FR2806096A1 - Produits a propriete b2+ a-isoles a partir de e.coli, et leurs applications biologiques - Google Patents

Produits a propriete b2+ a-isoles a partir de e.coli, et leurs applications biologiques Download PDF

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Xavier Nassif
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Abstract

La présente invention est relative à des produits à propriété B2+ A- isolés à partir de E. coli, et à leurs applications biologiques, notamment médicales et biotechnologiques. Par " propriété B2+ A- ", il est entendu dans la présente demande une présence à une fréquence supérieure à 10% parmi les souches E. coli de groupe B2 de la collection ECOR, et à une fréquence inférieure à 10% parmi les souches de groupe A de la même collection. Est notamment décrite une méthode de détermination phylogénétique permettant de discriminer rapidement et facilement les groupes A, B1, B2 et D de l'espèce E. coli avec une précision de plus de 99%.

Description

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Produits à propriété B2+ A- isolés à partir de E. coli, et leurs applications biologiques La présente invention est, de manière générale, relative à des produits à propriété B2+ A- isolés de E. coli, et à leurs applications biologiques, notamment médicales et biotechnologiques. Par "propriété B2+ A-", est entendu dans la présente demande une présence à une fréquence supérieure à 10% parmi les souches E. coli de groupe B2 de la collection ECOR, et à une fréquence inférieure à 10% parmi les souches de groupe A de la même collection. La notion de présence doit être interprétée selon le sens commun de l'homme du métier. Des illustrations en sont données dans ce qui suit. La collection ECOR est une collection représentant la diversité génétique de l'espèce E. coli, elle est disponible auprès de banques telles que l'ATCC.
L'espèce E. coli est actuellement répartie en quatre grands groupes phylogénétiques dénommés groupes A, B1, B2 et D. Les techniques actuellement connues pour déterminer le groupe phylogénétique d'une souche E. coli donnée comprennent l'électrophorèse enzymatique multilocus ou MLEE, et le ribotypage. Des descriptions de ces techniques sont notamment décrites dans Herzer et al. 1990 J.
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Bacteriol. 172 :6175-6181 et dans Selander et ciel. 1986 Appl. Environ. Microbiol. 51 :873-884 pour la MLEE, et dans Bingen et al. 1994 Clin. Microbiol. Rev. 7 :311- 317, Bingen et al. Clin. Infect. Dis. 22:152-156, Bingen et al. J. Infect. Dis.
177 :642-650 et dans Desjardins et al. 1995 J. Mol. Evol. 41 :440-448 pour le ribotypage. Brièvement, la MLEE est basée sur l'analyse du polymorphisme de migration d'enzymes bactériennes. Pour chaque souche, un grand nombre d'enzymes caractéristiques de l'espèce (souvent supérieur ou égal à 20) sont caractérisés par leur mobilité électrophorétique. L'existence de variants de migration pour ces enzymes permet de caractériser chaque souche par un electrophorétype. Le ribotypage est quant à lui basé sur l'analyse du polymorphisme de restriction des régions chromosomiques incluant les gènes codant pour les ARN 16s et 23s. Ce polymorphisme est révélé grâce à une sonde de cDNA marquée, réalisée à partir de
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l'ARN 16s et 23s du E. coli, et qui est hybridée sur un transfert de Southern de l'ADN digéré par divers enzymes de restriction, de la souche étudiée.
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Les techniques de l'art antérieur sont toutefois complexes à mettre en #uvre pour des applications de type industriel, tel que les analyses en milieu médical ou le criblage à grande échelle de souches d'intérêt pour les techniques biotechnologiques telles que le clonage. Elles sont de plus longues, et nécessitent de disposer d'une collection de souches de référence.
Une collection dénommée ECOR a d'ailleurs été constituée de manière à représenter la diversité génétique de l'espèce E. colt. Cette collection est disponible notamment auprès de l'ATCC (ATCC N 35320 à N 35391) Elle comprend : - 25 souches de E. coli de groupe A,
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- 16 souches de F'. coli de groupe B1, - 15 souches de E. coli de groupe B2, - 12 souches de E. coli de groupe D, et - 4 souches de E. coli non affectées à l'un des quatre groupes A, B l, B2, D.
Dans la littérature scientifique, quelques produits ont par ailleurs été décrits comme présents chez une ou quelques souches E. coli de groupe B2, et comme généralement absentes d'une ou quelques souches E. coli de A. C'est notamment le
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cas des gènes sfa, ibe 10, hly, pap, prs, kips, et les gènes impliqués dans le métabolisme du sorbose. La fiabilité de ces produits en tant que marqueurs phylogénétiques n'a toutefois jamais été mise en évidence. En tout état de cause, rien n'indique que ces produits soient capables de discriminer efficacement entre les différents groupes phylogénétiques de E. colt. De plus, ces produits ont été isolés de manière discrète avec une constatation a posteriori de leur présence chez une ou quelques souches E. coli B2 et de leur absence chez les quelques souches E. coli de groupe A qui ont été testées. L'homme du métier ne disposait donc pas dans l'art antérieur de moyens permettant d'obtenir des produits à propriété B2+ A-.
La présente invention fournit de tels moyens, et donne ainsi accès à l'ensemble exhaustif des produits à propriété B2+ A-. Il s'agit de la première description d'un
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tel ensemble, et de la première description de régions chromosomiques à propriétés B 2+ A-.
Le concept commun aux différents aspects de l'invention correspond à l'obtention de marqueurs phylogénétiques de E. coli en faisant le choix d'isoler l'ensemble des fragments d'ADN chromosomiques et plasmidiques de E. coli présentant une propriété B2- A- comme ci-dessus définie, et à cette fin. en mettant au point une méthode qui soit susceptible de permettre d'isoler l'ensemble exhaustif de ces fragments.
La méthode employée consiste à soustraire la population polynucléotidique d'une
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ou plusieurs souche(s) F. coli de groupe A cisaillée de manière aléatoire à la population polynucléotidique d'une ou plusieurs souche (s) E. coli de groupe B2 clivée par une endonucléase de restriction permettant d'obtenir des fragments comprenant de 100 à 1500 pb environ, avec une moyenne de 300 à 500 pb environ,
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telle que Sau3AI, Tsp509I, i11,,pl, NfaeII (toute enzyme de restriction présentant des sites de restriction courts, par exemple de 4 pb). Elle permet ainsi d'obtenir une banque de produits à propriété B2+ A- comme ci-dessus définie. Une telle soustraction peut être répétée de manière itérative jusqu'à obtention du niveau d'exhaustivité souhaité (le niveau d'exhaustivité de la banque peut être estimé en recherchant la présence ou l'absence de produits dont la propriété B2+ A- était
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connue tels que sfa, the 1 0). Entre les différentes itérations de soustraction, il est souhaitable si l'on cherche à augmenter le niveau d'exhaustivité, d'utiliser des enzymes de restriction différentes. Des exemples de réalisation d'une telle méthode sont notamment décrits dans l'exemple 1 qui suit. Différentes méthodes soustractives pour l'isolement d'ADN présents chez une bactérie et absents chez une autre bactérie ont été décrites dans l'art antérieur. Il s'agit toutefois ici de la première application d'une méthode soustractive dans l'objectif de résoudre un problème d'identification de marqueurs phylogénétiques. et en particulier de marqueurs phylogénétiques de E. coli, de la première application d'une méthode soustractive au niveau de l'espèce E. coli, et de la première application d'une méthode soustractive à d'une part un isolat E. coli de groupe B2 associé à la
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méningite néonatale et d'autre part des souches F coll de groupe A de la collection ECOR.
La présente invention offre donc les moyens d'obtenir l'ensemble des produits à propriété B2+ A-. A ce titre, les polynucléotides visés par la présente demande correspondent à l'ensemble des polynucléotides à propriété B2- A- nouvelle.
Certains de ces polynucléotides correspondent à des produits nouveaux en tant que
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tels (SEQ ID N à N 153 séquences correspondant aux régions 1, 3. 4. et 5 identifiées dans les exemples qui suivent, séquences ORF contenant ces séquences), d'autres correspondent des produits présentant des homologies avec des produits connus mais sont à propriété B2+, A- nouvelle (SEQ ID N 169, 170, 171,174,175,178,179,183,185,186,190,191,193,194,195,196,199,200,202,204,206, 208,209,211,214,218,220,221,233,234, 235,241,245,247,248,249,251, gène chuA, fragments du gène chuA qui ont conservé cette propriété B2+ A- tels que SEQ ID N 241, 195, 185, 249.
La présente demande a donc pour objet tout polynucléotide isolé à propriété B2+ Anouvelle qui correspond à un produit nouveau en tant que tel. Elle vise notamment tout polynucléotide isolé dont la séquence correspond à une séquence choisie parmi le groupe constitué par :
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- les séquences SEQ ID N 1 à N 153. - les séquences polynucléotidiques qui sont telles qu'obtenues par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe avec une enzyme de restriction
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choisie parmi le groupe constitué par Not et j5/I, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 134, 144,109, 115. 140, 135,
33, 56,122, 130, 141,25, 48,51, 57,121, 44, 45, 113, 119 ; 120. 23,52, et par séquençage des fragments sélectionnés, et - les séquences des ORF (cadres de lectures ouverts) qui contiennent une de ces séquences, - les séquences variantes ou fractionnelles conservatrices de ces séquences.
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L'obtention de ce groupe polynucléotidique est décrite en détail dans les exemples qui suivent. Il correspond aux polynucléotides à propriété B2- A- nouvelle qui sont également nouveaux en tant que produits. Outre les fragments SEQ ID N 1à N 153 isolés, il comprend les nouvelles régions 1, 3, 4 et 5 identifiées selon l'invention, et les ORF qui peuvent être identifiés sur ces polynucléotides (cf. exemples).
Par séquence conservatrice d'une séquence, il est ici entendu toute séquence qui a conservé la propriété B2+ A- (telle que ci-dessus définie) du polynucléotide correspondant à cette séquence parente. Par "variant", est ici entendu toute séquence présentant par rapport à la séquence parente des insertions et/ou des délétions et/ou des substitutions de nucléotides, ceci inclut toute séquence complémentaire de la séquence parente. Par "fractionnelle", il est ici entendu tout fragment de la séquence parente.
Dans la présente demande, est considérée comme E. coli toute souche pouvant être considérée comme appartenant à l'espèce E. coli selon les critères donnés par le Bergey's manual of systemic bacteriology (cf. notamment volume 1).
De même, est considérée comme appartenant au groupe B2 ou au groupe A toute souche E. coli qui serait considérée comme telle en réalisant un test phylogénétique de référence approprié à la discrimination B2/A, tel que par exemple l'électrophorèse enzymatique multilocus (MLEE) et/ou le ribotypage. De telles techniques phylogénétiques sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples de protocoles adaptés sont notamment décrits dans Herzer et al. 1990 J. Bacteriol.
172 :6175-6181 et dans Selander et al. 1986 Appl. Environ. Microbiol. 51 :873-884 pour la MLEE, et dans Bingen et al. 1994 Clin. Microbiol. Rev. 7 :311-317, Bingen et al. Clin. Infect. Dis. 22 :152-156, Bingen et al. J. Infect. Dis. 177 :642-650 et dans Desjardins et al. 1995 J. Mol. Evol. 41 :440-448 pour le ribotypage.
Des exemples de telles déterminations sont donnés dans les exemples qui suivent.
Le fait d'être ou de ne pas être présent dans une souche bactérienne ou dans un échantillon donnée correspond à la notion commune de l'homme du métier dans le domaine. Afin de déterminer si un polynucléotide donné est, ou n'est pas, présent
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dans une souche déterminée de E. coli, il peut notamment être procédé par transfert
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de Southern de la population nucléotidique de ladite souche l:. CO!I, et mise en contact de ce transfert avec le polynucléotide testé, ou une sonde dérivée de ce polynucléotide, dans des conditions appropriées aux réactions d'hybridation polynucléotidiques. Des exemples de telles sondes et de telles conditions sont données dans l'exemple L Une hybridation positive sera alors interprétée comme une présence dudit polynucléotide dans ladite souche E. coli, une hybridation négative ou non significative par rapport au bruit de fonds sera alors interprétée comme une absence dudit polynucléotide chez ladite souche E. coli. Il peut également être procédé par détection PCR d'une amplification positive ou négative à l'aide d'amorces d'amplification construites à partir dudit polynucléotidique, et placées en contact avec la population nucléotidique de ladite souche E. coli dans des conditions favorables à l'amplification par ces amorces d'une cible sur cette population. Des illustrations de telles procédures PCR sont données dans les exemples qui suivent.
Les polynucléotides à propriété B2+ A- selon l'invention sont avantageusement présents chez les E. coli ECOR de groupe B2 avec une fréquence supérieure à 40%, préférentiellement supérieure à 50%, plus préférentiellement supérieure à 60%, encore plus préférentiellement supérieure à 70%. Certains d'entre eux sont présents chez les E. coli ECOR de groupe B2 avec une fréquence supérieure à 80%, voire à une fréquence égale à 100%. Ces mêmes polynucléotides à propriété B2+ A- selon l'invention sont avantageusement présents chez les E. coli ECOR de groupe A à une fréquence inférieure à 5%, voire inférieure à 3%, voire égale à 0% (cf. exemples).
Ces polynucléotides à propriété B2+ A- peuvent être utilisés pour la simple détection de la présence de bactéries E. coli du groupe B2 et D avec une probabilité d'au moins 90% (présence desdits polynucléotides). Pris en combinaison entre eux. ou avec d'autres produits (cf. exemples), ils permettent de discriminer totalement entre les groupes A, B l, B2 et D de E. coli. Ils présentent également des appplications thérapeutiques, palliatives et/ou préventives d'intérêt. Ces polynucléotides seront désignés dans ce qui suit par : polynucléotides nouveaux à propriété B2+ A- nouvelle.
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La présente demande vise également tout couple d'amorces permettant l'amplification par PCR d'au moins un polynucléotide nouveau à propriété B2- Anouvelle tel que ci-dessus défini. La mise au point de conditions expérimentales de PCR appropriées est accessible à l'homme du métier (cf. notamment Molecular
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Cloning - A laboratory manual, Sambrook, Fritsch, 0,laniatis, et en particulier Vol. 2, Chap 14 2"d édition; cf. Ausubel et al. 1989 CUITent protocols in molecular biology; John Wiley and sons Ed., et en particulier Vol. 2 Chap 15). Des exemples en sont données dans les exemples qui suivent.
Elle vise en particulier le couple d'amorces correspondant au couple SEQ ID N 164 et N 165. Ce couple particulier d'amorces permet d'amplifier le fragment SEQ ID N 119 (clone TspE4C2).
La présente demande vise également toute sonde nucléotidique comprenant au moins un polynucléotide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle tel que ci-dessus défini. Elle vise en particulier toute sonde telle qu'obtenue à l'aide d'au moins un couple d'amorces selon l'invention notamment par amplification PCR (cf:
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exemples), tels que SEQ ID N'160 - 161) , (SEQ ID N 162 ; 163) (SEQ ID Nô 164 165).
La présente demande vise également tout polynucléotide anti-sens, caractérisé en ce que sa séquence correspond à l'antisens d'au moins un polynucléotide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle, et tout polypeptide isolé, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés correspond à une séquence codée, selon le code génétique universel et en tenant compte de la dégénérescence de ce code, par au moins un polynucléotide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle.
La présente demande vise également tout produit liant, capable de se lier à au moins un polypeptide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle. De tels produits correspondent notamment à du sérum, du sérum purifié, des anticorps, ou des
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anticorps monoclonaux. Des méthodes permettant de fabriquerde tels produits liants à l'aide des polypeptides selon l'invention sont disponibles à l'homme du métier. Il s'agit de méthodes classiques, qui comprennent notamment l'immunisation d'animaux tels que des lapins et la récolte du sérum produit, suivie éventuellement de la purification du sérum obtenu. Une technique appropriée à la production d'anticorps monoclonaux est celle de Kôhler et Milstein (Nature 1975, 256 : 495-497).
Par capable de se lier . nous entendons dans la présente demande des conditions
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de type physiologiques (in vivo ou mimant le iii vrvo) lorsque ledit produit liant est destiné à être administré à un organisme humain ou animal, et des conditions de type ELISA lorsque ledit produit liant est destiné à être utilisé dans des tests et méthodes In vitro, par exemple pour la détermination du groupe phylogénétique d'une bactérie E. coli.
La présente demande vise également tout vecteur comprenant au moins un polynucléotide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle, ainsi que toute cellule transformée par génie génétique, caractérisée en ce qu'elle comprend par transfection au moins un polynucléotide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle, et/ou au moins un vecteur selon l'invention, et/ou en ce que ladite transformation induit la production par cette cellule d'au moins un polypeptide correspondant à un polynucléotide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle.
La présente demande a également pour objet toute composition, notamment toute composition pharmaceutique, comprenant au moins un composé choisi parmi le groupe constituépar les polynucléotides nouveaux à propriété B2+ A- nouvelle, les polypeptides correspondant à au moins un polynucléotide nouveau à propriété B2+ A- nouvelle, les vecteurs et les cellules selon l'invention ci-dessus mentionnés. De telles compositions sont notamment utiles au traitement et/ou à la palliation et/ou à la prévention d'infections à E. coli, et notamment de la présence de bactéries E. coli extra-intestinales. Lorsque ledit composé est immunogène ou est rendu immunogène, ces compositions peuvent correspondre à des vaccins.
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Elle a également pour objet toute composition, notamment toute composition pharmaceutique, comprenant au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par les polynucléotides nouveaux à propriété B2+ A- nouvelle, les couples d'amorces et sondes selon l'invention ci-dessus mentionnés, et les produits liants selon l'invention ci-dessus mentionnés. Une telle composition est notamment utile à la détermination phylogénétique d'une bactérie E colt. Elle peut donc correspondre à une composition ou à un kit de diagnostic.
Elle a également pour objet toute composition, notamment toute composition pharmaceutique, comprenant au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par les polynucléotides antisens selon l'invention ci-dessus mentionnés, les produits liants selon l'invention ci-dessus mentionnés. De telles compositions peuvent également être utilisées pour la détermination phylogénétique d'une bactérie E. coli, et prendre la forme de composition ou de kit de diagnostic. Elles peuvent également être utilisées à titre thérapeutique afin de traiter et/ou pallier et/ou prévenir toute croissance non désirée de E. coli, telle qu'une contamination sanitaire, une infection
Figure img00090001

à L'. coli, et notamment la présence d'F. coli extra-intestinales (cf: exemples). La présente demande a également pour objet toute utilisation de ces produits selon l'invention pour la fabrication de telles compositions.
La présente invention fournit également des produits qui présentent des homologies avec des produits connus, mais dont la propriété B2+ A- est nouvelle. Il s'agit notamment des séquences SEQ ID N 169, 170,171, 174. 175. 178,179, 183, 185,
Figure img00090002

186, 190, 191, 193, 194, 195, 196, I99, 200, 202, 204, 206, 208, 209, 2I l, 2I4, 218, 220,221, 233, 234, 235, 241,245, 247, 248, 249, 251, des séquences ORF contenant ces séquences, du gène chuA, de l'opéron de ce gène et de ses fragments et variants conservateurs, et des polynucléotides correspondant à une région 1,6a, 6b de E. coli telle que décrite dans l'exemple 1 qui suit. Ces produits répondront
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dans ce qui suit à la désignation :produits à homologie mais à propriété B2- A- nouvelle.
Le gène chuA est un produit connu mais n'a jamais été décrit comme un marqueur phylogénétique : il n'a été décrit que chez quelques E. coli responsables d'infections intestinales et extra-intestinales, chez une Shigella et une Yersinia, et cela à titre de gène impliqué dans le métabolisme du fer, mais sa présence ou son absence chez d'autres E. coli n'a jamais été décrite. La présente invention rapporte pour la première fois sa présence chez la E. coli uropathogène J96. et rapporte pour la première fois qu'il est présent chez 100% des des B2 et des D et chez 0% des A et des Bl de la collection ECOR. Quatre fragments de chuA à propriété B2+ A- sont de plus décrits (SEQ ID N 241, 195,185, 249).
Les polynucléotides à homologie mais à propriété B2+ A- nouvelle selon l'invention sont avantageusement présents chez les E. coli ECOR de groupe B2 avec une fréquence supérieure à 40%, préférentiellement supérieure à 50%, plus préférentiellement supérieure à 60%, encore plus préférentiellement supérieure à 70%. Certains d'entre eux sont présents chez les E. coït ECOR de groupe B2 avec une fréquence supérieure à 80%, voire à une fréquence égale à 100%. Ces mêmes polynucléotides à propriété B2+ A- nouvelles selon l'invention sont avantageusement présents chez les E. coli ECOR de groupe A à une fréquence inférieure à 5%, voire inférieure à 3%, voire égale à 0%. (cf: exemples).
La présente demande vise notamment toute utilisation d'au moins un composé polynucléotidique choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
170, 171, 174, 175,178, 179, 183, 185. 186, 190, 191, 193, 194,
195,196, 199,200, 202,204, 206,208, 209, 211. 214, 218, 220,
Figure img00100001

221, ?33, ?3, 235, 2-l, 25. 27, 248, 29. 251, - l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de
Figure img00100002

restriction choisie parmi le groupe constitué par Nordi et Blill, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins
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une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125, 123, 116, 43, 40,127, 133, 27, 34, 36. 42, 46, 54, 55, 38, 128, 151. 212. 211, 201, 229 à l'exception des polynucléotides sfa,
Figure img00110001

hlv, cnj . pop'prs, hro, ibe 10, - les polypeptides dont la séquence correspond à un ORF comprenant la séquence d'un des polynucléotides cités dans les trois paragraphes précédents, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides (et notamment SEQ ID N 241, 195, 185,
249), - les couples d'amorces, les sondes et les polynucléotides antisens dont la séquence est telle que dérivée de ces polynucléotides, - les produits liants qui sont capables de se lier à ces polynucléotides, pour la détermination phylogénétique d'une bactérie E. colt. La présente invention vise également l'utilisation d'au moins un de ces composés pour le diagnostic de la présence ou de l'absence de bactéries E. coli non désirés tels que des E. coli contaminants ou des E. coli extra-intestinaux et/ou pour le diagnostic d'une infection à E. coli. Elle vise également toute utilisation d'au moins un de ces composés pour la fabrication d'une composition destinée à une telle détermination phylogénétique et/ou à un tel diagnostic.
Ces composés chuA, SEQ ID N SEQ ID N 169, 170, 171, 174,175, 178,179, 183,
Figure img00110002

185, 186, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 202, 20-, 20G, 208, 209, 21 l, 21, 218,220, 221, 233, 234, 235, 241,245, 247, 248, 249, 251, et les polynucléotides variants ou fractionnels conservateurs de ces produits correspondent en effet à des produits à propriété B2+ A- (telle que ci-dessus définie) nouvelle. La détection de la présence ou de l'absence de tels composés peut notamment se faire par hybridation nucléotidique, par amplification PCR, ou bien encore par détection de leurs produits polypeptides. Une détection de présence de tels composés permet de conclure à la présence de bactérie E. colt B2. L'utilisation combinée de ces composés, ou
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l'utilisation d'un ou plusieurs de ces composés combinée à d'autre(s) produit(s) tels que notamment yjaA, permettent d'affiner l'affectation phylogénétique. L'utilisation
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combinée de la détection de la présence ou de l'absence de chuta et de ycr (SEQ ID N 254) permet notamment de conclure à la présence ou l'absence de E. coli de groupe B2 et/ou de E. colt de groupe D (cf. exemples).
Elle vise également toute utilisation d'au moins un composé polynucléotidique choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169, 170, 171, 174. 175, 178, 179, 183. 185,186, 190, 191, 193, 194.
195,196, 199,200, 202, 204, 206,208, 209, 211, 214, 218, 220,
Figure img00120002

221, 233, 234, 35, 241, 245, 47, 248. 249, 251, - les polynucléotides tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction choisie
Figure img00120003

parmi le groupe constitué par Notl et 9//7/. par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125, 123, 116, 43. 40,127, 133, 27, 34, 36, 42, 46, 54, 55. 38, 128. 151, 212, 211,
Figure img00120004

201, 229, à l'exception des polynucléotides 6/, hl v, en}], papprs, hra, ibe 10.
- les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF comprenant la séquence d'un des polypeptides cités dans les trois paragraphes précédents, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides (et notamment SEQ ID N 241, 195. 185,
249), - les polypeptides dont la séquence correspond selon le code génétique universel, et en tenant compte de le dégénérescence de ce code, à ces polynucléotides.
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- les vecteurs comprenant au moins un de ces polynucléotides, - les cellules transformée par génie génétique qui comprennent au moins un de ces polynucléotides, et/ou au moins un de ces vecteurs et/ou dont la transformation induit la production d'au moins un de ces polypeptides, pour la fabrication d'une composition, notamment d'une composition pharmaceutique, destinée à pallier, et/ou prévenir, et/ou traiter une croissance non
Figure img00130001

désirée de E. coli telle qu'une infection E. coli, la présence c''L'. colt extra- intestinale, une contamination sanitaire.
Selon un autre aspect appliqué, la présente demande vise toute méthode permettant d'identifier un composé capable d'inhiber la croissance de E. coli, et notamment d'inhiber son développement extra-intestinal, qui comprend la détection d'au moins un composé : i. capable de se lier à au moins un polynucléotide choisi parmile groupe constitué par : - les polynucléotides nouveaux à propriété B2+ A- nouvelle (cf. ci- dessus), - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
170,171, 174, 175,178, 179, 183, 185, 186, 190,191, 193, 194,
195,196, 199,200, 202, 204, 206,208, 209, 211, 214, 218,220,
Figure img00130002

221, 233, 234, 235, 241,245, 247. 248, 249, 251. - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction
Figure img00130003

choisie parmi le groupe constitué par NOIr et //?1, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125,
Figure img00130004

123, 116, 43, 40,127, 1JJ, 27, 3-1, 36, -12, 6. 51. 55, 38. 128. 151. 212, 211, 201, 229 à l'exception des polynucléotides .fa, hly. cnfl, pap prs, hra, ibe 10,
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les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF comprenant la séquence d'un des polynucléotides cités dans les quatre paragraphes précédents.
- les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides et notamment (SEQ ID N 241, 195. 185,
249), et ii. capable d'inhiber la transcription et/ou la traduction correcte de ce polynucléotide.
La présente invention vise également toute méthode permettant d'identifier un composé capable d'inhiber la croissance d'une bactérie E. coli, et notamment son développement extra-intestinal, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection d'au moins un composé capable d'inhiber l'activité d'une protéine dont l'ORF comprend un polynucléotide choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides nouveaux à propriété B2+ A- nouvelle selon l'invention, - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à (SEQ ID N 169,
170,171, 174,175, 178, 179, 183, 185, 186, 190, 191, 193, 194,
195,196, 199,200, 202, 204, 206, 208, 209,211, 214, 218,220,
Figure img00140001

221, 233, 234, 235, 241,245, 247, 248, 249, 251, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction
Figure img00140002

choisie parmi le groupe constitué par Notl et Binl, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125, 123, 116,43,40,127, 133,27,34,36,42,46,54, 55, 38, 128. 151,
Figure img00140003

212, 2l 1, 201, 229 à l'exception des polynucléotides s fa, hly, c/7/7. pap prs, hm, 1 b I0,
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- les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF (cadre de lecture ouvert) comprenant la séquence d'un de ces polynucléotides, les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides.
De tels composés peuvent être notamment obtenus par criblage de banques chimiques et/ou biologiques La présente demande vise également tout composé tel qu'identifié par l'une ou l'autre de ces méthodes, et toute composition, notamment toute composition pharmaceutique, comprenant au moins un tel composé. De telles compositions sont notamment utiles au traitement et/ou à la palliation et/ou à la prévention d'une croissance non désirée de E. coli, telle que des infections à E. coli, une contamination à E. coli, et notamment utiles au traitement et/ou à la palliation et/ou à la prévention de la présence de bactéries E. coli extra-intestinaux.
La présente demande a également pour objet, selon un aspect remarquable de l'invention, des méthodes d'identification phylogénétique qui mettent en #uvre la détection de la présence ou de l'absence d'au moins un des polynucléotides à propriété B2+ A- nouvelle (que ces polynucléotides soient nouveaux en tant que produits, ou qu'ils présentent des homologies avec des produits connus): - les polynucléotides nouveaux selon l'invention - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
170, 171, 174, 175, 178,179, 183, 185. 186, 190, 191, 193, 194,
195, 196, 199, 200,202, 204,206, 208,209, 211, 214, 218,220,
221, 233, 234, 235, 241,245, 247, 248, 249, 251, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction choisie parmi le groupe constitué par NotI et BlnI. par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une
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séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID \ 125.
Figure img00160001
123, 116, 43, 40,127, 133, 27. 34, 36. 42, 46. 54. 55. 33. 128. 15 f, 212, 211, 201, 229 à l'exception des polynucléotides .sfcr, hly, c-/7. papprs, hra, ibe 10, - les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF (cadre de lecture ouvert) comprenant la séquence d'un de ces polynucléotides, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides.
. Cette détection peut être réalisée par détection directe dudit polynucléotide, ou de ses fragments, ou bien par détection de polypeptide(s) lui correspondant. En particulier, la présente demande vise toute méthode d'identification phylogénétique, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en #uvre d'au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides nouveaux à propriété B2+ A- nouvelle (cf: ci- dessus), - les couples d'amorces permettant d'amplifier ces polynucléotides nouveaux à propriété B2+ A- nouvelle, tels que ci-dessus définis, - les sondes comprenant ces polynucléotides nouveaux à propriété
B2+ A- nouvelle, telles que ci-dessus définies, - les produits liants aux polynucléotides nouveaux à propriété B2-
A- nouvelle, tels que ci-dessus définis, - les polynucléotides antisens des polynucléotides nouveaux propriété B2- A- nouvelle, tels que ci-dessus définis, - les composés tels qu'identifiés par une méthode selon l'invention d'identification de composés capables d'inhiber la croissance E. coli, - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
170, 171, 174, 175. 178. 179, 183, 185. 186. 190, 191. 193. 194.
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Figure img00170001

195, 196, 199. 200, 202. 204, 206. 208. 209. 211. 214. 2 i , 220,
221, 233. 234, 235, 241,245. 247, 248, 249, 25 1, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction
Figure img00170002

choisie parmi le groupe constitué par Noll et BInI. par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125,
Figure img00170003

1Z3, 116,43,40,127, 133. 27. 34. 36. 42, 46, 54, 55. Je, 128. 15 1, 212, 211, 201, 229 à l'exception des polynucléotides sfâ. hly, cnfl, pcrp, prs, h a, ibe 10, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins de ces polynucléotides (et notamment S EQ ID N 241, 195. 185,
249).
- les polynucléoties dont la séquence correspond à un ORF comprenant la séquence d'un des polynucléotides cités dans les paragraphes précédents, - les couples d'amorces, les sondes et les polynucléotides antisens dont la séquence est telle que dérivée de ces polynucléotides, - les produits liants qui sont capables de se lier à ces polynucléotides.
Cette mise en #uvre peut être réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier de manière à permettre audit au moins un composé de détecter dans un échantillon biologique la présence ou l'absence du ou des polynucléotide(s), ou le cas échéant polypeptide (s), qui constituent leur cible : ELISA pour les réactions de type anticorps-antigène, hybridation de type Southem ou PCR pour les réactions de type hybridation polynucléotidiques et/ou amplification.
Des échantillons biologiques appropriés comprennent notamment tous les prélèvements d'origine humaine provenant de sites normalement stériles (sang. liquide céphalorachidien, LCR, liquide d'épanchement...) ou non stériles (selles.
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cropharynx, peau...), mais aussi les prélèvements d'origine eimronnementale (sols, eaux..), d'origine alimentaire, d'origine animale. les cultures microbiologiques.
Cette méthode permet de conclure, lorsque ladite détection est positive, à la présence de bactéries E. coli du groupe 82. Lorsque cette méthode ne met en #uvre que la détection de la présence ou de l'absence de chuA, elle permet de conclure, lorsque cette détection est positive, à la présence de bactéries E. coli de groupe B2 ou D, et lorsque cette détection est négative, à la présence de bactéries du groupe B 1 ou A.
Cette méthode peut en outre comprendre la mise en #uvre de plusieurs desdits composés, par exemple de manière à détecter la présence ou l'absence du gène chuA, et aussi celle du fragment SEQ ID N 119. Elle permet alors de conclure : - lorsque cette détection est négative pour chuA et positive pour
SEQ ID N 119, à la présence de bactéries E. coli de groupe B 1, - lorsque cette détection est négative pour chuA et négative pour
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SEQ ID N l 19, à la présence de bactéries L'. coli de groupe A. Des exemples de telles méthodes et détection sont donnés dans les exemples qui suivent. Il est notamment décrit une paire d'amorces SEQ ID N 160 et N 161 permettant de détecter la présence ou l'absence du gène chuA, et une paire d'amorces SEQ ID N 164 et 165 permettant de détecter la présence ou l'absence de SEQ ID N 119 (TspE4C2).
La méthode d'identification phylogénétique selon l'invention peut en outre mettre
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en #uvre la détection de la présence ou de l'absence du gène yaA. Le gène 3/aA (cf. figure 5) était dans antérieur connu pour être présent dans la souche E. coli K12, (groupe A). Rien dans l'ait: antérieur ne suggérait qu'il puisse constituer un marqueur phylogénétique capable de discriminer entre groupe B2 et groupe D.
La figure 5 montre la séquence de yjaA (SEQ ID N 254) et celle de l'ORF correspondant (SEQ ID N 255).
La détection de la présence ou de l'absence du gène yjaA peut se faire par toute technique accessible à l'homme du métier. elle peut notamment se faire par
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détection du polynucléotide ou de ses fragments (SEQ ID N 254), ou par détection des polypeptides qui lui correspondent (SEQ ID N 255). La mise au point, de réactifs permettant une telle détection est accessible à l'homme du métier : sondes ou amorces d'amplification pour la détection de polynucléotides, composé de type sérum ou anticorps pour la détection de polypeptides. Les réactions d'hybridation polynucléotidiques peuvent être par exemple réalisées par Southern et/ou par PCR, et celles de type antigène-anticorps par ELISA. Des exemples de réalisation d'une telle étape de détection sont donnés dans les exemples qui suivent. Il est notamment décrit une paire d'amorces (SEQ ID N 162 et ?163 permettant d'amplifier yjaA.
La présente invention vise également toute méthode d'identification phylogénétique, qui met en #uvre au moins la détection de la présence ou de l'absene du gène yjaA.
Cette détection permet de discriminer entre E. coli de groupe B2 et E. coli de groupe D (cf exemples).
De manière remarquable, la présente invention fournit une méthode de détection phylogénétique qui permet de discriminer complètement les groupes A, B1, B2 et D de E. coli. cette méthode met en oeuvre la détection de la présence et de l'absence
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du gène chuA, du gène y,cr et de SEQ ID N 119. Cette méthode est décrite de manière détaillée dans les exemples. Des conditions PCR avantageusement y sont notamment mentionnées ("PCR simplifiée").
Avantageusement, cette détection peut être réalisée par amplification PCR. Des exemples de conditions PCR appropriées sont données à titre purement illustratif dans les exemples. La présente demande vise en particulier une méthode d'identification telle que ci-dessus définie qui met en #uvre la détection simultanée d'un ou plusieurs desdits polynucléotides à propriété B2+ A- et de yjaA, préférentiellement par PCR triplex. De manière particulièrement avantageuse, cette méthode peut être appliquée directement aux bactéries ou à l'échantillon analysé. elle ne nécessite pas de disposer d'une collection de souches de référence.
La présente demande vise également toute méthode de détection d'une croissance non désirée de E. coli, toute méthode de diagnostic d'une infection E. toute
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méthode de détection ou de contrôle sanitaire (aliments, liquides destinés à la consommation, sols), et toute méthode de sélection de souches E. coli appropriées aux manipulation biotechnologiques, qui mettent en #u\re la méthode d'identification phylogénétique selon l'invention.
Elle vise également tout kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de d'identification phylogénétique, de diagnostic, et/ou de sélection selon l'invention, éventuellement assorti d'un mode d'emploi. De tels kits peuvent notamment comprendre au moins un des composés mis en #uvre dans lesdites méthodes. Ils peuvent également comprendre un mode d'emploi faisant figurer un ou plusieurs des profils présentés en figure 4 (cf. exemple 4), ou décrivant un ou plusieurs de ces profils.
Un kit avantageux comprend au moins l'un des couples d'amorces (SEQ ID N 160,
161) (SEQ ID N 162, 163) (SEQ ID N 164, 165), préférentiellement deux de ces couples, plus préférentiellement les trois couples d'amorces.
La présente invention est illustrée par les exemples qui suivent, donnés à titre non limitatif. D'autres avantages et des variantes de réalisation peuvent être lus par l'homme du métier dans ces exemples. De telles variantes sont visées par la présente demande.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures suivantes : - la figure 1 représente la distribution de clones B2' A- le long du chromosome de la souche E. coli RS218, - la figure 2 donne la liste des séquences de fragments B2' A- isolés, et indique leurs N de SEQ ID respectifs, - la figure 3 illustre un schéma décisionnel pour l'analyse phylogénétique d'une souche E. coli, - la figure 4 représente les différents profils phylogénétiques obtenus à l'aide d'une méthode triplex PCR selon l'invention (pistes 1 et 2 : groupe A : piste 3 : groupe B 1 ; pistes 4 et 5 :groupe D ; pistes 6 et 7 :groupe B2).
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- la figure 5 représente la séquence polynucléotidique du gène yjaA (SEQ ID N 254), et la séquence ORF correspondante.
EXEMPLE 1
Isolement de l'ensemble des fragments B2+ A-
MATERIEL ET METHODES
Souches bactériennes. Les souches mises en oeuvre pour cette hybridation soustractive sont un E. colt (E. coli C5 ; (sérotype 018:K1:H7), isolé du liquide céphalorachidien (LCR) d'un nouveau-né (15) et deux souches de groupes A de E. coli, ECOR4 et ECOR15 qui appartiennent à la collection ECOR (ATCC). E. coli C5 héberge plusieurs facteurs de virulence, tels que l'antigène capsulaire K1, un
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opéron 5fèr, le gène ibe 10, des pili Pap, et le gène de l'hémolysine (hly). Cette souche appartient au groupe phylogénétique B2. D'autre part, les souches ECOR4 et ECOR15, qui appartiennent au groupe phylogénétique A, n'expriment aucun facteur de virulence identifié. D'autres souches de E. coli ont été utilisées : souche
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RS218 (sérotype 018:K1H7), un isolat du LCR de nouveau-né, qui a été décrit notamment par Huang et al. 1995 (Infect. Immun. 63: 4470-4475) et qui héberge les mêmes facteurs de virulence que la souche C5 ; et la souche de laboratoire E. colr K-12 MG1655 (groupe A), dont le génome a été récemment séquence (Blattner et al. 1997, Science 277: 1453-1461).
En outre, nous avons utilisé un ensemble de 54 ECNM E. colt qui ont pu être associées à une méningite néonatale) obtenu du LCR de nouveau-nés atteints de méningite (fourchette d'âge, 1 à 28 jours) et appartenant au groupe phylogénique B2. Cette population a été comparée aux 15 souches de E coli du groupe phylogénique B2 des 72 souches de la collection ECOR, qui sont quant elles non associées à la méningite. Cette collection est disponible auprès de l'ATCC (ATC N 3520 à N 35391). Ces souches de référence. isolées à partir de divers hôtes et divers lieux géographiques sont représentatives de la gamme de variation chez
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l'espèce et sont divisées en quatre groupes phylogéniques principaux (A, B 1, B2 et D) quatre d'entre elles sont non classées. Les bactéries ont été cultivées à 37 C dans
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du bouillon Lm'ia-Bertani ou sur gélose Luria-Bertani. Lorsque c'est nécessaire, on a utilisé de l'ampicilline à une concentration de 100 g. par ml.
Transfert de Southern. Le transferts de Southern ont été réalisés par transfert capillaire sur des membranes en nylon chargées positivement. Les hybridations ont été réalisées à 65 C dans du dodécylsulfate de sodium à 1% - NaCl 1 M - -tris-HCl 50 mM (pH 7,5) - 1% de réactif de blocage (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne). Les membranes ont été lavées, d'abord dans du SSC 2x (SSC lx et du NaCl 0,15 M plus du citrate de sodium 0.015 M) pendant 15 min à température ambiante, puis dans du SSC 2x - du dodécylsulfate de sodium pendant 30 min à 65 C et enfin dans du SSC 0, lx pendant 5min à température ambiante. La détection par chimioluminescence a été réalisée avec le kit de détection de luminescence DIG pour l'acide nucléique (Boehringer Mannheim) selon les instructions du fabricant. Les sondes sfa et ibe 10 ont été produites par PCR en utilisant des amorces et un procédé d'amplification précédemment décrit (Bingen et al. 1997, J. Clin. Microbiol. 35: 2981-2982).
Analyse de différence représentationnelle. L'ADN chromosomique des souches ECOR a été cisaillé de manière aléatoire par passages répétés dans une aiguille hypodermique de manière à obtenir des fragments d'une longueur comprise entre 3 et 10 kb environ. Cet ADN digéré a été purifié par extraction au phénol.
L'ADN chromosomique de E. coli C5 a été clivé par l'endonucléase de restriction
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Sau3AI ou 1:p509l. Cet ADN (20 pg) a été ligaturé avec 10 nmoles d'oligonuléotides hybridés R. Baml2 (5'-GATCCTCGGTGA-3' ; SEQ ID N 154) et RBam24 (5'-AGGACTCTCCAGCCTCTCACCGAG-3- : SEQ ID N 155) ou REcol2 (5'-AATTCTCGGTGA-3' ; SEQ ID N 156) et REco24 (5'AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAG-3' ; SEQ ID N 157) lorsque la restriction a
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été réalisée par SemAI ou Tsp5091, respectivement. L'ADN a été séparé des amorces en excès par électrophorèse dans un gel d'agarose à faible point de fusion à 2%. La portion du gel contenant des fragments de plus de 200 pb a été excisé et digéré par de la P-agarase. CetADN a été purifié par extraction au phénol.
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Pour l'hybridation soustractive (premier tour), on a mélangé 0.2 g d'ADN de E. coli C5, ligaturé aux oligonucléotides, avec 40 ug d'ADN de de ECOR4 ou ECOR15 fragmenté dans un volume total de 8 l de tampon EE 3x (le tampon EE
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Ix et de l'acide N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-iV'-(3-propanesulfonique 10 mM) - - EDTA 1 mM [pH 8,0] ) ordinaire. La solution a été recouverte d'huile minérale, et l'ADN a été dénaturé en chauffant à 100 C pendant 2 min ; on a ajouté 2 l de NaCl 5 M, et on a laissé le mélange s'hybrider à 55 C pendant 48 h. Le mélange réactionnel a été dilué 10 fois avec du tampon EE 3x - NaCl 1 M préchauffé et placé immédiatement dans la glace. On a ajouté une partie de la dilution (10 ul) à 400 l de mélange réactionnel PCR (Tris HCl 10 mM [pH 9,0], KC1 50 mM, MgCl2
1,5 mM, Triton X-100 à 0,1%, une concentration de 0,25 mM de chaque désoxynucléotide triphosphate, 50 U de Taq polymérase par ml) et on a incubé pendant 3 min à 70 C pour remplir les extrémités des fragments de E. coli C5 réhybridés. Après dénaturation à 94 C pendant5 min et addition d'oligonucléotides RBam24 ou REco24 (0,1 mmole par 100 ul), on a amplifié les hybridations par PCR (30 cycles de 1 min à 94 C, 1 min à 70 C, et3 min à 72 C, puis 1 min à 94 C et 10 min à 72 C dans un thermocycleur de marque GeneAmp 9600 [PerkinElmer] ). Les produits de PCR ont été purifiés sur gel pour séparer les fragments de E. coli C5 de l'amorce et de l'ADN ECOR de soustraction de poids moléculaire élevé. Le deuxième tour d'hybridation soustractive a été réalisé en utilisant 40 g d'ADN fragmenté de E. coli ECOR4 ou ECOR15 et 25 ng d'ADN ligaturé à RBam24 ou REco24 obtenus du premier tour. Les produits du deuxième tour de soustraction ont été radio-marqués en masse et utilisés comme sonde dans des expériences d'hybridation de Southem afin de vérifier que les fragments amplifiés étaient bien uniques à l'ADN de la souche B2 absents des souches de groupe A.
Ainsi, quatre banques soustractives ont été obtenues.
Analyse de clones des banques soustractives. L'ADN des banques
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soustractives a été cloné au niveau des sites BamH (banques SLlu3AI) ou I'coR (banques Tsp5091) de pUCl9 (New England Biolabs. Beverly, Mass.). puis transformé dans des cellules ultra-compétentes Epicurian coli XL2-bleu (Stratagene. La Jolla, Calif.). Les inseits ont été amplifiés par des réactions de PCR réalisées sur
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des colonies transformées, en utilisant les amorces suivantes : Pl(5'CATGCCTGCAGGTCGACTCT-3' ; SEQ ID N 158) et P2 (5'-
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CGTTGTAAAACGACGGCCAG-3' ; SEQ ID :.Jo 159). Les clones ont été désignés par ce qui suit (dans l'ordre) :l'enzyme de restriction utilisée ( Tsp ou Sau ), la souche utilisée pour la soustraction (E4 ou E 15), et une désignation alphanumérique.
(i) Séquençage d'ADN. Après purification des produits de PCR par immobilisation réversible sur phase solide, les fragments de PCR purifiés ont été séquences en utilisant le kit Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit avec l'AmpliTaq ADN polymérase (Perkin-Elmer) sur un séquenceur d'ADN automatique ABI PRISM 377 XL (Perkin-Elmer), en suivant les instructions du fabricant. Lorsqu'on a rencontré des problèmes pour obtenir une séquence de bonne qualité avec une amorce déterminée, la réaction de séquençage a été réalisée avec le kit dGDT Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (PerkinElmer). Les séquences ont été criblées pour des homologies avec les séquences déjà publiées en utilisant les programmes informatiques BLASTN et BLASTX (Centre National pour les Informations sur Biotechnologie, NCBI Altschul et al. 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
(ii) Hybridation de Southern-blot. Pour vérifier leur spécificité, les produits de PCR obtenus en utilisant les amorces P 1 et P2 à partir des colonies de transformants ont été marqués par l'incorporation de digoxygénine-11-dUTP (Boehringer, Mannheim) et utilisés comme sondes pour l'analyse Southem-blot de l'ADN chromosomique digéré par DraI provenant des souches E. coli C5, ECOR4 et ECOR15 et E. coli K-12 MG1655.
(iii) Electrophorèse sur gel en champs pulsés et cartographie des clones sur les chromosomes des sousches RS218 et C5. La position des séquences d'ADN correspondant aux produits de différence clones a été déterminée par rapport à la carte de E. coli RS218 (Rode et al. 1999, Infect. Immun. 67: 230-236) en sondant des transferts Southern des gels d'agarose en champs pulsés. L'ADN de
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la souche RS218 a été digéré par Blini, Mo (h et bal et soumis à électrophorèse sur gel en champs puisés, tout comme l'ADN de la souche C5 qui a été digéré par BlnI,
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Mail. Les gels étaient ragarose à 1% dans du tampon Tris-borate-EDTA 0,5x. et ils ont été soumis à électrophorèse à 6V/cm pendant 27 h, avec des durées d'impulsions variant de façon linéaire entre 2 et 49 s. Les positions sur le chromosome de RS218 de séquences réactives avec chacun des clones ont été déterminées par comparaison des fragments de restriction reconnue de BlnI, et NotI avec la carte de macrorestriction publiée (Rode et al. 1999).
RESULTATS
Production de banques de fragments d'ADN de la souche de groupe B2 que l'on ne trouve pas dans le génome des E. coli de groupe A. En utilisant la technique d'analyse de différence représentationnelle, nous avons soustrait les chromosomes des deux souches de groupe A (ECOR4 et ECOR15) des chromosomes de la souche de groupe B2 (souche C5). Quatre banques ont été produites et désignées SauE4, SauE15, TspE4. et TspE15, selon l'enzyme utilisée pour digérer le chromosome de la souche C5, et la souche utilisée pour la soustraction. Dans chaque cas, le produit de différence amplifié du deuxième tour de soustraction a été marqué et utilisé comme sonde contre l'ADN digéré par DraI de C5, RS218, ECOR4 et ECOR15. On a observé une forte réactivité avec le chromosome des souches de groupe B2. D'autre part, il y avait peu ou pas de signal dans les colonnes correspondant aux souches soustractives (groupe A). 494 des clones obtenus ont été isolés pour séquençage. Parmi ceux-ci. 140 présentent une homologie significative avec la séquence de E. coli K-12 et ont été éliminés. Parmi
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les 354 fragments restants, 259 séquences (SEQ ID T 1 à N 153, et N 169 à N 253) étaient uniques. Le tableau 1 ci-dessous montre tous les clones qui présentent une homologie significative avec des gènes précédemment décrits.
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TABLEAU 1. Recapituaitifde la recherche BLAST pour ies clones B2' A' qui présentent des homologies significatives"
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Clone' Taille Séquences de la base de données prSèI1ldl1l U1C Score Proba- W craccessi de similarité bilite GenBank SI èl ) " Í 1) ,i 1 ()l) ] , . 1nser .,-).) (pb) SauE 1 ..- 163 IS629 (1\), plasmide pO 157, lîacdtcnvc.ht . cwlr . 1 7* ABOI 15,49 O I 7H7 SauE 5.A7 190 iroC.' (N), transporteur de cassette d'ATP (locus 157 e"3: U6211-9 régulé par du fer). Salmonella typhi SauE15.B2 294 repB eN), protéine de réplication. plasmide I)CD 1, 123 -' F03916 Xc/'.s'//<r//7.')'//.s' SauE 15.B6 157 kps (01), région promoteur de la région 3 de z? e~ 2 L05251 l'amas du gène de l'acide polysialique, 1:. colt SauEI.B9 107 lru}) (N), plasmide du facteur sewel F. F coli 198 e,SI' 12 9 2 SauE15.BL0 240 ORF 34/35 (P), région instable 102 lcv, pesas 69 e-o C.a? 1357 SauE15.B12 479 protéine inconnue(P), 1". coli ec 1 102 e,:l ~-FOi.-I-503 SauE 15. C 100 gène r6 (N), transposase, îlot de hathogénicité de 198 e -Il) .-\F08 1285 F. coli CFT073 SuE 15.CG 119 IS100 (N), Yen-!f7io pesfis 228 e,Si) L 19030 SauE 15.C7 155 Précurseur (P) du récepteur HI 12 17 dépendant de 52 e-' P45 1-4 TonB, Haemophillfs influenzae SauEI5.C9 273 r htnLl (N). îlot de patEioénicité de ~elmo:rIln 3]1 e"8" AF 106566 ryphll1lllf'lllill (SPI 3) SauE 15.C 11 77 orfE (N) région distale du promoteur de l'opéron 129 c':' :<SS8l p lis i 111 cle RI 00, S //<.\7p/'/ SauE 15. D4 153 I.S'lll0 (). 5: pesll) 287 e-" L 19030
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Figure img00270001

SauE15.D8 347 gène r3 (), bét-m5tathionese. îlot de 6 ! e'; -I A FOS] 286 pathogénicité de 1;". coli CFT073 SauE 1 .E-1 281 sefl8 (N), entérotoxine, 1:". cull 541 e-1 Z5--1- i 95 SauE15.ElI 314 nul I(). p(aswide RI-19. Iï: olr 523 e -1-:- 19 Il, 10 SauEl5.F3 422 chuA (P), gène d'utilisation de heme. ;:. coli 98 e--" L679:20 0157H7 SauE 1 . F9 137 thioestérase (P), 8uc'iII/ls 4Q e'o ABOIG--1-27 SauEIS.FI0 210 ène r3 (N). bètz-cystatllionese, îlot de 408 e,ll: If081?86 pathogénicité A. coli CFT073 SauE15.G3 206 fraC; (N), plasmide RI 00, S.~flwocti 165 e-'' LOl159 SauE 1 .G6 328 LSI00 (;). Y. pc.5 tr.s -1-80 e"i34 L 19030 SauE iS.HS 200 protéine (P) HIL'P 1, Y'm.sirticr erttctwcol!trcr 80 e"15 127 SauE15.H7 150 Oxido-réductase (P). Thennotogu inantima 160 e-l' AEOO 1762 SauE15.Hl 141 tral (M). plasmide R 100, L: colt 280 e"74 J01769 0 SauE15.Hl 160 hémoglobine protéase (P), 1:". coli EQ 50 e-{) CAA 11507 1 Sauret543 176 erssl (M). arylsu1fate sulfotransférase, Kleh\lellu sp 3--1- e,02 L.;32616 SauE15.1 1 162 chn-l (N), gène de l'utilisation de heme. 1:'. cu Il 305 e'2 L67920 O17H7 SauE15.J7 118 ii-ob (N), homologue de glucosyl transférase, S 7-1- e- U62129 typhi SauE15.J9 96 Lf l0(l (N), Ypeslis 17-1- e---!2 L 19030 SauE 15.M4 193 gène r3 et i7icil.'(N), îlot de pathogénicitè de 1. 383 e -lo-1 --F0001286 cola CFT073 SauE1.118 149 Delta-(L-a-amil1oadipyl)-L-cystéinyl-D-valine 65 e-' P26046 synthétase (P) Pénicillium sJ7.
SauE 1 5. Ml 119 .eiib (N). entérotoxine de 1.. çoh enterons ast\ 228 e"' Z54 ! 95
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Figure img00280001

SnuEI5.\7 188 Piasmiclc pColEM-C i 139 <N) /:'. cal: 20;; - M35o83 SauE4..-\2 32! Uli W ( n, 1~ l:vili IilSille Cle IÛ~ Iw :l , . , 135 e'" ALU31866 SauE4.A5 249 elie Ci (). Ielai-W. Stit171011e1Je~ ilCt Cl 355 e AF081286 pvt110ètlèçit :le l:. c'oli CFTO i SauE4.B4 360 IS200 (\ )./:'. coli 523 e""" L25845 SauE4.C7 275 111p17L11eliC: 1.'Cli'O(else (1, (CJflljJ,'lCI'Clc'li'c'lili 54 e' P45493 SaE4.C![ 255 PllsIlll;ll.,Ct:l ~ . 1ellm ( )~ .ilt uTl;,~'", , . - e"' CAA6*243 SauE4.D3 239 i". coli 474 e"": X 18 1323 SauE4.E3 263 gènes A7;//A'(\). gènes d'titilisaltioo cle heme 387 e"" U645 1 6 .S7?///c/ (h 'scnicnae SauE4.EH 242 1,66 (N), i". L'ol! 329 c-11 .-F 1 19170 SauE4.F8 188 gènes opéi-oil sor pom' l'utili5atiolfe L- 139 e-" X66U59 sorbose. Klehsiclla pneumoniae SaaE4.F9 439 Yn<\'(P)6/c/7,/.Y.//?//7/.y 51 e'' BAA23404 SauE4.Fl2 324 /cn.s;l1(I), région 3 de l'amas du gène de Faeide 642 M57332 po!ysia!ique.A'.c/7I<[ SauE4dd2 85 .wm:ll (), o,orotl sor poun l'utilisatioll cle L.- [05 e'" X66059 sorbose. K. 7ilLlüllUillCIC' S'ILIE 1.12 431 ~villa. (\)~ PI1s11ïicLe R100..'..I'-,il'l'1 S29 0 AP000342 TspE4.A5 27) /76//?/7/(\)P-protèmedepiiU7.// 49S e":>' X61239 TspE4.A8 216 oi-f 17 1cD cle prs opéron pili (') hrotèille 387 e"'1''1' X61238 cytoplasmique. /7 coli TspE4.A9 179 /'7'(N). règ]on 3 de l'amas du gène de l'icid2 347 e'"' \ 15738 po!ysia!!que,A'.#//I<! TspE4.A ! 10 -112 FïecB (P). transporteur putatif de Faeiivateur de 73 e": ' AAC3 1980 Fhémofysine. lînviniu chrysanthemi TspE-1.B 229 gène ri (N). îlot de pathogénicité /:'. coli CFT073 430 e-;" .0 1?86 TspE4.B5 2!5 tlansdtlctioll sellsol7elle llisticline 1<inlse ( P 52 e'" B~ .- 18??3 .!'i lC'C'!1 UC'l'.SII.S TspE4.B9 3f9 .//(\).en[e!'oio\inedeA'.(.7.7/emero!n\a.,!\'e !" c'''' Z54195 'FspE4d3!2 430 IS100 (\ F./.'//.\ b98 0 LJ9030
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TspE4.C!0 26ï amas capsuiaire inlergénique (X) de !#'.. cul; k-!2 466 AFH325! TspE4.D2 232 )rc/c//,('\).no)au tipidiqL[eAde/Y.L//:!igasede 404 ç'l AF019746 pol) 1l1àe de surface TspE4.Dn 245 01'1' [69 (:\) plasmide F, r l'Of! 456 e"!2(1 Xi7539 TspE-1-,O!O 222 cnfl (Xi) facteur de nécrose eytoMX!que./,'..'// 440 e"" X70670 TspE4. D 1 2i7 /\8(:)hl1h):sine,rc'()lj 422 e" >,i31323 TspE4.E3 298 ///t7,)(\)hérnoysine,/'.'.c// 553 e"lN' \.i'C!33 TspE4.E4 267 0[i'95 (î\L pJas1l1icle F. J:'. col! 432 e"1"4 XI 7539 TspE4.E6 190 EsorbosePréductase(P).7./?//'/;/'///. 112 ç'2:' P37084 TspE4.E8 285 J)'f3 (;\1) h1l10Iysine, l:'. coli 54! e"'5: V181823 TspE4.G7 238 /m(\).p]asmK'eF./7// 443 e"i:4 X61575 TspE4.G8 323 Protéine transJ11.:mbranaire (P), r l'oli 82 e'i5 AAA92620 TspE-I-,1-[1 283 Oésiminasecrarginine (P) Pseiulomouas 63 e"1'1 p i 98 avruginosa TspE4.H9 179 (rcrr (<), plasmide R 00, r coli 353 e''"'' JO 1760 TspE4.H10 223 pifpap! (X), gène de régulation de l'adhesme. /#.'. 4[3 e"" X766i3 coli TspE44-Mi 279 orf9 (i"i), plasmide F. 1:'. coli 456 e"i:: Xi 7539 TspE4.ll 0 269 Ulfe' (X). amas du gène de li capsule, coli 492 e"ir MS4026 TspE4.Jl 327 j'hl.-! (1\), p]asmick RI 00, !:', col; 521 e"14 APOOÙ342 TspE4.J6 221 c/zr.-J (\J),gne de: ['uti]jsation cIl' hçll1è, /:" 375 e"|1); L 67920 Ot57H7 TspE4.K3 180 iss C\J) survie en sérum, E. coli 270 e"70 AF042279 TspE44<8 184 /,'100 et ()0 e--;7 Ll9030 /'7//"/'//7(X)A'.// !43 e : X766i3 TspEi5.A[ 332 Ni-:-'l-1--- iiit' //////-:c 96 e":" Q5''007 TspE15.Cl 299 /J'u (\ ) ilgg! ut i l'i nt:: th',:r11lo+s i:Jta!! lc, /, ,-,J" Îl; 537 ,y' UU7174
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TspE)5.C3 336 il( f ( . 1 :. !'r;l'i 3! -y' \KJ-:-i5G3 TSPE 1 D7 239 NI' 1 8" e" P I 1 904 T 1 --7,. D 23U de il21-"Ie 1;-. 39 c''' AAC44357 O157H7 TsI7E l.E 360 Icf.S.' (t) rin ; le IatLms c'tu ;ét;e 1,: ln <llsll J3 e"1*' X745ô" coli K5 TspE 15.G 287 attliuo-trtnsiért se puttie ( l'). f3..-Tlf,lil.v "2 ..-'- 008432 TspE15.!-I2 258 Enzyme d'acdvadon de ll p.1-Li 51 e-" AAS39799 U'C'f7!!lC'(i(.'C l;.s iillllClil.S TspE 1 . H 3 1 C) enjï (N) facteur de nécrose rw: totov.ic)m, L-. ul' gaz ; e" L42629 TspE 1 -. H9 273 sous-unité fimbnaie majeure de fimbriae 48 e 141206 ressemblant ( F l 7 (P) 1,,". coli TspEL542 112 /7/'.s'//';(\'protéinedepi!iP.A'.// 222 e"57 X62153
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a Seules les homologies d'une probabilité d'au moins e,5 ont été retenues.
Homologies avec les bactériophages (n=2D ne sont pas présentées.
Les clones sont désignés par le nom de t'enzyme (iL,- noir! de la souche utilisée pour la soustraction (E4 ou E15) et un code compose d'une lettre et d'un chiffre. le nom de la séquence du gène est donné (avec le type de similarité entre parenthèses), suivi du produit ou de la fonction qui est encodé par le gène et.'ou la localisation du gène. ainsi que le nom de J'organisme N, similarité au niveau du nucléotide: P, au ni\eau de la protéine, ORF, cadre de lecture ou\ert.
Certains de ces clones correspondent à des gènes déjà connus coillme étant présents
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dans la souche C5, tels que pop, lilli- et kps. Parmi ces 494 clones. aucun ne ne s'est avéré être homologue de s fa ou ;l,c'Iii. Des tours additionnels de soustraction et, où le séquençage de clones supplémentaires permettent d'obtenir L;1:: .vil;l;iji.:. pius l'orle. jusqu'à être complète. D'autre part, sont. i','- t0 L l', les séquences correspondant (les facteurs de urulenee décrits dans des souches qui n'ont pas a ce
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Figure img00310001

jour été associées à la méningite néonatale : (i) pr.s. cnf èt lira, tous faisant partie d'un Pali (ilôt de pathogénicité) dans la souche uropathogène F coli J96 ; (ii) chuA. un gène impliqué dans le système de transport de fer et trouvé dans L'. coll entérohémorragique 0157:H7 ; et (iii) sens, un gène codant pour une entérotoxine sur le plasmide de virulence de Shrgella et L'~ coli entéroinvasive. Enfin. 153 des fragments séquences (SEQ ID N 153) n'ont présenté aucune homologie significative avec une quelconque séquence publiée.
Cartographie des séquences spécifiques de ECNM sur le chromosome de E. coli. La disponibilité d'une carte physique du chromosome de E. coli RS218 (Rode et al. 1999, Infect. Immun. 67: 230-236) a permis la recherche de la distribution des séquences citées ci-dessus. Des 64 clones qui ont été choisis à cette fin, 7 présentent
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une homologie avec des facteurs de virulence connus {kp.s, lilly, pis, lira, crrfl, chuA, et senB) et 57 ne présentent aucune homologie connue. Ces derniers clones ont été choisis au hasard dans les banques TspE4 et SauE15. Ces deux banques ont été choisies car elles contiennent la majorité des gènes attendus chez les B2 (par ex., pap, hly, et kps) et ont donc été considérées comme étant suffisamment complètes pour être représentatives. Tous les clones ont présenté une homologie par hybridation de Southem vis-à-vis du chromosome de la souche RS218. Les produits de PCR de ces clones ont été marqués et utilisés pour sonder des transferts de
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Southern d'ADN de RS218 digéré par les enzymes Biiil Notl et XhaI (enzymes coupant de manière non fréquente). La localisation aussi bien de sfa et de ibe10 a été déterminée. Pour confirmer que chacun de ces clones était spécifique des E. coli de groupe B2, ils ont tous été utilisés pour sonder l'ADN digéré par DraI de souches ECOR4, ECOR15 et MG1655 et se sont avérés non réactifs vis-à-vis de ces souches.
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TABLEAU 2. Souches isolées à partir des cas de méningites néonatales et à partir de la collection ECOR qui se sont hybridés avec les clones soustractifs utilisés comme sonde % de souches positives à ['hybridation par transfert de Southern avec des clones donnés représentatifs de différentes régions ou homologues à chuA
Figure img00320001
<tb>
<tb> (région <SEP> 1) <SEP> (région <SEP> 3) <SEP> (région <SEP> 4) <SEP> (région <SEP> 5) <SEP> (région <SEP> 6b)
<tb>
Figure img00320002

Source n TspE4 TspE4 SauE15 TspE4 SallE!5. SauE15 TspE4 SauEl TspE4 SauEl PAI chuA .K6 H5 M9 H6 L4 Kl2-C-1- 5.M10 C2 5.N4 V
Figure img00320003
<tb>
<tb> TspE
<tb> 4. <SEP> J6
<tb>
Figure img00320004

Méningite 54 91 91b 80' 80 8 l 8 ll) 81" 100 98" 17D I7b , 100
Figure img00320005
<tb>
<tb> appartenant <SEP> au <SEP>
<tb> groupe
<tb> phylogenique <SEP> B2
<tb> Collection
<tb>
Figure img00320006

1 40 40 13 13 47 -17 -17 100 87 47 47 100
Figure img00320007
<tb>
<tb> ECOR.
<tb> groupe
<tb> phylogeni
<tb> -que <SEP> 82 <SEP>
<tb>
Figure img00320008

a - La prévalence de PAI V a été évaluée en utilisant les clones TspE4.Dll, TspE4.D10 et TspE15.CI homologues des gènes hay, cnj et hcr, respectivement. b : P<0,05, par rapport aux souches de la collection ECOR (l'existence d'une différence dans la distribution des clones étudiés a été testée par le test de #2).
: Non significatif, par rapport aux souches de la collection ECOR.
La cartographie de ces clones a révélé une distribution non aléatoire des séquences B2 A-. Cette distribution est illustrée par la figure 1. Dans cette figure. les flèches du haut indiquent les six régions trouvées dans cette étude et
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Figure img00330001

représentées par des fragments noix et Z//?1 avec une forte densité de clones spécifiques de C5. Les clones présentant des homologies connues sont indiqués,
Figure img00330002

tout comme les positions des sondes sfcr et he 1 (J. La région 6 a été divisée en deux sous régions selon la cartographie des clones sur différents fragments XbaI. Les exposants contre les noms des clones désignent ce qui suit : L TspE4.A7 a été positionné par chevauchement SauE15.F12 :2. SauE15.F12 présente également une réactivité sur le plasmide ;et 3, TspE4.A8 présente également une faible réactivité sur le fragment P de NotI.
(Fig. 1). Quarante-quatre des clones se sont amassés dans six groupes distincts sur
Figure img00330003

le chromosome. Un clone codant pour une partie du gène chu A trouvé dans I'. c6'// entérohémorragique n'était pas associé avec l'un quelconque de ces amas et est resté isolé. La région 1 est contenue dans le fragment m de BlnI (85 kb). Les clones de la région 2 ont été cartographie sur les fragments p et n de NotI (-240 kb). La région 3 est contenue dans le fragment a de NotI (-310 kb), et la région 4 est contenue dans le fragment h de BlnI (210 kb). La région 5 est localisée sur le fragment j de BlnI (135 kb). La région 6, qui chevauche le fragment b de NotI et le fragment b de BlnI (-550 kb), a été divisée en deux sous-régions par l'enzyme XbaI, les régions 6a et 6b. Cette dernière sous-région contient des clones présentant
Figure img00330004

des homologies avec cnFl, hly, prs et hrcr. Les sondes sfÓ et ibelo s'hybrident dans les régions 2 et 6a, respectivement. Les gènes codant pour la capsule n'étaient liés à aucune de ces régions. Six clones ne présentant aucune homologie avec les séquences connues et le gène senB ont été tous localisés sur un grand plasmide présent dans la souche RS218.
Distribution de régions génomiques B2 A- parmi deux collections de souches de E. coli. Afin d'affiner la pertinence de ces régions en termes de pathogénèse, nous avons déterminé la fréquence de l'apparition de clones localisés sur les régions 1, 3, 4. 5 et 6b ainsi que le clone contenant une par-tie du gène chuA
Figure img00330005

dans une collection de 54 (/:'. Col qui ont été associées à la méningite néonatale. et qui appartiennent au groupe phylogénique 82 (54 ECNM). Nous avons exclu de
Figure img00330006

cette étude les régions 2 et 6a car elles contenaient les gènes y fi et rbel0, dont la
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distribution parmi les souches de E. coli du groupe 82 a pu être établie. Pour chaque région, on a utilisé deux à quatre clones indépendamment pour sonder des
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transferts de Southem de [' AD\Í génomique des isolats ECNM. Le groupe témoin correspondait aux 15 souches B2 de la collection ECOR ,ces souches n'ont pas à ce jour été associées à la méningite. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 cidessous.
Toutes les régions mentionnées ci-dessus sont largement présentes parmi les ECNM, sauf la région 6b qui est sous représentée dans les souches associées à la méningite. En outre, les régions 1, 3 et 4 sont apparues avec une fréquence sensiblement plus élevée (P<0,05) parmi les ECNM que les autres souches B2, suggérant ainsi que ces régions contiennent des ADN codant pour des facteurs spécifiques de ECNM.
DISCUSSION
Dans ces travaux, nous avons réalisé une hybridation soustractive pour identifier les régions du chromosome susceptibles de coder des attributs phylogénétiques d'intérêt. Nous avons réalisé deux tours d'hybridation soustractive en choisissant de soustraire la population ADN d'une E. coli B2 (associée à la méningite néonatale) à celle de E. coli A. Nous avons ainsi obtenu des banques de clones B2- A- contenant des inserts de tailles allant de 100 à 500 pb dans lesquelles des clones spécifiques ECNM peuvent être identifiés. La spécificité des banques soustractives a été évaluée (i) par transfert de Southern avec des souches non pathogènes, et (ii) par analyses de séquences qui ont montré que 72% des clones ne présentent aucune homologie avec la séquence publiée de E. coli K-12.
Figure img00340002

Certains clones correspondent à des gènes associés à la virulence (kps, pop et lily), D'autre part, nous n'avons pas isolé de clone correspondant aux gènes sfcr et obel0. Toutefois, des clones issus de régions contenant ces deux gènes ont été obtenus. Pris ensemble, ces données confirment le caractère complet de ces banques.
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Une approche épidémiologique a été entreprise afin d'étudier le rôle de ces régions dans le processus infectieux de ECNM (E. coli qui ont pu être associées à la méningite néonatale). Etant donné que la majorité des ECNM appartient au groupe phylogénique B2, nous avons déterminé la prévalence de chaque région ainsi que de chuA parmi les ECNM du groupe B2. et parmi les souches du groupe B2 non associées à la méningite (collection ECOR). Bien qu'il soit petit, ce groupe témoin a été choisi car il est composé des souches de référence de la collection ECOR, qui est considérée comme étant représentative de la gamme de variations génotypiques des espèces. Nous avons utilisé deux à quatre clones de chaque région et le clone
Figure img00350001

TspE4.J6 (SEQ ID ;\' 2-1-1), homologue de e'/.4, comme sondes contre des transferts de Southern d'ADN génomique préparé à partir d'isolats appartenant aux deux groupes. La présence de ce clone parmi les isolats de méningite indique que toutes ces régions, sauf la région 6b, sont largement représentées parmi ECNM, suggérant ainsi l'implication de gènes codés par ces régions dans la pathogénèse de ces souches. D'autre part, et de manière étonnante, la région 6b qui ressemble à PAI V, a une faible prévalence dans les ECNM (17%) mais est largement représentée dans les souches du groupe B2 de la collection ECOR (47%). La région 5 a une forte prévalence, mais elle est similaire dans les deux collections et peut ainsi correspondre à des segments fortement caractéristiques du groupe phylogénique B2 par rapport au groupe A. La même distribution a été observée pour chuA, mais de façon intéressante, ces gènes étaient présents dans toutes les souches du groupe B2 testées sans exception. Etant donné que les région 1,3 et 4, qui sont spécifiques de ECNM, tout en étant B2' A- (fréquence de présence supérieure à 10% chez les B2, et inférieures à 10% chez les A) ne contiennent pas de facteurs de virulence connus, ces régions apparaissent correspondre à des îlots d'ADN associés à l'invasion des méninges par E. coli. Chez les nourrissons et nouveaux-nés.
L'application de la technique soustractive décrite a permis l'isolement d'un ensemble de fragments d'ADN chromosomiques et plasmidiques présents avec une fréquence supérieure à 10% chez les E. coli de groupe B2 de la collection ECOR, et à une fréquence inférieure à 10% chez les E. coli de groupe A de cette même
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collection (en l'occurrence à une fréquence de 0% chez les E. coli ECOR de groupe A pour plus de 90% d'entre eux).
Dans l'exemple ci-dessus décrit, 494 clones ont été isolés pour séquençage et ont permis d'obtenir 259 clones différents les uns des autres et qui ne présentent pas d'homologie significative avec E. coli K12. Si souhaité, le nombre initial de clones initialement isolés et séquences peut être considérablement augmenté, par exemple en partant de 3000 clones ou plus au lieu de 494. Des appareils de séquençage automatique permettent aisément de traiter un tel nombre de clones. Augmenter le nombre de clones initialement séquences permet notamment d'augmenter l'ensemble final de clones qui sont différents les uns des autres et qui ne présentent pas d'homologie significative avec E. coli K12. Ceci permet d'augmenter le niveau d'exhaustivité de l'ensemble obtenu. Alternativement, ou de manière combinée, il peut être choisi d'augmenter le nombre de souches L-. coli B2 dont proviennent la population d'ADN, et/ou d'augmenter le nombre de banques soustractives réalisées (en utilisant d'autres enzymes de restriction). Afin d'augmenter le niveau de spécificité B2+ A- obtenu, il peut être choisi de multiplier les cycles de soustraction : dans l'exemple ci-dessus décrit. deux cycles seulement ont été nécessaires à l'obtention desdits 259 clones, mais il peut être choisi de réaliser un troisième, ou un quatrième cycle. Il peut également être choisi d'utiliser d'autres enzymes de restriction, toute enzyme permettant l'obtention de fragments de 100 à 1500 pb environ, avec une moyenne de 300 à 500 pb environ, étant a priori les mieux adaptées (c'est-à-dire toute enzyme de restrcition présentant des sites de
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restriction courts, par exemple de 4 pb, telles que Tsp509L Sau3Al, mais aussi Mspl, Ala(- -11). Avantageusement, deux à trois tours de soustraction suivis de l'élimination de ceux des clones qui présentent une homologie avec une souche de groupe A telle que E. coli K12 donnent un très bon niveau de spécificité. Le fait de varier la nature des enzymes de restriction utilisées, notamment entre chaque cycle de soustraction, augmente encore le niveau d'exhaustivité et/ou de spécificité de l'ensemble obtenu. Afin d'évaluer le niveau d'exhaustivité effectivement obtenu, il peut être procédé en recherchant la présence ou l'absence de marqueurs connus tels que sfa, ibe10. La présente invention décrit donc des moyens qui donnent accès à
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l'ensemble exhaustif des fragments d'ADN, et donc des ADN, qui sont présents à une fréquence supérieure à 10% chez les E. coli de groupe B2 de la collection ECOR, et à une fréquence inférieure à 10% chez les E. coli de groupe A de cette même collection.
Dans cet ensemble, peuvent être identifiés des ADN particulièrement discriminateurs : la plupart d'entre eux (plus de 80% d'entre eux) sont en effet présents chez les E. coli de groupe B2 de la collection ECOR à une fréquence supérieure à 40% (clones des régions 1, 4,5, 6b), certains d'entre eux étant même présents à une fréquence supérieure à 50%, voire supérieure à 80% (clones de la région 5 et clones correspondant à chuA), pour atteindre les 100% de fréquence B2 pour environ 15% de l'ensemble obtenu (certains clones de la région 5 et clone isolé correspondant à chuA).
La région 5 des E. coli apparaît ainsi comme une source avantageuse de fragments d'ADN présents chez une large majorité (plus de 80%) des E. coli de groupe B2 de la collection ECOR, et absents de la majorité des E. coli de groupe A de la collection ECOR. Comme la collection ECOR est représentative de la diversité génétique de l'espèce E. coli, la région 5 de toute souche E. coli apparaît être une source de marqueurs phylogénétiques B2+ A- particulièrement avantageuse.
Les régions identifiées sur la carte chromosomique de E. coli RS218 correspondent
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au fragment Blini m de RS218 pour la région 1, aux fragments NotI p et n pour la région 2, au fragment NotI e pour la région 3, au fragment BlnI h pour la région 4, la région 5 correspond à une zone chevauchant les fragments NotI v et BlnI j de RS218, et la région 6 (sous-régions 6a et 6b) correspondent au fragment BlnI b de RS218. Il peut être noté qu'on ne disposait pas dans l'art antérieur des séquences des régions 1, 3,4, 5, et qu'aucune fonction ne leur était connue. Les régions 1, 3, 4 et 5 ne comprennent par ailleurs aucun fragment d'ADN de l'art antérieur, elles correspondent donc bien à des régions nouvelles en tant que produits. Les régions 2, 6a et 6b comprennent quant à elles des ADN qui étaient connus en tant que produits, mais il s'agit de la première description de l'existence de telles régions et de leur propriété B2+ A- telle que définie ci-dessus.
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L'homme du métier appréciera par ailleurs que les différentes régions identifiées sur la carte chromosomique de E. coli RS218 à l'aide clones B2+ A- isolés à partir d'une souche déterminée de E. coli de groupe B2 (E. coli C5 dans l'exemple cidessus décrit) peuvent être aisément retrouvées chez une autre E. coli de groupe B2. Il peut notamment être ainsi procédé en identifiant, et si nécessaire en isolant, tout fragment d'ADN chromosomique ou plasmidique de cette autre E. coli B2 qui est tel qu'obtenu par digestion de l'ADN total de cette autre E. coli B2 avec une enzyme de restriction choisie parmi le groupe constitué par NotI et BlnI, et par sélection de ceux des fragments qui s'hybrident à au moins un des clones B2+ Aobtenus à partir de ladite souche déterminée.
L'invention fournit donc des moyens donnant accès à l'ensemble exhaustif des produits E. coli B2+ A-, et donne, à titre illustratif, un ensemble de fragments B2+ A- dans lequel sont identifiés des fragments d'ADN à propriété B2+ A- nouvelle (certains présentent des homologies avec des produits connus-SEQ ID N 241, 195, 185,249, gène chuA -numéro d'accession U67920 sur Genbank- et tout fragment à propriété B2+ A- de ce gène-, d'autres sont des produits nouveaux-SEQ ID N 1 à N 153, gènes qui leur correspondent, et tout fragment à propriété B2+ A- de ces gènes-). L'invention met de plus en évidence que ces fragments d'ADN ne sont pas dispersés de manière aléatoire sur le chromosome de E. coli, et qu'il existe des régions chromosomiques de E. coli à propriété B2+ A- : pour l'ensemble de ces régions, cette propriété B2+ A- (telle que ci-dessus définie) est nouvelle, certaines de ces régions étant de plus nouvelles en tant que produits. En d'autres termes, l'ensemble exhaustif des produits E. coli B2+ A- auquel l'invention donne accès peut être considéré comme correspondant à l'ensemble constitué par les 259 fragments d'ADN B2+ A- isolés comme indiqué ci-dessus. Parmi ces 259 fragments, 153 sont nouveaux en tant que produits (SEQ ID N 1à N 153), les autres fragments présentent une homologie avec des produits connus. Parmi les fragments à homologie, certains sont décrits pour la première fois comme présentant une propriété B2+ A- (telle que ci-dessus définie), c'est notamment le cas de chuA (numéro d'accession ATCC U67920) et des quatre clones qui apparaissent lui correspondre : TspE4J6 (SEQ ID N 241, 221 pb, probabilité de e-
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Figure img00390001

'02, score de 375), SauE 15111 (SEQ ID N 195, 162 pb, probabilité de e-82, score de 305), SauE15F3 (SEQ ID N 185, 422 pb, probabilité e-20 score de 98), et TspE15D9 (SEQ ID N 249, 230 pb, probabilité de e-18, score de 89). C'est également le cas de l'îlot PAIV, et des régions 1, 6a et 6b qui ont été identifiées (cf. exemples).
EXEMPLE 2
Distribution des fragments B2+ A- isolés parmi les souches ECOR Les fragments obtenus dans l'exemple 1 présentent une fréquence de présence supérieure à 10% chez les E. coli ECOR de groupe B2 et inférieure à 10% chez les E. coli ECOR de groupe A. Leur fréquence de présence chez les E. coli ECOR de groupes B 1 et D a été mesurée par hybridation Southern comme décrit en exemple 1. Sont reportés dans le tableau 3 ci-dessous les résultats de 14 d'entre eux (SEQ ID N 56, 116, 43, 51,141, 130, 45, 50,52, 119,127, 125,55, 37).
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TABLEAU 3 PREVALENCE DES CLONES SOUSTRACTIFS SANS HOMOLOGIE AU SEIN DES SOUCHES DE LA COLLECTION ECOR
Figure img00400001
<tb> ECOR
<tb>
Figure img00400002

VJ r-<< )---( -t N C, i v0 v0 H H ;: N " 00 :z H 1 C1 I x w ! ) ) U H 0 )! COLLECTION -< t <t-<f<t-H-H MHHHM MHHMHMHH D Pn t> t3 Pu PM ED)!Z3FL,f( <i iy3<î<!oco <!<t:<!;MMM<t!<tI GROUPES (1) E-< (1) (1) E-< E-< Cf) (1) Cf) E-< H E-< Cf) Cf) ô 5 ô ô ô ô 5 5 ô ô 2 ô ô ô n=,25 (12,5%) 0 3 0 0 0 0 0 0 0 15 0 1 0 3 Bln=16 QS,75%) 3,75%) (6,25%) (18,75%) 13 Il 9 2 2 4 7 15 15 12 12 10 7 15 B2 n=15 (86,67%) (73,55%) (ë0%) 3,33%)(l3,33%) (26,67%) 6,67%) (100%) (100%) (80%) (80%) (66,67%) (46,67%) (100%) o 0 0 0 0 0 6 3 2 3 0 1 12 Dn=12 (50%) (25%) (l6,67%j (250/0/ (8,33%) (l00%) Entre parenthèses : fréquence du clone panni le groupe ECOR considéré (pourcentage de souches de ce groupe ECOR dans lesquelles le clone est présent) .
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On observe que la grande majorité des fragments (plus de 90%) sont absents (fréquence de présence de 0%) des 16 souches E. coli de groupe A que comprend la collection ECOR, et qu'ils sont tous présents à une fréquence supérieure à 10% dans les 15 souches E. coli de groupe B2 que comprend la collection ECOR, comme indiqué dans l'exemple 1 ci-dessus. Plus de 75% des fragments sont présents dans les 15 souches E. coli ECOR de groupe B2 à une fréquence supérieure à 40%, 50% d'entre eux y sont présents à une fréquence supérieure à 70%, et environ 35% d'entre eux y sont présents à une fréquence supérieure ou égale à 80%.
On observe également certains de ces fragments à propriété B2+ A- sont également présents chez des souches E. coli ECOR de groupe B 1 et/ou chez des souches E. coli ECOR de groupe D. On note en particulier que le clone TspE4C2 (SEQ ID N 119) est présent chez les E coli ECOR de groupe B1à une fréquence supérieure à 90%, tout en étant complètement absent des souches E. coli ECOR de groupe A.
Le clone SauE15I12 (SEQ ID N 37) est quant à lui présent avec une fréquence de 100% chez les E. coli ECOR de groupe D, avec une fréquence également de 100% chez les E. coli ECOR de groupe B2, tout en étant complètement absent des E. coli ECOR de groupe, et très peu présents chez les E. coli ECOR de groupe B1.
Comme la collection ECOR représente la diversité génétique de l'espèce E. coli, les différents résultats obtenus indiquent que l'ensemble des ADN à propriété B2+ Aobtenus selon l'invention constituent, pris seuls ou en combinaison, des outils appropriés à l'identification phylogénétique de souches E. coli.
EXEMPLE 3
Obtention des séquences des régions B2 A- En exemple 1, est décrit l'isolement et le séquence de 153 nouveaux fragments d'ADN à propriété B2+ A-, et sont fournis des moyens permettant d'obtenir l'ensemble exhaustif de ces produits.
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L'homme du métier appréciera qu'à partir de ces fragments d'ADN peut être identifiée, isolée et séquencée la séquence de chacune des régions 1,2, 3, 4,5, 6a et 6b décrites. ORF qui peuvent leur correspondre.
L'exemple 1 et la figure 1 donnent la séquence de huit (nouveaux) fragments appartenant à la région 1 (SEQ ID N 134,144, 109,115, 140,135, 33, 56). Pour la région 2, sont indiqués 5 nouveaux fragments (SEQ ID N 125, 123, 116, 43, 40) et la présence du gène sfa. Pour la région 3, sont indiqués 7 (nouveaux) fragments (SEQ ID N 122, 130,141, 25,48, 51,57). Pour la région 4, sont indiqués 3 (nouveaux) fragments (SEQ ID N 121, 44,45). Pour la région 5, sont indiqués 5 (nouveaux) fragments (SEQ ID N 113, 119,120, 23,52). Pour la région 6a, sont indiqués huit nouveaux fragments (SEQ ID N 127, 133, 27,34, 36, 42,46, 54) et la présence du produit connu ibelO. Pour la région 6b, sont indiqués quatre (nouveaux) fragments (SEQ ID N 55, 38,128, 151) et la présence de quatre produits connus (SEQ ID N 151, 212, 211, 201, 229).
La fourniture de ces séquences permet à l'homme du métier d'obtenir la séquence complète de la région correspondante en suivant les techniques classiques, et d'identifier dans ces régions la présence d'éventuels cadres de lectures (ORF).
Une des techniques classiques consiste à élaborer des amorces d'amplification de la région souhaitée à partir des séquences des fragments de cette région, et à réaliser une amplification par PCR à l'aide de différentes combinaisons desdites amorces placées en contact avec la population polynucléotidique d'une souche E. coli de groupe B2 (ECOR ou non) dans des conditions classiques de PCR. Les produits PCR qui se chevauchent sont séquences à partir des deux brins en utilisant la technique de terminaison de chaîne et le séquençage automatisé.
Si nécessaire, on peut prolonger la séquence obtenue au-delà de la limite des clones disponibles en clonant par exemple dans Lambda DASH-II, des fragments partiels de 15 kb environ obtenus par restriction sur ladite population polynucléotidique. On identifie alors les inserts chevauchant la région souhaitée par hybridation avec des clones de cette région. L'ADN inséré est alors séquence à partir des extrémités des inserts et ces séquences sont utilisées pour élaborer de nouvelles amorces qui serviront à amplifier directement l'ADN chromosomique (et non phagique). On
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obtient alors une amplification de l'ADN chromosomique en utilisant ces nouvelles amorces et celles de la séquence plus courte déjà obtenue. Ces brins PCR sont également séquences à partir des deux brins, ce qui conduit alors à la séquence complète de la région souhaitée.
Les cadres de lecture des séquences obtenues pour les régions peuvent alors être analysés selon les techniques classiques de recherche d'ORF. On recherche notamment les ORF qui commencent par ATG ou CTG et qui présentent un indice d'usage de codons élevés.
EXEMPLE 4
Méthode et kit d'identification du groupe phylogénétique d'une souche E. coli Comme indiqués aux exemples 1, 2 et 3, les produits à propriété B2+ A- peuvent être utilisés pour déterminer le groupe phylogénétique de toute souche E. coli. ils peuvent être utilisés seuls, en combinaison entre eux ou en combinaison avec d'autres produits, selon le résultat et la précision de phylogénie recherchée.
L'ensemble des ADN à propriété B2+ A- permettent en cas de détection positive d'éliminer l'hypothèse d'une appartenance au groupe A. De manière plus fine, la présence ou l'absence du gène chuA ou des fragments à propriété B2+ A- (notamment SEQ ID N 241, 195,185, 249) permettent chacun de discriminer parfaitement entre groupe A ou B1 d'une part, et groupe B2 ou D d'autre part. La présence ou l'absence du fragment TSPE4C2 (SEQ ID N 119), du gène qui lui correspond, ou des autres fragments à propriété B2+ A- de ce gène permettent de discriminer parfaitement entre groupe A et groupe B l. La présence ou l'absence du fragment SauE15I12 (SEQ ID N 37), du gène qui lui correspond ou des autres fragments à propriété B2+ A- de ce gène permettent de discriminer parfaitement entre groupe groupe B2 ou D et groupe A. La détection de telles présences ou absences peut se faire par tout moyen disponible à l'homme du métier. Il peut notamment procéder en utilisant lesdits produits en tant que sondes (Southern), ou en construisant des amorces d'amplification qui correspondent à ces produits de manière à procéder par PCR. Lorsque ces produits sont codants, la détection des
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polypeptides correspondants constitue une variante de réalisation. La construction de sondes et d'amorces peut être réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier ; des exemples de telles constructions sont donnés ci-dessous.
A partir de l'enseignement donné par la présente demande, l'homme du métier peut concevoir l'arbre décisionnel qui correspond au niveau de précision phylogénétique recherché.
Est ici plus particulièrement décrite un exemple d'une méthode d'identification phylogénétique qui permet une précision phylogénétique d'au moins 99% pour E. coli. Cette méthode est basée sur la détection PCR de deux gènes connus à propriétés nouvelles (chuA et yjaA) et du fragment d'ADN TspE4. C2 (SEQ ID N 119). La méthode a été évaluée en testant 220 souches qui avaient été déjà groupées à l'aide des méthodes des références (électrophorèse enzymatique multilocus MLEE et/ou ribotypage). Les inventeurs ont en effet mis en évidence que le gène connu chuA est présent dans 100% des souches ECOR de groupe D et dans 100% des souches ECOR de groupe B2 et dans 0% des souches ECOR de groupe A et des souches ECOR de groupe B1. Ils ont également mis en évidence que le gène connu yjaA est présent dans 100% des souches ECOR B2 et dans 0% des souches ECOR de groupe D. Le gène connu yjaA était jusqu'alors uniquement connu pour être présent dans la souche E. coli K12 (groupe A) et n'avait pas de fonction connue. Il a également été mis en évidence que le nouveau fragment TspE4. C2 est présent dans environ 94% des souches ECOR de groupe Blet dans 0% des souches ECOR de groupe A. La combinaison de ces trois marqueurs phylogénétiques permet d'accéder à un niveau d'efficacité de discrimination entre les groupes A, B1, B2 et D supérieure à 99%. Il est également décrit une procédure technique de mise en #uvre de cette combinaison qui est techniquement très avantageuse : la PCR triplex. Cette nouvelle méthode est rapide, simple, elle peut s'appliquer directement sur une colonie bactérienne, et ne nécessite pas de disposer d'une collection de référence contrairement aux techniques de l'art antérieur, et à la MLEE et au ribotypage en particulier. La méthode décrite représente donc la première méthode qui puisse constituer un réel outil clinique pour des analyses de routine.
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Matériels et Méthodes Souches bactériennes. Les 72 souches de la collection ECOR sont disponibles sur l'ATCC. Ces souches de référence, isolées à partir de divers hôtes et diverses localisations géographiques, sont représentatives de la gamme de variation génotypique de l'espèce. Soixante huit de ces souches appartiennent aux quatre grands groupes phylogénétiques (A, B1, B2, D), et 4 sont non classifiés.
Ont également été testés un ensemble de 86 souches E. coli ayant provoqué une méningite néonatale (ECNM), 34 souches E. coli responsables de septicémie néonatale sans méningite, 30 souches E. coli isolées à partir de nouveaux-nés sains, et la souche uropathogène E. coli J96 (04:K6). La distribution par groupe phylogénétique de 69 des 86 souches ECNM a déjà été décrite (Binger et al. 1998, J. Infect. Dis. 177 :642-650). 17 autres ECNM et les 65 isolats cliniques restants ont été classifiés au moyen du ribotypage comme précédemment décrit dans Binger et al. La souche de laboratoire E. coli K-12 MG1655, qui appartient au groupe phylogénétique A, a également été utilisée.
Les bactéries ont été cultivées à 37 C sur du milieu Luria Bertani bouillon ou agar.
Si nécessaire, de l'ampicilline (lOOug par ml) a été utilisée.
Amplification par PCR. Dans une première étape, la PCR a été réalisée selon un protocole standard. La réaction a été réalisée dans un volume de 20 l contenant 2 l de tampon 10X (fournis avec Taq polymérase), 20 pmol de chaque amorce, 2 M de chaque dNTP, 2,5 U de Taq polymérase (ATGC Biotechnologie, Noisy-leGrand, France) et 200 ng d'ADN génomique. La PCR a été réalisée avec un appareil de la marque Perkin-Elmer GeneAmp 9600 à cyclage thermique avec des tubes de la marque MicroAm dans les conditions suivantes : dénaturation 5 minutes à 94 C, 30 cycles de 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 55 C et 30 secondes à 72 C et une étape d'extension finale de 7 minutes à 72 C, en utilisant les paires d'amorces : chuA.l (5'- GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' ; SEQ ID N 160) et chuA.2 (5'TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' ; SEQ ID N 161), pour chuA
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yjaA.l (5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' ; SEQ ID N 162) et yjaA.2 (5'ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' ; SEQ ID N 163), pour yjaA et TspE4C2. 1 (5'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3' ; SEQ ID N 164) et TspE4C2.2 (5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3' ; SEQ ID N 165) pour TspE4C2 (SEQ ID N 119).
Ces couples d'amorces génèrent par amplification des fragments de 279 pb, de 211 pb, et de 152 pb, respectivement.
Selon un protocole simplifié, une réaction par polymérase triplex en deux étapes a été mis en #uvre. Les composants de la réaction sont les mêmes que dans le protocole standard sauf (i) l'ADN a été fourni directement par 3 l de lysat bactérien ou une fraction de colonie, (ii) les six amorces ci-dessus mentionnées ont été mélangées ensembles, (iii) les étapes de PCR ont été comme suit : dénaturation 4 minutes à 94 C, 30 cycles à 5 secondes à 94 C et 10 secondes à 59 C, et une étape d'extension finale de 5 minutes à 72 C.
Transfert par Southern. Le transfert par Southern a été réalisé par transfert par capillarité sur des membranes en nylon chargées positivement. L'hybridation a été réalisée à 65 C dans SDS 1%/ NaCl 1 M/Tris 50 mM HCl, pH 7,5/1% d'agent bloquant (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne). Les membranes ont été lavées dans 2xSSC pendant 15 minutes à la température ambiante; ensuite dans 2xSSC/0,1% SDS pendant 30 minutes à 65 C, et enfin dans 0,1xSSC pendant 5 minutes à température ambiante. La détection de chimioluminescence a été réalisée selon les instructions du fabricant (DIG Luminescence Detection Kit pour acides nucléiques, Boehringer Mannheim). Les sondes ont été produites par PCR selon les instructions du fabricant (PCR DIG Probe Synthesis Kit, Boehringer Mannheim) et en utilisant les amorces et la procédure d'amplification décrite ci-dessus pour le protocole standard.
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Résultats Deux cent vingt souches ont été analysées. Leur groupe phylogénétique déterminé par les méthodes de référence sont les suivantes : 43 souches appartiennent au groupe A, 23 au groupe B1, 41 au groupe D et 113 au groupe B2.
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TABLEAU 4
Figure img00480001

Amplification ar l'CR des gènes chuA et yjuA et du fragment "'ADN TSPE4-C2 chez des souches E. coli de diversion collections, en fonction de leur groupe phylogénétique
Figure img00480002
<tb> Collection <SEP> de <SEP> souches <SEP> Méthode <SEP> groupes <SEP> selon <SEP> RM <SEP> nombre <SEP> de <SEP> souches <SEP> présentant <SEP> une <SEP> amplication <SEP> positive
<tb>
Figure img00480003

ou isolats (nombre de souches) dinA ) jcr1 'ISI'(:l C2 A (25) () 18(72%) 0 ECO 1 m 1-1 E Fil m (16) () 1 ( (1<1 ) 1 5 (9 tl % ) (|I=OH) D(12) )2()UU%) 0 2 (17 i ---------------------~flJJll~~~~~~--J~OO%) \ 5 (100%) 12 (80%) ---- ..., 1\ 5) 0 5 ( 1 UO%) U.
Méningite R'botypage 131 (3) 0 1 (33%) 2(66%) NT eonatale 1 0 ypage D(t8) 18(100%) 0 2(11%) ~~~~ (n=f3G) 132 (60) , 60 (1 OU%) 60 (1 OU%) 59 (98%) Autres souches Méthode A ( 2) () 9(75%) rlininiios Méthode BI ('1) 0 U 4()OU%) cIIIIH!UeS selon l'invention 1) ( I I ) Il (100%) U \ (9ry,) -- I. ~!!=Ot cvli IO 12 - M LCIJ 132 /1 ( ( I ) ~37 ( I () UU%) 37 ( l [ UU%) 34 (92%) E. coli )02 MLEE 1\ ( 1 0 0 Il. coli .196 Ribotypage (cette étude) n2 ( p 1 1 0 Autres souches n (13) U 33 (77%) 0 cliniques 01 (23) 0 2(9%) 21 (91%) (ii=220) [32 D ( (4 [ [ I ) 'il (1001/0) 0 oo io) 5 (12%) 132 (113) 113 (100%) 113 (100%) 105 (93%) R.M.: groupes phylogénétiques déterminés par les méthodes de référence (MLEE ou ribotypage)
Figure img00480004

MLEE : électrophorèse enzymatique multilocus Herzer et ai. 1990, J. Bactérie!. 172-6175-6178.
Itibolyp.gc ; Binzen et al. 1998 J. Infect. Dis. 177:642-650
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Le tableau 4 montre les résultats obtenus avec la méthode selon l'invention et les méthodes de référence pour l'ensemble complet des souches selon le groupe phylogénétique. Le gène chuA est présent dans toutes les souches appartenant au groupe B2 et D, et absent de toutes les souches des groupes A et B l. Ceci permet de séparer efficacement les groupes B2/D des groupes A/B1. De la même manière, le gène yjaA permet une discrimination parfaite entre les groupes B2 (100% des souches positives) et D (100% des souches négatives). Enfin, le nouveau clone TspE4. C2 est présent dans toutes les souches de groupe B1sauf 2, et absent de toutes les souches de groupe A. Tous les résultats PCR ont été confirmés par hybridation Southern. Les résultats de ces trois amplifications ont permis d'établir un arbre de décision dichotomique pour le groupage phylogénétique. Cet arbre décisionnel est notamment illustré en figure 3. En suivant cet arbre, 218 des 220 souches testées (99%) sont correctement groupées par rapport aux méthodes de référence, alors que seulement deux souches considérées comme appartenant au groupe B1 selon les méthodes de référence sont identifiées comme étant du groupe A avec la technique selon l'invention. Des résultats identiques ont été obtenus avec les protocoles standards et simplifiés de PCR. La figure 4 illustre les différents profils qui ont été obtenus par PCR triplex pour les quatre groupes phylogénétiques. Ces nouveaux profils constituent donc des références d'analyse pour le groupage phylogénétique de E. coli.
Discussion Les inventeurs ont développé une méthode PCR pour déterminer rapidement le groupe phylogénétique des souches E. coli. A l'aide de deux gènes chuA et yjaA, et d'un nouveau fi-agment d'ADN désigné TSPE4. C2 (SEQ ID N 119, cf. exemple 1), ont été déterminés les groupes phylogénétiques de 220 souches qui avaient été précédemment affectées à des groupes phylogénétiques déterminés à l'aide des méthodes connues. La précision d'analyse obtenue selon l'invention excède les 99% par rapport aux groupages établis avec les méthodes de l'art antérieur. De plus, les
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mêmes résultats ont été observés avec une méthode PCR triplex techniquement très simple qui s'applique directement aux colonies bactériennes.
La caractérisation phylogénétique des souches E. coli sur la base de quelques caractéristiques génotypiques ou phénotypiques apparaissait dans Fart antérieur très difficile. De telles caractéristiques génotypiques (présence ou absence d'un gène par exemple) doivent répondre à différents critères afin de pouvoir être utilisées pour la caractérisation phylogénétique. Tout d'abord, le gène doit avoir été acquis ou avoir être délété lorsque le groupe qu'il caractérise a émergé. Deuxièmement, ce même gène doit avoir été "stabilisé", de manière à écarter tout phénomène de délétion ou de transfert horizontal subséquent vers des bactéries appartenant à d'autres groupes phylogénétiques. Enfin, les phénomènes de recombinaisons chez le gène candidat doivent être très rares. En d'autres termes, le produit du gène ne doit pas être une cible pour la sélection naturelle, ce qui favoriserait de nouvelles recombinaisons génétiques. Dans l'art antérieur, les tentatives pour identifier des caractéristiques de groupes phylogénétiques basées sur le phénotype ou sur le génotype ne se sont pas montrées suffisamment discriminantes. Pour la première fois, est ici décrite l'utilisation combinée de deux gènes et d'un nouveau fragment d'ADN qui permettent de manière techniquement très simple de déterminer avec une bonne efficacité le groupe phylogénétique.
Toutefois, deux souches (ECOR 70 et une ECNM) appartenant selon les techniques classiques au groupe phylogénétique B1ont été classées par la méthode selon l'invention dans le groupe A. Cet écart d'analyse peut être expliqué par le fait qu'il puisse exister une base génétique intermédiaire commune à ces deux groupes de souches, et par le fait que la région étudiée par la méthode selon l'invention (chuA, yjaA et TSPE4. C2, sont localisées à 78,7 minutes, 90,8 minutes et approximativement à 87 minutes, respectivement, sur le génome de E. coli K12) pourrait être plus proche du groupe A que les régions étudiées à l'aide des méthodes de l'art antérieur. En effet, il a été démontré que les groupes A et B1sont des groupes frères. De plus, des analyses récentes de séquences nucléotidiques chromosomiques multiples montrent que ECOR 70 peut être considérée comme une souche "hybride", dans laquelle quelques gènes domestiques présentent des
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séquences nucléotidiques communes avec souches ECOR de groupe A, et dans laquelle quelques autres gènes présentent des séquences nucléotidiques communes avec les souches ECOR de groupe Bl. L'appartenance phylogénétique de ECOR 70 au groupe B1 n'est pas clairement déterminée, il est en tout état de cause considéré comme faisant partie du groupe A avec 1 méthode selon l'invention.
En sus de la rapidité de notre nouvelle méthode PCR, l'invention présente l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation d'une collection de référence telle que la souche ECOR ou une autre collection, ce qui veut dire que l'analyse peut aisément réalisée en laboratoire et notamment pour des analyses de routine. De plus, contrairement aux autres méthodes, l'affectation aux groupes phylogénétiques est sans équivoque.
En effet, les 4 souches jusqu'alors non classées dans la collection ECOR (E31, 37, E42 et E43) peuvent être classées grâce à la méthode de l'invention : les trois premières souches appartiennent au groupe D et la quatrième au groupe A. Il peut être également remarqué que toutes les séquences des gènes domestiques étudiés dans cette dernière souche apparaissent caractéristiques de celles trouvées chez les souches de groupe A.
En conclusion, cette technique de groupage phylogénétique simple et rapide présente de nombreuses applications pratiques. La première est bien entendu l'application bioclinique, en tenant compte du lien qui peut être établi entre le groupe phylogénétique et l'éventuelle virulence ou dangerosité. La seconde application correspond à un outil de criblage biotechnologique qui permet d'éliminer des souches potentiellement pathogènes, c'est-à-dire à fort niveau de dangerosité, lorsque l'on recherche des souches candidates pour le clonage. De tels outils de criblages ont pu être développés dans l'art antérieur, par exemple pour identifier les souches E. coli K-12 par PCR ou pour détecter des souches E. coli qui ne présentent aucun des gènes de virulence qui étaient jusqu'alors connus à l'aide d'une procédure de buvardage en tâches inversé ( reverse dot blot ). La méthode ici décrite présente l'avantage notable de permettre l'identification de souches non pathogènes autres que E. coli K12, et d'être appropriée pour le criblage de souches à grande échelle.
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EXEMPLE 5
Application thérapeutique des nouveaux produits B2+ A- Les clones B2+ A- isolés selon l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication d'une composition, notamment d'une composition pharmaceutique, destinée à la prévention et/ou la palliation et/ou la thérapie d'une infection à E. coli, et notamment de la présence extra-intestinale de bactéries E. coli, telle qu'une septicémie, une infection urinaire, infection méningée chez le nouveau-né. De tels produits sont adaptées au traitement et/ou à la prévention et/ou à la palliation de septicémies, et sont particulièrement utiles dans le cadre d'infections nosocomiales avérées ou potentielles.
La région 5 (cf notamment exemples 1 et 3) apparaît comme une source avantageuse pour la fabrication de produits à large spectre anti-coli B2. Les régions 1, 3, et 4 apparaissent quant à elles comme des sources avantageuses pour la fabrication de produits anti-septicémie à méningite, et notamment anti-méningite néonatale.
L'invention vise notamment les compositions, notamment les compositions pharmaceutiques, comprenant au moins un desdits nouveaux ADN, ou au moins un desdits nouveaux ORF, ou au moins un polypeptide dont la séquence peut être considérée comme correspondant selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code, à un de ces ADN ou ORF. Elle vise également l'utilisation des ADN connus à propriété B2+ A- nouvelle tels que chuA, les fragments à propriété B2+ A- de chuA, et des polypeptides correspondants à ces ADN pour la fabrication de telles compositions. Lorsque les produits utilisés sont immunogènes, des solutions vaccinales peuvent être mises au point.
Alternativement, ces ADN ou polypeptides peuvent être utilisés pour cribler des banques chimiques et/ou biologiques de manière à identifier des composés capables de se lier à eux et de bloquer le développement extra-intestinal de bactéries E. coli.
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La formulation et la posologie de telles compositions peuvent être mises au point et ajustées par l'homme du métier en fonction de l'indication médicale visée, du mode d'administration souhaité, et du patient considéré (âge, poids, sexe, état).
Ces compositions peuvent en outre notamment comprendre un ou plusieurs véhicules physiologiquement inertes, et notamment tout excipient adapté à la formulation galénique et/ou au mode d'administration souhaité (comprimé, patch, gélule, poudre, spray, solution buvable, solution injectable, colloïde). Elles peuvent également comprendre un ou plusieurs co-agent(s) actif(s) afin de moduler l'intensité d'activité du composé B2+ A- selon l'invention, ou de moduler son régime d'activité, ou bien de moduler le ciblage de son activité. Elles peuvent également comprendre d'autres agents utiles à la prévention et/ou la palliation et/ou le traitement d'une infection, sans que ces agents présentent une quelconque interaction avec les composés B2+ A- selon l'invention.
Préférentiellement, les polynucléotides et polypeptides à propriété B2+ A- nouvelle selon l'invention sont utilisés pour.identifier, par exemple par criblage de banque(s) chimique (s) et/ou biologique (s), composés capables d'inhiber in vivo ou dans des conditions mimant au mieux le in vivo, l'activité d'une protéine dont l'ORF comprend un polynucléotide à propriété B2+ A- nouvelle selon l'invention. De tels composés peuvent notamment être compris dans des compositions, notamment des compositions pharmaceutiques, destinées à inhiber la croissance de E. coli, et notamment sa croissance extra-intestinale. La présente invention a pour objet une telle méthode d'identification, les composés tels qu'obtenus par une telle méthode, et de telles compositions.

Claims (24)

  1. parmi le groupe constitué par NotI et Blini, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 134, 144,109, 115,140, 135, 33, 56, 122,130, 141,25, 48,51, 57, 121, 44, 45, 113, 119 ; 120, 23, 52, et par séquençage des fragments sélectionnés, - les séquences des ORF qui comprennent une de ces séquences, - les séquences variantes ou fractionnelles conservatrices de ces séquences.
    Figure img00540001
    REVENDICATIONS 1. Polynucléotide isolé dont la séquence correspond à une séquence choisie parmi le groupe constitué par : - les séquences SEQ ID N 1à N 153, - les séquences polynucléotidiques qui sont telles qu'obtenues par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction choisie
  2. 2. Couple d'amorces permettant l'amplification par PCR d'au moins un polynucléotide selon la revendication 1.
  3. 3. Couple d'amorces selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il correspond au couple SEQ ID N 164 et N 165 .
  4. 4. Sonde nucléotidique comprenant au moins un polynucléotide selon la revendication 1.
  5. 5. Polynucléotide anti-sens, caractérisé en ce que sa séquence correspond à l'antisens d'au moins un polynucléotide selon la revendication 1.
  6. 6. Polypeptide isolé, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés correspond à une séquence codée, selon le code génétique universel et en tenant compte de la dégénérescence de ce code, par au moins un polynucléotide selon la revendication 1.
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  7. 7. Produit liant, caratérisé en ce qu'il est capable de se lier à au moins un polypeptide selon la revendication 6.
  8. 8. Vecteur comprenant au moins un polynucléotide selon la revendication 1.
  9. 9. Cellule transformée par génie génétique, caractérisée en ce qu'elle comprend par transfection au moins un polynucléotide selon la revendication 1, et/ou au moins un vecteur selon la revendication 8, et/ou en ce que ladite transformation induit la production par cette cellule d'au moins un polypeptide selon la revendication 6.
  10. 10. Composition comprenant au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par les polynucléotides selon la revendication 1, les polypeptides selon la revendication 6, les vecteurs selon la revendication 8, les cellules selon la revendication 9.
  11. 11. Composition comprenant au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par les polynucléotides selon la revendication 1, les couples d'amorces selon la revendication 2 et 3, les sondes selon la revendication 4, les produits liants selon la revendication 7.
  12. 12. Composition comprenant au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par lés polynucléotides antisens selon la revendication 5, les produits liants selon la revendication 7.
  13. 13. Utilisation d'au moins un composé polynucléotidique choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
    170,171, 174,175, 178,179, 183, 185,186, 190,191, 193, 194,
    <Desc/Clms Page number 56>
    211, à l'exception des polynucléotides sfa, hly, cnfl, pap/prs, hra, ibe 10, - les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF comprenant une séquence d'un de ces polynucléotides, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides, - les couples d'amorces, les sondes et les polynucléotides antisens dont la séquence est telle que dérivée de ces polynucléotides, - les produits liants qui sont capables de se lier à ces polynucléotides, pour la détermination phylogénétique d'une bactérie E. coli.
    123, 116, 43, 40,127, 133, 27, 34, 36, 42, 46, 54,55, 38, 128, 151,
    choisie parmi le groupe constitué par NotI et BINI, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125,
    Figure img00560001
    221, 233, 234, 235, 241, 244, 246, 247, 248, 250, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction
    195,196, 199,200, 202,205, 206,208, 209,211, 214,218, 220,
  14. 14. Utilisation d'au moins un composé polynucléotidique choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
    170,171, 174,175, 178,179, 183,185, 186,190, 191,193, 194,
    195,196, 199,200, 202,205, 206,208, 209,211, 214,218, 220,
    221,233,234,235,241,244,246,247,248,250, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction
    Figure img00560002
    choisie parmi le groupe constitué par Notl et Blril, par sélection de
    <Desc/Clms Page number 57>
    211, à l'exception des polynucléotides sfa, hly, con}1, pap-prs, hrci, ibe 10, - les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF comprenant une séquence d'un de ces polynucléotides, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides, - les polypeptides dont la séquence correspond selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code, à ces polynucléotides, - les vecteurs comprenant au moins un de ces polynucléotides, - les cellules transformée par génie génétique qui comprennent au moins un de ces polynucléotides, et/ou au moins un de ces vecteurs et/ou dont la transformation induit la production d'au moins un de ces polypeptides, pour la fabrication d'une composition destinée à pallier, et/ou prévenir, et/ou traiter une croissance non désirée de E. coli.
    Figure img00570001
    ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125, 123,116, 43, 40,127, 133, 27, 34, 36,42, 46,54, 55,38, 128, 151,
  15. 15. Méthode permettant d'identifier un composé capable d'inhiber la croissance d'une bactérie E. coli, et notamment son développement extra-intestinal, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection d'au moins un composé : i. capable de se lier à au moins un polynucléotide choisiparmi le groupe constitué par : - les polynucléotides selon la revendication 1, - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
    170,171, 174,175, 178,179, 183, 185,186, 190,191, 193, 194,
    <Desc/Clms Page number 58>
    211, à l'exception des polynucléotides .sfà, hly, cnfl, papprs, hra, ibe 10, - les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF comprenant une séquence d'un de ces polynucléotides, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides, et ii. capable d'inhiber la transcription et/ou la traduction correcte de ce polynucléotide.
    Figure img00580002
    choisie parmi le groupe constitué par NotI et Binl, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125, 123, 116, 43, 40,127, 133, 27, 34, 36, 42, 46, 54, 55, 38, 128, 151,
    Figure img00580001
    195,196, 199,200, 202,205, 206,208, 209,211, 214,218, 220, 221, 233, 234, 235, 241, 244, 246, 247, 248, 250 , - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction
  16. 16. Méthode permettant d'identifier un composé capable d'inhiber la croissance d'une bactérie E. coli, et notamment son développement extra-intestinal, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection d'au moins un composé capable d'inhiber l'activité d'une protéine dont l'ORF comprend un polynucléotide choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides selon la revendication 1, - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
    170,171, 174,175, 178,179, 183, 185,186, 190,191, 193, 194,
    195,196, 199,200, 202,205, 206,208, 209,211, 214,218, 220, 221, 233, 234, 235, 244, 246, 247, 248, 250, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction
    <Desc/Clms Page number 59>
    211, à l'exception des polynucléotides sfà, hly, cnfl, papers, hra, ibe 10, - les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF (cadre de lecture ouvert) comprenant la séquence d'un de ces polynucléotides, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides.
    Figure img00590002
    choisie parmi le groupe constitué par Noil et BlXI, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125, 123,116, 43, 40,127, 133, 27, 34, 36,42, 46, 54,55, 38, 128, 151,
    Figure img00590001
  17. 17. Composition comprenant au moins un composé tel qu'identifié par la méthode selon la revendication 15 ou 16.
  18. 18. Méthode d'identification phylogénétique, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la présence ou de l'absence d'au moins un polynucléotide choisi parmi le groupe constitué par: - les polynucléotides selon la revendication 1, - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
    170,171, 174,175, 178,179, 183,185, 186,190, 191,193, 194,
    195,196, 199,200, 202,205, 206,208, 209,211, 214,218, 220, 221,233,234,235,241,244,246,247,248,250, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction choisie parmi le groupe constitué par NotI et Blnl, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125,
    123,116, 43,40,127, 133, 27, 34, 36,42, 46,54, 55, 38, 128,151,
    <Desc/Clms Page number 60>
    211, à l'exception des polynucléotides sfa, hly, cnf1, paplprs, hra, ibe 10, - les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF (cadre de lecture ouvert) comprenant la séquence d'un de ces polynucléotides, - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides.
  19. 19. Méthode d'identification phylogénétique, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en #uvre d'au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par : - les polynucléotides selon la revendication 1, - les couples d'amorces selon la revendication 2 et 3, - les sondes selon la revendications 4, - les produits liants selon la revendication 7, - les polynucléotides antisens selon la revendication 5, - les composés tels qu'identifiés par la méthode selon la revendication 15 ou 16, - les polynucléotides correspondant au gène chuA et à son opéron, - les polynucléotides dont la séquence correspond à SEQ ID N 169,
    170,171, 174,175, 178,179, 183, 185,186, 190,191, 193,194,
    195,196, 199,200, 202,205, 206,208, 209,211, 214,218, 220, 221, 233, 234, 235, 241, 244, 246, 247, 248, 250, - les polynucléotides qui sont tels qu'obtenus par digestion de l'ADN total d'une E. coli de groupe B2 avec une enzyme de restriction choisie parmi le groupe constitué par NotI et BlnI, par sélection de ceux des fragments obtenus qui s'hybrident à au moins une séquence choisie parmi le groupe constitué par SEQ ID N 125,
    123, 116, 43, 40,127, 133, 27, 34, 36, 42, 46, 54, 55, 38, 128, 151,
    Figure img00600001
    211, à l'exception des polynucléotides sfà, hly, cnfl, pap/prs, hra, ibe 10,
    <Desc/Clms Page number 61>
    - les polynucléotides dont la séquence correspond à un ORF comprenant une séquence d'un des polynucléotides cités dans les trois paragraphes précédents.
    - les polynucléotides dont la séquence correspond à une séquence variante ou fractionnelle conservatrice de la séquence d'au moins un de ces polynucléotides, - les couples d'amorces, les sondes et les polynucléotides antisens dont la séquence est telle que dérivée de ces polynucléotides, - les produits liants qui sont capables de se lier à ces polynucléotides.
  20. 20. Méthode selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce qu'elle met en outre en #uvre la détection de la présence ou de l'absence du gène yjaA.
  21. 21. Méthode de diagnostic d'une infection E. coli de contrôle sanitaire, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre la méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
  22. 22. Méthode de contrôle sanitaire, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre la méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
  23. 23. Méthode de sélection de souches E. coli appropriées aux manipulation biotechnologiques, caractérisée en ce qu'elle met en #uvre la méthode d'identification selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
  24. 24. Kit pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, éventuellement assorti d'un mode d'emploi.
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