FR2793805A1 - New promoter from a wheat thioredoxin gene, useful for controlling transgene expression in plants, provides seed-specific expression - Google Patents

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Abstract

Promoter (A) contains at least one functional domain specific to the promoter of the TaTrxh2 gene, encoding a thioredoxin h in wheat (Triticum aestivum). Independent claims are also included for the following: (1) expression cassette or recombinant vector containing (A); and (2) plant cell, or transgenic plant, transformed by at least one (A).

Description

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PROMOTEUR DE LA THIORÉDOXINE TaTrxh2 DE BLE
L'invention est relative au clonage et à la caractérisation d'un promoteur de thiorédoxine de blé. PROMOTER OF THIOREDOXIN TaTrxh2 DE BLE
The invention relates to the cloning and characterization of a wheat thioredoxin promoter.

Les thiorédoxines sont des protéines de faible poids moléculaire, qui ont été mises en évidence chez un grand nombre d'organismes, où elles catalysent différentes réactions d'oxydoréduction impliquant des échanges dithiolsulfhydryles. Leur site catalytique comprend la séquence conservée : -Trp-Cys-Gly/Pro/AlaPro-Cys-. Les thiorédoxines sous forme oxydée comprennent un pont disulfure, dont la réduction en groupes-SH, par la ferrédoxine réduite ou par le NADPH, est catalysée par l'intermédiaire d'un système spécifique.  Thioredoxins are low molecular weight proteins that have been found in a large number of organisms, where they catalyze different redox reactions involving dithiolsulfhydryl exchange. Their catalytic site includes the conserved sequence: -Trp-Cys-Gly / Pro / AlaPro-Cys-. Thioredoxins in oxidized form include a disulfide bridge, whose reduction to SH-groups, reduced ferredoxin or NADPH is catalyzed through a specific system.

Chez les plantes, on a mis en évidence 3 types de thiorédoxine : les 2 premières (thiorédoxines m et f), sont des thiorédoxines ferrédoxine-dépendantes, localisées dans les chloroplastes, où elles interviennent dans la régulation de la photosynthèse. Un troisième type, dénommé thiorédoxine h, a été mis en évidence dans le cytosol. La thiorédoxine h fait partie d'un système thiorédoxine NADP-dépendant (NTS), où elle est associée au NADPH et à une enzyme dénommée NADP-thiorédoxine réductase (NTR) .  In plants, three types of thioredoxin have been identified: the first two (thioredoxins m and f) are ferredoxin-dependent thioredoxins, localized in chloroplasts, where they intervene in the regulation of photosynthesis. A third type, called thioredoxin h, has been shown in the cytosol. Thioredoxin h is part of a NADP-dependent thioredoxin system (NTS), where it is combined with NADPH and an enzyme called NADP-thioredoxin reductase (NTR).

Initialement, 2 thiorédoxines h ont été extraites et partiellement purifiées à partir du grain de blé (VOGT et FOLLMANN, Biochem. Biophys. Acta 873,415- 418,1986). Récemment, l'équipe des Inventeurs a isolé et caractérisé 2 clones d'ADNc codant une thiorédoxine h de blé tendre (TaTrxhl), et une thiorédoxine h de blé dur (TdTrxhl) (GAUTIER et al., Eur. J. Biochem. 252,314-324, 1998). Les structures primaires déduites des clones d'ADNc des thiorédoxines h TaTrxhl et TdTrxhl sont très conservées (96% d'identité entre elles). Elles possèdent une extension N-terminale très riche en résidus Ala, dont l'analyse révèle un domaine transmembranaire putatif de 20 résidus. Elles présentent de fortes homologies avec  Initially, 2 thioredoxins h were extracted and partially purified from wheat grain (VOGT and FOLLMANN, Biochem Biophys Acta 873, 415- 418, 1986). Recently, the team of the inventors has isolated and characterized 2 cDNA clones encoding thioredoxin h wheat (TaTrxhl), and thioredoxin durum wheat (TdTrxhl) (GAUTIER et al., Eur J Biochem 252,314 -324, 1998). The primary structures deduced from the cDNA clones of thioredoxin h TaTrxhl and TdTrxhl are very conserved (96% identity between them). They have an N-terminal extension very rich in Ala residues, whose analysis reveals a putative transmembrane domain of 20 residues. They present strong homologies with

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les thiorédoxines h de céréales (70 à 80%) et les thiorédoxines h de dicotylédones (60%).  thioredoxins h cereals (70 to 80%) and thioredoxins h dicotyledonous (60%).

Les thiorédoxines h interviennent au cours de la germination du grain de blé, où elles participent, au niveau de l'albumen, à la mobilisation des réserves nécessaires à la croissance de l'embryon. Elles agissent notamment : - en réduisant les ponts disulfure de certaines protéines de réserve, telles que les gliadines et les gluténines (KOBREHEL et al., Plant Physiol. 99, 919-924,1992), ce qui augmente leur sensibilité à la protéolyse ; - en réduisant des enzymes impliquées dans la mobilisation des réserves, ou des inhibiteurs de ces enzymes, ce qui entraîne l'activation des premières, et la désactivation des seconds.  The thioredoxins h occur during the germination of the wheat grain, where they participate, at the level of the albumen, in the mobilization of the reserves necessary for the growth of the embryo. They act in particular: by reducing the disulfide bridges of certain reserve proteins, such as gliadins and glutenins (KOBREHEL et al., Plant Physiol 99, 919-924, 1992), which increases their sensitivity to proteolysis; - by reducing enzymes involved in the mobilization of reserves, or inhibitors of these enzymes, which leads to the activation of the former, and the deactivation of the latter.

Il a également été proposé d'utiliser les thiorédoxines h pour améliorer la qualité d'aliments, notamment à base de céréales ; il a en effet été constaté qu'elles favorisaient la formation de la pâte lors de la fabrication du pain (WONG et al., Cereal Chem. 70,113- 114,1993), et qu'en outre elles diminuaient l'allergénicité de certains aliments.  It has also been proposed to use thioredoxins h to improve the quality of foods, particularly those based on cereals; it has been found that they promote the formation of the dough during bread making (WONG et al., Cereal Chem 70, 113-114, 1993), and that in addition they reduce the allergenicity of certain foods. .

Les Inventeurs ont entrepris l'étude de l'expression des thiorédoxines h dans les graines de céréales, notamment dans le blé, afin de fournir des moyens de contrôle de cette expression.  The inventors have undertaken the study of the expression of thioredoxin h in cereal seeds, especially in wheat, in order to provide means for controlling this expression.

Dans le cadre de ces travaux, ils ont isolé un gène dénommé ci-après TaTrxh2, codant une thiorédoxine h de blé tendre (Triticum aestivum), dénommée ci-après TaTrxh2, dont la structure primaire présente 97% de similarité avec celle de la thiorédoxine h TaTrxhl de blé tendre (GAUTIER et al., 1998, publication précitée).  As part of this work, they isolated a gene named hereafter TaTrxh2, coding a thioredoxin h wheat common (Triticum aestivum), hereinafter called TaTrxh2, whose primary structure has 97% similarity with that of thioredoxin h TaTrxhl soft wheat (GAUTIER et al., 1998, publication cited above).

Les Inventeurs ont également isolé le promoteur du gène TaTrxh2, et ont exprimé, chez le riz, le gène rapporteur gus sous contrôle de ce promoteur. Ils  The inventors also isolated the promoter of the TaTrxh2 gene, and expressed in rice the reporter gene gus under control of this promoter. They

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ont ainsi observé que l'expression du gène rapporteur était localisée exclusivement dans le grain de riz et plus particulièrement dans l'albumen amylacé. Ils ont en outre mis en évidence des régions impliquées dans la régulation spatiale et temporelle de ce promoteur.  thus observed that the expression of the reporter gene was localized exclusively in the grain of rice and more particularly in the starchy albumen. They also highlighted regions involved in the spatial and temporal regulation of this promoter.

La séquence du gène TaTrxh2 et de la région en 5' comprenant le promoteur sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1.  The sequence of the TaTrxh2 gene and of the 5 'region comprising the promoter are represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 1.

La présente invention a pour objet un promoteur constitué par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel spécifique du promoteur du gène TaTrxh2.  The subject of the present invention is a promoter consisting of a nucleic acid fragment comprising at least one functional domain specific for the promoter of the TaTrxh2 gene.

On entend par promoteur une séquence d'ADN double-brin comprenant au moins les séquences nécessaires à l'initiation de la transcription d'un gène, éventuellement associées à des séquences de contrôle en cis de ladite transcription ; on entend par : domaine fonctionnel spécifique d'un promoteur , une séquence dudit promoteur comprenant un ou plusieurs motifs d'ADN intervenant dans l'initiation de la transcription, ou bien une séquence d'ADN double-brin constituant un domaine de régulation comprenant un ou plusieurs des motifs d'ADN intervenant dans le contrôle en cis de la transcription par ledit promoteur.  By promoter is meant a double-stranded DNA sequence comprising at least the sequences necessary for the initiation of the transcription of a gene, optionally associated with cis control sequences of said transcription; the expression: specific functional domain of a promoter, a sequence of said promoter comprising one or more DNA motifs involved in the initiation of transcription, or a double-stranded DNA sequence constituting a regulatory domain comprising a or more of the DNA motifs involved in the cis control of transcription by said promoter.

Des promoteurs conformes à l'invention peuvent comprendre en particulier : a) le fragment d'acide nucléique représenté dans la liste de séquences en annexe par la séquence SEQ ID NO : 2, ainsi que sur la figure 1, et qui correspond à la région 5' non codante du gène TaTrxh2 s'étendant de la position-1 à la position-1111 par rapport au codon d'initiation ATG, ou des portions dudit fragment, notamment : * le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-1 à la position-83 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment  Promoters according to the invention may comprise in particular: a) the nucleic acid fragment represented in the attached sequence listing by the sequence SEQ ID NO: 2, as well as in FIG. 1, and which corresponds to the region 5 'non-coding TaTrxh2 gene extending from position-1 to position-1111 relative to the ATG initiation codon, or portions of said fragment, including: * the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-1 to position-83 relative to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; this fragment

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comprend les séquences intervenant dans l'initiation de la transcription, et nécessaires à l'activité de base du promoteur ; * des fragments d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels intervenant dans la régulation de la transcription du gène TaTrxh2, et en particulier dans sa spécificité tissulaire et/ou dans son expression à différents stades du développement de la plante ; il s'agit en particulier : - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-591 à la position-1111 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'inhibition de l'expression du gène TaTrxh2 dans l'épithélium du scutellum ; - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-228 à la position-451 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'induction de l'expression du gène TaTrxh2 en début de maturation du grain ; - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-451 à-591 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'induction de l'expression du gène TaTrxh2 dans l'épithélium du scutellum ; - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-83 à la position-228 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend des séquences intervenant dans l'induction de l'expression au niveau de l'albumen amylacé. b) du fragment d'acide nucléique constituant le premier intron (positions 1232-2203 sur la séquence SEQ ID NO: 1) du gène TaTrxh2 ; ce fragment pourrait comprendre un domaine de régulation de type  includes the sequences involved in the initiation of transcription, and necessary for the basic activity of the promoter; nucleic acid fragments comprising functional domains involved in the regulation of transcription of the TaTrxh2 gene, and in particular in its tissue specificity and / or in its expression at different stages of the development of the plant; it is in particular: the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-591 to position -1111 with respect to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; this fragment comprises a regulatory domain involved in the inhibition of TaTrxh2 gene expression in the scutellum epithelium; nucleic acid fragment whose sequence extends from position-228 to position-451 relative to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; this fragment comprises a regulatory domain involved in the induction of TaTrxh2 gene expression at the beginning of grain maturation; nucleic acid fragment whose sequence extends from position-451 to -591 with respect to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; this fragment comprises a regulatory domain involved in the induction of TaTrxh2 gene expression in the scutellum epithelium; nucleic acid fragment whose sequence extends from position-83 to position-228 with respect to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; this fragment comprises sequences involved in the induction of expression at the level of the starchy albumen. b) the nucleic acid fragment constituting the first intron (positions 1232-2203 on the sequence SEQ ID NO: 1) of the TaTrxh2 gene; this fragment could include a regulatory domain of

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amplificateur, augmentant le niveau d'expression du gène Ta Trxh2 .  enhancer, increasing the expression level of the Ta Trxh2 gene.

L'homme du métier peut, à partir des fragments comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur du gène TaTrxh2 spécifiés ci-dessus, identifier plus précisément les limites de ces domaines fonctionnels, ainsi que les motifs d'ADN impliqués dans la fonction de chacun d'entre eux, par des techniques connues en ellesmêmes, par exemple par la technique des empreintes sur l'ADN (footprints), en incubant ces fragments avec des extraits nucléaires de cellules de l'albumen du grain, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules dans lesquels le promoteur du gène TaTrxh2 est inactif.  Those skilled in the art can, from the fragments comprising at least one functional domain of the promoter of the TaTrxh2 gene specified above, identify more precisely the boundaries of these functional domains, as well as the DNA motifs involved in the function of each. of them, by techniques known in themselves, for example by the technique of fingerprints on the DNA (footprints), by incubating these fragments with nuclear extracts of cells of the albumen of the grain, as well as with extracts cells in which the promoter of the TaTrxh2 gene is inactive.

L'invention englobe en particulier tout promoteur pouvant être obtenu à partir d'un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur du gène TaTrxh2, par les techniques classiques du génie génétique, notamment par mutagénèse et/ou recombinaison génétique. Il est ainsi possible de produire des promoteurs artificiels possédant le niveau d'activité, et le degré de spécificité souhaité.  The invention particularly encompasses any promoter obtainable from a nucleic acid fragment comprising at least one functional domain of the promoter of the TaTrxh2 gene, by conventional techniques of genetic engineering, in particular by mutagenesis and / or genetic recombination. It is thus possible to produce artificial promoters having the level of activity, and the desired degree of specificity.

On peut ainsi par exemple inactiver un ou plusieurs des domaines fonctionnels de régulation localisés dans la région 5' non codante du gène TaTrxh2, par exemple en procédant à la délétion d'au moins un nucléotide ou d'une séquence de nucléotides des motifs d'ADN impliqués dans la fonction du ou des domaines concernés. On peut également associer les molécules d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels du promoteur du gène TaTrxh2 entre elles, et/ou avec des domaines fonctionnels provenant de promoteurs autres que celui du gène TaTrxh2.  For example, it is possible to inactivate one or more regulatory functional domains located in the 5 'non-coding region of the TaTrxh2 gene, for example by deleting at least one nucleotide or nucleotide sequence from the motifs. DNA involved in the function of the area (s) concerned. Nucleic acid molecules comprising functional domains of the promoter of the TaTrxh2 gene may also be associated with each other, and / or with functional domains originating from promoters other than that of the TaTrxh2 gene.

L'invention englobe également : - les cassettes d'expression, comprenant, outre un promoteur conforme à l'invention, un gène  The invention also encompasses: the expression cassettes, comprising, in addition to a promoter according to the invention, a gene

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d'intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un site permettant l'insertion dudit gène d'intérêt ; - les vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'un promoteur ou d'une cassette d'expression conformes à l'invention dans un vecteur hôte.  of interest placed under transcriptional control of said promoter, or a site allowing the insertion of said gene of interest; the recombinant vectors resulting from the insertion of a promoter or an expression cassette according to the invention into a host vector.

Les promoteurs conformes à la présente invention peuvent être utilisés pour contrôler l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules de plantes, notamment de monocotylédones.  The promoters according to the present invention can be used to control the expression of a gene of interest in plant cells, especially monocotyledons.

Ledit gène d'intérêt peut par exemple être soit le gène TaTrxh2, placé sous contrôle d'un promoteur artificiel, tel que défini ci-dessus, dérivé du promoteur TaTrxh2, soit un gène hétérologue codant une thiorédoxine autre que TaTrxh2, ou toute autre protéine d'intérêt.  Said gene of interest may for example be either the TaTrxh2 gene, placed under the control of an artificial promoter, as defined above, derived from the TaTrxh2 promoter, or a heterologous gene encoding a thioredoxin other than TaTrxh2, or any other protein interest.

On peut par exemple introduire un gène d'intérêt sous contrôle du promoteur du gène TaTrxh2, ou d'un promoteur artificiel construit à partir des éléments de régulation de celui-ci qui confèrent la spécificité d'expression dans les cellules de l'albumen, afin d'exprimer ledit gène d'intérêt uniquement dans les cellules de l'albumen du grain. On peut également procéder à la délétion sélective des séquences du promoteur du gène TaTrxh2 responsables de la spécificité d'expression, afin de construire un promoteur artificiel permettant d'assurer une expression ubiquitaire d'une thiorédoxine h, ou d'une autre protéine d'intérêt.  For example, it is possible to introduce a gene of interest under the control of the promoter of the TaTrxh2 gene, or an artificial promoter constructed from the regulatory elements of this gene which confer specificity of expression in the cells of the albumen, to express said gene of interest only in the cells of the albumen of the grain. Selective deletion of TaTrxh2 gene promoter sequences responsible for expression specificity can also be performed to construct an artificial promoter to ensure ubiquitous expression of a thioredoxin h, or other protein of interest.

L'invention a en outre pour objet des cellules végétales et des plantes transgéniques, en particulier des monocotylédones, et notamment des céréales, transformées par au moins une molécule d'acide nucléique comprenant un promoteur conforme à l'invention.  The subject of the invention is also plant cells and transgenic plants, in particular monocotyledons, and in particular cereals, transformed by at least one nucleic acid molecule comprising a promoter according to the invention.

Les Inventeurs ont ainsi obtenu des riz transgéniques, dans lesquelles un gène hétérologue a été placé sous contrôle transcriptionnel du promoteur du gène  The inventors thus obtained transgenic rice, in which a heterologous gene was placed under transcriptional control of the gene promoter.

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TaTrxh2 et ont observé chez ces plantes une expression spécifique dans les cellules de l'albumen du grain.  TaTrxh2 and have observed in these plants a specific expression in cells of a grain albumen.

Les cellules transformées et les plantes transgéniques conformes à l'invention sont également utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes dans les cellules de l'albumen du grain.  The transformed cells and the transgenic plants according to the invention are also useful as models for studying and / or modifying the expression of different genes in the cells of the albumen of the kernel.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant le clonage et la caractérisation du gène TaTrxh2 et de son promoteur.  The present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to non-limiting examples illustrating the cloning and characterization of the TaTrxh2 gene and its promoter.

EXEMPLE 1 :ISOLEMENT ET CARACTÉRISATION DU GÈNE TaTrxh2 1.- Criblage d'une banque d'ADN génomique de blé
Une banque d'ADN génomique a été réalisée à partir de l'ADN extrait de feuilles de blé tendre (Triticum aestivum) de la variété Andain. Après digestion partielle de l'ADN génomique par MboI, les fragments de taille moyenne 15 kb ont été clonés au site BamHI du phage EMBL3 SP6/T7, qui a été propagé dans la bactérie hôte K802-K 802 (galK2, galT22, HsdR2, (rk-, mk+), mcrA , - + mcrB , metBl, mrr , supE44). EXAMPLE 1 Isolation and Characterization of the TaTrxh2 Gene 1. Screening of a Genomic DNA Library of Wheat
A genomic DNA library was made from DNA extracted from wheat leaves (Triticum aestivum) of the Andain variety. After partial digestion of the genomic DNA with MboI, the 15 kb average fragments were cloned at the BamHI site of the EMBL3 SP6 / T7 phage, which was propagated in the host bacterium K802-K 802 (galK2, galT22, HsdR2, (rk-, mk +), mcrA, - + mcrB, metBl, mrr, supE44).

6
6. 10 clones de la banque d'ADN génomique ont été étalés et criblés avec une sonde de 669 pb (TRX) contenant la totalité de la séquence codant la thiorédoxine h de blé tendre TaTrxhl (GAUTIER et al., 1998, publication précitée), et les clones positifs ont ensuite été criblés par ACP (amplification en chaine par polymérase) à l'aide d'un couple d'amorces (THP2 et THM2) dérivées de la même séquence. 6
6. 10 clones of the genomic DNA library were plated and screened with a 669 bp probe (TRX) containing the entire thioredoxin h sequence of TaTrxhl soft wheat (GAUTIER et al., 1998, supra) , and the positive clones were then screened by PCR (polymerase chain amplification) using a pair of primers (THP2 and THM2) derived from the same sequence.

L'un des clones sélectionnés (#4), qui contient un fragment d'ADN génomique de blé de 10 kb environ, a été digéré par PstI, libérant deux fragments, l'un de 1,5 kb et l'autre de 3,8 kb, tous les deux reconnus par la sonde TRX. Ces deux fragments ont été  One of the selected clones (# 4), which contains a wheat genomic DNA fragment of about 10 kb, was digested with PstI, releasing two fragments, one of 1.5 kb and the other of 3 , 8 kb, both recognized by the TRX probe. These two fragments were

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clonés dans le vecteur pLITMUS 29 (BIOLAB) au site de restriction PstI. Les deux clones obtenus sont dénommés CTRX3 et CTRX4. Le clone CTRX3 correspond au fragment de 1,5 kb et le clone CTRX4 au fragment de 3,8 kb.  cloned into the vector pLITMUS 29 (BIOLAB) at the PstI restriction site. The two clones obtained are called CTRX3 and CTRX4. Clone CTRX3 corresponds to the 1.5 kb fragment and clone CTRX4 to the 3.8 kb fragment.

L'analyse des séquences nucléotidiques des clones CTRX4 et CTRX3 montre qu'ils contiennent chacun une partie d'un même gène codant une thiorédoxine h de blé, tronqué lors de la digestion par PstI.  Analysis of the nucleotide sequences of the CTRX4 and CTRX3 clones shows that they each contain a part of the same gene coding for a wheat thioredoxin h, truncated during PstI digestion.

A partir des séquences nucléotidiques de ces 2 clones, les Inventeurs ont choisi deux amorces (THP8 et THM8) permettant d'amplifier un gène de thiorédoxine h sur une longueur d'environ 2,6 kb. L'ACP a été réalisée sur l'ADN non digéré du clone #4, et un fragment de la taille attendue a été cloné dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA). Le clone obtenu contient le gène TaTrxh2 codant une thiorédoxine h de blé tendre.  From the nucleotide sequences of these 2 clones, the inventors have chosen two primers (THP8 and THM8) for amplifying a thioredoxin h gene over a length of about 2.6 kb. The PCR was performed on the undigested DNA of clone # 4, and a fragment of the expected size was cloned into the pGEM-T vector (PROMEGA). The clone obtained contains the TaTrxh2 gene encoding a thioredoxin h of wheat.

Il comprend une région promotrice de 1111 pb, une région codante de 1447 pb, et une région 3' non codante de 131 pb.  It comprises a promoter region of 1111 bp, a coding region of 1447 bp, and a 3 'non-coding region of 131 bp.

La région codante du gène TaTrxh2 comprend trois exons de 120,123 et 135 pb séparés par deux introns, de 972 pb et de 93 pb. Le premier exon code un polypeptide de 40 acides aminés, le deuxième exon code un polypeptide de 41 acides aminés contenant le site actif, et le troisième exon code un polypeptide de 45 acides aminés.  The coding region of the TaTrxh2 gene comprises three exons of 120,123 and 135 bp separated by two introns, 972 bp and 93 bp. The first exon encodes a polypeptide of 40 amino acids, the second exon encodes a 41 amino acid polypeptide containing the active site, and the third exon encodes a polypeptide of 45 amino acids.

La séquence nucléotidique du gène TaTrxh2 code une thiorédoxine h de blé tendre, nommée TaTrxh2, de 126 acides aminés, de masse moléculaire calculée 13435 Da et de pI calculé 5,0.  The nucleotide sequence of the TaTrxh2 gene encodes a thioredoxin h of soft wheat, named TaTrxh2, of 126 amino acids, of calculated molecular mass 13435 Da and calculated pI 5.0.

La comparaison des séquences des produits de traduction du gène TaTrxh2 et des gènes TaTrxhl précédemment décrite par GAUTIER et al. (1998, publication précitée) et TdTrxhl (thiorédoxine h de blé dur) montre qu'elles sont très conservées. En effet, la séquence peptidique de TaTrxh2 présente 97% de similarité  The comparison of the sequences of translation products of the TaTrxh2 gene and TaTrxhl genes previously described by GAUTIER et al. (1998, cited above) and TdTrxhl (durum wheat thioredoxin) show that they are highly conserved. Indeed, the peptide sequence of TaTrxh2 has 97% similarity

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et 94% d'identité avec celle de TaTrxhl et 95% de similarité et 90% d'identité avec celle de TdTrxhl.  and 94% identity with that of TaTrxhl and 95% similarity and 90% identity with that of TdTrxhl.

Le domaine N-terminal de TaTrxh2 est plus court que celui de TaTrxhl et TdTrxhl. La structure primaire de TaTrxh2 ne contient pas de peptide signal, suggérant que la protéine est localisée dans le cytoplasme. Cependant, elle présente une extension Nterminale déjà mise en évidence dans la structure primaire de TaTrxhl et TdTrxhl, pouvant correspondre à un domaine transmembranaire. L'analyse de l'extension Nterminale de TaTrxh2 avec le programme RAO ARGOS (PC/gene, RAO et al., Biochem. Biophys. Acta 869,197- 214,1986) révèle un domaine transmembranaire putatif entre les résidus 2 et 19. Le site actif, formé des 5 acides aminés suivants : WCGPC, est conservé entre les 3 thiorédoxines h de blé TaTrxh2, TaTrxhl et TdTrxhl.  The N-terminal domain of TaTrxh2 is shorter than that of TaTrxhl and TdTrxhl. The primary structure of TaTrxh2 does not contain a signal peptide, suggesting that the protein is localized in the cytoplasm. However, it has an Nterminal extension already demonstrated in the primary structure of TaTrxhl and TdTrxhl, possibly corresponding to a transmembrane domain. Analysis of the Nterminal extension of TaTrxh2 with the ARGOS RAO program (PC / gene, RAO et al., Biochem Biophys.Acta 869,197-214,1986) reveals a putative transmembrane domain between residues 2 and 19. The site active, consisting of the following 5 amino acids: WCGPC, is stored between the 3 thioredoxins h wheat TaTrxh2, TaTrxhl and TdTrxhl.

Les introns ont des tailles différentes de celles des introns des gènes de thiorédoxines h de blé précédemment mis en évidence par ROBERT (1994) indiquant que le gène TaTrxh2 est différent de ceux-ci. Les introns du gène TaTrxh2 sont du type 0 et sont limités en 5' par la séquence GTA et en 3' par la séquence CAG, qui correspondent à des séquences consensus des limites intron-exon.  The introns have sizes different from those of the wheat thioredoxin h gene introns previously demonstrated by ROBERT (1994) indicating that the TaTrxh2 gene is different from these. The introns of the TaTrxh2 gene are of the 0 type and are 5 'limited by the GTA sequence and 3' by the CAG sequence, which correspond to consensus sequences of the intron-exon limits.

La région 3' non codante du gène TaTrxh2 présente le signal de polyadénylation AATAAA commun aux gènes transcrits par l'ARN polymérase II.  The 3 'non-coding region of the TaTrxh2 gene shows the polyadenylation signal AATAAA common to the genes transcribed by RNA polymerase II.

EXEMPLE 2 : ANALYSE STRUCTURELLE DU PROMOTEUR DU GÈNE TaTrxh2
Le promoteur du gène TaTrxh2 a été analysé pour rechercher des motifs de régulation putatifs susceptibles d'intervenir dans le contrôle de l'expression, et a notamment été comparé à celui des gènes de thiorédoxines h de C. reinhardtii (STEIN et al., Plant Mol. Biol. 28,487-503, 1995), de tabac (BRUGIDOU et al., Mol. Gen. Genet 238,285-293, 1993) et de riz EXAMPLE 2: STRUCTURAL ANALYSIS OF THE GENE PROMOTER TaTrxh2
The promoter of the TaTrxh2 gene was analyzed to look for putative regulatory motifs likely to be involved in the control of expression, and in particular was compared with that of the C. reinhardtii thioredoxin h genes (STEIN et al., Plant Mol Biol 28,487-503, 1995), tobacco (BRUGIDOU et al., Gen. Genet 238,285-293, 1993) and rice

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(ISHIWATARI et al., 1995), de la thiorédoxine m de C. reinhardtii (STEIN et al., 1995), et des thiorédoxines murine (MATSUI et al., Gene 152,165-171, 1995) et humaine (TONISSEN et al., Gene 102,221-228, 1992 ; KAGHAD et al., Gene 140,6643-6653, 1994).  (ISHIWATARI et al., 1995), C. reinhardtii thioredoxin m (STEIN et al., 1995), and murine thioredoxins (MATSUI et al., Gene 152, 165-171, 1995) and human (TONISSEN et al. , Gene 102, 211-228, 1992, KAGHAD et al., Gene 140, 6643-6653, 1994).

La séquence du promoteur du gène TaTrxh2 est représentée sur la figure 1.  The promoter sequence of the TaTrxh2 gene is shown in FIG.

Le site d'initiation de la transcription (représenté sur la figure 1 en gras et souligné d'un double trait) est une adénine située à-65 pb de l'ATG.  The transcription initiation site (shown in Figure 1 in bold and underlined with a double line) is an adenine located at -65 bp of the ATG.

Le promoteur du gène TaTrxh2 ne contient aucune séquence consensus correspondant à une boite TATAn ou à une boîte CAAT aux positions attendues pour les gènes transcrits par l'ARN polymérase II.  The promoter of the TaTrxh2 gene contains no consensus sequence corresponding to a TATAn box or a CAAT box at the expected positions for the genes transcribed by RNA polymerase II.

En revanche, il contient une boîte TATA-like (AATTTAT, soulignée d'un double trait sur la figure 1) à -105 pb de l'ATG.  On the other hand, it contains a TATA-like box (AATTTAT, underlined by a double line in Figure 1) at -105 bp of the ATG.

Il contient également une boîte GC (GGGCCGGG, soulignée en pointillés sur la figure 1) située à-84 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Les boites GC sont reconnues par des facteurs de transcription de type Spl (DYNAN et al. Nature 316,774-778, 1985), et interviennent dans l'expression constitutive des gènes. Des boîtes GC sont présentes dans tous les promoteurs connus de gènes de thiorédoxines.  It also contains a GC box (GGGCCGGG, underlined in dotted lines in FIG. 1) located at -84 bp of the ATG of the TaTrxh2 gene. The GC boxes are recognized by Spl transcription factors (DYNAN et al., Nature 316,774-778, 1985), and are involved in the constitutive expression of the genes. GC boxes are present in all known promoters of thioredoxin genes.

Une séquence riche en adénine, interrompue par un résidu G (AAAAAAAGAAAAAAAAA, en caractères gras soulignés d'un trait simple sur la figure 1), est située à-227 pb de l'ATG du gène TaTrxh2 ; des séquences de ce type ont également été identifiées précédemment dans les promoteurs des gènes de thiorédoxine h de tabac et de riz.  A sequence rich in adenine, interrupted by a residue G (AAAAAAAGAAAAAAAAA, in bold type underlined by a single line in FIG. 1), is located at 227 bp of the ATG of the TaTrxh2 gene; sequences of this type have also been previously identified in thioredoxin h gene promoters of tobacco and rice.

Des séquences bHLH (CANNTG), reconnues par des facteurs de transcription de la famille hélice/boucle/hélice, sont localisées à-206 pb et  BHLH (CANNTG) sequences, recognized by transcription factors of the helix / loop / helix family, are localized at -206 bp and

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-411 pb de l'ATG du gène TaTrxh2 ; elles sont représentées sur la figure 1 en lettres minuscules.  -411 bp of the ATG of the TaTrxh2 gene; they are represented in FIG. 1 in lowercase letters.

Des séquences bzip (ACGT, soulignées d'un trait simple sur la figure 1) reconnues par des facteurs de transcription de la famille des fermetures éclair à leucine (bZIP), sont localisées à-251 pb et-184 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Les protéines bZIP ont été décrites dans l'activation de l'expression de gènes codant des protéines de réserve du grain. Des motifs ACGT, ont également été décrits dans des séquences consensus ABRE (ABA-responsive element) des promoteurs de gènes dont l'expression est régulée par l'acide abscissique (ABA) (MUNDY et al., Proc. Natl. Acad. Sci.  Bzip sequences (ACGT, highlighted by a single line in Figure 1) recognized by transcription factors of the leucine zipper (bZIP) family, are localized at -251 bp and -184 bp of the ATG of the TaTrxh2 gene. The bZIP proteins have been described in the activation of the expression of genes encoding grain reserve proteins. ACGT motifs have also been described in ABRE (ABA-responsive element) consensus sequences of gene promoters whose expression is regulated by abscisic acid (ABA) (Mundy et al., Proc Natl Acad Sci .

USA, 87, 1406-1410, 1990). USA, 87, 1406-1410, 1990).

Deux boîtes pyrimidine (CCTTTCTCT et TCTTTCTTC, encadrées sur la figure 1) sont respectivement localisées à-553 pb et-541 pb de l'ATG du gène TaTrxh2.  Two pyrimidine boxes (CCTTTCTCT and TCTTTCTTC, boxed in FIG. 1) are respectively located at -553 bp and 541 bp of the ATG of the TaTrxh2 gene.

Les boîtes pyrimidine (CCTTTT) interviennent dans la régulation de l'expression par l'acide gibérellique, généralement en association avec des séquences GARE (GAresponsive element) (TAACAAA) (HUANG et al., Plant Mol. The pyrimidine boxes (CCTTTT) are involved in the regulation of expression by gibberellic acid, generally in association with GARE (GAresponsive element) (TAACAAA) sequences (HUANG et al., Plant Mol.

Biol. 14,115-121, 1990), et des séquences 02S (opaque-2binding séquence) ou boîte I (TATCCAT) (GUBLER et al., Plant Cell 4,1435-1441, 1992 ; LANAHAN et al., Plant Cell, 4,203-211, 1992), avec lesquelles elles s'organisent en un complexe appelé GARC (GA-responsive complex) (BETHKE et al., Bot. 48,1337-1356, 1997). Biol. 14, 115-121, 1990), and 02S (opaque-2binding sequence) or box I (TATCCAT) sequences (GUBLER et al., Plant Cell 4, 1435-1441, 1992, LANAHAN et al., Plant Cell, 4, 203-211 , 1992), with which they are organized into a complex called GARC (GA-responsive complex) (BETHKE et al., Bot 48, 1337-1356, 1997).

Aucune séquence GARE ou 02S n'a été mise en évidence dans les 1111 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2. No GARE or 02S sequence was detected in the 1111 bp upstream of the Ta Trxh2 gene ATG.

Un motif TGTGTGAGCA (en caractères gras, et souligné d'un trait en pointillés sur la figure 1) est situé à-403 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Ce motif ne diffère que par la présence d'un résidu G supplémentaire, de la séquence consensus GCN4-like (TGTGTGACA) de la boîte albumen impliquée dans l'expression albumenspécifique de gènes de gluténines de blé (HAMMOND-KOSACK  A TGTGTGAGCA motif (in bold, underlined with a dashed line in FIG. 1) is located at -403 bp of the ATG of the TaTrxh2 gene. This motif differs only in the presence of an additional G residue, the GCN4-like consensus sequence (TGTGTGACA) of the albumen box involved in the albumen specific expression of wheat glutenin genes (HAMMOND-KOSACK).

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et al., EMBO J. 12,545-554, 1993). Cependant, l'autre motif de la boîte albumen, dénommé EM (TGTAAAAGT), et dont la présence est également nécessaire pour l'expression albumen-spécifique (ALBANI et al., Plant Cell 9,171-184, 1997), n'a pas été mis en évidence dans les 1111 pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2.  et al., EMBO J. 12,545-554, 1993). However, the other motif of the albumen box, called EM (TGTAAAAGT), and whose presence is also necessary for albumen-specific expression (ALBANI et al., Plant Cell 9,171-184, 1997), does not was demonstrated in the 1111 bp upstream of the TaTrxh2 gene ATG.

Des diades trimériques CAA et TTG (en italique sur la figure 1) séparées par 10 bases, sont présentes respectivement à-107 pb et-97 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Ces motifs sont associés à une expression spécifique dans la couche à aleurone (THOMAS et al., Plant Cell 2,1171-1180, 1990).  CAA and TTG trimeric diadems (shown in italics in FIG. 1) separated by 10 bases are present at -107 bp and -97 bp, respectively, of the ATG of the TaTrxh2 gene. These motifs are associated with specific expression in the aleurone layer (THOMAS et al., Plant Cell 2, 1171-1180, 1990).

EXEMPLE 3 : ANALYSE FONCTIONNELLE DU PROMOTEUR DU GÈNE TaTrxh2 . EXAMPLE 3: FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE PROMOTER OF THE GENE TaTrxh2

La séquence de 1111 pb en 5' de l'ATG du gène TaTrxh2, ou différents fragments de cette séquence ont été clonés en amont de la séquence codante du gène rapporteur gus dans le vecteur pSPORTl-GUS. Le vecteur pSPORTl-GUS (DIGEON, 1997) contient la séquence codante du gène gus (P-glucuronidase d'E. coli) et le terminateur nos-ter du gène de la nopaline synthase, insérés au site EcoRI-HindIII du vecteur pSPORTl (GIBCO BRL).  The 1111 bp 5 'sequence of the ATG of the TaTrxh2 gene, or different fragments of this sequence were cloned upstream of the coding sequence of the reporter gene gus in the vector pSPORT1-GUS. The vector pSPORT1-GUS (DIGEON, 1997) contains the coding sequence of the gus gene (E. coli P-glucuronidase) and the nos-ter terminator of the nopaline synthase gene, inserted at the EcoRI-HindIII site of the vector pSPORT1 ( GIBCO BRL).

Les constructions réalisées sont les suivantes : - P1 : cette construction comprend la totalité de la séquence de 1111 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ; - P2 : cette construction comprend la séquence de 589 pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2 ; - P3 : cette construction comprend la séquence de 481 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ; - P4 : cette construction comprend la séquence de 228pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2 ; - P5 : cette construction comprend la séquence de 83pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2.  The constructs carried out are as follows: P1: this construct comprises the entire 1111 bp sequence upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene; P2: this construct comprises the sequence of 589 bp upstream of the ATG of the TaTrxh2 gene; P3: this construct comprises the 481 bp sequence upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene; P4: this construct comprises the 228bp sequence upstream of the ATG of the TaTrxh2 gene; P5: this construct comprises the sequence of 83bp upstream of the ATG of the Ta Trxh2 gene.

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Les limites des régions du promoteur du gène TaTrxh2 utilisées dans les constructions sont indiquées sur la figure 1.  The boundaries of the promoter regions of the TaTrxh2 gene used in the constructs are shown in Figure 1.

A titre de témoin positif, on a utilisé le vecteur pUGCl (CHAIR et al., 1996), qui permet l'expression constitutive et ubiquitaire du gène gus sous le contrôle du promoteur, du premier exon et du premier intron du gène codant l'ubiquitine du mais.  As a positive control, the pUGCl vector (CHAIR et al., 1996) was used, which allows the constitutive and ubiquitous expression of the gus gene under the control of the promoter, the first exon and the first intron of the gene coding for ubiquitin from maize.

Le vecteur pSPORTl-GUS a été utilisé comme contrôle négatif.  The vector pSPORT1-GUS was used as a negative control.

Ces différentes constructions ont été transférées par bombardement selon le protocole décrit par FAUQUET et al. (Proc. Third. Int. Rice Genet. Symp., Ed. G.S. Khush, 153-165,1996), dans de jeunes cals embryogènes de riz (var. japonica IRAT 349) dérivant de la prolifération du scutellum de l'embryon mature. Toutes les constructions testées ont été co-transférées avec le vecteur pILTAB227 (FAUQUET et al., 1997), qui confère la résistance à l'hygromycine et qui permet la sélection des cellules transformées.  These different constructs were transferred by bombardment according to the protocol described by FAUQUET et al. (Third Report, Int.Richard Genet, Symp., Ed., GS Khush, 153-165, 1996), in young rice embryogenic calli (IRAT 349 japonica var.) Derived from mature embryo scutellum proliferation. . All the constructs tested were co-transferred with the vector pILTAB227 (FAUQUET et al., 1997), which confers resistance to hygromycin and which allows the selection of the transformed cells.

Un mélange du vecteur portant la construction à tester, et du vecteur pILTAB227 (rapport molaire : vecteur à tester/pILTAB227 = 4/1) est utilisé pour enrober des microparticules d'or, à raison de 5 ug d'ADN total (3 ug d'ADN à tester + 2 ug de pILTAB227) à une concentration de 1 ug/ul, pour 3 mg d'un mélange en quantité égale de microparticules d'or de diamètres 1,0 um et 1,6 um, en suspension dans 50 ul d'eau distillée.  A mixture of the vector carrying the construct to be tested, and the vector pILTAB227 (molar ratio: vector to be tested / pILTAB227 = 4/1) is used to coat gold microparticles, at the rate of 5 μg of total DNA (3 μg of DNA to be tested + 2 μg of pILTAB227) at a concentration of 1 μg / μl, for 3 mg of an equal quantity mixture of gold microparticles of diameters of 1.0 μm and 1.6 μm, suspended in 50 μl of distilled water.

Le bombardement est effectué à l'aide d'un canon à particules PDS-1000/He (PARTICULE DELIVERY SYSTEM, BIORAD).  The bombardment is carried out using a particle gun PDS-1000 / He (PARTICLE DELIVERY SYSTEM, BIORAD).

Les cals embryogènes bombardés sont ensuite criblés sur un milieu de sélection contenant de l'hygromycine. Les cals résistants à l'hygromycine sont sélectionnés et placés sur milieu de régénération  The bombarded embryogenic calli are then screened on a selection medium containing hygromycin. Hygromycin-resistant calli are selected and placed on regeneration medium

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dépourvu d'hygromycine. Les plants régénérés (génération FO) ont ensuite été transférés dans des pots, et, après acclimatation en phytotron, sont cultivés en serre.  devoid of hygromycin. The regenerated plants (FO generation) were then transferred to pots, and after acclimation to the phytotron, are grown in a greenhouse.

L'expression du gène gus a été recherchée dans les organes végétatifs et dans les graines des riz des générations TO et Tl. Seules les plantes fertiles et présentant un phénotype normal, ont été retenues pour l'analyse. L'intégration du transgène dans les plantes analysées a été vérifiée par ACP et transfert de Southern.  Expression of the gus gene was sought in the vegetative organs and in the rice seeds of the TO and Tl generations. Only the fertile plants with a normal phenotype were selected for analysis. The integration of the transgene into the analyzed plants was verified by PCR and Southern blotting.

La détection de l'activité -glucuronidase a été effectuée par test histochimique, en détectant la coloration bleue résultant de l'hydrolyse de l'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl P-D-glucuronique (X-GLU), et sa quantification a été effectuée par test fluorométrique, en mesurant la 4-méthylumbélliférone (MU) formée à partir d'acide 4-méthylumbélliréfyl ssglucuronique, selon les protocoles décrits par JEFFERSON et al. (Plant Mol. Biol. Report 5,387-405, 1987).  The detection of the -glucuronidase activity was carried out by histochemical test, by detecting the blue coloration resulting from the hydrolysis of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl PD-glucuronic acid (X-GLU), and its quantification was carried out by fluorometric assay, by measuring the 4-methylumbelliferone (MU) formed from 4-methylumbellylfluoric acid, according to the protocols described by JEFFERSON et al. (Plant Mol Biol Report 5,387-405, 1987).

1. Expression du gène gus dans les organes végétatifs
L'analyse a été effectuée sur les racines, les chaumes, et les feuilles. 1. Expression of the gus gene in vegetative organs
The analysis was done on roots, stubble, and leaves.

Dans le cas des plants de riz non-transformés, ou de ceux transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS, l'analyse histochimique ne révèle pas d'activité GUS, et les mesures fluorimétriques ne font apparaître qu'une activité très faible voire nulle.  In the case of untransformed rice plants, or those transformed with the vector pSPORT1-GUS, the histochemical analysis reveals no GUS activity, and the fluorimetric measurements reveal only a very low or even zero activity.

Dans le cas des plants de riz transformés avec le vecteur pUGCI, on observe une activité GUS élevée (supérieure à 500 pmol MU/min/mg de protéine) dans tous les organes végétatifs testés.  In the case of rice plants transformed with the pUGCI vector, a high GUS activity (greater than 500 pmol MU / min / mg of protein) is observed in all the vegetative organs tested.

Dans le cas des plants de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5, on n'observe aucune coloration dans les organes végétatifs incubés en présence de X-GLU, et l'activité GUS mesurée par fluorométrie n'est pas significativement différente de  In the case of rice plants transformed with the constructions P1, P2, P3, P4 or P5, no staining was observed in the vegetative organs incubated in the presence of X-GLU, and the GUS activity measured by fluorometry was not not significantly different from

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celles mesurée pour les plantes transformées avec le vecteur pSPORTl-GUS ou les plantes non transformées. Ces résultats montrent que le promoteur du gène TaTrxh2 ne permet pas l'expression du gène gus dans les organes végétatifs.  those measured for plants transformed with the vector pSPORT1-GUS or non-transformed plants. These results show that the promoter of the TaTrxh2 gene does not allow the expression of the gus gene in the vegetative organs.

2. Expression du gène gus dans les grains Analyse histochimique Au niveau des grains entiers
Les grains de riz, prélevés à 35 JAF (jours après fécondation) ont été coupés dans le sens longitudinal puis incubés en présence de X-GLU. 2. Expression of the gus gene in grains Histochemical analysis At the level of whole grains
The rice grains, taken at 35 JAF (days after fertilization) were cut in the longitudinal direction and then incubated in the presence of X-GLU.

Aucune coloration n'est détectée dans les grains de riz transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS.  No staining is detected in the rice grains transformed with the vector pSPORT1-GUS.

On détecte au contraire une coloration intense de la totalité du grain pour les grains de riz transformés avec le vecteur pUGCl.  On the contrary, an intense coloration of the whole grain is detected for the rice grains transformed with the vector pUGCl.

Dans le cas des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4, une coloration bleue est détectée dans l'albumen des grains, mais pas dans l'embryon (axe cotylédonaire et scutellum), les enveloppes ou les épillets. Au niveau de l'albumen, cette coloration apparaît notamment à la périphérie de l'embryon, au dessus de l'épithélium du scutellum, et dans une zone médiane de l' albumen sur toute la longueur du grain.  In the case of rice grains transformed with constructions P1, P2, P3 or P4, a blue color is detected in the albumen grains, but not in the embryo (cotyledonary axis and scutellum), envelopes or spikelets. At the level of the albumen, this coloration appears in particular at the periphery of the embryo, above the epithelium of the scutellum, and in a median zone of the albumen along the whole length of the grain.

Cette coloration est moins intense, et apparaît moins rapidement que celle observée dans les grains de riz transformés avec pUGCl. L'intensité de la coloration semble varier selon la construction (P1, P2, P3 ou P4) concernée. L'intensité la plus élevée est observée dans les grains de riz transformés avec la construction P2, et la plus faible dans ceux transformés avec la construction P4. Ces résultats sont confirmés par l'analyse des grains Tl, où la coloration apparaît plus rapidement que dans les grains TO et est plus intense.  This coloration is less intense and appears less rapidly than that observed in rice grains transformed with pUGCl. The intensity of the coloration seems to vary according to the construction (P1, P2, P3 or P4) concerned. The highest intensity is observed in the rice grains transformed with the construction P2, and the lowest intensity in those transformed with the construction P4. These results are confirmed by the analysis of T1 grains, where the coloration appears more rapidly than in the TO grains and is more intense.

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Dans le cas des grains de riz transformés avec la construction P5, aucune coloration n'est détectée, ni dans l'embryon, ni dans l'albumen, ni dans les enveloppes.  In the case of rice grains transformed with the P5 construct, no staining is detected either in the embryo, in the albumen, or in the envelopes.

Au niveau des différents tissus du grain
Pour déterminer précisément la localisation de l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur du gène Ta Trxh2, des coupes histologiques ont été réalisées et observées au microscope photonique. At the level of the different tissues of the grain
To precisely determine the location of the expression of the gus gene under the control of the promoter of the Ta Trxh2 gene, histological sections were made and observed under a light microscope.

Ces observations montrent que, pour les constructions Pl, P2, P3 ou P4, le marquage est localisé dans un petit nombre de cellules de l'albumen amylacé situées à la périphérie de l'embryon et dans la zone centrale de l'albumen amylacé. Les cellules de l'embryon, de la couche à aleurone et des enveloppes, ne sont pas marquées. Pour la construction P5, aucun marquage n'est visible.  These observations show that, for the constructions P1, P2, P3 or P4, the labeling is localized in a small number of amylaceous albumen cells situated at the periphery of the embryo and in the central zone of the starchy albumen. The cells of the embryo, the aleurone layer and the envelopes are not marked. For construction P5, no marking is visible.

Analyse fluorimétrique
L'activité GUS a été mesurée d'une part sur les embryons et d'autre part sur l'albumen des grains de riz. Fluorometric analysis
The GUS activity was measured on the one hand on the embryos and on the other hand on the albumen of rice grains.

L'activité GUS est nulle ou très faible dans les grains de riz transformés avec le vecteur pSPORTlGUS, comme dans les grains de riz non-transformés. En revanche, elle est très forte (>500 pmol/MU/min/mg de protéine) dans l'embryon et l'albumen des grains de riz transformés avec le vecteur pUGCl.  GUS activity is zero or very low in rice grains transformed with the vector pSPORTlGUS, as in non-processed rice grains. On the other hand, it is very strong (> 500 pmol / MU / min / mg protein) in the embryo and albumen of rice grains transformed with the pUGCl vector.

L'activité GUS mesurée dans les embryons des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2 P3, P4 ou P5 n'est pas significativement différente de celle mesurée dans les grains de riz non-transformés ou de riz transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS.  The GUS activity measured in rice seed embryos transformed with the P1, P2 P3, P4 or P5 constructs is not significantly different from that measured in untransformed rice or rice grains transformed with the pSPORT1- vector. GUS.

En revanche, l'activité mesurée dans l'albumen des grains de riz transformés avec les constructions Pl, P2, P3 ou P4, est 25 à 40 fois plus élevée que celle mesurée dans l'albumen des grains de riz non-transformés  On the other hand, the activity measured in the albumen of the rice grains transformed with the constructions P1, P2, P3 or P4, is 25 to 40 times higher than that measured in the albumen of the non-transformed rice grains.

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ou transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS. Elle varie de 40 pmol/MU/min/mg de protéine pour les grains de riz transformés avec la construction P2, à 25 pmol/MU/min/mg de protéine pour ceux transformés avec la construction P4. Pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée dans les grains.  or transformed with the vector pSPORT1-GUS. It ranges from 40 pmol / MU / min / mg protein for rice grains transformed with P2 construction, to 25 pmol / MU / min / mg protein for those transformed with P4 construct. For construction P5, no GUS activity is detected in the grains.

Ces résultats montrent que la région (-1111 pb à -83 pb) du promoteur du gène Ta Trxh2 permet l'expression du gène gus uniquement dans les cellules de l'albumen amylacé, et que seule la délétion ne laissant subsister que 83 pb en amont de l'ATG a supprimé les séquences responsables de l'expression spatiale, dont certaines sont probablement localisées dans la région du promoteur comprise entre-228 pb et-83 pb.  These results show that the region (-1111 bp to -83 bp) of the promoter of the Ta Trxh2 gene allows the expression of the gus gene only in the cells of the starchy albumen, and that only the deletion leaving only 83 bp in upstream of ATG deleted the sequences responsible for spatial expression, some of which are probably localized in the promoter region between -228bp and -83bp.

Le motif GCN4-like identifié lors de l'analyse de la structure du promoteur du gène TaTrxh2 n'est donc apparemment pas le seul responsable de la spécificité tissulaire de l'expression ; en effet, malgré sa délétion dans les constructions P3 et P4, l'expression du gène gus demeure spécifique de l'albumen du grain.  The GCN4-like motif identified during the analysis of the promoter structure of the TaTrxh2 gene is therefore apparently not the only one responsible for the tissue specificity of the expression; indeed, despite its deletion in the P3 and P4 constructs, the expression of the gus gene remains specific to the albumen of the grain.

Deux séquences : AACAAATCC, et AACAAAGTG (représentées en caractères gras sur la figure 1), sont respectivement présentes à-51 pb et-381 pb par rapport à l'ATG du gène TaTrxh2. Ces séquences présentent une similitude avec des motifs AACA (AACAAACTCTATC) récemment mis en évidence dans les promoteurs de 6 gènes codant des glutélines de riz, et intervenant dans l'expression albumen-spécifique de ces gènes.  Two sequences: AACAAATCC, and AACAAAGTG (shown in bold in Figure 1), are present at -51 bp and -381 bp, respectively, relative to the ATG of the TaTrxh2 gene. These sequences show a similarity with AACA motifs (AACAAACTCTATC) recently demonstrated in the promoters of 6 genes encoding rice glutelins, and involved in the albumen-specific expression of these genes.

EXEMPLE 4 : EVOLUTION DE L'EXPRESSION DU GÈNE GUS AU COURS DU DÉVELOPPEMENT DES GRAINS DES RIZ TRANSGÉNIQUES
L'expression du gène gus a été suivie au cours de la maturation et de la germination de grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5. EXAMPLE 4: EVOLUTION OF THE EXPRESSION OF THE GUS GENE DURING THE DEVELOPMENT OF GRAINS OF TRANSGENIC RICE
The expression of the gus gene was followed during the maturation and germination of rice grains transformed with the constructions P1, P2, P3, P4 or P5.

1. Au cours de la maturation
Trois stades ont été analysés : 10 JAF, 25 JAF et 35 JAF. L'expression du gène gus a été évaluée, soit 1. During ripening
Three stages were analyzed: 10 JAF, 25 JAF and 35 JAF. The expression of the gus gene was evaluated, either

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par localisation histochimique de l'activité GUS, soit par détection des transcrits par transfert de Northern.  by histochemical localization of GUS activity, either by detection of transcripts by Northern blotting.

Activité GUS
L'analyse histochimique montre que pour les trois stades de maturation étudiés, 10,25, et 35 JAF, une activité GUS est toujours détectée dans l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4. Par contre pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée. GUS activity
Histochemical analysis shows that for the three stages of maturation studied, 10.25, and 35 JAF, GUS activity is always detected in the starchy albumen of rice grains transformed with constructions P1, P2, P3 or P4. On the other hand, for construction P5, no GUS activity is detected.

A 10 JAF, l'activité GUS est détectée dans l'albumen amylacé, à la périphérie de l'embryon. A 25 JAF, l'activité GUS progresse vers la zone médiane de l'albumen amylacé. A 35 JAF, l'activité GUS est détectée sur toute la surface de l'albumen amylacé.  At 10 JAF, GUS activity is detected in the starchy albumen at the periphery of the embryo. At 25 JAF, the GUS activity progresses towards the mid-zone of the starchy albumen. At 35 JAF, GUS activity is detected on the entire surface of the starchy albumen.

L'intensité de la coloration varie avec la nature de la construction et le stade de maturation, en particulier dans le cas de la construction P4, pour laquelle la coloration est très difficile à détecter en début de maturation.  The intensity of the coloration varies with the nature of the construction and the stage of maturation, in particular in the case of the P4 construction, for which the coloring is very difficult to detect at the beginning of maturation.

Ces résultats sont confirmés par les observations plus détaillées au niveau de chaque tissu du grain, qui montrent que : - A 10 JAF : pour les constructions P1, P2 ou P3, l'activité GUS est très forte dans les cellules de l'albumen amylacé à la périphérie de l'embryon, et elle n'est pas détectée dans les cellules de la zone médiane de l'albumen amylacé. Pour la construction P4, l'activité GUS dans les cellules de l'albumen amylacé est très faible, voire non détectable. En outre, dans les grains de riz transformés avec la construction P2, une activité GUS est également détectée dans les cellules de l'épithélium du scutellum.  These results are confirmed by the more detailed observations at the level of each tissue of the grain, which show that: - At 10 JAF: for the constructions P1, P2 or P3, the GUS activity is very strong in the cells of the starchy albumen on the periphery of the embryo, and it is not detected in the cells of the mid-zone of the starchy albumen. For the P4 construct, the GUS activity in the cells of the starchy albumen is very low, or even undetectable. In addition, in rice grains transformed with the P2 construct, GUS activity is also detected in scutellum epithelium cells.

- A 25 JAF : pour les constructions P1, P2 ou P3, l'activité GUS a diminué dans les cellules de l'albumen amylacé à la périphérie de l'embryon et augmente dans celles de la zone centrale de l'albumen  At 25 JAF: for the constructions P1, P2 or P3, the GUS activity decreased in the cells of the starchy albumen at the periphery of the embryo and increases in those of the central zone of the albumen.

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amylacé ; pour les grains de riz transformés avec la construction P2, on ne détecte plus d'activité GUS dans les cellules de l'épithélium du scutellum. Dans les grains de riz transformés avec la construction P4, l'activité GUS a augmenté dans les cellules de l'albumen amylacé situées à la périphérie de l'embryon et dans la zone centrale.  starchy; for the rice grains transformed with the P2 construct, no GUS activity is detected in the cells of the scutellum epithelium. In rice grains transformed with the P4 construct, GUS activity increased in the starchy albumen cells located at the periphery of the embryo and in the central zone.

- A 35 JAF : l'activité GUS est beaucoup plus faible qu'à 25 JAF dans toutes les cellules de l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec P1, P2 ou P3 ; dans les grains de riz transformés avec la construction P4, l'activité GUS est détectée dans les cellules de la zone médiane de l'albumen amylacé.  At 35 JAF: the GUS activity is much lower than at 25 JAF in all cells of the starchy albumen of rice grains transformed with P1, P2 or P3; in the rice grains transformed with the P4 construct, the GUS activity is detected in the cells of the middle zone of the starchy albumen.

Pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée quel que soit le stade de maturation ou le tissu du grain analysé.  For construction P5, no GUS activity is detected regardless of the ripening stage or the tissue of the analyzed grain.

Quelle que soit la construction utilisée, aucune activité GUS n'est détectée au cours de la maturation, dans les cellules de l'axe embryonnaire, de la couche à aleurone, ou des enveloppes des grains.  Whatever the construction used, no GUS activity is detected during maturation, in the cells of the embryonic axis, the aleurone layer, or the envelopes of the grains.

Détection des transcrits du gène gus
La présence des transcrits du gène gus a été recherchée dans les ARN totaux extraits, aux différents stades de maturation, des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5. La détection a été réalisée par transfert de Northern, en utilisant la sonde P3+GUS. Cette sonde de 2,6 kb comprend la séquence de 481 pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2, la séquence codante du gène gus et le terminateur du gène nos. Detection of gene transcripts
The presence of transcripts of the gus gene was sought in the total RNAs extracted, at the different stages of ripening, from the rice grains transformed with the constructions P1, P2, P3, P4 or P5. Detection was performed by Northern blotting, using the P3 + GUS probe. This 2.6 kb probe comprises the 481 bp sequence upstream of the TaTrxh2 gene ATG, the gus gene coding sequence and the nos gene terminator.

Pour chacune des constructions Pl, P2, P3, P4 ou P5, cette sonde permet de détecter la présence de transcrits dont la taille attendue est comprise entre 1,9 et 2,4 kb, selon la construction.  For each of the constructions P1, P2, P3, P4 or P5, this probe makes it possible to detect the presence of transcripts whose expected size is between 1.9 and 2.4 kb, depending on the construction.

La présence de ces transcrits varie en fonction de la construction utilisée pour la transformation, et du stade de maturation.  The presence of these transcripts varies depending on the construction used for processing, and the stage of maturation.

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Pour les riz transformés avec la construction Pl, les transcrits sont détectés aux 3 stades de la maturation avec un maximum à mi-maturation.  For rice transformed with the P1 construct, the transcripts are detected at the 3 stages of ripening with a maximum at mid-ripening.

Pour les riz transformés avec la construction P2, les transcrits sont détectés au début de la maturation.  For rice processed with construction P2, transcripts are detected at the beginning of maturation.

Pour les riz transformés avec la construction P3, les transcrits sont détectés au début et à la fin de la maturation du grain.  For rice processed with P3 construction, transcripts are detected at the beginning and at the end of grain ripening.

Pour les riz transformés avec la construction P4, les transcrits sont détectés à mi-maturation et en fin de maturation du grain.  For rice processed with the P4 construct, transcripts are detected at mid-ripening and at the end of grain maturation.

Pour les riz transformés avec la construction P5, aucun transcrit du gène gus n'est détecté quel que soit le stade de maturation analysé.  For rice transformed with the P5 construct, no transcript of the gus gene is detected regardless of the stage of ripening analyzed.

2. Au cours de la germination
Pour l'étude de l'expression du gène gus au cours de la germination, l'activité GUS a été analysée par histochimie dans des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5. 2. During germination
For the study of gus gene expression during germination, GUS activity was analyzed by histochemistry in rice grains transformed with constructions P1, P2, P3, P4 or P5.

Pour chaque construction, 10 grains ont été mis à germer à l'obscurité et prélevés à différents temps après imbibition : 0,12, 24,48 et 72 heures.  For each construction, 10 seeds were germinated in the dark and removed at different times after imbibition: 0.12, 24.48 and 72 hours.

L'activité GUS est détectée dans l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4 quel que soit le stade de germination. Par contre pour les grains de riz transformés avec la construction P5 aucune activité GUS n'est détectée.  The GUS activity is detected in the starchy albumen of the rice grains transformed with the P1, P2, P3 or P4 constructions irrespective of the stage of germination. On the other hand, for the rice grains transformed with the construction P5, no GUS activity is detected.

L'étude de l'accumulation des transcrits du gène gus dans les grains transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4 montre que ceux-ci ne sont pas accumulés au cours de la germination quelle que soit la construction.  The study of the accumulation of transcripts of the gus gene in the grains transformed with the constructions P1, P2, P3 or P4 shows that they are not accumulated during the germination regardless of the construction.

Ces résultats indiquent que le promoteur (1111 pb en amont de l'ATG) du gène TaTrxh2 ne permet pas  These results indicate that the promoter (1111 bp upstream of the ATG) of the TaTrxh2 gene does not allow

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l'expression du gène gus au cours de la germination. L'activité GUS détectée dans les grains germés est certainement une activité résiduelle due à la très grande stabilité de la P-glucoronidase dans le grain.  the expression of the gus gene during germination. The GUS activity detected in sprouted grains is certainly a residual activity due to the very high stability of β-glucoronidase in the grain.

Conclusion
L'analyse de l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur du gène TaTrxh2 au cours du développement des grains de riz transformés avec les constructions Pl, P2, P3, P4 ou P5 met en évidence un effet des délétions du promoteur du gène TaTrxh2 sur l'expression temporelle et spatiale du gène gus dans les grains des riz transformés. Conclusion
Analysis of the expression of the gus gene under the control of the promoter of the TaTrxh2 gene during the development of the rice grains transformed with the P1, P2, P3, P4 or P5 constructs reveals an effect of the gene promoter deletions. TaTrxh2 on the temporal and spatial expression of the gus gene in processed rice grains.

Les constructions Pl, P2, P3 permettent une expression du gène gus plus précoce que la construction P4 au cours de la maturation. La construction P5 ne permet pas l'expression du gène gus puisqu'aucun transcrit n'est détecté. En effet, des transcrits du gène gus sont détectés à 10 JAF pour les 3 constructions P1, P2, P3, et seulement 25 JAF pour la construction P4. Ceci suggère que les différences de niveau d'expression précédemment signalées entre les constructions P2 et P4, résultent probablement d'un retard dans l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur P4, plutôt que d'un niveau d'expression plus faible. La région du promoteur du gène TaTrxh2 comprise entre-1111 pb et - 228 pb contient certainement des séquences de régulation qui permettent une expression du gène gus dans les premiers stades de la maturation.  The constructs P1, P2, P3 allow an expression of the gene gus earlier than the P4 construct during maturation. The P5 construct does not allow expression of the gus gene since no transcript is detected. Indeed, transcripts of the gus gene are detected at 10 JAF for the 3 constructs P1, P2, P3, and only 25 JAF for the construct P4. This suggests that the previously reported differences in expression level between P2 and P4 constructs probably result from a delay in the expression of the gus gene under the control of the P4 promoter, rather than a lower level of expression. . The promoter region of the TaTrxh2 gene between -1111 bp and -228 bp certainly contains regulatory sequences that allow expression of the gus gene in the early stages of maturation.

Concernant l'expression spatiale, la région du promoteur du gène TaTrxh2 comprise entre-1111 pb et -591 pb contient probablement une séquence inhibant l'expression du gène dans l'épithélium du scutellum. En effet, lorsqu'elle est délétée (construction P2) l'expression du gène gus est observée dans ce tissu. A l'inverse, la région comprise entre-591 pb et-451 pb contiendrait une séquence activant l'expression dans  Regarding the spatial expression, the promoter region of the TaTrxh2 gene between -1111 bp and -591 bp probably contains a sequence inhibiting the expression of the gene in the scutellum epithelium. Indeed, when it is deleted (P2 construction) the expression of the gus gene is observed in this tissue. Conversely, the region between-591 bp and -451 bp would contain a sequence activating the expression in

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l'épithélium du scutellum, car lorsqu'elle est délétée (construction P3) il n'y a plus d'expression du gène gus dans ce tissu.  the epithelium of the scutellum, because when it is deleted (construction P3) there is no more expression of the gene gus in this tissue.

Les résultats montrent qu'au cours de la maturation des grains de riz, le promoteur du gène TaTrxh2 permet une expression du gène gus spécifique de l'albumen amylacé. Cette expression est détectée dans un nombre restreint de cellules réparties dans une zone centrale de l'albumen et à la périphérie de l'embryon.  The results show that during the maturation of rice grains, the promoter of the TaTrxh2 gene allows an expression of the gus gene specific for starchy albumen. This expression is detected in a small number of cells distributed in a central zone of the albumen and on the periphery of the embryo.

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LISTAGE DE SEQUENCES <110> INRA <120> Promoteur du gène TaTrxh2 <130> MJPcb539/87 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 2687 <212> ADN <213> Triticum aestivum <220> <221> exon <222> (1112)..(1231) <220> <221> intron <222> (1232)..(2203) <220> <221> exon <222> (2204)..(2326) <220> <221> intron <222> (2327)..(2420) <220> <221> exon <222> (2421)..(2558) <220> <221> CDS <222> (1112)..(1231) <220> <221> CDS <222> (2204)..(2326) <220> <221> CDS <222> (2421)..(2558) <400> 1 gaagtcagaa ggccgttcag aattgttgga ggactcgaaa aaaagaaggg gagcccaggc 60 agacgacggg gcggcatgtg cctgttcctt ggcgaggcgt ctagctttgg cagccgccgc 120 cgcttttctc cttgggtggg cgcgcgagct ccccgagttt gagccgcaat ttttttacat 180 tttatggcga tggcgtcagg cgtttatcta ggcgtctggg agggtacatt tgaagatgtg 240 ccaccaactc caaaccgaca accctgtatc tgagcatgcc tcatgcctct ccttcatgcc 300 SEQUENCE LISTING <110> INRA <120> Promoter of the TaTrxh2 gene <130> MJPcb539 / 87 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 2687 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> exon <222> (1112) .. (1231) <220> <221> intron <222> (1232). . (2203) <220> <221> exon <222> (2204) .. (2326) <220> <221> intron <222> (2327) .. (2420) <220> <221> exon <222> (2421) .. (2558) <220> <221> CDS <222> (1112) .. (1231) <220> <221> CDS <222> (2204) .. (2326) <220> <221> CDS <222> (2421) .. (2558) <400> 1 gaagtcagaa ggccgttcag aattgttgga ggactcgaaa aaaagaaggg gagcccaggc 60 agacgacggg gcggcatgtg cctgttcctt ggcgaggcgt ctagctttgg cagccgccgc 120 cgcttttctc cttgggtggg cgcgcgagct ccccgagttt gagccgcaat ttttttacat 180 tttatggcga tggcgtcagg cgtttatcta ggcgtctggg agggtacatt tgaagatgtg 240 ccaccaactc caaaccgaca accctgtatc tgagcatgcc tcatgcctct ccttcatgcc 300

<Desc/Clms Page number 24><Desc / Clms Page number 24>

tccctttggg tgaggtcatg tgcccttggc ggcgagtggc ttcccgttta gagcaagtat 360 aataagtcct agtcagctgg ctataagatg ttccacatca gcaaatcctt aaactggagg 420 agaaagaaag taggagtgag aagggcgtcg gcgcttcgtc aatcgctagc gatagcacaa 480 gctcccatgg aatcgagcca acatgcaacc cgcacaatga ctaaaggcaa acgccagcca 540 atcagtatgc ctttctctgc atctttcttc atgcaagcat taaatactat agctaatcta 600 cagccagttt attatataaa caggctatat agctgacctg gcagtgctat agagccggca 660 gccggctctt ctattagctt tgctcttatg gctacatctg tgtgagcagt cgattgattc 720 aaacaacaaa tccgggcgtt cagcaagtcg gaatgaattt cggctcatca ctcattgtcg 780 tgggcctcac gcgtattcgc ctaaccgtgt ttgaatcaga ccctcacgaa gccacggctc 840 cagcgacccg ttcaccacgt cagcctaaaa aaagaaaaaa aaactgttca atcacacgcc 900 catctgaacc gttcaacagc cccacgtaat ttcgcgcacc agcaaagggc atatccgtca 960 tagcgagcgc ataaattctg attcctgcct gcctgccgga caatttatct ttggggaggc 1020 gggccgggat tggagacaga gcccacaagg caacaacaaa gtgcgcgtga gaaatcaaca 1080 agcggtgctt gccgagaaga gagagagaga g atg gcg gcg tcg gcg gcg acg 1132
Met Ala Ala Ser Ala Ala Thr
1 5 gca acg gcg gcg gcg gtg ggg gcg ggg gag gtg atc tcc gtc cac acc 1180 Ala Thr Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly Glu Val Ile Ser Val His Thr
10 15 20 ctg gag cag tgg acc atg cag atc gag gag gcc aac gcc gcc aag aag 1228 Leu Glu Gln Trp Thr Met Gln Ile Glu Glu Ala Asn Ala Ala Lys Lys
25 30 35 ctg gtacgcatct ttccggatcg atctctccct cccccctcgt cttctcccgc 1281 Leu
40 aaggcggcac gggccgggcg aggatgctct tgtttcagat tggttggtga agttaagacc 1341 tggctcgtgc atgcggtggc cgcccgagga cgaatctgcg gttggtctgg ttgaattttg 1401 atggcttgga gagcatgtta cggtcggttt cttttccccg tcttattagg gctgccgtgg 1461 atatcatctt ctcatgttaa aaaggagaca gtttcagaac cgcgtgtacc gctacttcct 1521 cggtttctaa atatagatct tctaagattg caccacggac tatgtactga tgtatgtata 1581 tatatacata cttcagagta tagatcactc gttttgctcc gtatgtagta tgcagttcac 1641 ggggggcaca tctgtttgta tggtcttttt gtctgaaaac agtgttggtt atgctgtaat 1701 gtcatggcat ctttctgcga tgcagggggc atggctcttt acattaccct tgcagcattt 1761 tattgtttcc gcatcgtgct gcctcacatg cttttttaga ttgtatagga attgctattg 1821 cacgcaatta tccccttatc cgtggctgct gcagatttgc accaatattc cgtatgtaga 1881 tccctttggg tgaggtcatg tgcccttggc ggcgagtggc ttcccgttta gagcaagtat 360 aataagtcct agtcagctgg ctataagatg ttccacatca gcaaatcctt aaactggagg 420 agaaagaaag taggagtgag aagggcgtcg gcgcttcgtc aatcgctagc gatagcacaa 480 gctcccatgg aatcgagcca acatgcaacc cgcacaatga ctaaaggcaa acgccagcca 540 atcagtatgc ctttctctgc atctttcttc atgcaagcat taaatactat agctaatcta 600 cagccagttt attatataaa caggctatat agctgacctg gcagtgctat agagccggca 660 gccggctctt ctattagctt tgctcttatg gctacatctg tgtgagcagt cgattgattc 720 aaacaacaaa tccgggcgtt cagcaagtcg gaatgaattt cggctcatca ctcattgtcg 780 tgggcctcac gcgtattcgc ctaaccgtgt ttgaatcaga ccctcacgaa gccacggctc 840 cagcgacccg ttcaccacgt cagcctaaaa aaagaaaaaa aaactgttca atcacacgcc 900 catctgaacc gttcaacagc cccacgtaat ttcgcgcacc agcaaagggc atatccgtca 960 tagcgagcgc ataaattctg attcctgcct gcctgccgga caatttatct ttggggaggc 1020 gggccgggat tggagacaga gcccacaagg caacaacaaa gtgcgcgtga gaaatcaaca 1080 agcggtgctt gccgagaaga gagagagaga g atg gcg gcg tcg gcg gcg acg 1132
Met Ala Ala Ser Ala Ala Thr
1 5 gca acg gcg gcg gcg gtg ggg gcg ggg gag gtg atc tcc gtc cac acc 1180 ala thr ala ala ala val gly ala gly glu val island ser val histhr
10 15 20 ctg gag cag tgg acc atg cag atc gag gag gcc aac gcc gag aag aag 1228 Leu Glu Gln Gln Trp Thr Gln Met Gln Glu Glu Ala Asn Ala Ala Lys Lys
25 30 35 ctg gtacgcatct ttccggatcg atctctccct cccccctcgt cttctcccgc 1281 Leu
40 aaggcggcac gggccgggcg aggatgctct tgtttcagat tggttggtga agttaagacc 1341 tggctcgtgc atgcggtggc cgcccgagga cgaatctgcg gttggtctgg ttgaattttg 1401 atggcttgga gagcatgtta cggtcggttt cttttccccg tcttattagg gctgccgtgg 1461 atatcatctt ctcatgttaa aaaggagaca gtttcagaac cgcgtgtacc gctacttcct 1521 cggtttctaa atatagatct tctaagattg caccacggac tatgtactga tgtatgtata 1581 tatatacata cttcagagta tagatcactc gttttgctcc gtatgtagta tgcagttcac 1641 ggggggcaca tctgtttgta tggtcttttt gtctgaaaac agtgttggtt atgctgtaat 1701 gtcatggcat ctttctgcga tgcagggggcctgctcttt acattaccct tgcagcattt 1761 tattgtttcc gcatcgtgct gcctcacatg cttttttaga ttgtatagga attgctattg 1821 cacgcaatta tccccttatc cgtggctgct gcagatttgc accaatattc cgtatgtaga 1881

<Desc/Clms Page number 25><Desc / Clms Page number 25>

tcccaaacgt ctcctcaagt ttggcatagt aagatcgatt gtgctaactc cactaaaaac 1941 actgtaccag gaatttatat gatgatcatc ttgttgtttg tatatatttt tttgcggggg 2001 agtttataac tttccgtgga ttttcatctc tgaaattgtg gaacatcata aaattccagt 2061 gctattctct tcacgtgaat tataacctgg attgattgta agctctggta ggtgtttatg 2121 gtgttgaact agcagtagca ttattgaccc atgctttgca catttgtgtc aaggtcctgt 2181 taaccttgtc gtttgtaaca g gtg gtg gtt gac ttc act gca tca tgg tgt 2232
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45 50 gga cca tgc cgc atc atg gct cca gtt ttc gct gat ctc gcc aag aag 2280 Gly Pro Cys Arg Ile Met Ala Pro Val Phe Ala Asp Leu Ala Lys Lys
55 60 65 ttc cca aat gct gtt ttc ctc aag gtc gat gtc gat gaa ctg aag 2325 Phe Pro Asn Ala Val Phe Leu Lys Val Asp Val Asp Glu Leu Lys
70 75 80 gtaatggaac cgatggcgct gtttacagag cacagagtat catcgtgcga tttcagagct 2385 gtgttactaa caaggtttta tgttgtatga acagcccatt gcg gag caa ttc agc 2440
Glu Gln Phe Ser
85 gtt gag gcc atg cca acc ttc ctg ttc att aag gaa gga gat gtc aag 2488 Val Glu Ala Met Pro Thr Phe Leu Phe Ile Lys Glu Gly Asp Val Lys
90 95 100 gac agg gtt gtg gga gct atc aag gag gaa ctg acg aac aag gtt ggg 2536 Asp Arg Val Val Gly Ala Ile Lys Glu Glu Leu Thr Asn Lys Val Gly
105 110 115 cta cac gcg gcg gcc cag taatcaccta gcggagtagt attcgcctaa 2584 Leu His Ala Ala Ala Gln
120 ataaaattgt ggctcaagaa gcggtgcctc taatggcacc ttatatcctg tgtactgctt 2644 gttacttgtt ggttggatga tggtgaatca agtgtgactt tat 2687 <210> 2 <211> 1111 <212> ADN <213> Triticum aestivum <400> 2 gaagtcagaa ggccgttcag aattgttgga ggactcgaaa aaaagaaggg gagcccaggc 60 agacgacggg gcggcatgtg cctgttcctt ggcgaggcgt ctagctttgg cagccgccgc 120 cgcttttctc cttgggtggg cgcgcgagct ccccgagttt gagccgcaat ttttttacat 180 tttatggcga tggcgtcagg cgtttatcta ggcgtctggg agggtacatt tgaagatgtg 240 ccaccaactc caaaccgaca accctgtatc tgagcatgcc tcatgcctct ccttcatgcc 300 tcccaaacgt ctcctcaagt ttggcatagt aagatcgatt gtgctaactc cactaaaaac 1941 actgtaccag gaatttatat gatgatcatc ttgttgtttg tatatatttt tttgcggggg 2001 agtttataac tttccgtgga ttttcatctc tgaaattgtg gaacatcata aaattccagt 2061 gctattctct tcacgtgaat tataacctgg attgattgta agctctggta ggtgtttatg 2121 gtgttgaact agcagtagca ttattgaccc atgctttgca catttgtgtc aaggtcctgt 2181 taaccttgtc gtttgtaaca g gtg gtg gtt gac ttc act gca tgg tgt TCA 2232
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tccctttggg tgaggtcatg tgcccttggc ggcgagtggc ttcccgttta gagcaagtat 360 aataagtcct agtcagctgg ctataagatg ttccacatca gcaaatcctt aaactggagg 420 agaaagaaag taggagtgag aagggcgtcg gcgcttcgtc aatcgctagc gatagcacaa 480 gctcccatgg aatcgagcca acatgcaacc cgcacaatga ctaaaggcaa acgccagcca 540 atcagtatgc ctttctctgc atctttcttc atgcaagcat taaatactat agctaatcta 600 cagccagttt attatataaa caggctatat agctgacctg gcagtgctat agagccggca 660 gccggctctt ctattagctt tgctcttatg gctacatctg tgtgagcagt cgattgattc 720 aaacaacaaa tccgggcgtt cagcaagtcg gaatgaattt cggctcatca ctcattgtcg 780 tgggcctcac gcgtattcgc ctaaccgtgt ttgaatcaga ccctcacgaa gccacggctc 840 cagcgacccg ttcaccacgt cagcctaaaa aaagaaaaaa aaactgttca atcacacgcc 900 catctgaacc gttcaacagc cccacgtaat ttcgcgcacc agcaaagggc atatccgtca 960 tagcgagcgc ataaattctg attcctgcct gcctgccgga caatttatct ttggggaggc 1020 gggccgggat tggagacaga gcccacaagg caacaacaaa gtgcgcgtga gaaatcaaca 1080 agcggtgctt gccgagaaga gagagagaga g 1111 tccctttggg tgaggtcatg tgcccttggc ggcgagtggc ttcccgttta gagcaagtat 360 aataagtcct agtcagctgg ctataagatg ttccacatca gcaaatcctt aaactggagg 420 agaaagaaag taggagtgag aagggcgtcg gcgcttcgtc aatcgctagc gatagcacaa 480 gctcccatgg aatcgagcca acatgcaacc cgcacaatga ctaaaggcaa acgccagcca 540 atcagtatgc ctttctctgc atctttcttc atgcaagcat taaatactat agctaatcta 600 cagccagttt attatataaa caggctatat agctgacctg gcagtgctat agagccggca 660 gccggctctt ctattagctt tgctcttatg gctacatctg tgtgagcagt cgattgattc 720 aaacaacaaa tccgggcgtt cagcaagtcg gaatgaattt cggctcatca ctcattgtcg 780 tgggcctcac gcgtattcgc ctaaccgtgt ttgaatcaga ccctcacgaa gccacggctc 840 cagcgacccg ttcaccacgt cagcctaaaa aaagaaaaaa aaactgttca atcacacgcc 900 catctgaacc gttcaacagc cccacgtaat ttcgcgcacc agcaaagggc atatccgtca 960 tagcgagcgc ataaattctg attcctgcct gcctgccgga caatttatct ttggggaggc 1020 gggccgggat tggagacaga gcccacaagg caacaacaaa gtgcgcgtga gaaatcaaca 1080 agcggtgctt gccgagaaga gagagagaga 1111 g

Claims (8)

REVENDICATIONS 1) Promoteur caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel spécifique du promoteur du gène Ta Trxh2. 1) Promoter characterized in that it consists of a nucleic acid fragment comprising at least one functional domain specific to the Ta Trxh2 gene promoter. 2) Promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment d'acide nucléique est choisi dans le groupe constitué par : - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-1 à la position-1111 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-1 à la position-83 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-451 à la position-591 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-591 à la position-1111 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-228 à la position-451 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-451 à-591 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-83 à la position-228 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence est celle du premier intron du gène TaTrxh2.  2) Promoter according to claim 1, characterized in that said nucleic acid fragment is selected from the group consisting of: - the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-1 to position-1111 by compared to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-1 to position-83 with respect to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-451 to position-591 with respect to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-591 to position -1111 relative to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-228 to position-451 with respect to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-451 to -591 relative to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; the nucleic acid fragment whose sequence extends from position-83 to position-228 with respect to the ATG codon of the TaTrxh2 gene; the nucleic acid fragment whose sequence is that of the first intron of the TaTrxh2 gene. 3) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2.  3) expression cassette characterized in that it comprises a promoter according to any one of claims 1 or 2. <Desc/Clms Page number 28> <Desc / Clms Page number 28> 4) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2.  4) recombinant vector characterized in that it comprises at least one promoter according to any one of claims 1 or 2. 5) Cellule végétale transformée par au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2.  5) plant cell transformed with at least one promoter according to any one of claims 1 or 2. 6) Plante transgénique transformée par au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2.  6) transgenic plant transformed with at least one promoter according to any one of claims 1 or 2. 7) Plante transgénique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une monocotylédone.  7) Transgenic plant according to claim 6, characterized in that it is a monocotyledonous. 8) Utilisation d'un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2 pour contrôler l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule végétale. 8) Use of a promoter according to any one of claims 1 or 2 for controlling the expression of a gene of interest in a plant cell.
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