FR2798391A1

FR2798391A1 - THYROID ENZYME NADPH OXYDASE, NUCLEIC ACID ENCODING THIS ENZYME AND THEIR APPLICATIONS

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Publication number: FR2798391A1
Application number: FR9911528A
Authority: FR
Inventors: Corinne Dupuy; Renee Ohayon; Alain Virion; Hudson Marie Sophie Noel; Danielle Deme; Jean Paul Blondeau
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1999-09-15
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2001-03-16
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: FR2798391B1; WO2001020001A1

Abstract

The invention concerns a thyroid enzyme, the only or main component of thyroid NADPH oxidase, the nucleic acid coding for said enzyme and their diagnostic and therapeutic applications, in particular in hyperthyroidoses, hypothyroidoses, thyroid cancers and other malignant tumours.

Description

La présente invention concerne une enzyme thyroïdienne, composant de la NADPH oxydase de thyroïde, l'acide nucléique codant pour cette enzyme et leurs applications diagnostiques et thérapeutiques. The present invention relates to a thyroid enzyme, a component of thyroid NADPH oxidase, the nucleic acid encoding this enzyme, and their diagnostic and therapeutic applications.

La thyroperoxydase (TPO) est l'enzyme qui catalyse l'iodation de la thyroglobuline et le couplage des iodotyrosines en hormones. Mais la TPO en tant que telle ne présente aucune activité catalytique. L'activité peroxydasique n'est en effet catalysée que par le "composé I", ainsi que par les composés enzymatiques qui en dérivent. C'est la réaction d'oxydation de l'hème de la TPO par une molécule de peroxyde d'hydrogène (H202) qui conduit à la formation du composé I. Sans H202, il ne peut donc y avoir de biosynthèse des hormones. Thyroperoxidase (TPO) is the enzyme that catalyzes the iodization of thyroglobulin and the coupling of iodotyrosines into hormones. But TPO as such has no catalytic activity. The peroxidase activity is in fact catalyzed only by "compound I", as well as by the enzymatic compounds which are derived therefrom. It is the heme oxidation reaction of TPO by a hydrogen peroxide molecule (H202) which leads to the formation of compound I. Without H202, there can therefore be no biosynthesis of hormones.

Le thyrocyte contient un système enzymatique capable de produire des quantités importantes de H202. Il est évident que l'activité d'un tel système doit être rigoureusement contrôlée pour autoriser la formation d'une quantité de H202 suffisante pour la synthèse des hormones et le stockage de l'iodure, tout en évitant cependant la surproduction de cet oxydant puissant. Le rôle essentiel du peroxyde d'hydrogène dans la synthèse hormonale et le stockage de l'iode ainsi que ses propriétés oxydantes font aussi de l'enzyme qui le génère, une source potentielle de troubles thyroïdiens, rendant d'autant plus intéressante son identification moléculaire. The thyrocyte contains an enzymatic system capable of producing significant quantities of H202. It is obvious that the activity of such a system must be rigorously controlled to allow the formation of an amount of H202 sufficient for the synthesis of hormones and the storage of iodide, while avoiding however the overproduction of this powerful oxidant. . The essential role of hydrogen peroxide in hormonal synthesis and the storage of iodine as well as its oxidizing properties also make the enzyme which generates it, a potential source of thyroid disorders, making its molecular identification all the more interesting. .

Bien qu'une production de H202 par des coupes de thyroïde ait été mise en évidence en 1970, la nature biochimique du système générateur est restée longtemps hypothétique. Although production of H202 by thyroid sections was demonstrated in 1970, the biochemical nature of the generator system remained hypothetical for a long time.

En 1981, Bjôrkman et al ont localisé cytochimiquement un système générateur de H202 au pôle apical de follicules ouverts de thyroïde de rat. Cette localisation coïncidait parfaitement avec celle du site majeur d'iodation, mise en évidence à la fin des années 70 à l'interface de la membrane apicale et de la lumière folliculaire (Ekholm et al, 1981), et suggérait fortement qu'il s'agissait d'une enzyme associée à la membrane plasmique. Le seul système générateur de H202 connu associé à la membrane plasmique étant la NADPH oxydase de phagocytes, les mêmes auteurs ont proposé que cette enzyme ou une enzyme similaire soit impliquée dans la biosynthèse des hormones thyroïdiennes. In 1981, Bjôrkman et al cytochemically localized a H202 generating system at the apical pole of open rat thyroid follicles. This location coincided perfectly with that of the major iodization site, demonstrated in the late 1970s at the interface of the apical membrane and the follicular lumen (Ekholm et al, 1981), and strongly suggested that it was an enzyme associated with the plasma membrane. The only known H202 generating system associated with the plasma membrane being NADPH oxidase from phagocytes, the same authors have proposed that this enzyme or a similar enzyme be involved in the biosynthesis of thyroid hormones.

Conformément à l'hypothèse de Bjôrkman et al, Dème et al en
1985 ont rapporté une formation de H202 en système acellulaire en incubant des particules de thyroïde de porc avec du NADPH, puis ont montré que cette production de H202 était stimulée réversiblement par des concentrations submicromolaires de Ca2+. En 1987, Nakamura et al confirmaient l'existence d'une NADPH oxydase dépendante du Ca2+ dans une fraction enrichie en membranes plasmiques et en cytosquelette d'actine. In accordance with the hypothesis of Bjôrkman et al, Dème et al in
1985 reported the formation of H202 in the acellular system by incubating pig thyroid particles with NADPH, then showed that this production of H202 was reversibly stimulated by submicromolar concentrations of Ca2 +. In 1987, Nakamura et al confirmed the existence of a Ca2 + -dependent NADPH oxidase in a fraction enriched in plasma membranes and in actin cytoskeleton.

La solubilisation de la NADPH oxydase des membranes plasmiques de thyroïde de porc s'est avérée délicate (Gorin et al, 1996). Une augmentation importante de la force ionique en présence de cytochalasine B et de détergent a été nécessaire pour obtenir son extraction de la membrane. La NADPH oxydase ainsi solubilisée est toutefois fortement affectée par ce traitement, puisqu'elle devient incapable de produire de l'H202. Une dialyse de plusieurs heures de l'extrait restaure la production NADPH-dépendante de
H202, ainsi que sa dépendance vis à vis du Ca2+,montrant que si l'enzyme est formée de plusieurs facteurs, tous ses composants ont bien été solubilisés. Le pourcentage de reconstitution de l'activité varie entre 50 et 90 % selon les extraits. Solubilization of NADPH oxidase from pig thyroid plasma membranes has been shown to be difficult (Gorin et al, 1996). A significant increase in ionic strength in the presence of cytochalasin B and detergent was necessary to obtain its extraction from the membrane. The NADPH oxidase thus solubilized is however strongly affected by this treatment, since it becomes unable to produce H2O2. Dialysis of the extract for several hours restores the NADPH-dependent production of
H2O2, as well as its dependence on Ca2 +, showing that if the enzyme is formed from several factors, all of its components have been solubilized. The percentage of reconstitution of the activity varies between 50 and 90% depending on the extracts.

A la suite de la solubilisation, Gorin et al ne sont cependant parvenus qu'à purifier seulement partiellement l'enzyme. Following solubilization, Gorin et al, however, only partially purified the enzyme.

Les auteurs de la présente invention ont maintenant réussi à cloner l'acide nucléique codant pour un polypeptide qui est le composant unique ou majeur de la NADPH oxydase de thyroïde, obtenant par suite la séquence d'acides aminés de ce polypeptide. The authors of the present invention have now succeeded in cloning the nucleic acid coding for a polypeptide which is the single or major component of the thyroid NADPH oxidase, thereby obtaining the amino acid sequence of this polypeptide.

La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé, composant unique ou majeur de la NADPH oxydase de thyroïde comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID n 2, ou
SEQ ID n 4. Ce composant a été désigné par p138tox
La séquence SEQ ID n 2 représente la séquence d'acides aminés de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde humaine. The subject of the present invention is therefore an isolated polypeptide, a single or major component of the thyroid NADPH oxidase comprising an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 2, or
SEQ ID No. 4. This component has been designated by p138tox
The sequence SEQ ID No. 2 represents the amino acid sequence of the p138tox of human thyroid NADPH oxidase.

La séquence SEQ ID n 4 représente la séquence d'acides aminés de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde de porc. The sequence SEQ ID No. 4 represents the amino acid sequence of the p138tox of pig thyroid NADPH oxidase.

Sont également compris dans l'invention les polypeptides homologues des polypeptides de séquence SEQ ID n 2 ou n 4. Also included in the invention are polypeptides homologous to polypeptides of sequence SEQ ID No. 2 or No. 4.

Par polypeptide homologue , on entend tout polypeptide ayant une séquence d'acides aminés qui diffère des séquences SEQ ID n 2 ou n 4 par substitution, délétion et/ou insertion d'un ou plusieurs acides aminés, à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité de la p138tox. The term “homologous polypeptide” means any polypeptide having an amino acid sequence which differs from the sequences SEQ ID No. 2 or No. 4 by substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids, at positions such that these modifications do not do not significantly affect the activity of p138tox.

Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe, tels que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine). Said substitutions are preferably conservative substitutions, that is to say substitutions of amino acids of the same class, such as substitutions of amino acids with uncharged side chains (such as asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as aspartic acid and glutamic acid); amino acids with apolar side chains (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine).

De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est identique à au moins 65 %, de préférence au moins 75 %, de préférence au moins 85 %, de préférence encore au moins 95 % des séquences SEQ ID n 2 ou n 4. Preferably, such a homologous amino acid sequence is identical to at least 65%, preferably at least 75%, preferably at least 85%, more preferably at least 95% of the sequences SEQ ID n 2 or n 4.

Ces séquences homologues peuvent être notamment des séquences d'autres espèces de mammifères que l'homme ou le porc. Ces séquences homologues comprennent également tout fragment des séquences SEQID n 2 ou n 4 possédant l'activité biologique de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde. These homologous sequences can in particular be sequences of other mammalian species than humans or pigs. These homologous sequences also include any fragment of the sequences SEQID n 2 or n 4 having the biological activity of the p138tox of the thyroid NADPH oxidase.

Par "activité biologique de la p13tox", on se réfère notamment à l'activité connue et mesurable de la NADPH oxydase de thyroïde : il s'agit de la production d'H202 et/ou d'activités de réduction d'accepteurs d'électrons exogènes tels que par exemple le nitroblue tetrazolium (NBT) et le ferricyanure de potassium. Cette enzyme transmembranaire transfére les électrons du NADPH cytosolique vers l'oxygène moléculaire dans la lumière du follicule thyroïdien. Elle fournit ainsi le peroxyde d'hydrogène indispensable à l'activité de la thyroperoxydase, qui peut alors oxyder l'iodure et ioder la thyroglobuline. By "biological activity of p13tox", we refer in particular to the known and measurable activity of thyroid NADPH oxidase: it is the production of H2O2 and / or activities of reduction of acceptors of exogenous electrons such as, for example, nitroblue tetrazolium (NBT) and potassium ferricyanide. This transmembrane enzyme transfers electrons from the cytosolic NADPH to molecular oxygen in the lumen of the thyroid follicle. It thus provides the hydrogen peroxide essential for the activity of thyroperoxidase, which can then oxidize iodide and iodize thyroglobulin.

L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie (i.e. identité) est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions. Homology is usually determined using sequence analysis software (for example, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Similar amino acid sequences are aligned to obtain the maximum degree of homology (i.e. identity). To this end, it may be necessary to artificially introduce gaps in the sequence. Once the optimal alignment has been achieved, the degree of homology (i.e. identity) is established by recording all the positions for which the amino acids of the two sequences compared are identical, relative to the total number of positions.

La présente invention a également pour objet un acide nucléique isolé codant pour un polypeptide ayant une activité de p138tox, tel que défini cidessus. The present invention also relates to an isolated nucleic acid encoding a polypeptide having p138tox activity, as defined above.

La présente invention concerne plus particulièrement les acides nucléiques comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n 1, SEQ ID n 3, toute séquence homologue biologiquement actif desdites séquences. The present invention relates more particularly to nucleic acids comprising a nucleotide sequence chosen from the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, any biologically active homologous sequence of said sequences.

La séquence SEQ ID n 1 représente la séquence d'ADNc codant pour la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde humaine. The sequence SEQ ID No. 1 represents the cDNA sequence coding for the p138tox of human thyroid NADPH oxidase.

La séquence SEQ ID n 3 représente la séquence d'ADNc codant pour la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde de porc. The sequence SEQ ID No. 3 represents the cDNA sequence coding for the p138tox of pig thyroid NADPH oxidase.

Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 3 par substitution, délétion, et/ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues codent pour des polypeptides tels que définis précédemment. By "homologous nucleotide sequence" is meant any nucleotide sequence which differs from the sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3 by substitution, deletion, and / or insertion of one or more nucleotides, at positions such as these nucleotide sequences. homologs code for polypeptides as defined above.

De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 60 % des séquences SEQ ID n 1 ou n 3, de préférence au moins 70 %, de préférence encore au moins 95 %. Preferably, such a homologous nucleotide sequence is identical to at least 60% of the sequences SEQ ID n 1 or n 3, preferably at least 70%, more preferably at least 95%.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires des séquences SEQ ID n 1 ou n 3, dans des conditions stringentes. Les Preferably, such a homologous nucleotide sequence hybridizes specifically to the sequences complementary to the sequences SEQ ID No. 1 or No. 3, under stringent conditions. The

paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0,41(%G+C)+16,6Log(concentration en cations) - 0,63 (%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62). For sequences comprising more than 30 bases, Tm is defined by the relation: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C) + 16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - ( 600 / number of bases) (Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) 2 (A+T). For sequences of length less than 30 bases, Tm is defined by the relation: Tm = 4 (G + C) 2 (A + T).

Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple. Under appropriate stringency conditions, to which the aspecific sequences do not hybridize, the hybridization temperature is approximately 5 to 30 C, preferably 5 to 10 C below Tm, and the hybridization buffers used are preferably solutions of high ionic strength such as a 6xSSC solution for example.

Les séquences nucléotidiques homologues comprennent également tout fragment des séquences SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 3, qui code pour un peptide possédant l'activité biologique de la p138tox, telle que définie précédemment. The homologous nucleotide sequences also include any fragment of the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3, which codes for a peptide having the biological activity of p138tox, as defined above.

Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n 1 ou n 3. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art. The different nucleotide sequences of the invention can be of artificial origin or not. They may be DNA or RNA sequences, obtained by screening of sequence banks using probes prepared on the basis of the sequence SEQ ID No. 1 or No. 3. Such banks can be prepared by techniques molecular biology classics known to those skilled in the art.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques. The nucleotide sequences according to the invention can also be prepared by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening libraries.

Les séquences nucléotidiques de l'invention permettent la réalisation de sondes nucléotidiques, hybridant spécifiquement avec une séquence SEQ ID n 1 ou n 3 selon l'invention. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique The nucleotide sequences of the invention allow the production of nucleotide probes, specifically hybridizing with a sequence SEQ ID No. 1 or No. 3 according to the invention. Appropriate hybridization conditions correspond to temperature and ionic strength conditions

usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes telles que définies précédemment. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, notamment d'hybridation "in situ", de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'un mauvais épissage. Les anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme et les éventuelles mutations peuvent être mises en évidence par la technique dite de PCR (réaction en chaîne par la polymérase) en utilisant des amorces spécifiques déterminées à partir des séquences ID n 1 ou ID n 3. usually used by those skilled in the art, preferably under stringent conditions as defined above. Such probes are also part of the invention. They can be used as an in vitro diagnostic tool for the detection, by hybridization experiments, in particular of "in situ" hybridization, of specific transcripts of the polypeptides of the invention in biological samples or for the demonstration of aberrant syntheses or improper splicing. Genetic anomalies resulting from polymorphism and possible mutations can be demonstrated by the technique known as PCR (polymerase chain reaction) using specific primers determined from the sequences ID n 1 or ID n 3.

Les sondes de l'invention comportent au minimum 10 nucléotides, et de préférence au moins 14 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 50 nucléotides, et au maximum comportent la totalité de la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou n 3 ou de leur brins complémentaires. The probes of the invention comprise at least 10 nucleotides, and preferably at least 14 nucleotides, preferably at least 20 nucleotides, preferably still at least 50 nucleotides, and at most comprise the entire nucleotide sequence SEQ ID n 1 or n 3 or their complementary strands.

Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique. Preferably, the probes of the invention are marked, prior to their use. For this, several techniques are within the reach of those skilled in the art such as, for example, fluorescent, radioactive, chemiluminescent or enzymatic labeling.

Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie, le réarrangement génique, les mutations pontuelles et les délétions au niveau des séquences nucléiques codant pour un peptide de l'invention, sont incluses dans la présente invention. The in vitro diagnostic methods in which these nucleotide probes are used for the detection of aberrant syntheses or of genetic anomalies, such as loss of heterozygosity, gene rearrangement, bridge mutations and deletions at the level of nucleic sequences encoding a peptide of the invention are included in the present invention.

L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression de p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde dans un échantillon cellulaire ou tissulaire d'un mammifère, notamment d'un homme, comprenant les étapes consistant à : - préparer l'ARN dudit échantillon ; The subject of the invention is also a method for detecting the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase in a cell or tissue sample from a mammal, in particular from a man, comprising the steps consisting in: - preparing the RNA of said sample;

- mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini précédemment ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde. - contacting said RNA obtained with a probe having a nucleotide sequence capable of specifically hybridizing with a nucleic acid as defined above; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase.

L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde dans des cellules ou un tissu de mammifère, notamment d'un homme, par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini précédemment ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde. The subject of the invention is also a method for detecting the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase in cells or tissue of mammals, in particular of humans, by in situ hybridization, comprising the steps consisting in: - bringing said cells or said tissue into contact with a probe having a nucleotide sequence capable of specifically hybridizing with a nucleic acid as defined above; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase.

Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques sens et/ou antisens pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique de PCR ou toute autre variante de celle-ci. The nucleotide sequences of the invention are also useful for the manufacture and use of sense and / or antisense oligonucleotide primers for specific sequencing or amplification reactions according to the PCR technique or any other variant thereof.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de polypeptides recombinants possédant l'activité biologique de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde tels que précédemment définis. The nucleotide sequences according to the invention can moreover be used for the production of recombinant polypeptides possessing the biological activity of the p138tox of thyroid NADPH oxidase as defined above.

Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier. These polypeptides can be produced from the nucleotide sequences defined above, according to techniques for the production of recombinant products known to those skilled in the art.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs et/ou terminateurs de transcription. According to one embodiment of the invention, the nucleotide sequence can be inserted into an expression vector, in which it is operably linked to elements allowing the regulation of its expression, such as in particular promoters and / or terminators of transcription.

Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction The signals controlling the expression of the nucleotide sequences (promoters, activators, termination sequences, etc.) are chosen according to

de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium. of the cell host used. To this end, the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host. Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example electroporation or precipitation with calcium phosphate.

Tous vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention, font également partie de la présente invention. All cloning and / or expression vectors as described above, containing one of the nucleotide sequences defined according to the invention, also form part of the present invention.

L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. The invention further relates to host cells transfected, transiently or stable, with these expression vectors. These cells can be obtained by introducing into host cells, prokaryotic or eukaryotic, a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.

La présente invention a ainsi pour objet un procédé de production d'un polypeptide recombinant à activité de p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde, dans lequel on cultive des cellules transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi la séquence SEQ ID n 2 ou n 4, ou toute séquence homologue et on récupère ledit polypeptide. The subject of the present invention is therefore a process for the production of a recombinant polypeptide with p138tox activity of thyroid NADPH oxidase, in which transformed cells are cultivated under conditions allowing the expression of a polypeptide comprising a sequence of amino acids chosen from the sequence SEQ ID No. 2 or No. 4, or any homologous sequence and said polypeptide is recovered.

Ce procédé comprend généralement les étapes consistant à : i) insérer une séquence nucléotidique telle que définie précédemment dans un vecteur d'expression, ladite séquence nucléotidique étant liée de manière opérante avec des éléments permettant la régulation de son expression ; ii) transformer une cellule hôte avec le vecteur ainsi obtenu ; iii) cultiver ladite cellule hôte dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence nucléotidique ; iv) recueillir le peptide recombinant exprimé ; v) éventuellement purifier ledit peptide. This method generally comprises the steps consisting in: i) inserting a nucleotide sequence as defined above into an expression vector, said nucleotide sequence being operably linked with elements allowing the regulation of its expression; ii) transforming a host cell with the vector thus obtained; iii) culturing said host cell under conditions allowing the expression of said nucleotide sequence; iv) collecting the expressed recombinant peptide; v) optionally purifying said peptide.

La présente invention rend possible une régulation de NADPH oxydase dans les cellules de thyroïde, qui produisent de l'H202, dans les cas où ce peroxyde serait produit de manière ou en quantité anormales. The present invention makes it possible to regulate NADPH oxidase in thyroid cells, which produce H2O2, in cases where this peroxide is produced in an abnormal manner or in quantity.

Une production incontrôlée de peroxyde d'hydrogène (H202) peut en effet induire des cassures dans l'ADN (Birnboim H. C et coll., 1982) et des modifications au niveau des bases thymine et guanine (Jackson J. H. et coll., 1989). Un échappement de la NADPH oxydase à son contrôle par le calcium peut donc être notamment une cause de transformation des thyrocytes normaux en cellules cancéreuses. Uncontrolled production of hydrogen peroxide (H202) can indeed induce DNA breaks (Birnboim H. C et al., 1982) and modifications to the thymine and guanine bases (Jackson JH et al., 1989 ). An escape of NADPH oxidase to its control by calcium can therefore be in particular a cause of transformation of normal thyrocytes into cancer cells.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont donc des utilisations dans le domaine thérapeutique, notamment pour la réalisation de séquences antisens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager, utilisables en thérapie génique. L'invention a ainsi pour objet des séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement, la production de NADPH oxydase de thyroïde, telle que définie précédemment. De telles séquences sont avantageusement constituées par celles qui constituent le cadre de lecture codant pour la p138tox de la NADPH oxydase au niveau du transcrit. The nucleotide sequences according to the invention therefore have uses in the therapeutic field, in particular for the production of antisense sequences, capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence, including a messenger RNA, which can be used in gene therapy. The subject of the invention is therefore antisense sequences capable of inhibiting, at least partially, the production of thyroid NADPH oxidase, as defined above. Such sequences are advantageously constituted by those which constitute the reading frame coding for the p138tox of NADPH oxidase at the level of the transcript.

La présente invention a donc pour objet une composition thérapeutique comprenant au moins un acide nucléique comprenant une séquence antisens capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique codant pour la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The subject of the present invention is therefore a therapeutic composition comprising at least one nucleic acid comprising an antisense sequence capable of hybridizing specifically with a nucleic acid coding for the p138tox of thyroid NADPH oxidase, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent en outre être utilisées pour transformer des cellules cibles et leur faire exprimer un polypeptide possédant l'activité biologique de p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde . The nucleotide sequences according to the invention can also be used to transform target cells and make them express a polypeptide having the biological activity of p138tox of thyroid NADPH oxidase.

L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon l'invention codant pour un polypeptide possédant l'activité biologique de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite composition étant destinée à être utilisée en thérapie génique. L'acide nucléique d'intérêt, de préférence inséré dans un vecteur et A subject of the invention is therefore also a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid according to the invention coding for a polypeptide having the biological activity of the p138tox of thyroid NADPH oxidase, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, said composition being intended to be used in gene therapy. The nucleic acid of interest, preferably inserted into a vector and

placé sous le contrôle d'un promoteur de transcription spécifique de la glande thyroïde, peut être administré sous forme nue ou en association avec au moins un agent facilitant la transfection dudit acide nucléique. placed under the control of a transcription promoter specific for the thyroid gland, can be administered in naked form or in combination with at least one agent which facilitates the transfection of said nucleic acid.

Une telle composition pharmaceutique peut être par exemple utilisée en thérapie génique chez des malades affectés d'hypothyroïdies, notamment liées à un défaut d'organification de l'iodure (c'est-à-dire un défaut de formation de liaison covalente de l'iodure aux protéines cellulaires), résultant d'un défaut de production d'H202 dans la thyroïde. Such a pharmaceutical composition can for example be used in gene therapy in patients affected by hypothyroidism, in particular linked to a defect in the organization of iodide (that is to say a defect in the formation of covalent bonding of the iodide to cellular proteins), resulting from a defect in production of H2O2 in the thyroid.

L'invention permet également l'expression ectopique de la NADPH oxydase thyroïdienne, en particulier dans les cellules cancéreuses de diverses origines en vue de leur faire produire des quantités toxiques d'H202 susceptibles d'entraîner l'apoptose ou la nécrose des cellules tumorales. Pour cela, la séquence d'acide nucléique ou une partie de celle-ci associée à un promoteur de transcription spécifique du tissu cancéreux est insérée dans un vecteur d'expression. The invention also allows the ectopic expression of thyroid NADPH oxidase, in particular in cancer cells of various origins in order to make them produce toxic quantities of H 2 O 2 capable of causing apoptosis or necrosis of tumor cells. For this, the nucleic acid sequence or a part thereof associated with a transcription promoter specific for cancerous tissue is inserted into an expression vector.

Les séquences nucléotidiques codant pour la NADPH oxydase selon l'invention peuvent également être utilisées en co-expression ectopique avec le cotransporteur basolatéral Na+/l- symporter (NIS) et la thyroperoxydase (TPO) en vue d'un traitement radioisotopique (131I) de diverses tumeurs. Pour cela, une séquence nucléique de p138tox de NADPH oxydase de thyroïde associée à un promoteur de transcription spécifique du tissu cancéreux est insérée dans un vecteur d'expression et co-transfectée avec le NIS et la TPO dont l'expression est sous le contrôle du même promoteur. Le traitement permet la capture de 1,1311 par la tumeur, son organification (liaison covalente à des protéines cellulaires) et la destruction de la tumeur. The nucleotide sequences coding for the NADPH oxidase according to the invention can also be used in ectopic co-expression with the basolateral Na + / 1-symporter (NIS) cotransporter and the thyroperoxidase (TPO) for radioisotopic treatment (131I) of various tumors. For this, a nucleic sequence of p138tox of thyroid NADPH oxidase associated with a transcription promoter specific for cancerous tissue is inserted into an expression vector and co-transfected with NIS and TPO, the expression of which is under the control of same promoter. The treatment allows the capture of 1.1311 by the tumor, its organization (covalent bond to cellular proteins) and the destruction of the tumor.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées dans la production d'animaux transgéniques dont le gène de la NADPH oxydase thyroïdienne est "éteint", délété ou muté. Ces animaux peuvent être utilisés dans la mise au point de méthodes de diagnostic, de médicaments ou de traitements à visées thérapeutiques. The nucleotide sequences according to the invention can be used in the production of transgenic animals in which the thyroid NADPH oxidase gene is "turned off", deleted or mutated. These animals can be used in the development of diagnostic methods, drugs or therapeutics.

La présente invention vise également des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité efficace d'au moins un polypeptide tel que défini précédemment, en association avec un véhicule The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising an effective amount of at least one polypeptide as defined above, in combination with a vehicle

pharmaceutiquement acceptable. De telles compositions pharmaceutiques sont particulièrement utiles dans les cas d'hypothyroïdies telles que mentionnées précédemment. pharmaceutically acceptable. Such pharmaceutical compositions are particularly useful in cases of hypothyroidism as mentioned above.

La présente invention vise également des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité efficace d'au moins un polypeptide modifié par rapport au polypeptide p138tox de telle sorte que ledit peptide mime la zone d'interaction avec la thyroperoxydase (TPO) avec pour conséquence l'inhibition de la NADPH oxydase et/ou l'inhibition de la TPO, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising an effective amount of at least one polypeptide modified with respect to the p138tox polypeptide such that said peptide mimics the zone of interaction with thyroperoxidase (TPO) with as a consequence the inhibition of NADPH oxidase and / or inhibition of TPO, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.

De telles compositions pharmaceutiques sont particulièrement utiles dans le traitement d'affections impliquant une activité anormale de la NADPH oxydase de thyroïde, que l'on souhaite bloquer ou diminuer. Such pharmaceutical compositions are particularly useful in the treatment of conditions involving an abnormal activity of the thyroid NADPH oxidase, which it is desired to block or decrease.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être notamment administrée par voie orale, parentérale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, percutanée ou par administration intra-nasale. A pharmaceutical composition according to the invention can in particular be administered orally, parenterally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, percutaneously or by intra-nasal administration.

La préparation des compositions pharmaceutiques qui contiennent des principes actifs dissous ou dispersés dans ces dernières, est bien connue de l'homme du métier. Généralement, ces compositions sont préparées sous la forme de solutions ou de suspensions injectables. The preparation of pharmaceutical compositions which contain active principles dissolved or dispersed in the latter is well known to those skilled in the art. Generally, these compositions are prepared in the form of solutions or injectable suspensions.

Cependant, elles peuvent aussi être sous des formes solides appropriées pour préparer des solutions, ou des suspensions extemporanément. Les préparations peuvent aussi être émulsifiées. However, they can also be in solid forms suitable for preparing solutions, or suspensions extemporaneously. The preparations can also be emulsified.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être déterminés de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc. The modes of administration, the dosages and the galenical forms of the pharmaceutical compositions according to the invention can be determined in the usual way by a person skilled in the art, in particular according to the criteria generally taken into account for the establishment of a suitable therapeutic treatment to a patient, such as for example the patient's age or body weight, the seriousness of his general condition, the tolerance to treatment, and the side effects observed, etc.

Le polypeptide de l'invention est également particulièrement utile pour le criblage d'inhibiteurs de la NADPH oxydase de la thyroïde, destinés à la The polypeptide of the invention is also particularly useful for the screening of inhibitors of thyroid NADPH oxidase, intended for the

fabrication d'un médicament pour la prévention et/ou le traitement d'affections impliquant une activité anormale de la NADPH oxydase de thyroïde. manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of conditions involving abnormal activity of thyroid NADPH oxidase.

Parmi ces affections, on peut citer notamment les hyperthyroïdies, comme la maladie de Grave's Basedow, ou les cancers de la thyroïde ou autres tumeurs malignes. Among these conditions, mention may in particular be made of hyperthyroidism, such as Grave's Basedow disease, or thyroid cancer or other malignant tumors.

La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'anticorps anti-NADPH oxydase dans un échantillon biologique, dans lequel on met en contact ledit échantillon biologique avec un polypeptide selon l'invention, marqué de manière détectable et on détecte les complexes

p138tox-anticorps. The present invention also relates to a method for detecting anti-NADPH oxidase antibodies in a biological sample, in which said biological sample is brought into contact with a polypeptide according to the invention, detectably labeled and the complexes are detected.

p138tox-antibody.

Le polypeptide de l'invention peut ainsi permettre le criblage de serums de malades souffrant de maladies autoimmunes de la thyroïde telle que la maladie d'Hashimoto, par la recherche d'anticorps circulants antiNADPH oxydase. The polypeptide of the invention can thus allow the screening of sera of patients suffering from autoimmune thyroid diseases such as Hashimoto's disease, by searching for circulating antiNADPH oxidase antibodies.

L'invention a également pour objet un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé spécifiquement contre la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde, ou un fragment dudit anticorps capable de se lier spécifiquement à la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde. The invention also relates to a monoclonal or polyclonal antibody directed specifically against the p138tox of thyroid NADPH oxidase, or a fragment of said antibody capable of specifically binding to the p138tox of thyroid NADPH oxidase.

Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde selon l'invention selon les modes opératoires usuels. Polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against the p138tox of thyroid NADPH oxidase according to the invention according to the usual procedures.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (Nature, (1975), vol. 256, pp. 495-497). The monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Kôhler and Milstein (Nature, (1975), vol. 256, pp. 495-497).

L'invention a également pour objet un procédé de production d'anticorps dirigés contre la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde dans lequel on immunise des animaux par administration d'un vecteur d'expression contenant une séquence nucléotidique selon l'invention. The subject of the invention is also a process for the production of antibodies directed against the thyroid NADPH oxidase p138tox in which animals are immunized by administration of an expression vector containing a nucleotide sequence according to the invention.

L'invention vise également des animaux immunisés (tels que des souris) par injection d'un vecteur d'expression contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention en vue de faire produire des anticorps dirigés contre la NADPH oxydase. The invention also relates to animals immunized (such as mice) by injection of an expression vector containing one of the nucleotide sequences defined according to the invention with a view to producing antibodies directed against NADPH oxidase.

Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention sont par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Par exemple, ils peuvent être associés à une toxine, telle la toxine diphtérique ou à un produit radioactif. The antibodies or antibody fragments of the invention are for example chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab and F (ab ') 2 fragments. They can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies. For example, they can be associated with a toxin, such as the diphtheria toxin or with a radioactive product.

Les anticorps ainsi produits peuvent être notamment utilisés pour détecter et/ou doser la NADPH oxydase de thyroïde dans tout échantillon biologique susceptible d'en contenir. The antibodies thus produced can in particular be used to detect and / or assay thyroid NADPH oxidase in any biological sample capable of containing it.

L'invention a donc également pour objet un procédé de détection et/ou de dosage immunologique de la NADPH oxydase de thyroïde dans un échantillon biologique d'un mammifère, notamment d'un homme, dans lequel : i) on met en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps tel que défini précédemment, marqué de manière détectable ; ii) on observe la formation d'un complexe anticorps-NADPH oxydase de thyroïde, indicateur de la présence de NADPH oxydase de thyroïde dans ledit échantillon. The invention therefore also relates to a method for the detection and / or immunological assay of thyroid NADPH oxidase in a biological sample from a mammal, in particular from a man, in which: i) said sample is brought into contact biological with an antibody as defined above, detectably labeled; ii) the formation of an antibody-thyroid NADPH oxidase complex is observed, an indicator of the presence of thyroid NADPH oxidase in said sample.

Les anticorps de l'invention peuvent donc être avantageusement mis en #uvre dans toute situation où l'expression de la NADPH oxydase de thyroïde doit être observée. The antibodies of the invention can therefore be advantageously used in any situation where the expression of thyroid NADPH oxidase must be observed.

En particulier, la NADPH oxydase de thyroïde est un marqueur de la différenciation de thyrocytes. In particular, the thyroid NADPH oxidase is a marker for the differentiation of thyrocytes.

L'identification de certains cancers thyroïdiens (par exemple papillaires, folliculaires, anaplasiques,...) peut être facilitée par la possibilité de détecter, à l'aide de ces anticorps, l'expression (ou la non-expression) de ce marqueur cellulaire spécifique du thyrocyte. The identification of certain thyroid cancers (for example papillary, follicular, anaplastic, etc.) can be facilitated by the possibility of detecting, using these antibodies, the expression (or non-expression) of this marker. cell specific thyrocyte.

Les exemples ci-dessous illustrent l'invention sans en limiter la portée. The examples below illustrate the invention without limiting its scope.

EXEMPLES
I - Purification de l'enzyme
La purification d'une flavodeshydrogénase (FAD) appartenant à l'oxydase de thyroïde de porc a permis le microséquençage de deux peptides (de 8 et 16 acides aminés respectivement) ayant une séquence inconnue dans les banques de données :
Cette purification a pu être réalisée selon le protocole suivant :
L'enzyme extraite de membranes de thyroïde de porc par 2M KCI en présence de 0,2% Triton X 100 (Serva, Heidelberg, Allemagne) est chromatographiée sur Octyl sepharose (support hydrophobe). Après un lavage de la colonne par un détergent (10 mM CHAPS, Sigma Chemical Co, St Louis, Colorado), l'enzyme est éluée par un tampon sans FAD contenant 0,2M KCI et 1% Triton X 100. Cette étape permet une purification de 30 fois de la flavoproteine. EXAMPLES
I - Purification of the enzyme
The purification of a flavodeshydrogenase (FAD) belonging to pig thyroid oxidase allowed the microsequencing of two peptides (of 8 and 16 amino acids respectively) having an unknown sequence in the databases:
This purification could be carried out according to the following protocol:
The enzyme extracted from pig thyroid membranes by 2M KCI in the presence of 0.2% Triton X 100 (Serva, Heidelberg, Germany) is chromatographed on Octyl Sepharose (hydrophobic support). After washing the column with a detergent (10 mM CHAPS, Sigma Chemical Co, St Louis, Colorado), the enzyme is eluted by a buffer without FAD containing 0.2M KCI and 1% Triton X 100. This step allows a 30 times purification of flavoprotein.

L'enzyme est ensuite fixée en batch sur FAD agarose pendant une nuit à 4 C et éluée par 250 l de tampon d'échantillon ( SDSPAGE "sample buffer", Laemmli, 1970). La totalité du volume d'élution est déposé dans un puits unique d'un gel d'acrylamide à 8% (conditions de Laemmli). Les protéines sont révélées par coloration à l'amidoblack. La bande d'intérêt (180 kDa) est découpée du gel (3,5 g de protéine) et séchée et incubée dans 50 mM de tampon Tris pH 6,0,03 % SDS, 0,2 g/ml d'endoprotéase Lys-C de Boehringer (une nuit à 35 C) pour être soumise à un microséquençage. The enzyme is then fixed in batch on FAD agarose overnight at 4 ° C. and eluted with 250 l of sample buffer (SDSPAGE "sample buffer", Laemmli, 1970). The entire elution volume is deposited in a single well of an 8% acrylamide gel (Laemmli conditions). Proteins are revealed by amidoblack staining. The band of interest (180 kDa) is cut from the gel (3.5 g of protein) and dried and incubated in 50 mM of Tris buffer pH 6.0.03% SDS, 0.2 g / ml of endoprotease Lys -C Boehringer (overnight at 35 C) to be subjected to microsequencing.

Le volume de surnageant a été réduit à 200 l sous vide et injecté dans une précolonne Ax300 (2,1 x 30 mm) de Perkin-Elmer suivie d'une colonne HPLC en phase inverse 218TP52 Vydac (2,1 x 250 mm). Les peptides ont été élués avec un gradient linéaire de 2 à 35 % (vol/vol) de 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans l'acétonitrile pendant 90 minutes à une vitesse de 200 pl/min. Les pics majeurs ont été séquences. The volume of supernatant was reduced to 200 l under vacuum and injected into an Ax300 precolumn (2.1 x 30 mm) of Perkin-Elmer followed by a reverse phase HPLC column 218TP52 Vydac (2.1 x 250 mm). Peptides were eluted with a linear gradient of 2 to 35% (vol / vol) of 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile for 90 minutes at a speed of 200 µl / min. The major peaks have been sequenced.

Les deux peptides séquences présentent les séquences suivantes : peptide A = AWPPPRLYTEALQEK et peptide B = The two sequenced peptides have the following sequences: peptide A = AWPPPRLYTEALQEK and peptide B =

X(V)QLIN(R/P)QDQ(T)HFVHHYEN(P), ce peptide B contenant huit acides aminés HFVHHYEN certains. X (V) QLIN (R / P) QDQ (T) HFVHHYEN (P), this peptide B containing eight amino acids HFVHHYEN some.

Il - Clonage de l'ADNc de porc
A partir du peptide de 8 acides aminés, une amorce de 30 nucléotides a été déterminée pour l'obtention de l'extrémités 3' de l'ADNc par la technique dite de RACE (Rapid Amplification of cDNA extremity). Cette technique permet d'amplifier des séquences d'acides nucléiques d'un ARN entre un site interne et une des extrémités 5' ou 3' inconnues. Pour cela les ARN ont été extraits à partir de thyrocytes de porc cultivés pendant 4 jours en présence de 10 M de forskoline. Il - Cloning of pig cDNA
From the peptide of 8 amino acids, a primer of 30 nucleotides was determined for obtaining the 3 'ends of the cDNA by the technique called RACE (Rapid Amplification of cDNA extremity). This technique makes it possible to amplify nucleic acid sequences of an RNA between an internal site and one of the unknown 5 'or 3' ends. For this, the RNAs were extracted from pig thyrocytes cultured for 4 days in the presence of 10 M of forskolin.

Culture de thvrocvtes de porc
Les thyrocytes porcins sont préparés selon un protocole décrit dans Haye B. et al, 1985. Les cellules sont isolées des glandes par trypsinisation et suspendues dans un milieu Eagle's MEM (pH 7,4) contenant 10% (vol/vol) de sérum de veau, de la pénicilline (200 U/ml) et de la streptomycine (50 g/ml). Les cellules (2 x 106 cellules/ml) sont cultivées en suspension pendant 4 jours à 37 C avec 10 M de forskoline. Les follicules reconstitués sont collectés par centrifugation à 200 x g pendant 7 min et congelés dans l'azote liquide avant extraction des ARNs. Cultivation of pork products
Pig thyrocytes are prepared according to a protocol described in Haye B. et al, 1985. The cells are isolated from the glands by trypsinization and suspended in Eagle's MEM medium (pH 7.4) containing 10% (vol / vol) of serum. calf, penicillin (200 U / ml) and streptomycin (50 g / ml). The cells (2 × 10 6 cells / ml) are cultured in suspension for 4 days at 37 ° C. with 10 M of forskolin. The reconstituted follicles are collected by centrifugation at 200 xg for 7 min and frozen in liquid nitrogen before extraction of the RNAs.

Préparation des ARN
Les ARN totaux sont extraits des cellules par la technique du guanidium de thiocyanate (Chomczynski et coll., 1987). Preparation of NRAs
Total RNAs are extracted from cells by the thiocyanate guanidium technique (Chomczynski et al., 1987).

RACE
L'ADNc complet est obtenu par 3' et 5' RACE selon le protocole donné par CLONTECH dans le kit "SMART RACE cDNA Amplification". Les différents produits d'amplification sont clonés dans le vecteur pCR-XL-TOPO (Invitrogen). RACE
The complete cDNA is obtained by 3 'and 5' RACE according to the protocol given by CLONTECH in the "SMART RACE cDNA Amplification" kit. The different amplification products are cloned into the vector pCR-XL-TOPO (Invitrogen).

III - Clonage de l'ADNc humain
Le clonage de l'ADNc humain est réalisé en utilisant également la technique du 3' et 5' RACE. Les réactions de PCR sont faites à partir d'ADNc III - Cloning of human cDNA
The cloning of human cDNA is carried out also using the 3 'and 5' RACE technique. PCR reactions are made from cDNA

de thyroïdes humaines (Marathon-Ready cDNA) commercialisés par CLONTECH. L'amorce déterminée à partir du peptide porcin de 8 acides aminés a permis d'obtenir l'extrémité 3' de l'ADNc humain. L'extrémité 5' est obtenue par 5' RACE en utilisant une amorce spécifique choisie dans l'extrémité 3' de la séquence humaine. Les produits d'amplification sont clonés dans le plasmide pCR-XL-TOPO (Invitrogen) puis séquences. human thyroid (Marathon-Ready cDNA) marketed by CLONTECH. The primer determined from the porcine peptide of 8 amino acids made it possible to obtain the 3 'end of the human cDNA. The 5 'end is obtained by 5' RACE using a specific primer chosen from the 3 'end of the human sequence. The amplification products are cloned into the plasmid pCR-XL-TOPO (Invitrogen) and then sequenced.

IV- Expression tissulaire de la NADPH oxydase clonée
L'ARNm de 5 kb correspondant à l'expression de l'enzyme clonée n'a pu être détecté par Northern Blot que dans le tissu thyroïdien. Cette observation va dans le sens d'une participation de l'enzyme clonée à la fonction spécifique des thyrocytes, c'est-à-dire la biosynthèse des hormones thyroïdiennnes. IV- Tissue expression of cloned NADPH oxidase
The 5 kb mRNA corresponding to the expression of the cloned enzyme could only be detected by Northern Blot in the thyroid tissue. This observation goes in the direction of a participation of the cloned enzyme in the specific function of the thyrocytes, that is to say the biosynthesis of thyroid hormones.

Les thyrocytes porcins cultivés sans forskoline n'expriment pas l'ARNm de 5 kb alors que son expression est maintenue, voire accentuée en présence d'AMP cyclique. Pig thyrocytes cultivated without forskolin do not express the 5 kb mRNA while its expression is maintained, or even accentuated in the presence of cyclic AMP.

Ces résultats sont en accord avec ceux de Raspé et Dumont, 1995, qui rapportent que la TSH induit l'expression du générateur de H202 des thyrocytes de chien via l'activation de la cascade de l'adénylate cyclase. These results are in agreement with those of Raspé and Dumont, 1995, who report that TSH induces the expression of the H202 generator of dog thyrocytes via the activation of the adenylate cyclase cascade.

V - Localisation chromosomique du gène de la NADPH oxydase de thyroïde
Les auteurs de la présente invention ont recherché par la technique FISH d'hybridation in situ fluorescente la localisation du gène de la p138tox de la NADPH oxydase de thyroïde dans le génome humain. A cette fin, 50 métaphases normales ont été analysées, à l'aide d'une sonde (vecteur pCR-XL-TOPO contenant le produit de 4 kb humain de la 5'-RACE), selon la technique de Valent et al, 1996 et 1997. On a utilisé 40 ng de sonde marquée avec 120 ng de compétiteur (ADN de placenta humain) dénaturés. V - Chromosomal localization of the thyroid NADPH oxidase gene
The authors of the present invention have sought, by the fluorescent in situ hybridization FISH technique, the location of the thyroid NADPH oxidase p138tox gene in the human genome. To this end, 50 normal metaphases were analyzed, using a probe (vector pCR-XL-TOPO containing the human 4 kb product of 5'-RACE), according to the technique of Valent et al, 1996 and 1997. 40 ng of probe labeled with 120 ng of denatured competitor (human placenta DNA) were used.

Dans 40 des métaphases observées, un signal fluorescent a été détecté sur la bande chromosomique 15q15. In 40 of the metaphases observed, a fluorescent signal was detected on the 15q15 chromosomal band.

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Claims

1. Isolated polypeptide having p138tox activity of thyroid NADPH oxidase, comprising an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 2 or No. 4, or any homologous amino acid sequence.

2. Isolated nucleic acid encoding a polypeptide having a p138tox activity of the thyroid NADPH oxidase according to claim 1.

3. Nucleic acid according to claim 2 comprising a nucleotide sequence chosen from the sequence SEQ ID No. 1 or No. 3 or any sequence homologous to said sequences.

4. Cloning and / or expression vector containing a nucleotide sequence according to any one of claims 2 or 3.

5. Host cell transformed by a vector according to claim 4.

6. Mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, characterized in that they are capable of specifically recognizing a polypeptide according to claim 1.

7. A method of producing a recombinant polypeptide with p138tox activity of thyroid NADPH oxidase, in which transformed cells according to claim 5 are cultured under conditions allowing the expression of a polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the sequence SEQ ID No. 2 or No. 4, or any homologous sequence and said polypeptide is recovered.

8. Nucleotide probe comprising at least 10 nucleotides, capable of specifically hybridizing, under stringent conditions, with a nucleic acid according to one of claims 2 or 3.

9. A method of detecting the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase in a cell or tissue sample, comprising the steps consisting in: - preparing the RNA of said sample; - contacting said RNA obtained with a probe having a nucleotide sequence capable of hybridizing specifically with a nucleic acid as defined in claim 2 or claim 3; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase.

10. Method for detecting the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase in cells or tissue by in situ hybridization, comprising the steps consisting in: - bringing said cells or said tissue into contact with a probe having a nucleotide sequence capable of specifically hybridizing with a nucleic acid as defined in claim 2 or claim 3; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of p138tox of thyroid NADPH oxidase.

11. Method for detecting and / or immunoassaying thyroid NADPH oxidase in a biological sample in which: i) said biological sample is brought into contact with an antibody as defined in claim 6, detectably labeled; ii) the formation of an antibody-thyroid NADPH oxidase complex is observed, an indicator of the presence of thyroid NADPH oxidase in said sample.

12. Therapeutic composition comprising at least one nucleic acid comprising an antisense sequence capable of hybridizing

specifically with a nucleic acid according to claim 2 or 3, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.

13. A therapeutic composition comprising a nucleotide sequence according to any one of claims 2 or 3 optionally placed under the control of a promoter specific for thyroid cells or a promoter specific for cancer cells, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

14. A pharmaceutical composition comprising an effective amount of at least one polypeptide according to claim 1, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

15. A pharmaceutical composition comprising an effective amount of at least one polypeptide modified with respect to the polypeptide according to claim 1 so that said peptide mimics the zone of interaction with thyroperoxidase (TPO) with as a consequence the inhibition of NADPH oxidase and / or inhibition of TPO, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.

16. Use of a polypeptide according to claim 1 for the screening of inhibitors of thyroid NADPH oxidase, intended for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of conditions involving an abnormal activity of the NADPH thyroid oxidase.

17. Method for detecting anti-NADPH oxidase antibodies in a biological sample, in which said biological sample is brought into contact with a polypeptide according to claim 1, labeled

detectable and the p138to "-antibody complexes are detected.

18. Process for the production of antibodies against the p138tox of thyroid NADPH oxidase in which animals are immunized by

administration of an expression vector containing a nucleotide sequence according to any one of claims 2 or 3.

19. Animals immunized by administration of an expression vector containing a nucleotide sequence according to any one of claims 2 or 3 for the production of antibodies directed against NADPH oxidase.