID No:8) F14 59 81 82 87 54 88 57 75 52 51 (SEQ ID No:9) F15 97 63 62 60 87 60 97 59 51 50 (SEQ ID No:10) F17 51 52 52 52 47 53 54 48 98 97 (SEQ ID No: 11) F19 99 65 64 62 89 60 98 58 52 50 (SEQ ID No:12) F21 52 53 52 54 48 53 54 49 97 98 (SEQ ID No:13) F22 53 54 54 55 49 54 54 48 99 97 (SEQ ID No:14) F23 51 52 53 53 48 55 54 47 98 98 (SEQ ID No:15) F24 16) 52 53 52 54 48 53 53 48 98 97 (SEQ ID No:16)

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Séquences M1 M2 M6 M7 Mil M12 M14 M16 M17 M18 identifiées (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID No :25) No :26) No :27) No :28) No :29) No :30) No:31) No:32) No :2) No :33) F25 52 54 54 54 49 55 54 47 98 97 ( SEQ ID No:17) F26 60 83 84 97 56 98 57 77 54 54 (SEQ ID No:18) F28 51 52 53 53 47 55 54 48 98 99 (SEQ ID No:19) Sl F30 64 99 98 84 59 82 61 93 53 52 ' (SEQ ID No:20) ce F31 82 60 60 58 77 57 82 55 54 52 (SEQ ID No:21) F32 65 94 95 85 56 85 43 93 48 48 (SEQ ID No:22) F33 52 53 54 54 48 54 54 48 97 98 (SEQ ID No:23) F36 57 81 81 79 53 79 55 75 51 50 (SEQ ID No:24) 79" 55~

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Claims (1)

1. LISTE DE SEQUENCES <110> Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS <120> Nouveaux récepteurs de phéromones de rat, leur clonage et leurs utilisations <130> C009-7413FR <140> FR2000xxxxxx <141> 2000-05-03 <160> 67 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc feature <222> (1)..(512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   Séquence partielle F1.

   <400> 1 tcctgtttag caaagttcaa atataaatcc acacagcaca gcctgtgttc ccttcttgtg 60 ctctgggcct tctacatgtc ctgtggtact cactactcct tcaccatcgt tgctgactac 120 aacttctctt cacgcagtct catatttgtc actgaatcct gcattatttt acccatggat 180 tacatcacca ggcatttatt tttcatattg gggatatttc gggatgtgtc cttcataggt 240 ctcatggccc tctccagcgg gtacatggtg gccctcttgt gcagacacag gaaacaggcc 300 cagcatcttc acaggaccag cctttctcca aaagcatccc cagagcaaag ggccaccagg 360 accatcctgt tgctcatgag cttctttgtg ttgatgtact gcttggactg caccatatcc 420 gcctccagac ttatgcacaa cggtgaacca atccaccaca gtattcagat gatggtctcc 480 aatagctatg ccaccctcag cccttttctg tt 512 <210> 2 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc feature <222> (1)..(512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   <Desc/Clms Page number 21>

   Séquence partielle F3.

   <400> 2 tcctgtttag caaagtttaa acataaatcc acacagcaca gcctgtgttc ccttcttgtg 60 ctctgggcct tctacatgtc ctgtggtact cactactcct tcaccatcgt tgctgactac 120 aacttctctt cacgcagtct catatttgtc actgaatcct gcattatttt acccatggat 180 tacatcacca ggcatttatt tttcatattg gggatatttc gggatgtgtc cttcataggt 240 ctcatggccc tctccagcgg gtacatggtg gccctcttgt gcagacacag gaaacaggcc 300 cagcatcttc acaggaccag cctttctcca aaagcatccc cagagcaaag ggccaccagg 360 accatcctgt tgctcatgag cttctttgtg ttgatgtact gcttggactg caccatatcc 420 gcctccagac ttatgcacaa cggtgaacca atccaccaca gtattcagat gatggtctcc 480 aatagctatg ccaccctcag cccttttctg tt 512 <210> 3 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc feature <222> (1)..(512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   Séquence partielle F4.

   <400> 3 tcctgtttag caaagttcaa atataaatcc acacagcaca gcctgtgttc ccttcttgtg 60 ctctgggcct tctacatgtc ctgtggtact cactactcct tcaccatcgt tgctgactac 120 aacttctctt cacgcagtct catatttgtc actgaatcct gcattatttt acccatggat 180 tacatcacca ggcatttatt tttcatattg gggatatttc gggatgtgtc cttcataggt 240 ctcatggccc tctccagcgg gtacatggtg gccctcttgt gcagacacag gaaacgggcc 300 cagcatcttc acaggaccag cctttctcca aaagcatccc cagagcaaag ggccaccagg 360 accatcctgt tgctcatgag cttctttgtg ttgatgtact gcttggactg caccatatcc 420 gcctccagac ttatgcacaa cggtgaacca atccaccaca gtattcagat gatggtctcc 480 aatagctatg ccaccctcag ccctttgctg tt 512 <210> 4 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc feature <222> (1) .. (512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   Séquence partielle F5.

   <Desc/Clms Page number 22>

   <400> 4 tcctgtttag caacgtttaa acataactct ccccatcaca tctcaggtgc ctttcttttc 60 ctttgtgttc tctatatgtc ttttagcagt cacctcttag tatcaattat tgctaccccc 120 aatttaacct caaatatttt tatgtatgtt actcagtcct gctcacttct acccatgagt 180 tactccagaa caagcacgtt ttccacaaca atcgccatca gggaagcttt tcttatcagt 240 ctcatggccc tgtccagtgg gtttatggtg actctcctat ggagacacaa gaagcaggcc 300 cagcatcttc acagcaccag cctttcttca aaggcatctc cagaacgaag ggctaccaga 360 accatcctgc tgctcatgag cttctttgtg gttctctaca ttttagaaaa tgttgtcttc 420 tactcaagga tgaagttcaa ggatgggtca atgttctact gtgtccaaat tattgtgtcc 480 catagctatg ccaccctcag cccttttctg tt 512 <210> 5 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc feature <222> (1)..(512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   Séquence partielle F6.

   <400> 5 tcctgtttag caaagtttaa acataaatct ccccgtcaca tctcaggtgc ctatcttttc 60 ttctgtgttc tctatatgtc ctttagcagt cacctctttg tattggttat tgctacctcc 120 aatttaacct cagatcattt tatgtatgtt actcagtcct gctcacttct acccatgagt 180 tactccagaa caagcacgtt ttccttactg atggtcacca gggaagtctt tcttatcagt 240 ctcatggccc tgtccagtgg gtacatggtg actctcctat ggaggcacaa gaagcaggcc 300 cagcatcttc acagcaccag actttcttca aaagcatccc cacagcaaag ggccaccagg 360 accatcctgc tgcttatgac cttctttgtg gttttctaca ttttaggcac tgttatcttc 420 cactcaagga ctaagttcaa ggatgggtca atcttctact gtgtccaaat tattgtgtcc 480 catagctatg ccaccctcag cccatttctg tt 512 <210> 6 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc feature <222> (1)..(512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   Séquence partielle F9.

   <400> 6 tcctgtttag caaagttcaa atataagcct tcccatcaca tctcctgtgc cattctttct 60

   <Desc/Clms Page number 23>

   ctgagtgtcc tctacatgtt cattagcagt cacctcttag tatccatcat tgccacccca 120 aatttgacca cgaatgactt tattcatgtt actcagtcct gctctattct acccatgagt 180 tacctcatgc aaagcatgtt ttctacactg ctggccatca gggatgtctt tcttattagt 240 ctcatggtcc tgtcaacatg gtacatggtg gctctcttgt gtaggcacag gaaacagacc 300 cggcatcttc agggtaccag cctttcccca aaagcatccc cagaacaaag ggccacccgt 360 tccatcctga tgctcatgag cttatttgtt ctgatgtctg tctttgacag cattgtctgc 420 agctcaagaa ctatgtatct gaatgatcca atatcttatt ctattcaact atttatggtg 480 cacatctatg ccaccctcag ccctttgctg tt 512 <210> 7 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc feature <222> (1)..(512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   Séquence partielle F10.

   <400> 7 tcctgtttag caaagttcaa atataaatcc acacagcaca gcctgtgttc ccttcttgtg 60 ctctgggcct tctacatgtc ctgtggtact cactactcct tcaccatcgt tgctgactac 120 aacttctctt cacgcagtct catatttgtc actgaatcct gcattatttt acccatggat 180 tacatcacca ggcatttatt tttcatattg gggatatttc gggatgtgtc cttcataggt 240 ctcatggccc tctccagcgg gtacatggtg gccctcttgt gcagacacag gaaacaggcc 300 cagcatcttc acaggaccag cctttctcca aaagcatccc cagagcaaag ggccaccagg 360 accatcctgt tgctcatgag cttctttgtg ttgatgtact gcttggactg caccatatcc 420 gcctccagac ttatgcacaa cggtgaacca atccaccaca gtattcagat gatggtctcc 480 aatagctatg ctaccctcag cccattgctg tt 512 <210> 8 <211> 512 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> mise feature <222> (1)..(512) <223> Récepteur phéromones chez le rat femelle .

   Séquence partielle Fil.

   <400> 8 tcctgtttag caaagttcaa atataaatcc acacagcaca gcctgtgttc ccttcttgtg 60 ctctgggcct tctacatgtc ctgtggtact cactactcct tcaccatcgt tgctgactac 120 aacttctctt cacgcagtct catatttgtc actgaatcct gcattatttt acccatggat 180