FR2796808A1 - NEW APPLICATIONS OF ABCA CARRIERS - Google Patents
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Abstract
Description
<Desc/Clms Page number 1> <Desc / Clms Page number 1>
La présente invention est relative à une méthode de criblage de médicaments aptes à moduler le transporteur ABCA ainsi qu'à ses applications. The present invention relates to a method for screening drugs capable of modulating the ABCA transporter as well as to its applications.
La présente invention est également relative à des vecteurs de recombinaison homologue et à des vecteurs d'expression d'un transporteur ABCA, à des cellules eucaryotes les contenant et à des séquences spécifiques issues de transporteurs ABCA. The present invention also relates to homologous recombination vectors and expression vectors of an ABCA transporter, to eukaryotic cells containing them and to specific sequences derived from ABCA transporters.
De manière générale, les transporteurs ABC constituent une superfamille de protéines hautement conservées impliquées dans le transport membranaire couplé à l'hydrolyse de l'ATP, d'un grand nombre de substrats (ions, acides aminés, peptides, sucres, vitamines et hormones stéroïdes, par exemple). In general, ABC transporters are a superfamily of highly conserved proteins involved in membrane transport coupled with the hydrolysis of ATP, a large number of substrates (ions, amino acids, peptides, sugars, vitamins and steroid hormones). , for example).
Les protéines ABC sont caractérisées par la présence : - de deux cassettes de liaison à l'ATP (ATP Binding Cassette ou domaine de liaison nucléotidique à l'ATP (NBD ou ATP nucleotide-binding romain)), hautement conservées dans la famille des transporteurs ABC et comprenant chacune un motif A de Walker GX4GK(S/T), un motif B de Walker (R/K)X6-8hyd4D (hyd = résidu hydrophobe) et une séquence SS (signature sequence (L/Y)SGG(Q/M)), située entre le motif A de Walker et le motif B de Walker et - de deux domaines transmembranaires (TD) comprenant chacun six segments ou boucles transmembranaires (Figure 1). The ABC proteins are characterized by the presence of: - two ATP binding cassettes (ATP Binding Cassette or ATP nucleotide binding domain (NBD or ATP nucleotide-binding Roman)), highly conserved in the family of transporters ABC and each comprising a Walker GX4GK motif A (S / T), a Walker motif (R / K) X6-8hyd4D (hyd = hydrophobic residue) and a sequence SS (signature sequence (L / Y) SGG (Q). / M)), located between the Walker motif A and the Walker B motif and - two transmembrane domains (TD) each comprising six segments or transmembrane loops (Figure 1).
Un transporteur ABC fonctionnel requiert une association symétrique de ces quatre domaines protéiques ; la spécificité des molécules transportées est déterminée par les domaines transmembranaires, tandis que l'énergie requise pour le transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du NBD. A functional ABC transporter requires a symmetric association of these four protein domains; the specificity of the transported molecules is determined by the transmembrane domains, while the energy required for transport is provided by the degradation of ATP at the NBD level.
Un nouveau sous-groupe de la famille des transporteurs ABC (ATP binding cassette), chez les mammifères le sous-groupe ABCA, a été décrit en 1994, suite à l'identification du transporteur prototype ABCA1 (M. F. Luciani et al., Genomics, 1994,21, 150-159). A new subgroup of the ABC (ATP binding cassette) transporter family, in mammals subgroup ABCA, was described in 1994, following the identification of the ABCA1 prototype transporter (MF Luciani et al., Genomics, 1994, 21, 150-159).
Les transporteurs du sous-groupe ABCA comprennent un domaine hautement hydrophobe (domaine HH1inclus dans le domaine de régulation R), localisé entre les deux moitiés de la protéine (figures 1,2 et 3). Transporters of the ABCA subgroup include a highly hydrophobic domain (HH1 domain included in the R regulatory domain), located between the two halves of the protein (Figures 1, 2 and 3).
Des études fonctionnelles chez la souris ont montré que le transporteur ABCA1 est impliqué dans l'englobement ( engulfment ) des cellules en apop- Functional studies in mice have shown that the ABCA1 transporter is involved in the engulfment of cells in apoptosis.
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tose par les macrophages (M. F. Luciani et al., EMBO J., 1996,15, 226-235 ; Y. macrophages (M. F. Luciani et al., EMBO J., 1996, 15, 226-235;
Hamon et al., Blood, 1997,8, 2911-2915). Hamon et al., Blood, 1997, 8, 2911-2915).
Des études in vitro ont montré que le transporteur ABCAI humain est régulé, dans les macrophages, par les stérols (T. Langmann et al., BBRC, 1999, 257, 29-33). In vitro studies have shown that the human ABCAI transporter is regulated in macrophages by sterols (Langmann, T., et al., BBRC, 1999, 257, 29-33).
A l'heure actuelle, d'autres transporteurs de type ABCA ont été décrits, comme il ressort des données disponibles sur le site
,,7v,,,-w.med.rtig.nl/mdl/humanabe.htm et résumées dans le Tableau 1 ci-après. Tableau I
At present, other ABCA carriers have been described, as can be seen from the data available on the website.
,, 7v ,,, - w.med.rtig.nl/mdl/humanabe.htm and summarized in Table 1 below. Table I
<tb>
<tb> Nom <SEP> Symbole <SEP> Chromosome <SEP> Chromosome <SEP> RNA <SEP> AA <SEP> Exons <SEP> Accession
<tb> humain <SEP> souris
<tb> ABC1 <SEP> ABCA1 <SEP> 9q22-q31 <SEP> 4A5-B3 <SEP> 6,9 <SEP> 2259 <SEP> 48 <SEP> AJ012376
<tb> ABC2 <SEP> ABCA2 <SEP> 9q34 <SEP> 2A2-B <SEP> 6,7 <SEP> >2174 <SEP> >42 <SEP> U18235
<tb> (ABC-C) <SEP> ABCA3 <SEP> 16p13.3 <SEP> 17B <SEP> 6,5 <SEP> 1704 <SEP> ? <SEP> U78735
<tb> ABCR <SEP> ABCA4 <SEP> 1 <SEP> p22 <SEP> ? <SEP> 7,3 <SEP> 2273 <SEP> 50 <SEP> NM000350
<tb> EST90625 <SEP> ABCA5 <SEP> 17q21-q24 <SEP> ? <SEP> ? <SEP> ? <SEP> 38 <SEP> U66672
<tb> EST155051 <SEP> ABCA6 <SEP> 17q21 <SEP> ? <SEP> ? <SEP> 38 <SEP> U66680
<tb> KIAA0822 <SEP> ABCA8 <SEP> 17q24 <SEP> ? <SEP> 5,7 <SEP> 1581 <SEP> 38 <SEP> AB020629
<tb> <Tb>
<tb> Name <SEP> Symbol <SEP> Chromosome <SEP> Chromosome <SEP> RNA <SEP> AA <SEP> Exons <SEP> Accession
<tb> human <SEP> mice
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<tb> ABCR <SEP> ABCA4 <SEP> 1 <SEP> p22 <SEP>? <SEP> 7.3 <SEP> 2273 <SEP> 50 <SEP> NM000350
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<Tb>
Parmi ceux-ci, seuls quatre d'entre eux ont été complètement séquences : ABCA1, ABCA2, ABCA3 et ABCAR, soit chez l'homme, soit chez la souris. Of these, only four of them were completely sequenced: ABCA1, ABCA2, ABCA3 and ABCAR, either in humans or in mice.
Le gène de souris ABCA1 est schématiquement illustré à la figure 1 : il comprend plus de 100kb sur le chromosome 4A5-B3 et est divisé en 49 exons. The ABCA1 mouse gene is schematically illustrated in Figure 1: it comprises more than 100kb on chromosome 4A5-B3 and is divided into 49 exons.
L'organisation de ces exons et la correspondance entre les exons et les différents domaines du transporteur ABCA1 sont également illustrées à la Figure 1. The organization of these exons and the correspondence between the exons and the different domains of the ABCA1 transporter are also illustrated in Figure 1.
Une analyse croisée de l'organisation des gènes de différents transporteurs ABCA (ABCA1, ABCAR et ABCA2) montre une conservation maximale dans les régions codant pour les NBD (NBD1 et NBD2 : cassette de liaison à l'ATP) et les domaines transmembranaires (TD1 et TD2) (figures 2 et 3), alors que la région codant le domaine de régulation, présente une grande variabilité dans les positions des sites d'épissage et dans le nombre d'exons : exons pour ABCA2,13 pour ABCA1, 12 pour ABCAR. Cette variabilité se reflète au niveau de la séquence en acides aminés, bien que ses caractéristiques principales se retrouvent dans tous les transporteurs de cette famille : grand nombre de résidus chargés, présence de plusieurs sites de A cross analysis of the gene organization of different ABCA transporters (ABCA1, ABCAR and ABCA2) shows a maximal conservation in the NBD coding regions (NBD1 and NBD2: ATP binding cassette) and the transmembrane domains (TD1 and TD2) (FIGS. 2 and 3), whereas the region coding for the regulation domain has a great variability in the positions of the splice sites and in the number of exons: exons for ABCA2,13 for ABCA1, 12 for ABCAR. This variability is reflected in the sequence of amino acids, although its main characteristics are found in all the transporters of this family: large number of charged residues, presence of several sites of
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phosphorylation putatifs et présence de la zone hautement hydrophobe (HH1) ; toutefois, bien que la zone HH1 soit toujours présente, sa position varie d'un membre de la famille à l'autre ; par exemple la figure 4 illustre deux configurations possibles. putative phosphorylation and presence of the highly hydrophobic zone (HH1); however, although the HH1 zone is still present, its position varies from one family member to another; for example, Figure 4 illustrates two possible configurations.
Au niveau de la séquence en acides aminés, les transporteurs ABCA connus présentent une identité comprise entre 45 et 66 %. L'analyse comparative des plots d'hydrophobicité révèle également des profils similaires. At the amino acid sequence level, the known ABCA transporters have an identity of between 45 and 66%. Comparative analysis of the hydrophobicity plots also reveals similar profiles.
Les domaines TD (domaine transmembranaire) incluent les 6 zones transmembranaires ainsi que les boucles intermédiaires précitées. Ceci correspond pour le transporteur ABCAI aux résidus 630-846 pour les zones transmembranaires N-terminales (TD1 : segments transmembranaires 1-6: exons 14-16) et aux résidus 1647-1877 pour les zones transmembranaires C-terminales (TD2: segments transmembranaires 7-12 : 36-40) (Figure 3). The TD domains (transmembrane domain) include the 6 transmembrane zones as well as the intermediate loops mentioned above. This corresponds for the ABCAI transporter at residues 630-846 for the N-terminal transmembrane zones (TD1: transmembrane segments 1-6: exons 14-16) and residues 1647-1877 for the C-terminal transmembrane zones (TD2: transmembrane segments 7-12: 36-40) (Figure 3).
Une analyse plus précise des séquences TD parmi les différents transporteurs ABC de type A montre un plus grand degré de conservation dans le second groupe (TD2) malgré un degré faible de conservation de la séquence primaire lorsque l'on compare les séquences TD aux séquences NBD (taux d'identité moyen : 44 % pour TD1et 53 % pour TD2). Ceci est particulièrement frappant pour les TM 7, 9 et 10 qui présentent une identité supérieure à 50 %. A more precise analysis of the TD sequences among the different ABC type A transporters shows a greater degree of conservation in the second group (TD2) despite a low degree of preservation of the primary sequence when comparing the TD sequences to the NBD sequences (average identity rate: 44% for TD1 and 53% for TD2). This is particularly striking for TM 7, 9 and 10 which have an identity greater than 50%.
En ce qui concerne les NBD, ils s'étendent, dans le transporteur ABCA1 par exemple, de l'acide aminé 885 à l'acide aminé 1152, pour la séquence Nterminale (NBD 1 : exons 17-22) et de l' acide aminé 1919 à l' acide aminé 2132 pour la séquence C-terminale (NBD2 : exons 42-47). Une analyse de la conservation des séquences NBD montre une identité comprise entre 55 % et 66 % (moyenne 59 %) pour NBD et entre 57 % et 69 % (moyenne 65 %) pour NBD2. With regard to the NBDs, they extend, in the ABCA1 transporter, for example, from amino acid 885 to amino acid 1152, for the Nterminal sequence (NBD 1: exons 17-22) and acid. amino 1919 to amino acid 2132 for the C-terminal sequence (NBD2: exons 42-47). An analysis of the conservation of NBD sequences shows an identity between 55% and 66% (average 59%) for NBD and between 57% and 69% (average 65%) for NBD2.
Une analyse plus fine de la conservation des NBD conduit à une définition de motifs uniques à la famille ABCA, présentés dans le Tableau II ci-après. A more detailed analysis of NBD conservation leads to a definition of patterns unique to the ABCA family, presented in Table II below.
Tableau II
Table II
<tb>
<tb> Walker <SEP> A <SEP> - <SEP> # <SEP> #50 <SEP> hot <SEP> spot
<tb> NBD1 <SEP> GQ....LGHNGAGKTTT <SEP> G.CPQ.N <SEP> LTV.EH.FY
<tb> NBD2 <SEP> GECFGLLGCNGAGKSTT <SEP> GYCPQFD <SEP> ILTGRE.L
<tb> <Tb>
<tb> Walker <SEP> A <SEP> - <SEP>#<SEP># 50 <SEP> hot <SEP> spot
<tb> NBD1 <SEP> GQ .... LGHNGAGKTTT <SEP> G.CPQ.N <SEP> LTV.EH.FY
<tb> NBD2 <SEP> GECFGLLGCNGAGKSTT <SEP> GYCPQFD <SEP> ILTGRE.L
<Tb>
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<tb>
<tb> ATS <SEP> / <SEP> C <SEP> Walker <SEP> B <SEP> switch <SEP> # <SEP> 162 <SEP>
<tb> NBD1 <SEP> LSGGM.RK <SEP> LDEPT.G.DP <SEP> L.TH.MDEA..LGDR
<tb> NBD2 <SEP> YSGG.KRK <SEP> LDEPTTGMDP <SEP> LTSHSMEECEALC.R
<tb> <Tb>
<tb> ATS <SEP> / <SEP><SEP> Walker <SEP><SEP> switch <SEP>#<SEP> 162 <SEP>
<tb> NBD1 <SEP> LSGGM.RK <SEP> LDEPT.G.DP <SEP> L.TH.MDEA..LGDR
<tb> NBD2 <SEP> YSGG.KRK <SEP> LDEPTTGMDP <SEP> LTSHSMEECEALC.R
<Tb>
Dans ce Tableau II, les acides aminés en gras correspondent aux zones conservées dans tous les transporteurs ABC, les points correspondent aux résidus non-conservés et les résidus en caractères normaux sont conservés dans les transporteurs de type ABCA. In Table II, the fatty amino acids correspond to the zones conserved in all the ABC transporters, the dots correspond to the non-conserved residues and the residues in normal characters are preserved in the ABCA type transporters.
On peut observer une conservation élevée des résidus d'acide aminé entourant soit les glycines conservées du motif A de Walker, soit l'aspartate du motif B de Walker ; des conservations similaires se retrouvent à la fois dans NBD et dans NBD2. High retention of the amino acid residues surrounding either the conserved glycines of Walker's A motif or Walker's B motif aspartate can be observed; similar preservatives are found in both NBD and NBD2.
Au moins trois autres motifs ABCA peuvent également être définis : - la région autour du résidu histidyle, en aval du motif B de Walker est hautement conservée (switch #162) - le cluster de résidus autour de la glutamine +50 par rapport au motif A de Walker (#50) et - la région dite hot spot , qui correspond à la position DF508 dans CFTR (hot spot). At least three other ABCA motifs may also be defined: - the region around the histidyl residue, downstream of Walker's B pattern is highly conserved (switch # 162) - the residue cluster around glutamine +50 compared to pattern A from Walker (# 50) and - the so-called hot spot region, which corresponds to the DF508 position in CFTR (hot spot).
Les transporteurs ABCA se retrouvent aussi bien chez les mammifères que chez les plantes, les insectes et mêmes les organismes inférieurs. ABCA carriers are found in mammals as well as in plants, insects and even lower organisms.
Parmi les membres du sous-groupe des transporteurs ABCA, ABCA1 a été associé au processus d'englobement des cellules en apoptose (M.F. Among members of the ABCA transporter subgroup, ABCA1 has been associated with the apoptotic cell-embedding process (M.F.
Luciani et al., EMBO J., 1996, précité). ; la fonction moléculaire précise exercée par le transporteur ABC pendant l'englobement n'est pas connue. Luciani et al., EMBO J., 1996, supra). ; the precise molecular function exerted by the ABC transporter during the embrittlement is not known.
Les transporteurs ABC ont également été associés à des pathologies ; dans le sous-groupe des transporteurs ABCA, actuellement seul ABCR a été associé, de manière claire à la pathogénèse des maladies dégénératives de l'oeil. ABC transporters have also been associated with pathologies; in the subgroup of ABCA carriers, currently only ABCR has been clearly associated with the pathogenesis of degenerative diseases of the eye.
Les Inventeurs ont maintenant trouvé que les transporteurs du sousgroupe ABCA sont susceptibles d'intervenir directement dans le contrôle de la composition en lipides de la membrane. The inventors have now found that the carriers of the ABCA subgroup are likely to intervene directly in the control of the lipid composition of the membrane.
En fait, à la fois chez les souris ABCA1 knock-out et chez des cellules eucaryotes transfectantes surexprimant un transporteur de type ABCA In fact, both in ABCA1 knockout mice and in transfectant eukaryotic cells overexpressing an ABCA-type transporter
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(ABCA1, par exemple), on observe une mobilité membranaire modifiée des phospholipides. (ABCA1, for example), we observe a modified membrane mobility of phospholipids.
Ces éléments ont conduit les Inventeurs à mettre au point un modèle adapté au criblage de molécules aptes à stimuler spécifiquement les transporteurs de type ABCA ; de tels transporteurs interviennent ainsi dans le contrôle de la composition lipidique des membranes et ensuite dans le contrôle de l'efflux de ces lipides vers le plasma. Il en résulte une modification des taux de lipide plasmatiques, étroitement liée au risque d'athérosclérose. Une modulation de l'activité des transporteurs ABCA permet donc un contrôle du risque des maladies cardiovasculaires. These elements led the inventors to develop a model suitable for screening molecules capable of specifically stimulating ABCA type carriers; such carriers are thus involved in the control of the lipid composition of the membranes and then in controlling the efflux of these lipids to the plasma. This results in a change in plasma lipid levels, closely related to the risk of atherosclerosis. A modulation of the activity of ABCA carriers thus allows a risk control of cardiovascular diseases.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un mammifère nonhumain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA. The present invention relates to the use of a recombinant nonhuman mammal carrying at least one allele of the gene encoding an inactivated ABCA transporter, for the selection or screening of products capable of modulating ABCA transporters.
On entend par gène inactivé aussi bien un gène altéré, modifié, inhibé ou tronqué. By inactivated gene is meant an altered, modified, inhibited or truncated gene.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, au moins l'un des allèles du gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1 ou ATP nucleotidebinding domain 1). According to an advantageous embodiment of the invention, at least one of the alleles of the gene is truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP-binding cassette (NBD1 or ATP nucleotidebinding domain 1).
En particulier, les animaux hétérozygotes (présence à la fois de l'allèle sauvage et d'un allèle inactivé, tel que défini ci-dessus) constituent un modèle dans lequel le taux sanguin de cholestérol HDL est faible ; dans ce contexte, la stimulation des transporteurs ABCA entraîne une augmentation significative des particules HDL (restauration d'un taux normal de cholestérol HDL). In particular, the heterozygous animals (presence of both the wild-type allele and an inactivated allele, as defined above) constitute a model in which the blood level of HDL cholesterol is low; in this context, the stimulation of ABCA transporters leads to a significant increase in HDL particles (restoration of a normal level of HDL cholesterol).
La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu d'un mammifère non-humain recombinant pour le gène codant un transporteur de type ABCA, lesquelles cellules sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un allèle dudit gène inactivé, de préférence, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1 ou ATP nucleotide-binding domain 1), pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA. The present invention also relates to the use of cells derived from any tissue of a recombinant nonhuman mammal for the gene encoding an ABCA transporter, which cells are characterized in that they comprise at least one allele of said inactivated gene, preferably truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBD1 or ATP nucleotide-binding domain 1), for selection or screening of products able to modulate ABCA carriers.
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La présente invention a également pour objet un procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler (à stimuler) les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'extraction d'un échantillon biologique à partir d'au moins un @ mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1) ; - la mise en contact in vitro dudit échantillon biologique avec au moins une substance à cribler ; @ - la mesure du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon ; et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA. The subject of the present invention is also a process for screening and selecting molecules capable of modulating (stimulating) ABCA transporters, characterized in that it comprises: the extraction of a biological sample from at least a recombinant nonhuman mammal carrying at least one allele of the gene encoding an inactivated ABCA-type transporter, preferably truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP-binding cassette ( NBD1); - bringing into in vitro contact said biological sample with at least one substance to be screened; measuring the membrane flux of lipids (phospholipids and / or cholesterol) and / or the mobility of the membrane phospholipids of the cells of said sample; and comparing the values obtained with those of the cells of a biological sample obtained from a non-human mammal of the same type bearing two wild alleles of the gene encoding an ABCA-type transporter.
La présente invention a également pour objet un vecteur de recom- binaison homologue d'un gène d'un transporteur de type ABCA de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique issue d'un gène codant un transporteur de type ABCA, inactivée, de préférence tronquée au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDI). The subject of the present invention is also a homologous recombination vector of a mammalian ABCA transporter gene, characterized in that it comprises a nucleotide sequence derived from a gene coding for an ABCA transporter, inactivated, preferably truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBDI).
Conformément à l'invention, ledit gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons 17 à 22 correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP du transporteur ABCA 1. According to the invention, said gene is truncated at at least one of exons 17 to 22 corresponding to the first ATP binding cassette of the ABCA 1 transporter.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA de mammifère, comprenant une séquence nucléotidique incluant un gène sélectionné dans le groupe constitué par : - le gène sauvage d'un transporteur de type ABCA et - les gènes d'un transporteur de type ABCA, mutés au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP (NBD1 ou NBD2), pour la transformation génétique d'une cellule eucaryote conve- nable. The subject of the present invention is also the use of an expression vector of a mammalian ABCA transporter, comprising a nucleotide sequence including a gene selected from the group consisting of: the wild-type gene of a transporter of ABCA type and - ABCA-type transporter genes, mutated at at least one of the ATP binding cassettes (NBD1 or NBD2), for genetic transformation of a suitable eukaryotic cell .
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Lesdits gènes mutés permettent notamment l'expression de protéines ABCA non-fonctionnelles utiles pour tester la spécificité des substances sélectionnées avec les modèles knock-out tels que définis ci-dessus. Said mutated genes notably allow the expression of non-functional ABCA proteins that are useful for testing the specificity of the substances selected with the knock-out models as defined above.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une origine de réplication dans une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection des cellules eucaryotes transformées par ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression d'un gène du transporteur du type ABCA dans lesdites cellules eucaryotes et une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP. The subject of the present invention is also an expression vector of an ABCA-type transporter, characterized in that it comprises at least one origin of replication in a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection of eukaryotic cells transformed with said vector, an appropriate regulatory sequence, in particular a promoter allowing the expression of an ABCA type transporter gene in said eukaryotic cells and a nucleotide sequence containing the gene coding for a wild-type or mutated ABCA transporter. at least one of the ATP binding cassettes.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau du motif A de Walker de la première cassette de liaison à l'ATP. According to an advantageous embodiment of said vector, said nucleotide sequence contains the gene coding for an ABCA transporter having at least one point mutation at the Walker A motif of the first ATP binding cassette.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur, ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau de chacun des motifs A de Walker des deux cassettes de liaison à l'ATP. According to another advantageous embodiment of said vector, said nucleotide sequence contains the gene coding for an ABCA transporter having at least one point mutation at each of the Walker A motifs of the two ATP binding cassettes.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences génomiques et les ADNc codant les transporteurs ABCA1 à ABCA4 et ABCAX. According to another advantageous embodiment of the invention, said nucleotide sequence is selected from the group consisting of the genomic sequences and the cDNAs encoding the ABCA1 to ABCA4 and ABCAX transporters.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence génomique (SEQ ID NO : 2) et la séquence d'ADNc (SEQ ID NO :1) codant le transporteur ABCAX. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said nucleotide sequence is selected from the group consisting of the genomic sequence (SEQ ID NO: 2) and the cDNA sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the ABCAX transporter.
La présente invention a également pour objet des cellules eucaryotes hôtes obtenues par transformation génétique, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. De telles cellules voient leur niveau d'expression du transporteur augmenté par rapport à leur niveau basal. The subject of the present invention is also eukaryotic host cells obtained by genetic transformation, characterized in that they are transformed by an expression vector as defined above. Such cells see their level of carrier expression increased relative to their basal level.
Certaines desdites cellules surexpriment ainsi ledit transporteur ; par surexpression Some of said cells thus overexpress said carrier; by overexpression
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on entend toute expression supérieure au niveau naturel d'expression dudit transporteur. any expression above the natural level of expression of said transporter is meant.
Ces cellules eucaryotes hôtes sont de préférence des cellules HeLa transfectées de manière stable par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus et par exemple caractérisé en ce qu'il est constitué d'une origine de réplication appropriée, d'un gène de résistance à un antibiotique, du promoteur viral SV40, d'une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté, d'un site de polyadénylation dérivé du virus SV40 et du gène codant la protéine GFP (greenfluorescence protein). These eukaryotic host cells are preferably HeLa cells stably transfected with an expression vector as defined above and for example characterized in that it consists of an appropriate origin of replication, a gene of antibiotic resistance, the SV40 viral promoter, a nucleotide sequence containing the gene encoding a wild type or mutated ABCA transporter, a polyadenylation site derived from the SV40 virus and the gene encoding the GFP (green fluorescence protein).
La présente invention a également pour objet une méthode de production de mammifères non-humains recombinants, notamment des souris recombinantes porteuses d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1), caractérisée en ce que : - l'on tronque un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1) ; - l'on introduit ladite séquence modifiée dans un segment de l'ADN génomique dudit mammifère non-humain, associé à un marqueur approprié, de manière à obtenir une séquence marquée M, contenant ledit allèle tronqué ; - l'on intègre ladite séquence M, in vitro, dans les cellules souches de lignées germinales d'embryons dudit mammifère non-humain par transfection et on sélectionne les cellules ayant ledit allèle par des événements de recombinaison homologue ; puis - l'on réinjecte lesdites cellules souches sélectionnées à un embryon réimplanté chez un mammifère non-humain du même type afin d'obtenir des animaux chimériques ; et - l'on obtient à la génération FI des mammifères non-humains, des souris par exemple, recombinés hétérozygotes et à la génération F2 des mammifères non-humains (des souris par exemple) recombinés homozygotes, reconnaissables à la présence du marqueur. The subject of the present invention is also a method for producing recombinant non-human mammals, in particular recombinant mice carrying at least one allele of the gene coding for an ABCA transporter, truncated at the level of at least the first binding cassette ATP (NBD1), characterized in that: - an allele of the gene encoding an ABCA transporter is truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBD1); said modified sequence is introduced into a segment of the genomic DNA of said non-human mammal, associated with a suitable marker, so as to obtain a labeled sequence M containing said truncated allele; said sequence M is incorporated, in vitro, into the germline stem cells of embryos of said non-human mammal by transfection, and the cells having said allele are selected by homologous recombination events; then - the said selected stem cells are reinjected into a reimplanted embryo in a non-human mammal of the same type in order to obtain chimeric animals; and in the FI generation, non-human mammals, for example mice that are heterozygous recombined and, for example, the F2 generation, obtain homozygous recombinant non-human mammals (for example mice) that are recognizable by the presence of the marker.
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La présente invention a également pour objet un kit ou trousse d'évaluation d'une substance apte à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - une culture de cellules issues d'au moins un mammifère nonhumain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1) ; et - des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique du transporteur de type ABCA. The subject of the present invention is also a kit or kit for the evaluation of a substance capable of modulating ABCA transporters, characterized in that it comprises: a culture of cells originating from at least one recombinant nonhuman mammal carrying at least one gene allele encoding an ABCA transporter, truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBD1); and physical or chemical means for characterizing the biological activity of the ABCA transporter.
La présente invention a également pour objet un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence SEQ ID NO :1 ou la séquence SEQ ID NO:2 et correspond au transporteur ABCAX. The subject of the present invention is also an ABCA type transporter, characterized in that it is encoded by the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2 and corresponds to the ABCAX transporter.
En variante, la présente invention a pour objet un procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'administration à au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP ; - l'extraction d'un échantillon biologique à partir dudit mammifère non-humain ; - la mesure in vitro du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon biologique ; et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA. In a variant, the subject of the present invention is a method for screening and selecting molecules capable of modulating ABCA transporters, characterized in that it comprises: the administration to at least one recombinant non-human mammal carrying a minus one allele of the gene encoding an inactivated ABCA-type transporter, preferably truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP-binding cassette; extracting a biological sample from said non-human mammal; the in vitro measurement of the membrane flux of lipids (phospholipids and / or cholesterol) and / or the mobility of the membrane phospholipids of the cells of said biological sample; and comparing the values obtained with those of the cells of a biological sample obtained from a non-human mammal of the same type bearing two wild alleles of the gene encoding an ABCA-type transporter.
La présente invention a également pour objet un transporteur ABCA muté, caractérisé en ce qu'il présente au moins une mutation ponctuelle au niveau de l'une des cassettes de liaison à l'ATP, de préférence au niveau des motif A de Walker. The subject of the present invention is also a mutated ABCA transporter, characterized in that it exhibits at least one point mutation at one of the ATP binding cassettes, preferably at the level of the Walker A motifs.
La présente invention a en outre pour objet des réactifs de détection de séquences nucléotidiques spécifiques des transporteurs de type ABCA, caractérisés The present invention furthermore relates to reagents for detecting nucleotide sequences specific to ABCA-type transporters, characterized
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en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences de 15 à 50 nucléotides amplifiant les fragments codant les séquences spécifiques au transporteur
ABCA, telles que définies dans le Tableau II. On peut citer par exemple, les séquences SEQ ID NO:30 et 31. in that they are selected from the group consisting of 15 to 50 nucleotide sequences amplifying the fragments encoding the transporter-specific sequences
ABCA, as defined in Table II. For example, the sequences SEQ ID NO: 30 and 31 may be mentioned.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention, avec réfé- rence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la correspondance entre la structure génomique du gène ABCA1 et des domaines de la protéine correspondante ; - la figure 2 illustre la conservation de la structure du gène ABCA, pour quatre transporteurs ABCA différents au niveau des NBD (NBD1 = N-terminal ; NBD2 = C-terminal). La structure génomique comparée des quatre transporteurs ABCA est illustrée. Les limites des domaines sont indiquées et correspondent aux exons intéressants. Les introns sont indiqués par des lignes noires ; les motifs conservés sont indiqués par des zones ombrées ; HS : hot spot ; S : switch région ; A : Walker A ; B : Walker B ; C : signature de transport active. Le rectangle du bas illustre une comparaison de l'organisation d'un NBD ou d'un NBD2 typique du transporteur de type ABCA. 1 : ABCA1 ; 2 : ABCA2 ; X : ABCA7 ; R : ABCAR ; - la figure 3 illustre la conservation de la structure du gène ABCA, pour quatre transporteurs ABCA différents au niveau des domaines transmembranaires (TD 1 : N-terminal ; TD2 : C-terminal) ; - la figure 4 représente la topologie prédictive du transporteur ABCA1, considéré comme le prototype du sous-groupe de transporteurs de type ABCA ; la figure 4A illustre un modèle topologique comprenant deux moitiés symétriques, interrompues par un domaine R (domaine de régulation). Le segment hautement hydrophobe HHI se présente sous la forme d'une épingle à cheveux traversant deux fois la membrane. Chaque moitié est composée d'un ensemble de six éléments transmembranaires et d'une cassette de liaison à l'ATP ; la figure 4B illustre un modèle topologique alternatif dans lequel le segment hautement hydrophobe HHI ne traverse qu'une fois la membrane (de l'intérieur vers l'extérieur), ceci conduit à une In addition to the foregoing, the invention also comprises other arrangements, which will become apparent from the following description, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention, with reference to the drawings. in which: - Figure 1 illustrates the correspondence between the genomic structure of the ABCA1 gene and domains of the corresponding protein; - Figure 2 illustrates the conservation of the structure of the ABCA gene, for four different ABCA carriers at the NBD (NBD1 = N-terminal; NBD2 = C-terminal). The comparative genomic structure of the four ABCA carriers is illustrated. The limits of the domains are indicated and correspond to the interesting exons. Introns are indicated by black lines; the preserved patterns are indicated by shaded areas; HS: hot spot; S: switch region; A: Walker A; B: Walker B; C: active transport signature. The bottom rectangle illustrates a comparison of the organization of a NBD or NBD2 typical of the ABCA type carrier. 1: ABCA1; 2: ABCA2; X: ABCA7; A: ABCAR; FIG. 3 illustrates the conservation of the structure of the ABCA gene, for four different ABCA carriers at the level of the transmembrane domains (TD 1: N-terminal; TD 2: C-terminal); FIG. 4 represents the predictive topology of the ABCA1 transporter, considered as the prototype of the subgroup of ABCA type transporters; FIG. 4A illustrates a topological model comprising two symmetrical halves, interrupted by a domain R (regulation domain). The highly hydrophobic segment HHI is in the form of a hairpin crossing the membrane twice. Each half is composed of a set of six transmembrane elements and an ATP binding cassette; FIG. 4B illustrates an alternative topological model in which the highly hydrophobic segment HHI only crosses the membrane once (from the inside to the outside), this leads to a
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structure asymétrique comprenant une grande boucle extracellulaire suivie d'un nombre impair d'éléments transmembranaires dans la seconde moitié du transporteur ; - les figures 5 à 8 représentent les différents éléments nécessaires à la construction du vecteur utilisé pour la préparation de souris knock-out : la figure 5 illustre le vecteur de base (Lyl.41oxP21.1) utilisé pour la construction du vecteur de recombinaison ou de ciblage (figure 7 et 9 : ABClloxP-BN8); les figures 6 et 7 illustrent les fragments d'homologies utilisés en 5' (figure 6) et en 3' (figure 7) ; figure 8 illustre l'origine des fragments d'homologies utilisés ; - la figure 9 représente l'établissement de souris de phénotype ABCA1 nul : la figure 9a montre (1) l'organisation génomique d'une partie du locus ABCA1, dans laquelle les exons sont en noir (schéma du haut), (2) la structure du vecteur de ciblage et la structure prédite de l'allèle mutant (schéma du milieu et du bas). Enzymes de restriction : E : EcoRI, B : BamHI, H : HindIII. La position de la sonde (fragment HindIII de 500pb) utilisée pour le génotypage et la taille des fragments BamHI sur l'allèle sauvage et sur l'allèle mutant sont indiqués. La figure 9b illustre le génotypage des souris ABCA1 de type sauvage (+/+), hétérozygotes (-/+) et homozygotes (-/-) par analyse en Southem blot sur de l'ADN digéré par BamHI. La sonde correspond à la région de recombinaison homologue située en 5' (voir figure 9a) ; la figure 9c montre que les souris ABCA1 -/- n'expriment pas le transcrit ABCA1. L'analyse en Northem blot sur de l'ARN de foie de souris ABCA1 de type sauvage (+/+), hétérozygotes (-/+) et homozygotes (-/-) montre effectivement une absence de transcrits chez les souris -/-.La sonde utilisée est un fragment PstI d'ADNccorrrespondant à la région de recombinaison homologue située en aval. La position de l'ARN ribosomal et indiqué par référence à sa taille ; - la figure 10 représente la modification de la mobilité transmembranaire de la phosphatidylsérine (PS) dans les souris ABCAI KO (-/- ou -/+), évaluée par un test à la prothrombinase (figure 10a), par microvésiculation (figure lOb et par les mouvements de la PS (figure 10c). Les globules rouges obtenus à partir de souris sauvages +/+, ABCA1 +/- et ABCA1 -/- sont analysées dans des conditions de base (colonnes en noir) ou après stimulation au A23187 (0,5 M : colonnes hachurage épais ; 1 M : colonnes hachurage fin) ; Figure10a : nM d'équivalents PS exposés à la surface de 106 globules rouges. Les valeurs obtenues sont les suivantes : 5,89 1,8 asymmetric structure comprising a large extracellular loop followed by an odd number of transmembrane elements in the second half of the transporter; FIGS. 5 to 8 represent the various elements necessary for the construction of the vector used for the preparation of knockout mice: FIG. 5 illustrates the base vector (Lyl.41oxP21.1) used for the construction of the recombination vector or targeting (Figure 7 and 9: ABClloxP-BN8); Figures 6 and 7 illustrate the homology fragments used in 5 '(Figure 6) and 3' (Figure 7); Figure 8 illustrates the origin of the homology fragments used; FIG. 9 shows the establishment of mice with a null ABCA1 phenotype: FIG. 9a shows (1) the genomic organization of part of the ABCA1 locus, in which the exons are in black (top diagram), (2) the structure of the targeting vector and the predicted structure of the mutant allele (middle and bottom schema). Restriction enzymes: E: EcoRI, B: BamHI, H: HindIII. The position of the probe (HindIII fragment of 500bp) used for genotyping and size of BamHI fragments on the wild-type allele and the mutant allele are indicated. Figure 9b illustrates the genotyping of wild type (+ / +), heterozygous (- / +) and homozygous (- / -) ABCA1 mice by Southem blot analysis on BamHI digested DNA. The probe corresponds to the homologous recombination region situated at 5 '(see FIG. 9a); Figure 9c shows that ABCA1 - / - mice do not express the ABCA1 transcript. The Northem blot analysis on wild type ABCA1 (+ / +), heterozygous (- / +) and homozygous (- / -) mouse liver RNA actually shows a lack of transcripts in mice - / - The probe used is a PstI fragment of cDNA corresponding to the homologous recombination region situated downstream. The position of ribosomal RNA and indicated by reference to its size; FIG. 10 represents the modification of the transmembrane mobility of phosphatidylserine (PS) in ABCAI KO mice (- / - or - / +), evaluated by a prothrombinase test (FIG. 10a), by microvesicles (FIG. 10b and FIG. by the movements of PS (Figure 10c) Red blood cells obtained from wild-type + / +, ABCA1 +/- and ABCA1 - / - mice are analyzed under baseline conditions (black columns) or after A23187 stimulation. (0.5 M: thick hatch columns, 1 M: fine hatch columns), Figure 10a: nM PS equivalents exposed to the surface of 106 red blood cells The values obtained are as follows: 5.89 1.8
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pour-/-, 5,84 1,2 pour +/- et 8,53 2,7 pour +/+ dans des conditions de base ; 5,5 0,49 pour -/-, 14,21 2,2 pour +/- et 15,67 3,9 pour +/+ à 0,5 M d'A23187 et 7,93
2,1 pour -/-, 17,1 1,7 pour +/- et 22,5 6 pour +/+ à 1 M d'A23187 ; Figure 10b évaluation en cytométrie de flux de la microvésiculation de la membrane plasmique. for - / -, 5.84 1.2 for +/- and 8.53 2.7 for + / + under basic conditions; 5.5, 0.49 for - / -, 14.21, 2.2 for +/- and 15.67, 3.9 for + / + at 0.5 M of A23187 and 7.93
2.1 for - / -, 17.1 1.7 for +/- and 22.5 6 for + / + to 1 M of A23187; Figure 10b flow cytometric evaluation of the microvesicles of the plasma membrane.
Les valeurs en % de microvésicules sont : 2,59 1,2 pour -/-, 4,6 1,3 pour +/- et 4,5
1,2 pour +/+dans des conditions de base ; 2,56 1,1 pour-/-, 5,5 1,9 pour +/- et 9,1 3,3 pour +/+ à 0,5 mM d'A23187 et 4,5 2,2 pour -/-, 6,1 2,1 pour + /- et 14,97 5,2 pour +/+ à 1 mM d'A23187 ; Figure 10c : évaluation des mouvements de PS entre les deux feuillets lipidiques : à 20 min 86,9 % de PS pour-/-, 84,1 % de PS pour +/- et 85,7 % de PS pour +/+ sont distribués au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique. Après un stress au calcium (A23187,2 mM à t=20 min) 24 % de PS pour +/+, 15 % de PS pour +/- et 10,6 % de PS pour-/- migrent vers le feuillet externe. Le mouvement net global est diminué de 45 % chez les souris-/- et de 62 % chez les animaux +/-, par rapport aux animaux de type sauvage ; - la figure 11illustre l'évolution des paramètres lipidiques (cholestérol, HDL et triglycérides) chez les souris-/-, -/+ et +/+ ; - les figures 12 à 17 illustrent le contrôle de l'expression du transporteur ABCA1 dans des cellules HeLa (transfectants stables) : figure 12 : immunoprécipitation de la protéine ABCA1/GFP (bande à 250kDa) ; figure 13 : stratégie d'obtention d'une construction ABCA1/GFP ; figure 14 : mutants ABCA1 ; figure 15 : représentation schématique du plasmide pBI ABCA1/GFP ; figure 16 : mesure de l'efflux de phospholipides contenant de la choline ; figure 17 : mesure de l'efflux de cholestérol (15000 cellules HeLa, 15000 cellules 6C, 40000 cellules AG2 par puits). The values in% microvesicles are: 2.59 1.2 for - / -, 4.6 1.3 for +/- and 4.5
1.2 for + / + under basic conditions; 2.56 1.1 for - / -, 5.5 1.9 for +/- and 9.1 3.3 for +/- 0.5 mM of A23187 and 4.5 2.2 for - / -, 6.1 2.1 for +/- and 14.97 5.2 for +/- at 1 mM A23187; Figure 10c: assessment of PS movements between the two lipid sheets: at 20 min 86.9% PS for - / -, 84.1% PS for +/- and 85.7% PS for + / + are distributed at the level of the inner leaflet of the plasma membrane. After calcium stress (A23187.2 mM at t = 20 min) 24% PS for + / +, 15% PS for +/- and 10.6% PS for - / - migrate to the outer leaflet. The overall net movement is decreased by 45% in - / - mice and by 62% in +/- animals, compared to wild type animals; FIG. 11 illustrates the evolution of lipid parameters (cholesterol, HDL and triglycerides) in the - / -, - / + and + / + mice; FIGS. 12 to 17 illustrate the control of the expression of the ABCA1 transporter in HeLa cells (stable transfectants): FIG. 12: immunoprecipitation of the ABCA1 / GFP protein (250 kDa band); figure 13: strategy for obtaining ABCA1 / GFP construction; Figure 14: ABCA1 mutants; Figure 15: schematic representation of plasmid pBI ABCA1 / GFP; Figure 16: measurement of the efflux of phospholipids containing choline; Figure 17: measurement of cholesterol efflux (15000 HeLa cells, 15000 6C cells, 40000 AG2 cells per well).
- la figure 18 (voir également SEQ ID NO:2) représente la séquence de l'ADN génomique du transporteur ABCAX ; cette figure, les exons sont en gras. FIG. 18 (see also SEQ ID NO: 2) represents the sequence of the genomic DNA of the ABCAX transporter; this figure, the exons are in bold.
- la figure 19 est une représentation schématique de la structure exon-intron du gène ABCX. FIG. 19 is a schematic representation of the exon-intron structure of the ABCX gene.
- la figure 20 représente le protocole PCR (exemple 4). FIG. 20 represents the PCR protocol (example 4).
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EXEMPLE 1 : Mesure des mouvements lipidiques. EXAMPLE 1 Measurement of Lipid Movements
Analyse cinétique de l'apparition de phosphatidylserine sur le feuillet lipidique externe de la membrane plasmique de différents types cellulaires
Les cellules sont récoltées soit à partir de culture in vitro ou ex vivo soit fraîchement isolées à partir de souris et placées à une concentration finale de 107 cellules/ml en milieu de culture RPMI. Pour chaque point de cinétique, la fixation à la surface des cellules, de l'annexine V conjuguée avec un fluorophore donné (FITC, PE ou Cy5) est enregistrée en fonction du temps par cytométrie de flux ; environ 106 cellules sont incubées à l'équilibre avec une concentration saturante d'annexine V conjuguée au fluorophore dans une solution A (NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4). A l'instant initial, l'ionophore de calcium A23187 (concentration variant entre 0,01 M et 10 M) est ajouté à la suspension cellulaire et les variations de fixation de l'annexine V à la surface des cellules sont enregistrées par intervalle de temps variant entre 100 ms et 1 sec. Les paramètres cinétiques de la fixation de l'annexine V sont calculés à partir du traitement des données d'enregistrement. Kinetic analysis of the appearance of phosphatidylserine on the outer lipid layer of the plasma membrane of different cell types
The cells are harvested either from in vitro or ex vivo culture or freshly isolated from mice and placed at a final concentration of 107 cells / ml in RPMI culture medium. For each point of kinetics, the attachment to the cell surface of annexin V conjugated with a given fluorophore (FITC, PE or Cy5) is recorded as a function of time by flow cytometry; about 106 cells are incubated at equilibrium with a saturating concentration of fluorophore-conjugated annexin V in solution A (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7.4). At the initial moment, the calcium ionophore A23187 (concentration varying between 0.01 M and 10 M) is added to the cell suspension and the annexin V attachment variations at the cell surface are recorded at intervals of time varying between 100 ms and 1 sec. The kinetic parameters of annexin V binding are calculated from the processing of the registration data.
Mesure des mouvements de phospholipides entre les feuillets lipidiques de la membrane plasmique des érythrocytes de souris
Les érythrocytes sont préparés à partir d'échantillon de sang de souris. Après élimination des lymphocytes, les érythrocytes sont lavés et suspendus à une concentration d'hématocrite de 20%. Measurement of phospholipid movements between lipid layers of the plasma membrane of mouse erythrocytes
The erythrocytes are prepared from mouse blood sample. After removal of the lymphocytes, the erythrocytes are washed and suspended at a hematocrit concentration of 20%.
Pour analyser les mouvements de phospholipides, les sondes lipidiques (phospholipides marqués en spin avec une courte chaîne ss (C5) portant une sonde nitroxyde) sont dispersées dans le milieu de culture cellulaire. Il en résulte une incorporation dans le feuillet externe de la membrane plasmique à une concentration finale de 1% des lipides totaux. A différents intervalles de temps, des fractions aliquotes sont diluées en présence de 2% d'albumine sérique bovine (BSA) dépourvue d'acide gras et conservées 1 minute sur la glace. La sonde phospholipidique extraite du feuillet membranaire externe par la BSA est réduite en présence d'ascorbate de sodium à une concentration finale de 65 mM. L'intensité résiduelle de résonance du champ électronique de spin, attribuable à la sonde localisée dans le feuillet interne, est To analyze the phospholipid motions, the lipid probes (spin-labeled phospholipids with a short ss chain (C5) carrying a nitroxide probe) are dispersed in the cell culture medium. This results in incorporation into the outer leaflet of the plasma membrane at a final concentration of 1% of total lipids. At different time intervals, aliquots are diluted in the presence of 2% bovine serum albumin (BSA) devoid of fatty acid and stored for 1 minute on ice. The phospholipid probe extracted from the outer membrane sheet by BSA is reduced in the presence of sodium ascorbate to a final concentration of 65 mM. The residual resonance intensity of the electronic spin field, attributable to the probe located in the internal sheet, is
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exprimée en pourcentage des mesures réalisées sur des fractions aliquotes en l'absence de BSA et d'ascorbate de sodium. expressed as a percentage of the measurements made on aliquots in the absence of BSA and sodium ascorbate.
Mesure des efflux de cholestérol à partir de cellules en culture
Les cellules à étudier sont distribuées en plaque de culture de
12 puits, le premier jour. Le milieu est changé par 1 ml de milieu de charge contenant 1,5 Ci/ml 14C-Cholesterol, 10 Ci/ml 3H-Choline le deuxième jour. Après deux rinçages avec du PBS-0,5%BSA, 1 ml de milieu d'efflux est ajouté le cinquième jour. Measurement of cholesterol efflux from cells in culture
The cells to be studied are distributed in culture plate of
12 wells, the first day. The medium is changed with 1 ml of loading medium containing 1.5 Ci / ml 14C-Cholesterol, 10 Ci / ml 3H-Choline on the second day. After two rinses with PBS-0.5% BSA, 1 ml of efflux medium is added on the fifth day.
Le milieu et des cellules sont séparés le sixième jour. Les milieux sont centrifugés 7 minutes à 3000 rpm pour éliminer les cellules mortes flottantes. Les cellules sont lysées dans deux fois 0,5 ml de SDS 0,2%, une partie est prélevée pour déterminer la concentration protéique. Les lipides sont extraits des milieux et les cellules sont lysées. Le comptage se fait par ajout de 3 ml de solution scintillante dans un compteur de scintillation. Le pourcentage d'efflux est la radioactivité mesurée pour le milieu divisée par la radioactivité totale (cellules + milieu). The middle and cells are separated on the sixth day. The media are centrifuged for 7 minutes at 3000 rpm to remove floating dead cells. The cells are lysed in twice 0.5 ml of 0.2% SDS, a part is taken to determine the protein concentration. The lipids are extracted from the media and the cells are lysed. The counting is done by adding 3 ml of scintillating solution in a scintillation counter. The percentage of efflux is the radioactivity measured for the medium divided by the total radioactivity (cells + medium).
Lvse des cellules
La lyse des cellules s'effectue après 2 rinçages au PBS dans une solution 0,2% SDS. Lvse cells
The lysis of the cells is carried out after 2 rinses with PBS in a 0.2% SDS solution.
Extraction lipidique
0,8 ml de lysat sont mélangés à 3 ml de Blight and dyer (chloroforme/méthanol 1:2, v/v) et laissé reposer 1 heure. Après l'addition d'l ml d'H20 et 1 ml de chloroforme, l'échantillon est vortexé 15 secondes et centrifugé à température ambiante 10 à 20 min. à 4000 rpm. La phase inférieure (organique) est pipetée et le chloroforme évaporé dans un speed vacuum. Le tube sec se garde à -20 C. Lipid extraction
0.8 ml of lysate are mixed with 3 ml of Blight and dyer (chloroform / methanol 1: 2, v / v) and allowed to stand for 1 hour. After the addition of 1 ml of H 2 O and 1 ml of chloroform, the sample is vortexed for 15 seconds and centrifuged at room temperature for 10 to 20 min. at 4000 rpm. The lower (organic) phase is pipetted and the chloroform evaporated in a speed vacuum. The dry tube is kept at -20 C.
Détermination de la concentration de cholestérol
Le culot de lipide sec est repris dans du chloroforme/méthanol (1:1, v/v) et la quantité voulue (en équivalent de g de protéines) déposée sur une plaque de chromatographie en couche mince (CCM) de silice. La migration s'effectue avec un solvant hexane/Et20/AcOH (80:20:1, v/v). La révélation se fait par un bain de 8 secondes dans du MnCl2 puis chauffage 30 minutes à 110 C. L'analyse de la plaque se fait par rapport à des standards par lecture de la fluorescence émise suite à Determination of cholesterol concentration
The dry lipid pellet is taken up in chloroform / methanol (1: 1, v / v) and the desired amount (in equivalent of g of proteins) deposited on a silica thin layer chromatography (TLC) plate. The migration is carried out with hexane / Et 2 O / AcOH solvent (80: 20: 1, v / v). The revelation is carried out by an 8-second bath in MnCl 2 and then heated for 30 minutes at 110 ° C. The plate is analyzed according to standards by reading the fluorescence emitted following
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l'excitation par une lampe à mercure. Les trois pics sont cholestérol (FC), triglycérides (TC), ester de cholestérol (CE). the excitement by a mercury lamp. The three peaks are cholesterol (FC), triglycerides (TC), cholesterol ester (CE).
Dosage des phospholipides
Le culot de lipide sec est repris dans du chloroforme/méthanol (1:1 v/v) et la quantité voulue (en équivalent de g de protéines) déposée sur une plaque de chromatographie en couche mince (CCM) de silice. La migration s'effectue avec un
solvant méthanol/chloroformeIMeAcIN-Prop/0,25%KCl (10:25:25:25:9, v/v). La révélation se fait par un bain de 12 secondes dans du CuSO4- et chauffage 10 minutes à 110 C puis 15 min à 170 C. L'analyse de la plaque se fait par rapport à des standards par lecture de la fluorescence émise suite à l'excitation par une lampe de mercure. Les différents pics sont sphingomyéline (SPM), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI) ; les phosphatidyléthanolamines (PE) et le phosphatidylglycérol (PG) ne peuvent pas être dissociés. Determination of phospholipids
The dry lipid pellet is taken up in chloroform / methanol (1: 1 v / v) and the desired amount (in equivalent of g of protein) deposited on a silica thin layer chromatography (TLC) plate. The migration is done with a
methanol / chloroform solvent. AcIN-Prop / 0.25% KCl (10: 25: 25: 25: 9, v / v). The revelation is carried out by a 12-second bath in CuSO4- and heating for 10 minutes at 110 ° C. and then for 15 minutes at 170 ° C. The plate is analyzed according to standards by reading the fluorescence emitted after excitement by a mercury lamp. The different peaks are sphingomyelin (SPM), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI); phosphatidylethanolamines (PE) and phosphatidylglycerol (PG) can not be dissociated.
EXEMPLE 2 : SourisABCA1 dans lesquelles le gène ABCA1 est inactivé : souris hétérozygotes (-/+) et souris homozygotes (-/-) A. Stratégie d'inactivation par recombinaison homologue du gène ABCA1 murin
Les fragments d'ADN génomiques utilisés pour construire le vecteur de recombinaison homologue sont tous issus de la banque de STRATAGENE d'ADN génomique de souris de souche 129SV cloné dans le vecteur lambda FIXII. EXAMPLE 2: Mouse ABCA1 in which the ABCA1 gene is inactivated: heterozygous mice (- / +) and homozygous mice (- / -) A. Homologous inactivation strategy of the murine ABCA1 gene
The genomic DNA fragments used to construct the homologous recombination vector are all from the STRATAGENE library of mouse 129SV genomic DNA cloned into the lambda vector FIXII.
Vecteur de recombinaison
Le vecteur de base (Lyl.41oxP21.1) est dérivé du vecteur pKO (X. Recombinant vector
The base vector (Lyl.41oxP21.1) is derived from the vector pKO (X.
Morin et al., Neuron, 1997, 18, 3, 411-423) contenant le gène de résistance au G418 (Neo) issu du vecteur pMCINeoPolyA (STRATAGENE) flanqué en 5' d'un site multiple de clonage et séparé en 3' de la cassette HSV-Tk par un site BamHI. Morin et al., Neuron, 1997, 18, 3, 411-423) containing the G418 (Neo) resistance gene from the vector pMCINeoPolyA (STRATAGENE) flanked in 5 'by a multiple cloning site and separated into 3' of the HSV-Tk cassette by a BamHI site.
Un site loxP issu du vecteur pZ30 et excisé XhoI-SalI a été rajouté en amont du gène Neo dans le site Xhol (figure 5). A loxP site derived from the vector pZ30 and excised XhoI-SalI was added upstream of the Neo gene in the XhoI site (FIG. 5).
Fragments génomiques d'homologies
En 5' : un fragment HindIII-EcoRI de 1,8 kb a été utilisé. HindIII est localisé dans l'intron 15 et EcoRI en position 2636 dans l'exon 17 (figures 6 et 8). Genomic fragments of homologies
In 5 ': a HindIII-EcoRI fragment of 1.8 kb was used. HindIII is localized in intron 15 and EcoRI at position 2636 in exon 17 (Figures 6 and 8).
En 3' : un fragment BamHI-NotI de 11,5 kb a été utilisé. BamHI est localisé dans l'intron 22 et Notl est un site artificiel de clonage issu du phage lambda In 3 ': a BamHI-NotI fragment of 11.5 kb was used. BamHI is localized in intron 22 and NotI is an artificial cloning site derived from lambda phage
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FIXII et serait situé dans l'intron 30. Ce fragment a été modifié par ajout d'un site loxP (dans la même orientation que le site loxP du vecteur) dans le site SphI situé à 5,5 kb de l'extrémité BamHI (figures 7 et 8). FIXII and would be located in intron 30. This fragment was modified by addition of a loxP site (in the same orientation as the vector loxP site) in the SphI site located 5.5 kb from the BamHI end ( Figures 7 and 8).
Origine des fragments d'homologies et détails de la construction (figure 8) :
Fragment 5' : un fragment BamHI-BamHI de 6,8 kb a été excisé du phage lambda 13.1 (extrémités : dans l'intron 11 et dans l'intron 23) issu d'un criblage de la banque de STRATAGENE d'ADN génomique de souris de souche 129SV décrite ci-dessus, par une sonde d'ADNc de ABCA1 de 875 pb EcoRI-PstI (2636- 3511). Ce fragment a été cloné dans pBKS (STRATAGENE) dans le site BamHI. Ce vecteur pBKS-BamHI a été digéré par EcoRI et HindIII. Le fragment de 1,8 kb a été cloné dans pBKS digéré EcoRI et HindIII. Ce vecteur pBKS-HindIII-EcoRI a été modifié par remplacement de la région EcoRI-SacI par le linker : AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO :3) TTAAGAGCTCGCCGGCGAAGCTTCTCGA (SEQ ID NO :4)
Ce linker contient un site XhoI servant à exciser le fragment HindIII-EcoRI de 1,8 kb pour le cloner ClaI-XhoI dans le vecteur de recombinaison digéré ClaI-XhoI oligonucléotides utilisés pour faire le linker : AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO :3) CTTCGAAGCGGCCGCTCGAG (SEQ ID NO :5)
Fragment 3' : le fragment BamHI-NotI a été excisé du phage lambda 3. 1 (extrémités : dans l'intron 16 et dans l'intron 30) issu du même ciblage que précédemment. Le site NotI est un site artificiel du vecteur lambda FIXII qui permet d'exciser l'insert du vecteur. Ce fragment a été cloné dans pBKS digéré BamHI et Notl. Ce vecteur pBKS-BamHI-NotI a été modifié par ajout d'un site loxP (avec un site Spel) dans le site SphI grâce au linker : CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO : 6) CGTACGTTATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATATAATGATCACGTAC (SEQ ID NO :7) Origin of fragments of homologies and details of construction (Figure 8):
5 'Fragment: a 6.8 kb BamHI-BamHI fragment was excised from phage lambda 13.1 (ends: in intron 11 and intron 23) from a screening of the genomic DNA stratagen library 129SV strain mouse described above, by an EcoRI-PstI 8765 bp ABCA1 cDNA probe (2636-3511). This fragment was cloned into pBKS (STRATAGENE) in the BamHI site. This pBKS-BamHI vector was digested with EcoRI and HindIII. The 1.8 kb fragment was cloned into EcoRI and HindIII digested pBKS. This pBKS-HindIII-EcoRI vector was modified by replacing the EcoRI-SacI region with the linker: AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO: 3) TTAAGAGCTCGCCGGCGAAGCTTCTCGA (SEQ ID NO: 4)
This linker contains a XhoI site for excising the 1.8 kb HindIII-EcoRI fragment for ClaI-XhoI cloning in the ClaI-XhoI digested recombination vector. Oligonucleotides used to make the linker: AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO: 3) CTTCGAAGCGGCCGCTCGAG (SEQ ID NO: 5)
Fragment 3 ': the BamHI-NotI fragment was excised from phage lambda 3. 1 (ends: in intron 16 and in intron 30) from the same targeting as previously. The NotI site is an artificial site of the lambda vector FIXII which makes it possible to excise the insert of the vector. This fragment was cloned into BamHI and NotI digested pBKS. This pBKS-BamHI-NotI vector was modified by adding a loxP site (with a Spel site) in the SphI site by means of the linker: CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO: 6) CGTACGTTATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATATAATGATCACGTAC (SEQ ID NO: 7)
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Oligonucléotides ayant servi à faire le linker : CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO : 6) et CACTAGTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGCATG (SEQ ID NO :8)
Puis un linker contenant le site BamHI a été introduit à la place de la région NotI-SacII du polylinker de pBKS-BamHI-NotI : GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO :9) CCGGCCTAGGTGCGCAGGCG (SEQ ID NO :10)
Oligonucléotides ayant servi à faire le linker : GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO : 9) GGACGCGTGGATCC (SEQ ID NO : 11)
Le fragment BamHI-NotI de 11,5 kb initial a pu donc être excisé BamHI et cloné dans le vecteur de recombinaison homologue contenant la région d'homologie 5'. Oligonucleotides used to make the linker: CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO: 6) and CACTAGTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGCATG (SEQ ID NO: 8)
Then a linker containing the BamHI site was introduced in place of the NotI-SacII region of the polylinker of pBKS-BamHI-NotI: GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO: 9) CCGGCCTAGGTGCGCAGGCG (SEQ ID NO: 10)
Oligonucleotides used to make the linker: GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO: 9) GGACGCGTGGATCC (SEQ ID NO: 11)
The initial 11.5 kb BamHI-NotI fragment could thus be excised BamHI and cloned into the homologous recombination vector containing the 5 'homology region.
Le vecteur a été linéarisé ClaI avant électroporation dans les cellules ES DBA-252 issues de souris de souche DBA-lLacJ. The vector was linearized ClaI before electroporation in ES cells DBA-252 from mice of strain DBA-lLacJ.
Recombinaison homologue
La recombinaison homologue résultante de cette électroporation, en conditions classiques, permet un remplacement de 5,7 kb de l'ADN génomique d'ABCAl, soit 910 pb de séquence codante correspondant à une partie de l'exon 17 et la totalité des exons 18, 19, 20, 21 et 22, par le gène Neo (figure 9). Homologous recombination
The resulting homologous recombination of this electroporation, under conventional conditions, allows a 5.7 kb replacement of the ABCA1 genomic DNA, ie 910 bp of coding sequence corresponding to part of the exon 17 and all the exons. , 19, 20, 21 and 22, by the Neo gene (Figure 9).
Le génotype obtenu est vérifié par PCR et par analyse en Southem blot de l'ADN digérée par BamHI et hybridée avec une sonde située hors de la région de recombinaison homologue. La taille des fragments de restriction est de 6,8 kb pour l'allèle sauvage et de 4,4 kb pour l'allèle mutant (figures 9a et 9b). The genotype obtained is verified by PCR and by Southem blot analysis of BamHI-digested DNA hybridized with a probe located outside the homologous recombination region. The size of the restriction fragments is 6.8 kb for the wild-type allele and 4.4 kb for the mutant allele (Figures 9a and 9b).
De manière plus précise, le génotypage par PCR est réalisé par utilisation de deux couples d'oligonucléotides : (1) un couple qui détecte l'allèle sauvage (environ 800 pb) : oligo KO sens : GGAACCCACTCATCTGAGGC (SEQ ID NO :12) oligo KO antisens : GGGGACAGACTCCCAGGTTC (SEQ ID NO :13) et (2) un couple détectant l'allèle recombiné (environ 2,3 kb) : More specifically, PCR genotyping is performed using two pairs of oligonucleotides: (1) a pair that detects the wild-type allele (about 800 bp): oligo KO sense: GGAACCCACTCATCTGAGGC (SEQ ID NO: 12) oligo Antisense KO: GGGGACAGACTCCCAGGTTC (SEQ ID NO: 13) and (2) a pair detecting the recombinant allele (about 2.3 kb):
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BgIII sens : CACCTCCCCAGGGTGTTGGATAAT (SEQ ID NO :14) Neo : TGCAATCCATCTTGTTCAATGGCCG (SEQ ID NO :15) Protocole de la PCR : 1-10' à 94 C
2-1' à 94 C
3-1' à 65 C 4-2'30"à72 C répéter 2- à 4-, 35 fois
En Southem blot : En 5' après digestion de l'ADN génomique par BamHI, une sonde BglII-HindIII de 520pb (BglII dans l'exon 15 en position 2410 et HindIII de clonage dans l'intron 15) détecte un fragment à 6,8 kb pour l'allèle sauvage et 4,4 kb pour l'allèle muté (figure 9). BgIII sense: CACCTCCCCAGGGTGTTGGATAAT (SEQ ID NO: 14) Neo: TGCAATCCATCTTGTTCAATGGCCG (SEQ ID NO: 15) PCR Protocol: 1-10 'to 94C
2-1 'to 94 ° C
3-1 'at 65 C 4-2'30 "at 72 C repeat 2- to 4-, 35 times
In Southem blot: In 5 'after digestion of genomic DNA with BamHI, a 520 bp BglII-HindIII probe (BglII in exon 15 at position 2410 and HindIII cloning in intron 15) detects a fragment at 6, 8 kb for the wild-type allele and 4.4 kb for the mutated allele (Figure 9).
En 3' en utilisant une sonde BgIII-Spel de 2,5 kb (BgIII dans l'intron 27 et SpeI dans l'intron 29). Par digestion de l'ADN génomique avec SpeI. La recombinaison a lieu avant le site loxP (contenant un site Spel) : détection d'un fragment de 7,5 kb. 3 'using a 2.5 kb BgIII-Spel probe (BgIII in intron 27 and SpeI in intron 29). By digestion of genomic DNA with SpeI. Recombination takes place before the loxP site (containing a Spel site): detection of a 7.5 kb fragment.
Par digestion EcoRI de l'ADN génomique : détection d'une bande de 5,3 kb si la recombinaison s'est produite correctement. By EcoRI digestion of genomic DNA: detection of a 5.3 kb band if recombination has occurred correctly.
Les clones résistants au G418/gancyclovir sont criblés par analyse en Southem blot et les cellules ES portant l'allèle tronqué sont microinjectées dans des embryons au stade blastocytes 3,5 jours. Le croisement des chimères conduit à une génération de descendants hétérozygotes croisés entre eux pour la production de mutants -/- homozygotes. The G418 / gancyclovir resistant clones are screened by Southem blot analysis and ES cells carrying the truncated allele are microinjected into 3.5 day blastocyst stage embryos. The crossing of the chimeras leads to a generation of heterozygous progeny crossed with each other for the production of homozygous mutants.
B. Propriétés des souris ABCA -/-. B. Properties of ABCA - / - mice.
Matériel et méthodes voir exemple 1
Résultats
L'allèle mutant ABCA1 obtenu ne comprend pas les 5 exons codant la 1ère cassette de liaison ATP et une partie du domaine de régulation du transporteur. Material and methods see example 1
Results
The mutant allele ABCA1 obtained does not include the 5 exons encoding the 1st ATP binding cassette and part of the transporter regulatory domain.
On obtient un phénotype nul ; les souris portant l'allèle mutant homozygote n'expriment pas l'ARNm d'ABCAI. A zero phenotype is obtained; mice bearing the homozygous mutant allele do not express ABCAI mRNA.
L'analyse des différents croisements hétérozygotes montrent que l'allèle muté ABCA1 est transmis de manière mendélienne ; on observe un taux de Analysis of different heterozygous crosses shows that the mutated allele ABCA1 is transmitted in a Mendelian manner; a rate of
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mortalité élevé dans les premières semaines (50 des 79 nouveau-nés survivent à 4 semaines dans les proportions suivantes : -/- : 5/21 ; +/- 28/40 ; +/+17/18). high mortality in the first weeks (50 of the 79 newborns survive at 4 weeks in the following proportions: - / -: 5/21; +/- 28/40; + / + 17/18).
Analyse de la cinétique de l'apparition de phosphatidylsérine (PS) sur le feuillet lipidique externe de la membrane plasmique de cellules-/-. Analysis of the kinetics of the appearance of phosphatidylserine (PS) on the outer lipid layer of the plasma membrane of cells - / -.
Des hématies sont prélevées sur des animaux de 4 semaines et la quantité de PS exposée sur le feuillet externe de la membrane plasmique est évaluée dans les conditions exposées à l'exemple 1. Red blood cells are taken from 4-week-old animals and the amount of PS exposed on the outer leaflet of the plasma membrane is evaluated under the conditions described in Example 1.
Les résultats sont illustrés à la figure 10 et montrent que la perte de la fonction ABCA1 perturbe les mouvements transmembranaires de lipides après stimulation par le ionophore de calcium A23187. The results are shown in Figure 10 and show that loss of ABCA1 function disrupts transmembrane lipid movements after calcium ionophore A23187 stimulation.
Analyse des lipides plasmatiques et des lipoprotéines
Comme illustré à la figure 11, les HDL sont pratiquement complètement absentes du sérum des souris ABCA1 -/- et de plus, le cholestérol total est significativement réduit. Plasma Lipid and Lipoprotein Analysis
As illustrated in FIG. 11, HDL are virtually completely absent from the serum of ABCA1 - / - mice and further, total cholesterol is significantly reduced.
Les souris ABCAI +/- présentent un phénotype intermédiaire qui peut refléter un effet gène-dépendant. ABCAI +/- mice have an intermediate phenotype that may reflect a gene-dependent effect.
Les taux sériques en triglycérides dans les mutants ABCA1 -/- sont significativement élevés par rapport à ceux observés chez les souris de type sauvage +/+ et chez les souris ABCA1 +/-. Serum triglyceride levels in ABCA1 - / - mutants were significantly elevated relative to those seen in + / + wild type mice and in ABCA1 +/- mice.
Ces résultats montrent une déficience plasmatique sévère en HDL chez les souris ABCA1 -/-. These results show a severe plasma deficiency in HDL in ABCA1 - / - mice.
EXEMPLE 3 : obtention de transfectants stables pour ABCA1 et ses dérivés 1. Constructions préliminaires
L'ADN complémentaire codant pour la protéine ABCA1 a été construit à partir des clones phagiques chevauchants XI 3C, #10F et #8a4 dans le vecteur de clonage procaryote pBluescript KS+/- (STRATAGENE). Le fragment EcoRI/HindIII du phage #10F (nucléotides 2568-5665) a été cloné en amont du fragment HindIII/XbaI du phage #8q4 (nucléotides 5666-6916) précédemment cloné HindIII/XbaI dans pBluescript KS+/- (KS 8a4 wt). La construction obtenue (ks 108 wt) a reçu le fragment NgoMI/EcoRI du clone #13C contenant la région 5' de ABCA1 (nucléotides 1-2567) permettant de reconstituer l'intégralité de l'ADNc de ABCA1. EXAMPLE 3: Obtaining stable transfectants for ABCA1 and its derivatives 1. Preliminary constructions
The complementary DNA coding for the ABCA1 protein was constructed from the overlapping phage clones XI 3C, # 10F and # 8a4 in the prokaryotic cloning vector pBluescript KS +/- (STRATAGENE). The EcoRI / HindIII fragment of phage # 10F (nucleotides 2568-5665) was cloned upstream of the HindIII / XbaI fragment of phage # 8q4 (nucleotides 5666-6916) previously cloned HindIII / XbaI in pBluescript KS +/- (KS 8a4 wt). . The resulting construct (ks 108 wt) received the NgoMI / EcoRI fragment of clone # 13C containing the 5 'region of ABCA1 (nucleotides 1-2567) to reconstitute all of the ABCA1 cDNA.
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La construction finale (KS ABCAlwt) a été excisée NotI/ApaI et clonée dans le ecteur pSP64TN poly (A), modifiée du vecteur pSP64T poly(A) (F. Becq et al., J. Biol. Chem., 1997,272, 5,2695-2699) par l'insertion d'un adaptateur (GATCTGGGCCCACTCGAGTTAACG CGGCCGCA) (SEQ ID NO : 16) conférant les sites uniques de clonage ApaI, XhoI, HpaI et NotI. La construction finale baptisée pSP64TN ABCA1 a servi de base à toutes les constructions dans le vecteur d'expression bidirectionnel et conditionnel pBI (Clontech). The final construct (KS ABCAlwt) was excised NotI / ApaI and cloned into the pSP64TN poly (A) vector, modified with the vector pSP64T poly (A) (F. Becq et al., J. Biol Chem., 1997,272 , 5,2695-2699) by the insertion of an adapter (GATCTGGGCCCACTCGAGTTAACG CGGCCGCA) (SEQ ID NO: 16) conferring the unique cloning sites ApaI, XhoI, HpaI and NotI. The final construct called pSP64TN ABCA1 served as a basis for all constructs in the bidirectional and conditional expression vector pBI (Clontech).
2. Constructions géniques dans le vecteur d'expression eucaryote pBI 2. 1. pBI ABCAI wt
Le fragment NotI/Bspl20I de pSP64TN ABCA1 de type sauvage (wt) contenant l'intégralité de l'ADNc de ABCA1 a été inséré dans le site NotI dans le second site multiple de clonage (MCS II) du vecteur pBI (pBI ABCAI wt). 2. Gene constructs in eukaryotic expression vector pBI 2. 1. pBI ABCAI wt
The NotI / Bspl20I fragment of wild-type pSP64TN ABCA1 (wt) containing the entire ABCA1 cDNA was inserted into the NotI site in the second cloning site (MCS II) of the pBI vector (pBI ABCAI wt). .
2. 2 pBI ABCA1/GFP
La construction pBI ABCAI/GFP (figure 15) a été obtenue en 3 étapes :
Le site Xba du MCS de KS 108 wt a été délété par coupure enzymatique des sites NotI et Spel, suivie du remplissage de leur extrémité 5' débordante par le fragment Klenow de la DNA polymérase 1 d'E. coli (Pharmacia). La construction KS 108/GFP a été obtenue par PCR (Polymerase Chain Reaction, technique d'extension par chevauchement (VALLEJO et al., page 603 et sv. in PCR Primers, Ed C. W. Dieffenbach G. S. Dveksler, CHSL press, 1995). Cette technique repose sur l'utilisation de 4 oligonucléotides (A, B, C, D) au cours de deux séries d'amplification (figure 13) :
L'amorce A, oligonucléotide 5' sens, spécifique de la région 3' de ABCAI :
A : TGAACCAACCACAGGCAT (ABCA1 nc 6221-6239) (SEQ ID NO :17). 2. 2 pBI ABCA1 / GFP
The pBI ABCAI / GFP construct (Figure 15) was obtained in 3 steps:
The Xba site of the MCS of KS 108 wt was deleted by enzymatic cleavage of the NotI and Spel sites, followed by the filling of their 5 'end flanking with the Klenow fragment of E. DNA polymerase 1. coli (Pharmacia). The KS 108 / GFP construct was obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction, overlap extension technique (VALLEJO et al., Page 603 and SV in PCR Primers, CW Ed Dieffenbach GS Dveksler, CHSL press, 1995). technique relies on the use of 4 oligonucleotides (A, B, C, D) during two amplification rounds (FIG. 13):
Primer A, 5 'sense oligonucleotide, specific for the 3' region of ABCAI:
A: TGAACCAACCACAGGCAT (ABCA1 No. 6221-6239) (SEQ ID NO: 17).
Les amorces B (3' antisens) et C (5' sens), partiellement complémentaires contenant l'extrémité 3' de ABCA1 (sans le codon stop) fusionnée avec l'extrémité 5' de EGFP (à partir de l'ATG d'initiation). The partially complementary B (3 'antisense) and C (5' sense) primers containing the 3 'end of ABCA1 (without the stop codon) fused with the 5' end of EGFP (from the ATG of initiation).
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B:TCGCCCTTGCTCACCATTACATAACTTTCTTTCACTTTC (GFP ne 17-1 ; ABCA1 ne 6798-6786) (SEQ ID NO :18). B: TCGCCCTTGCTCACCATTACATAACTTTCTTTCACTTTC (GFP No. 17-1, ABCA1 No. 6798-6786) (SEQ ID NO: 18).
C : ATGGTGAGCAAGGGCGA (GFP nc 1-17) (SEQ ID NO :19). C: ATGGTGAGCAAGGGCGA (GFP # 1-17) (SEQ ID NO: 19).
L'amorce D (3' antisens) spécifique de la région 3' de EGFP, contenant une mutation silencieuse du site BsrGI (en gras) le codon stop de la EGFP (en minuscule) et deux sites de clonage additionnels NotI et XbaI soulignés et séparés par /:
D : CTGCTCTAGA/GCGGCCGCTttaCTTATA (GFP nc 730-722) (SEQ ID NO : 20)
La première série de PCR a été réalisée d'une part avec les amorces A et B sur la matrice KS 108AXbaI et d'autre part avec les amorces C et D sur la matrice pEGFP (Clontech). Les amorces B et C étant complémentaires, les produits d'amplification AB et CD peuvent d'apparier et servir de nouvelle matrice pour une seconde amplification avec les amorces A et D. Le produit PCR AD obtenu a été ensuite cloné dans le site BsrGI/XbaI du vecteur KS 108AXbaI. La construction a été vérifiée par séquençage (T7 sequencing Kit, Pharmacia). The D-primer (3 'antisense) specific for the 3' region of EGFP, containing a silent mutation of the BsrGI site (in bold), the stop codon of EGFP (in lower case) and two additional NotI and XbaI cloning sites underlined and separated by /:
D: CTGCTCTAGA / GCGGCCGCTttaCTTATA (GFP nc 730-722) (SEQ ID NO: 20)
The first series of PCR was carried out on the one hand with the primers A and B on the KS 108AXbaI matrix and on the other hand with the primers C and D on the pEGFP matrix (Clontech). Since the primers B and C are complementary, the amplification products AB and CD can match and serve as a new template for a second amplification with the primers A and D. The PCR product AD obtained was then cloned into the BsrGI site. XbaI of the vector KS 108AXbaI. The construct was verified by sequencing (T7 sequencing Kit, Pharmacia).
Le fragment SphI/SphI contenant l'extrémité 3' de ABCA1 wt de pBI ABCAlwt a été remplacé par le fragment SphI/SphI de KS 108/GFPAXbaI contenant l'extrémité 3' de ABCA1 fusionnée à la EGFP pour donner pBI ABCA1/GFP. The SphI / SphI fragment containing the 3 'end of ABCA1 wt of pBI ABCAlwt was replaced by the SphI / SphI fragment of KS 108 / GFPAXbaI containing the 3' end of ABCA1 fused to EGFP to give pBI ABCA1 / GFP.
2. 3. Constructions mutantes
Les mutations ponctuelles de ABCAI ont été réalisées au préliminaire dans le vecteur pSP64TN ABCA1 wt. Elles ont consisté à muter la lysine en méthionine du motif Walker A (GAGKS) de chacune des deux cassettes ATP de ABCA1. 2. 3. Mutant constructions
Point mutations of ABCAI were made in the preliminary in the vector pSP64TN ABCA1 wt. They consisted of transferring lysine to Walker A pattern methionine (GAGKS) from each of the two ATP cassettes of ABCA1.
2.3.1. K879M
La mutation de la lysine de la première cassette ATP (Lys 879) par extension par chevauchement par PCR suivant la méthode précédemment décrite : A ABCA1 spécifique : TTGTCCGGACGCTGTTAG (SEQ ID NO :21) B comportant la mutation Lys (AAG) en MET (ATG) : GGTGGTGGTCATGCCGGCTCC (SEQ ID NO :22) 2.3.1. K879M
The mutation of the lysine of the first ATP cassette (Lys 879) by overlap extension by PCR according to the method previously described: A specific ABCA1: TTGTCCGGACGCTGTTAG (SEQ ID NO: 21) B comprising the Lys mutation (AAG) in MET (ATG ): GGTGGTGGTCATGCCGGCTCC (SEQ ID NO: 22)
<Desc/Clms Page number 22><Desc / Clms Page number 22>
C complémentaire de l'oligo B : GGAGCCGGCATGACCACCACC (SEQ ID NO :23) D ABCAI spécifique : GGGACGATTCCACATCTT (SEQ ID NO :24)
Le fragment AD obtenu a été cloné EcoRV/BsshII dans pSP64TN ABCAI wt en remplacement du fragment wt. La construction pSP64TN ABCAI MK a été validée par séquençage. C complementary to oligo B: GGAGCCGGCATGACCACCACC (SEQ ID NO: 23) Specific ABCAI: GGGACGATTCCACATCTT (SEQ ID NO: 24)
The AD fragment obtained was cloned EcoRV / BsshII in pSP64TN ABCAI wt replacing the wt fragment. The pSP64TN ABCAI MK construct was validated by sequencing.
2.3.2. K1892M
La mutation de la lysine de la seconde cassette ATP (Lys 1892) a été réalisée par PCR simple en tirant avantage de la présence du site HpaI à proximité de la région à muter. 2.3.2. K1892M
The mutation of the lysine of the second ATP cassette (Lys 1892) was performed by simple PCR taking advantage of the presence of the HpaI site near the region to be mutated.
Deux oligonucléotides ont été dessinés. Two oligonucleotides were drawn.
Oligo 5' sens contenant le site Hpal (souligné) et la mutation ponctuelle (en gras) : GTTAACGGAGCTGGATGTCA (SEQ ID NO :25). 5 'sense oligon containing the site Hpal (underlined) and the point mutation (in bold): GTTAACGGAGCTGGATGTCA (SEQ ID NO: 25).
Oligo 3' antisens spécifique du vecteur, en aval du codant stop de ABCA1. Vector-specific antisense oligon 3 ', downstream of the ABCA1 stop coder.
L'amplification a été réalisée sur la matrice pSP64TN ABCA1 wt. Amplification was performed on the matrix pSP64TN ABCA1 wt.
Le fragment PCR obtenu a été cloné HpaI/XbaI dans pSP64TN myc (construction contenant l'épitope antigénique c-myc inséré dans le deuxième site BsrGI de ABCA1 wt...) en remplacement du fragment équivalent (possédant l' insertion c-myc et pas la mutation). La construction a été criblée positivement avec une sonde ADNc spécifique du fragment ABCAI HpaI/XbaI et négativement avec une sonde spécifique de l'oligo c-myc. La construction obtenue (pSP64TN ABCA1 KM) a été validée par séquençage. The PCR fragment obtained was cloned HpaI / XbaI in pSP64TN myc (construction containing the antigenic epitope c-myc inserted in the second BsrGI site of ABCA1 wt ...) in replacement of the equivalent fragment (having the c-myc insertion and not the mutation). The construct was positively screened with a cDNA probe specific for the ABCAI HpaI / XbaI fragment and negatively with a probe specific for oligo c-myc. The resulting construct (pSP64TN ABCA1 KM) was validated by sequencing.
2. 3.3. K879M, K1892M
Le double mutant a été obtenu par insertion du fragment PCR généré pour la réalisation du mutant de la première cassette ATP dans le vecteur pSP64TN ABCAI KM donnant lieu à la construction pSP64TN ABCAI MM vérifiée par séquençage. 2. 3.3. K879M, K1892M
The double mutant was obtained by insertion of the PCR fragment generated for the production of the mutant of the first ATP cassette into the vector pSP64TN ABCAI KM giving rise to the pSP64TN ABCAI MM construct verified by sequencing.
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2.3.4. K1892R
Une construction équivalente à pSP64TN ACB1KM a été réalisée suivant le même mode opératoire à la distinction de la nature de la mutation consistant à remplacer la lys en arginine (AAG->AGG). 2.3.4. K1892R
A construction equivalent to pSP64TN ACB1KM was carried out according to the same procedure to the distinction of the nature of the mutation consisting in replacing lily with arginine (AAG-> AGG).
2.3.5. #HH1
Une construction visant à déléter le segment HH1 et une partie du domaine régulateur a été générée par PCR par extension par chevauchement en utilisant pSP64TN ABCAI wt comme matrice. 2.3.5. # HH1
A construct for deleting the HH1 segment and a portion of the regulatory domain was generated by overlap extension PCR using pSP64TN ABCAI wt as a template.
A ABCAl spécifique 5' sens : ne : 2778-2795 B : 3' antisens contenant trois mutations (dont deux silencieuses) introduisant une mutation ponctuelle (K1285G) créant un site unique NruI en gras souligné : GAAACCCTÇGCGACTCCGTC : ne 4036-4055 (SEQ ID NO : 26) C : 5' sens complémentaire de B : GACGGAGTCGCGAGGGTTTC : ne 4055-4036 (SEQ ID NO :27) D ABCA1 spécifique 3' antisens : ne :6049-6033
Le fragment AD généré est introduit dans le site BssHII/HpaI de pSP64TN ABCA1 wt en remplacement du fragment wt. La construction obtenue (pSP64TN ABCA1KG) est séquencée puis digérée Bst1107I/NruI et religuée sur ellemême (pSP64TN ABCA1 AHH1) : la délétion est de 132pb soit 44aa. A specific ABCAl 5 'sense: no: 2778-2795 B: 3' antisense containing three mutations (two silent) introducing a point mutation (K1285G) creating a unique site NruI in bold underlined: GAAACCCTÇGCGACTCCGTC: ne 4036-4055 (SEQ ID NO: 26) C: 5 'sense complementary to B: GACGGAGTCGCGAGGGTTTC: ne 4055-4036 (SEQ ID NO: 27) D ABCA1 specific 3' antisense: no: 6049-6033
The generated AD fragment is introduced into the BssHII / HpaI site of pSP64TN ABCA1 wt replacing the wt fragment. The resulting construct (pSP64TN ABCA1KG) is sequenced and then digested Bst1107I / NruI and religated on itself (pSP64TN ABCA1 AHH1): the deletion is 132bp or 44aa.
2.3.6. #R
Une construction visant à déléter le domaine régulateur (R) a été générée par PCR par extension par chevauchement en utilisant pSP64TN ABCA1 wt comme matrice pour l'amplification. 2.3.6. #R
A construct for deleting the regulatory domain (R) was generated by overlap extension PCR using pSP64TN ABCA1 wt as a template for amplification.
A ABCA1 spécifique 5' sens : ne : 2778-2795 B : 3' antisens contenant 4 mutations (dont une silencieuse) introduisant une mutation ponctuelle (L1554T) créant un site unique MIuI en gras souligné : GGTTGGCACGCGTAATGGCA ne : 4848-4866 (SEQ ID NO :28) C : 5' sens complémentaire de B : TGCCATTACGCGTGCCAACC ne : 4866-4848 (SEQ ID NO : 29) D ABCA1 spécifique 3' antisens : ne : 6049-6033 A specific ABCA1 5 'sense: no: 2778-2795 B: 3' antisense containing 4 mutations (one silent) introducing a point mutation (L1554T) creating a single site MIuI in bold underlined: GGTTGGCACGCGTAATGGCA no: 4848-4866 (SEQ ID NO: 28) C: 5 'complementary sense of B: TGCCATTACGCGTGCCAACC no: 4866-4848 (SEQ ID NO: 29) ABCA1 specific 3' antisense: no: 6049-6033
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Le fragment AD généré est introduit dans le site BssHII/HpaI de pSP64TN ABCA1 wt en remplacement du fragment wt. La construction obtenue (pSP64TN ABCA1 LT) est séquencée puis digérée BssHII/MIuI et religuée sur ellemême (pSP64TN ABCA1 AR). La délétion est de 1848 pb soit 616 aa. The generated AD fragment is introduced into the BssHII / HpaI site of pSP64TN ABCA1 wt replacing the wt fragment. The resulting construct (pSP64TN ABCA1 LT) is sequenced and then digested BssHII / MIuI and religated on itself (pSP64TN ABCA1 AR). The deletion is 1848 bp or 616 aa.
2. 4 Constructions mutantes dans pBI
Toutes les constructions obtenues (MK, KM, MM, #HH1, AR) sont transférées dans pBI ABCA1/GFP en remplaçant le fragment BsrGI/BsrGI de ABCA1 par le fragment équivalent des différentes constructions. pBI ABCA1/GFP MK pBI ABCAl/GFP KM pBI ABCA1/GFP MM pBI ABCA1/GFP #HH1 pBI ABCA1/GFP AR
Une construction supplémentaire a de plus été réalisée en délétant un fragment de 549 pb (position 3122-3671) en aval de la première cassette ATP, en digérant pBI ABCA1/GFP par PmII puis religué sur lui-même pBI ABCA1/GFP #Pm##. 2. 4 Mutant constructs in pBI
All the constructs obtained (MK, KM, MM, # HH1, AR) are transferred into pBI ABCA1 / GFP by replacing the BsrGI / BsrGI fragment of ABCA1 by the equivalent fragment of the different constructs. pBI ABCA1 / GFP MK pBI ABCA1 / GFP KM pBI ABCA1 / GFP MM pBI ABCA1 / GFP # HH1 pBI ABCA1 / GFP AR
An additional construct was further performed by deleting a 549 bp fragment (position 3122-3671) downstream of the first ATP cassette, digesting pBI ABCA1 / GFP with PmII and then religated on itself pBI ABCA1 / GFP # Pm # #.
3. Obtention de cellules transfectantes stables pour ABCA1/GFP et ses mutants 3.1. Procédure de transfection
Les ADNc des différentes constructions ont été purifiés selon la méthode dite de purification au polyéthylèneglycol faisant suite au protocole classique de lyse alcaline (MANIATIS et al.). Les préparations obtenues sont stockées par aliquotes de 20 g à -80 C en acétate de sodium 0,3 M, éthanol 100%. 3. Obtaining stable transfectant cells for ABCA1 / GFP and its mutants 3.1. Transfection procedure
The cDNAs of the different constructs were purified according to the so-called polyethylene glycol purification method following the conventional alkaline lysis protocol (MANIATIS et al.). The preparations obtained are stored in aliquots of 20 g at -80 ° C. in 0.3 M sodium acetate, 100% ethanol.
Les cellules utilisées sont des cellules HeLa tet-off (Clontech), cultivées dans du milieu DMEM complet (supplémenté en Sérum de veau f#tal (FCS) 10% pénicilline/streptomycine 50Ul/ml à 37 C 7,5% C02. Les cellules commerciales ont été expandues et congelées en FCS 90%, DMSO 10% au passage 2 et 3 à raison de 2 x 106 cellules par ampoule et stockée en azote liquide. The cells used are HeLa tet-off cells (Clontech) cultured in complete DMEM medium (supplemented with fetal calf serum (FCS) 10% penicillin / streptomycin 50 μl / ml at 37 ° C 7.5% CO2. Commercial cells were expanded and frozen in 90% FCS, 10% DMSO at passage 2 and 3 at 2 x 10 6 cells per ampoule and stored in liquid nitrogen.
La transfection de ces cellules a été réalisée avec le réactif Fugene# (Boehringer). 5 x 105 cellules sont étalées la veille de la transfection dans un puits d'une plaque 6 puits en DMEM complet. Transfection of these cells was performed with Fugene # reagent (Boehringer). 5 x 10 5 cells are plated the day before transfection in a well of a 6-well plate in complete DMEM.
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Un aliquote d'ADNc est centrifugé pendant 10 min. à 15000 rpm à 4 C. An aliquot of cDNA is centrifuged for 10 minutes. at 15000 rpm at 4 C.
Le culot est décanté délicatement sous une hotte cellulaire. Le culot ne devant pas trop sécher, il est rapidement resuspendu dans 8 l de H20 millipore stérile à la concentration de 2,5 g/ l. 2,5 g d'ADN sont mélangés à 100 ng de pTKHyg (1/50) (Clontech), vecteur possédant le gène de résistance à l'hygromycine utilisé comme agent de sélection lors de la phase d'établissement des lignées transfectants stables. The pellet is delicately decanted under a cellular hood. The pellet should not be too dry, it is quickly resuspendu in 8 l of Millipore H20 sterile at a concentration of 2.5 g / l. 2.5 g of DNA are mixed with 100 ng of pTKHyg (1/50) (Clontech), a vector possessing the hygromycin resistance gene used as a selection agent during the establishment phase of the stable transfectant lines.
Le mélange d'ADN est incubé pendant 15 min. avec 5 l de Fugene# préalablement dilué dans 100 ul de DMEM sans FCS ni antibiotiques. The DNA mixture is incubated for 15 minutes. with 5 l of Fugene # previously diluted in 100 μl of DMEM without FCS or antibiotics.
Pendant ce temps, les cellules sont lavées 3 fois en DMEM complet et incubées pendant la nuit dans 900 l de DMEM complet auxquels ont été rajoutés les 100 l du mélange Fugene#/ADN. During this time, the cells are washed 3 times in complete DMEM and incubated overnight in 900 l of complete DMEM to which have been added the 100 l of Fugene # / DNA mixture.
3. 2. Sélection/Expansion
Le surnageant est ensuite éliminé, les cellules sont ensuite lavées deux fois en DMEM complet. Les cellules sont ensuite incubées à nouveau pendant deux heures. Les cellules sont ensuite décrochées en trypsine EDTA et réparties en 7 boîtes de pétri de diamètre 10 cm. Parallèlement, trois lamelles en verre sont ensemencées avec 2,5 x 104 cellules afin de vérifier le pourcentage de transfection par observation des cellules en immunofluorescence directe (constructions GFP) ou indirecte (construction wt). La sélection en hygromycine (200 g/ml) débute deux jours après l'expansion. Les cellules sont en général sélectionnées environ deux semaines, aboutissant à l'apparition de clones cellulaires qui sont repiqués au moyen de cylindres de clonage puis transférés dans des plaques 96 puits afin de débuter leur expansion (96 puits/24 puits/6 puits/flasque 50 ml...). 3. 2. Selection / Expansion
The supernatant is then removed, the cells are then washed twice in complete DMEM. The cells are then incubated again for two hours. The cells are then unhooked in trypsin EDTA and distributed into 7 petri dishes of diameter 10 cm. In parallel, three glass slides are seeded with 2.5 × 10 4 cells in order to verify the percentage of transfection by observation of the cells in direct immunofluorescence (GFP constructions) or indirectly (wt construction). Hygromycin selection (200 g / ml) begins two days after expansion. Cells are usually selected about two weeks, resulting in the appearance of cell clones that are subcultured by cloning cylinders and then transferred to 96-well plates to begin their expansion (96 wells / 24 wells / 6 wells / flask 50 ml ...).
3. 3 Criblage des clones
On a pu estimer que en général, 85% des clones sélectionnés étaient en moyenne des clones faussement positifs, ayant intégré uniquement le vecteur de sélection. Parmi les 15% restant, nous devons choisir le meilleurs clone cellulaire. 3. 3 Screening clones
It has been estimated that in general, 85% of the clones selected were on average false-positive clones, having integrated only the selection vector. Of the remaining 15%, we must choose the best cell clone.
Pour cela, un premier tri est effectué juste après le repiquage en observant ces cellules For this, a first sorting is performed just after transplanting by observing these cells
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sous un microscope à fluorescence inversée, donc sur des cellules vivantes mais dont le milieu de culture a été provisoirement remplacé par de tampon Ringer, BSA 1%. under an inverted fluorescence microscope, thus on living cells but whose culture medium was provisionally replaced by Ringer buffer, BSA 1%.
Dans un second temps, les clones sont criblés par cytométrie de flux : au cours de l'expansion, deux puits de 6 sont ensemencés avec la moitié d'un puits de 24 (passage précédent). L'un des deux puits de 6 est destiné à la congélation du clone (en attente). Le second est décroché en trypsine EDTA. Le culot cellulaire obtenu après inactivation de la trypsine est rincé deux fois en PBS IX sans ca et Mg puis les cellules sont fixées en solution PBS IX, PAF 1%, EDTA 5 mM. Les cellules sont ensuite analysées suivant deux critères : l'intensité de la fluorescence et la clonalité de la population cellulaire. Les résultats obtenus sont ensuite confirmés par immunofluorescence directe et immunoprécipitation avec un antisérum de lapin spécifique d'une protéine recombinante portion de la première cassette ATP de ABCA1 (ser 16 : 1/500). Pratiquement, un puits de 6 contenant environ 106 cellules est lavé en PBS 1 X froid. Les cellules sont lysées sur la glace pendant 30' en tampon A avec triton (100 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% Triton X 100). Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4 C et le surnageant post nucléaire est ensuite nettoyé trois fois pendant 30' sous agitation à 4 C avec 100 l de Protéine A Sépharose (PAS) (50% v/v en Tampon A sans triton) afin d'éliminer le bruit de fond de fixation. Le surnageant nettoyé est ensuite incubé une heure en présence de sérum 16 (1/500ème) puis de 100 l de PAS. Le culot de PAS-Anticorps-Antigène est ensuite lavé trois fois en tampon A avec triton, trois fois en tampon A sans triton. Les complexes sont ensuite solubilisés en tampon de Laemmli pour SDS-PAGE supplémenté avec de l'urée 8 M. Les échantillons sont dénaturés 5' à 50 C et chargés sur un gel SDS-PAGE 6%.La bande revelée est de = 250 kDa (ABCA1# 220 + GFP 30). In a second step, the clones are screened by flow cytometry: during the expansion, two wells of 6 are sown with half a well of 24 (previous passage). One of the two wells of 6 is for freezing the clone (pending). The second is unhooked trypsin EDTA. The cell pellet obtained after inactivation of the trypsin is rinsed twice in PBS IX without AC and Mg then the cells are fixed in PBS IX, PAF 1%, 5 mM EDTA. The cells are then analyzed according to two criteria: the intensity of the fluorescence and the clonality of the cell population. The results obtained are then confirmed by direct immunofluorescence and immunoprecipitation with a rabbit antiserum specific for a recombinant protein portion of the first ATP cassette of ABCA1 (Ser 16: 1/500). Practically, a well of 6 containing about 10 6 cells is washed in cold 1X PBS. The cells are lysed on ice for 30 'in buffer A with triton (100 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% Triton X 100). The cells are centrifuged at 1500 rpm and the post-nuclear supernatant is then washed three times for 30 minutes while stirring at 4 ° C. with 100 μl Protein A Sepharose (PAS) (50% v / v Buffer A without tritone). in order to eliminate the fixing background noise. The cleaned supernatant is then incubated for one hour in the presence of serum 16 (1 / 500th) and then 100 l of PAS. The PAS-Antibody-Antigen pellet is then washed three times in buffer A with triton, three times in buffer A without tritone. The complexes are then solubilized in Laemmli buffer for SDS-PAGE supplemented with 8M urea. The samples are denatured at 5 ° C. at 50 ° C. and loaded on a 6% SDS-PAGE gel. The revealed band is of = 250 kDa. (ABCA1 # 220 + GFP 30).
Dans le cas particulier de constructions non GFP, pBI ABCA1 wt, le criblage a été réalisé par Western blot avec le Serum 16. Pratiquement, un puits de 6 contenant environ 106 cellules est lavé en PBS IX froid. Les cellules sont lysées sur la glace pendant 30' en tampon A avec triton. Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4 C. La quantité protéique du surnageant post nucléaire est quantifié selon la méthode de Lowry (?) (KitBlorad). 20 g de lysat total sont chargés sur un minigel SDS-PAGE 6% en tampon de charge Urée 8 M. Le gel est ensuite dégorgé 15' en tampon de In the particular case of non-GFP constructs, pBI ABCA1 wt, screening was performed by Western blotting with Serum 16. Practically, a well of 6 containing about 10 6 cells was washed in cold IX PBS. The cells are lysed on ice for 30 'in buffer A with triton. The cells are centrifuged at 1,500 rpm 4 C. The protein amount of the post-nuclear supernatant is quantified according to the method of Lowry (?) (KitBlorad). 20 g of total lysate are loaded onto a 6% SDS-PAGE minigel in 8 M urea loading buffer. The gel is then disgorged in buffer of
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transfert (Tris, Glycine, Méthanol 20%), préalable au transfert humide sur membrane de nitrocellulose pendant une nuit à 0,5A constant. transfer (Tris, Glycine, Methanol 20%), prior to wet transfer to nitrocellulose membrane overnight at 0.5A constant.
La membrane révélée au rouge ponceau est ensuite saturée en PBS IX, Lait 5%, Tween 20 0,1% pendant une heure à température ambiante. La membrane est ensuite incubée une nuit en PBS 1 X, Lait 1%, Tween 20 0,1% en présence de sérum 16 (1/500ème). La membrane est ensuite lavée 5 fois en PBS1X, Tween 20 0,1 % puis incubée avec un anticorps secondaire (chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase 1/1000ème) pendant une heure à température ambiante. La membrane est à nouveau lavée 5 fois en PBS 1 X, Tween 20 0,1%. La membrane est révélée avec le Kit ECL (Pharmacia). The membrane revealed to red culvert is then saturated with PBS IX, Milk 5%, Tween 20 0.1% for one hour at room temperature. The membrane is then incubated overnight in 1X PBS, 1% milk, 0.1% Tween 20 in the presence of 16 (1 / 500th) serum. The membrane is then washed 5 times with PBS1X, 0.1% Tween 20 and then incubated with a secondary antibody (goat anti-rabbit coupled with peroxidase 1 / 1000th) for one hour at room temperature. The membrane is washed again 5 times in 1X PBS, 0.1% Tween 20. The membrane is revealed with the ECL Kit (Pharmacia).
Dans ce cas, les clones sont criblés selon l'intensité de la bande apparaissant à 220 kDa par rapport à un échantillon témoin. La clonalité est vérifiée par immunofluorescence (Luciani and Chimini EMBO). In this case, the clones are screened according to the intensity of the band appearing at 220 kDa relative to a control sample. Clonality is verified by immunofluorescence (Luciani and Chimini EMBO).
4. Marquage à l'annexine V à l'état basal
Les cellules sont lavées une fois en PBS 1X et décrochés à la trysine EDTA pendant 3' à 37 C. La trypsine est inactivée avec 5 volumes de DMEM complet. Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4 C, lavées une fois en DMEM, et une fois en tampon Annexine V (10 mM Hepes NaOH pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCL2). Le culot cellulaire est resuspendu à la concentration de 106 cellules/ml en tampon Annexine V. 106 sont incubées en présence de 1 l d'Annexine V-Cy5 pendant 30' à 4 C à l'obscurité. Les cellules sont ensuite lavées une fois en tampon annexine V et fixées avec 200 l de solution tampon AnnexinV IX/paraformaldéhyde 1%. 4. Annexin V labeling in the basal state
The cells are washed once in 1X PBS and unshelled with EDTA trysine for 3 'at 37 C. Trypsin is inactivated with 5 volumes of complete DMEM. The cells are centrifuged at 1500 rpm, washed once in DMEM, and once in Annexin V buffer (10 mM Hepes NaOH pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2). The cell pellet is resuspended at the concentration of 106 cells / ml in Annexin V buffer. The cells are incubated in the presence of 1 l of Annexin V-Cy5 for 30 'at 4 ° C. in the dark. The cells are then washed once in annexin V buffer and fixed with 200 l of 1% AnnexinV IX / paraformaldehyde buffer solution.
5. Propriétés des cellules HeLa exprimant le transporteur ABCA1 Matériel et méthodes Cellules
Trois clones ont été étudiés, les cellules HeLa non transfectées (cellules HeLa), des cellules HeLa transfectées avec le précurseur murin de l'interleukine 1~ et un gène de résistance à l'hygromycine comme contrôle de transfection (cellules 6C) et des cellules HeLa transfectées avec une construction couplant 5. Properties of HeLa cells expressing ABCA1 transporter Material and methods Cells
Three clones were studied, non-transfected HeLa cells (HeLa cells), HeLa cells transfected with the murine precursor of interleukin 1 ~ and a hygromycin resistance gene as a transfection control (6C cells) and cells HeLa transfected with a coupling construct
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le gène ABCAI murin et le gène de la Green Fluorescence Protein (GFP) plus un gène de résistance à l'hygromycine (cellules AG2). the murine ABCAI gene and the Green Fluorescence Protein (GFP) gene plus a hygromycin resistance gene (AG2 cells).
Les cellules sont cultivées dans un milieu DMEM contenant 10% de FCS, 1% de Pénicilline et streptomycine (+200 ug/ml d'hygromycine pour les cellules 6C et AG2) à 37 C en présence de 5% de CO2. The cells are cultured in DMEM medium containing 10% FCS, 1% Penicillin and streptomycin (+200 μg / ml hygromycin for 6C and AG2 cells) at 37 ° C in the presence of 5% CO 2.
Lyse des cellules
La lyse des cellules s'effectue après 2 rinçages au PBS dans une solution 0,2% SDS. Lyse cells
The lysis of the cells is carried out after 2 rinses with PBS in a 0.2% SDS solution.
Détermination de la concentration protéique
Le protocole de détermination de la concentration protéique est dérivé de la méthode de Smith (SIGMA procédure No. TPRO-562) qui utilise la propriété à réduire le Cu II en Cu I d'une manière dépendante de leur concentration. Determination of protein concentration
The protocol for determining the protein concentration is derived from the Smith method (SIGMA procedure No. TPRO-562) which uses the property to reduce Cu II to Cu I in a concentration-dependent manner.
L'acide bicinchroninique est utilisé pour révéler l'apparition de Cu I avec lequel il forme un complexe qui absorbe à 562 nm. Bicinchroninic acid is used to reveal the appearance of Cu I with which it forms a complex that absorbs at 562 nm.
Extraction lipidique
Réalisée dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple I. Lipid extraction
Made under the same conditions as those set out in Example I.
Détermination de la concentration de cholestérol
Réalisée dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1. Determination of cholesterol concentration
Made under the same conditions as those described in Example 1.
Dosage des phospholipides
Réalisée dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1. Determination of phospholipids
Made under the same conditions as those described in Example 1.
Efflux de Cholestérol et phospholipides contenant de la Choline
Les cellules sont transférées dans des plaques de 12 puits (15000 cellules HeLa, 15000 cellules 6C, 40000 cellules AG2 par puits) le premier jour. La suite du protocole est identique à celui exposé à l'exemple 1. Efflux of cholesterol and phospholipids containing Choline
The cells are transferred to 12-well plates (15,000 HeLa cells, 15,000 6C cells, 40,000 AG2 cells per well) on the first day. The rest of the protocol is identical to that described in Example 1.
<Desc/Clms Page number 29> <Desc / Clms Page number 29>
Résultats Analyse lipidique
L'analyse lipidique des trois types cellulaires révèle une constance au niveau des phospholipides totaux. Mais l'on note une augmentation de 25% des SPM chez les cellules AG2 par rapport aux cellules 6C ou HeLa et une diminution de 20% des PC chez les cellules AG2 par rapport aux cellules 6C ou HeLa. Le ratio SPM/PC passe de 0,35 chez les cellules HeLa à 0,6 chez les cellules AG2. De plus, il apparaît chez les cellules transfectées par ABCA1 un pic (aire inconnue) qui n'est pas présent dans les standards utilisés et dont la composition n'a pas été rapportée dans la littérature, ce composé semble augmenter de 2 à 5 fois suivant les expériences. En revanche, la concentration en cholestérol ne montre pas de différence significative entre les trois types de cellules. Results Lipid analysis
The lipid analysis of the three cell types reveals a constant level of total phospholipids. But there is a 25% increase in SPM in AG2 cells compared to 6C or HeLa cells and a 20% decrease in PCs in AG2 cells compared to 6C or HeLa cells. The SPM / PC ratio increases from 0.35 in HeLa cells to 0.6 in AG2 cells. In addition, a peak (unknown area), which is not present in the standards used and whose composition has not been reported in the literature, appears in cells transfected with ABCA1. This compound appears to increase by 2 to 5 times. following the experiments. In contrast, the cholesterol concentration does not show a significant difference between the three cell types.
Efflux de Cholestérol et phospholipides contenant de la Choline
Les incorporations de cholestérol et de choline ne sont pas différentes suivant le type cellulaire (Figures 17 et 18). Les cellules AG2 montrent une augmentation de l'efflux de phospholipides contenant de la choline significative par rapport aux cellules HeLa et 6C en présence d'Apo AI (+85%) ou de HDL (+50%) (Figure 16). Efflux of cholesterol and phospholipids containing Choline
The incorporation of cholesterol and choline do not differ according to cell type (Figures 17 and 18). AG2 cells show an increase in efflux of phospholipids containing significant choline compared to HeLa and 6C cells in the presence of Apo AI (+ 85%) or HDL (+ 50%) (Figure 16).
EXEMPLE 4 : outils de détection de transporteurs ABCA
Des outils de détection peuvent être obtenus sur la base des motifs spécifiques identifiés au Tableau II. EXAMPLE 4: ABCA Carrier Detection Tools
Detection tools can be obtained on the basis of the specific patterns identified in Table II.
La définition de paires d'oligonucléotides dégénérés ayant pour cible les séquences codant lesdits motifs permettent d'amplifier des régions génomiques ou des ADNc par amplification PCR. The definition of degenerate oligonucleotide pairs targeting the sequences encoding said motifs makes it possible to amplify genomic regions or cDNAs by PCR amplification.
Pour l'amplification génomique, la stratégie exploite la conservation de la position des introns, parmi les différents transporteurs ABCA, chaque paire d'amorces étant adjacente à une limite exon-intron. Dans la mesure où la taille des introns est variable parmi les différents transporteurs ABCA, le produit d'amplification attendu est une échelle de bandes multiples résultant de l'amplification des gènes correspondants. For genomic amplification, the strategy exploits the positional conservation of introns among the different ABCA carriers, with each pair of primers being adjacent to an exon-intron boundary. Insofar as the size of the introns is variable among the different ABCA transporters, the amplification product expected is a multiple band scale resulting from the amplification of the corresponding genes.
<Desc/Clms Page number 30> <Desc / Clms Page number 30>
Pour l'amplification de l'ADNc, le résultat attendu de l'amplification est une bande unique contenant différentes séquences issues de chacun des transporteurs exprimé dans la cellule ou le tissu d'intérêt. For the amplification of the cDNA, the expected result of the amplification is a single band containing different sequences from each of the transporters expressed in the cell or tissue of interest.
Exemple d'oligonucléotides pour le ciblage de gènes ABCA au niveau des motifs spécifiques NBD2 : paire GYCP : GGNTAYTGYCCNCARTTYGA (SEQ ID NO :30) paire YSGG : CKYTTRTTNCCNCCRCTRTA (SEQ ID NO :31), dans lesquelles R = A ou G ; Y = C ou T ; N = A, C, G ou T. Example of oligonucleotides for targeting ABCA genes at specific units NBD2: GYCP pair: GGNTAYTGYCCNCARTTYGA (SEQ ID NO: 30) YSGG pair: CKYTTRTTNCCNCCRCTRTA (SEQ ID NO: 31), wherein R = A or G; Y = C or T; N = A, C, G or T.
Les conditions de la PCR sont les suivantes, pour 30 cycles : dénaturation 5 min à 95 C pour le premier cycle et 1 min 30 pour les autres, suivie d'une hybridation à 54 C pendant 1 min et d'une élongation à 72 C pendant 5 min (voir schéma sur la figure annexée). The conditions of the PCR are as follows, for 30 cycles: denaturation for 5 min at 95 ° C. for the first cycle and 1 min for the others, followed by hybridization at 54 ° C. for 1 min and extension at 72 ° C. for 5 minutes (see diagram in the attached figure).
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