FR2792531A1

FR2792531A1 - Using vectors encoding angiogenic factors for treatment or prevention of pulmonary arterial hypertension

Info

Publication number: FR2792531A1
Application number: FR9905272A
Authority: FR
Inventors: Serge Adnot; Didier Branellec
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1999-04-26
Filing date: 1999-04-26
Publication date: 2000-10-27
Anticipated expiration: 2019-04-26
Also published as: FR2792531B1

Abstract

Use of a vector (A), containing a nucleic acid (I) that encodes an angiogenic factor (II), to prepare a composition for prevention, alleviation and/or treatment of pulmonary arterial hypertension (PAH), is new. Independent claims are also included for the following: (1) preparing a composition for preventing, alleviating and/or treating PAH by combining (A) with one or more adjuvants; and (2) a pharmaceutical composition comprising a defective recombinant virus that contains (I) in a formulation for intratracheal administration.

Description

La présente invention concerne l'utilisation d'un vecteur comprenant un acide nucléique codant pour un facteur angiogénique pour la prévention, l'amélioration et/ou le traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire. Elle concerne également des compositions pharmaceutiques particulières permettant l'administration locale et efficace de ces vecteurs. The present invention relates to the use of a vector comprising a nucleic acid encoding an angiogenic factor for the prevention, improvement and / or treatment of pulmonary arterial hypertension. It also relates to particular pharmaceutical compositions allowing the local and effective administration of these vectors.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une pathologie fréquente, fatale dans ses formes graves, actuellement dépourvue de traitement en dehors de la transplantation. Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a frequent pathology, fatal in its serious forms, currently untreated outside transplantation.

Elle est caractérisée par une élévation des résistances artérielles pulmonaires faisant obstacle à l'éjection du ventricule droit et compromettant le débit cardiaque. Plusieurs anomalies fonctionnelles et structurales de la paroi vasculaire pulmonaire participent au développement de l'HTAP incluant : une hyperplasie des cellules musculaires lisses avec hypertrophie médiale et intimale, une accumulation de la matrice extra cellulaire, une raréfaction vasculaire avec réduction de la densité capillaire périphérique. It is characterized by an increase in pulmonary arterial resistances obstructing the ejection of the right ventricle and compromising cardiac output. Several functional and structural anomalies of the pulmonary vascular wall participate in the development of PAH including: hyperplasia of smooth muscle cells with medial and intimal hypertrophy, accumulation of extra cellular matrix, vascular rarefaction with reduction of peripheral capillary density.

L'invention fournit pour la première fois une méthode efficace pour le traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire. Cette méthode est basée sur l'utilisation de vecteurs comportant un acide nucléique codant pour un facteur angiogénique. The invention provides for the first time an effective method for the treatment of pulmonary arterial hypertension. This method is based on the use of vectors comprising a nucleic acid coding for an angiogenic factor.

L'implication de différents facteurs angiogéniques tels que les facteurs de croissance du fibroblaste (FGF) et le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire a été étudiée cependant, à ce jour, le rôle de ces facteurs n'a pu être élucidé. The involvement of various angiogenic factors such as fibroblast growth factors (FGF) and vascular endothelium growth factor (VEGF) in the development of pulmonary arterial hypertension has been studied, however, to date role of these factors could not be elucidated.

Le premier facteur de croissance sélectif des cellules endothéliales, VEGF a été identifié en 1989. Les études réalisées depuis ont démontré l' importance de VEGF The first selective growth factor for endothelial cells, VEGF was identified in 1989. Studies since then have demonstrated the importance of VEGF

dans les processus angiogéniques normaux et pathologiques. C'est un facteur angiogénique puissant dans la cornée de lapin et la membrane chorioallantoidienne de poulet, deux modèles classiques d'angiogénèse in vivo. VEGF est également connu comme facteur de perméabilité vasculaire. C'est une glycoprotéine homodimérique de 34-36 kDa, liant l'héparine, et dont la structure comporte un peptide signal lui permettant d'être sécrétée. Le gène codant pour VEGF est composé de 8 exons. in normal and pathological angiogenic processes. It is a powerful angiogenic factor in the rabbit cornea and the chorioallantoic membrane of chicken, two classic models of angiogenesis in vivo. VEGF is also known as a vascular permeability factor. It is a homodimeric glycoprotein of 34-36 kDa, binding heparin, and whose structure includes a signal peptide allowing it to be secreted. The gene encoding VEGF is made up of 8 exons.

Quatre formes de peptides sont générées par épissage alternatif. Elles comprennent respectivement 121,165, 189 et 206 acides aminés chez l'homme. Four forms of peptides are generated by alternative splicing. They respectively include 121,165, 189 and 206 amino acids in humans.

Chez l' adulte, VEGF est exprimé dans de nombreux tissus normaux, en particulier le coeur et les poumons. Cette expression n'est pas forcément associée à une angiogénèse importante. Les différentes formes de VEGF reconnaissent deux récepteurs à activité tyrosine kinase de la famille fms : récepteur FlT-1 et le récepteur Flk-1. Le récepteur Flt-1 (VEGFR)-l est un récepteur de haute affinité (10 pM). Le récepteur KDR ou flk-1 ou (VEGFR) -2 est un récepteur de basse affinité (750 pM) qui serait responsable des effets mitogènes du peptide. Un des aspects les plus remarquables de la régulation de l'expression de VEGF est sa sensibilité à des conditions hypoxiques. Il a été montré que des périodes relativement brèves d'hypoxie stimulent l'expression de VEGF par des cellules en culture in vitro, notamment les cardiomyocytes et les cellules musculaires lisses. Cependant le rôle de ce facteur dans le développement ou la prévention de l'hypertension artérielle pulmonaire n'est pas connu. In adults, VEGF is expressed in many normal tissues, particularly the heart and lungs. This expression is not necessarily associated with significant angiogenesis. The different forms of VEGF recognize two receptors with tyrosine kinase activity of the fms family: FlT-1 receptor and Flk-1 receptor. The Flt-1 receptor (VEGFR) -l is a high affinity receptor (10 pM). The KDR or flk-1 or (VEGFR) -2 receptor is a low affinity receptor (750 pM) which is responsible for the mitogenic effects of the peptide. One of the most remarkable aspects of the regulation of VEGF expression is its sensitivity to hypoxic conditions. Relatively short periods of hypoxia have been shown to stimulate expression of VEGF by cells in culture in vitro, including cardiomyocytes and smooth muscle cells. However, the role of this factor in the development or prevention of pulmonary arterial hypertension is not known.

La famille des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire comprend également d'autres molécules utilisables dans la présente invention comme le PIGF (Placenta Growth Factor), le VEGF-B, le VEGF-C, le VEGF-D et le VEGF-E. Le VEGF et le VEGF-B sont , au sein de la famille des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire, les formes plus particulièrement préférées dans le cadre de l' invention. The family of vascular endothelium growth factors also includes other molecules which can be used in the present invention such as PIGF (Placenta Growth Factor), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D and VEGF-E . VEGF and VEGF-B are, within the family of vascular endothelium growth factors, the forms more particularly preferred in the context of the invention.

Le VEGF-B est produit dans de nombreux tissus adultes, en particulier le coeur, le muscle squelettique et le pancréas. Deux formes de peptides sont générées par épissage alternatif et comprennent respectivement 167 et 186 acides aminés. Le VEGF-B stimule la prolifération des cellules endothéliales mais il ne se lie pas au récepteur VEGFR-2. VEGF-B is produced in many adult tissues, especially the heart, skeletal muscle and the pancreas. Two forms of peptides are generated by alternative splicing and include 167 and 186 amino acids, respectively. VEGF-B stimulates the proliferation of endothelial cells but it does not bind to the VEGFR-2 receptor.

La famille des facteurs de croissance du fibroblaste (FGF) comprend de nombreux représentants et, à ce jour, au moins 14 membres ont été identifiés (pour une revue voir Birnbaum et al. Médecine et Science 13, p 392 - 396,1997). Bien que les formes de FGF-1 et FGF-2 soient exprimées dans les cellules de l'épithélium pulmonaire et au niveau des cellules vasculaires dans le poumon, aucune information n'est disponible sur l'expression de ces facteurs en relation avec l'hypertension artérielle pulmonaire, ni sur la capacité de ces facteurs à induire la prolifération des cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses au niveau du poumon, ni sur l'expression de ces facteurs au niveau des cellules épithéliales bronchiales ou alvéolaires en relation avec différentes conditions environnementales et notamment les conditions d'hypoxie. The fibroblast growth factor family (FGF) includes many representatives and, to date, at least 14 members have been identified (for a review see Birnbaum et al. Medicine and Science 13, p 392 - 396,1997). Although the forms of FGF-1 and FGF-2 are expressed in cells of the pulmonary epithelium and at the level of vascular cells in the lung, no information is available on the expression of these factors in relation to pulmonary hypertension, neither on the capacity of these factors to induce proliferation of endothelial cells and smooth muscle cells in the lung, nor on the expression of these factors in the bronchial or alveolar epithelial cells in relation to different environmental conditions and in particular the conditions of hypoxia.

De manière inattendue, la demanderesse a maintenant mis en évidence que le transfert au niveau du poumon d'un acide nucléique codant pour un facteur angiogénique permet de réduire la pression artérielle pulmonaire et de prévenir l'hypertrophie ventriculaire droite associée à l'hypertension artérielle pulmonaire avec une efficacité jamais égalée jusqu'alors. Unexpectedly, the applicant has now demonstrated that the transfer to the lung of a nucleic acid coding for an angiogenic factor makes it possible to reduce the pulmonary arterial pressure and to prevent the right ventricular hypertrophy associated with pulmonary arterial hypertension with an efficiency never equaled before.

Pour étudier l'effet des facteurs angiogéniques dans la prévention et le traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire hypoxique, la demanderesse a utilisé comme modèle, des rats en hypoxie chronique. Le transfert d'acides nucléiques codant pour des facteurs angiogéniques a été réalisé au moyen de vecteurs recombinants de type adenovirus administrés par instillation intratrachéale. Les résultats obtenus montrent que l'expression au niveau du poumon de facteurs angiogéniques tels que notamment le VEGF-B ou le FGF-1 permet de réduire la pression artérielle To study the effect of angiogenic factors in the prevention and treatment of hypoxic pulmonary arterial hypertension, the applicant used as a model rats in chronic hypoxia. The transfer of nucleic acids coding for angiogenic factors was carried out by means of recombinant vectors of the adenovirus type administered by intratracheal instillation. The results obtained show that the expression in the lung of angiogenic factors such as in particular VEGF-B or FGF-1 makes it possible to reduce the blood pressure

pulmonaire, de prévenir l'hypertrophie ventriculaire droite et le remodelage vasculaire pulmonaire. L'invention fournit ainsi, pour la première fois, une méthode de traitement efficace de l'hypertension artérielle pulmonaire. pulmonary, prevent right ventricular hypertrophy and pulmonary vascular remodeling. The invention thus provides, for the first time, an effective treatment method for pulmonary arterial hypertension.

Parmi les différents facteurs angiogéniques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment :les membres de la famille des facteurs de croissance du fibroblaste (FGF), et plus particulièrement le FGF-1, FGF-2, FGF-4, et FGF-5, les facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire et plus particulièrement le VEGF, le VEGF-B, le VEGF-C, le VEGF-D, le VEGF-D et le P.I.G.F (Placenta Growth Factor) et les facteurs de type angiopoiétine (angiopoiétine 1 et angiopoiétine 2). Among the various angiogenic factors which can be used in the context of the present invention, there may be mentioned in particular: members of the family of fibroblast growth factors (FGF), and more particularly FGF-1, FGF-2, FGF-4, and FGF-5, growth factors of the vascular endothelium and more particularly VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-D and PIGF (Placenta Growth Factor) and the factors angiopoietin type (angiopoietin 1 and angiopoietin 2).

Un premier objet de l'invention concerne l'utilisation d'un vecteur comprenant un acide nucléique codant pour un facteur angiogénique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention, à l'amélioration et/ou au traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire. A first object of the invention relates to the use of a vector comprising a nucleic acid encoding an angiogenic factor for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the prevention, the improvement and / or the treatment of hypertension pulmonary arterial.

Préférentiellement, le facteur angiogénique est un facteur de croissance des cellules endothéliales choisi parmi la famille du FGF ou du VEGF ou de l' angiopoiétine, ou une combinaison d'au moins deux facteurs choisis parmi au moins une de ces familles. A titre d'exemple de combinaisons avantageuses de facteurs angiogéniques on peut citer notamment la combinaison associant au moins le FGF-1 et le VEGF, la combinaison associant au moins le FGF-1 et le VEGF-B, la combinaison associant au moins le FGF-1et l'angiopoïétine 1, la combinaison associant au moins le VEGF et l'angiopoïétine 1 et la combinaison associant au moins le VEGF-B et l' angiopoïétine 1. Preferably, the angiogenic factor is a growth factor for endothelial cells chosen from the family of FGF or VEGF or angiopoietin, or a combination of at least two factors chosen from at least one of these families. As an example of advantageous combinations of angiogenic factors, mention may be made in particular of the combination associating at least FGF-1 and VEGF, the combination associating at least FGF-1 and VEGF-B, the combination associating at least FGF -1 and angiopoietin 1, the combination combining at least VEGF and angiopoietin 1 and the combination associating at least VEGF-B and angiopoietin 1.

Selon un mode particulier, le facteur de croissance des cellules endothéliales est choisi parmi le FGF-1, le FGF-2, le FGF-4, le FGF-5, ou leurs variants. According to a particular mode, the growth factor of endothelial cells is chosen from FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5, or their variants.

Selon un autre mode, le facteur de croissance des cellules endothéliales est choisi parmi le VEGF, le VEGF-B, le VEGF-C, le VEGF-D, le VEGF-E ou leurs According to another mode, the endothelial cell growth factor is chosen from VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E or their

variants. De préférence, le facteur de croissance des cellules endothéliales est choisi parmi le VEGF ou le VEGF-B. variants. Preferably, the growth factor of the endothelial cells is chosen from VEGF or VEGF-B.

Au sens de la présente invention on entend par "variant" d'un polypeptide ou d'une protéine tout analogue, fragment, dérivé ou forme mutée qui est dérivé d'un polypeptide ou d'une protéine et qui retient au moins une fonction biologique dudit polypeptide ou de ladite protéine. Différent variants d'un polypeptide ou d'une protéine peuvent exister à l'état naturel. Ces variants peuvent être des variations alléliques caractérisées par des différences dans la séquence nucléotidique des gènes de structure codant pour la protéine ou peuvent résulter d'un épissage différentiel ou de modifications post-traductionnelle. Ces variants peuvent être obtenus par substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus acides aminés. Ces modifications peuvent être réalisées par toutes techniques connues de l'homme du métier. For the purposes of the present invention, the term "variant" of a polypeptide or protein is any analog, fragment, derivative or mutated form which is derived from a polypeptide or a protein and which retains at least one biological function. said polypeptide or said protein. Different variants of a polypeptide or protein can exist in their natural state. These variants can be allelic variations characterized by differences in the nucleotide sequence of the structural genes coding for the protein or can result from differential splicing or from post-translational modifications. These variants can be obtained by substitution, deletion, addition and / or modification of one or more amino acid residues. These modifications can be carried out by any techniques known to those skilled in the art.

Ces variants sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une expression améliorée in vivo, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques. These variants are in particular molecules having a greater affinity for their binding sites, sequences allowing improved expression in vivo, molecules exhibiting greater resistance to proteases, molecules having greater therapeutic efficacy or lesser side effects, or possibly new biological properties.

Parmi les variants préférés du FGF-1, on peut citer plus particulièrement les variants naturels du FGF-1, telles que les formes décrites dans le brevet US 4,868,113 et comprenant 154 acides aminés, 140 acides aminés ou 134 acides aminés. Parmi les variants préférés de VEGF, on peut citer les formes VEGF121, VEGF 165, VEGF189 et VEGF 206. Parmi les variants préférés de VEGF-B, on peut citer les formes VEGF 186 et VEGF 167. A titre de variant plus particulièrement préféré, on peut citer les formes FGF-1 ( 21-154 ) et le VEGF 165 et les formes VEGF 187 et VEGF 167. Among the preferred variants of FGF-1, there may be mentioned more particularly the natural variants of FGF-1, such as the forms described in US Pat. No. 4,868,113 and comprising 154 amino acids, 140 amino acids or 134 amino acids. Among the preferred variants of VEGF, there may be mentioned the forms VEGF121, VEGF 165, VEGF189 and VEGF 206. Among the preferred variants of VEGF-B, there may be mentioned the forms VEGF 186 and VEGF 167. As a more particularly preferred variant, mention may be made of the forms FGF-1 (21-154) and VEGF 165 and the forms VEGF 187 and VEGF 167.

D'autres variants utilisables dans le cadre de l'invention sont notamment les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions n'intervenant pas ou peu dans l'interaction avec les Other variants which can be used in the context of the invention are in particular the molecules in which one or more residues have been substituted, the derivatives obtained by deletion of regions having little or no action in the interaction with the

sites de liaison considérés ou exprimant une activité indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus supplémentaires, tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction. binding sites considered or expressing an undesirable activity, and the derivatives comprising, relative to the native sequence, additional residues, such as for example a secretion signal and / or a junction peptide.

Dans le cas du FGF-1, de manière avantageuse, la séquence nucléotidique codant pour le facteur angiogénique contient également un signal de sécrétion permettant de diriger le FGF-1 synthétisé dans les voies de sécrétion des cellules infectées, de manière à ce que le FGF-1 synthétisé soit libéré plus efficacement dans les compartiments extracellulaires et puisse activer ses récepteurs. Le signal de sécrétion utilisé peut être un signal de sécrétion hétérologue ou même artificiel. A titre d'exemple, on peut citer le signal de sécrétion de l'interféron (3 humain qui permet la sécrétion importante de FGF-1. In the case of FGF-1, advantageously, the nucleotide sequence coding for the angiogenic factor also contains a secretion signal making it possible to direct the FGF-1 synthesized in the secretory pathways of the infected cells, so that the FGF -1 synthesized is released more efficiently in the extracellular compartments and can activate its receptors. The secretion signal used can be a heterologous or even artificial secretion signal. By way of example, mention may be made of the secretion signal of human interferon (3 which allows the significant secretion of FGF-1.

La séquence d'ADN codant pour le facteur angiogénique utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg peut permettre une meilleure expression dans les cellules humaines. The DNA sequence coding for the angiogenic factor used in the context of the present invention may be a cDNA, a genomic DNA (gDNA), or a hybrid construct consisting, for example, of a cDNA in which one or more introns would be inserted. They can also be synthetic or semi-synthetic sequences. Particularly advantageously, a cDNA or a gDNA is used. In particular, the use of a gDNA can allow better expression in human cells.

Avantageusement, la séquence codant pour le facteur angiogénique est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules de l'épithélium pulmonaire. Préférentiellement, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-àdire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression du facteur angiogénique. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs E1A, MLP, Advantageously, the sequence coding for the angiogenic factor is placed under the control of signals allowing its expression in the cells of the pulmonary epithelium. Preferably, these are heterologous expression signals, that is to say signals different from those naturally responsible for the expression of the angiogenic factor. They may in particular be sequences responsible for the expression of other proteins, or synthetic sequences. In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect. Likewise, they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, including the adenovirus used. In this regard, mention may be made, for example, of the promoters E1A, MLP,

CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. II peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules de l'épithélium pulmonaire, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le vecteur a effectivement infecté ces cellules ; à cet égard, on peut citer par exemple le promoteur du gène de la cytokératine 18. CMV, LTR-RSV, etc. In addition, these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences or allowing tissue-specific expression. It may in fact be particularly advantageous to use expression signals which are active specifically or mainly in the cells of the pulmonary epithelium, so that the DNA sequence is not expressed and does not produce its effect until the vector actually infected these cells; in this regard, there may be mentioned, for example, the promoter of the cytokeratin 18 gene.

L'acide nucléique codant pour un ou plusieurs facteurs angiogéniques est introduit dans un vecteur. Au sens de la présente invention on entend par "vecteur" tout moyen permettant le transfert d'un acide nucléique dans une cellule hôte, de préférence au niveau du poumon et plus particulièrement au niveau de l'épithélium pulmonaire. Le terme vecteur comprend les vecteurs viraux et non-viraux pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule in vivo ou ex vivo. Un type de vecteur pour la mise en oeuvre de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant, etc. Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant. The nucleic acid encoding one or more angiogenic factors is introduced into a vector. For the purposes of the present invention, the term "vector" means any means allowing the transfer of a nucleic acid into a host cell, preferably at the level of the lung and more particularly at the level of the pulmonary epithelium. The term vector includes viral and non-viral vectors for the transfer of a nucleic acid into a cell in vivo or ex vivo. A type of vector for implementing the invention can be, for example, a plasmid, a cosmid or any DNA not encapsulated by a virus, a phage, an artificial chromosome, a recombinant virus, etc. It is preferably a plasmid or a recombinant virus.

Parmi les vecteurs de type plasmidique, on peut citer tous les plasmides de clonage et/ou d'expression connus de l'homme du métier et qui comportent généralement une origine de réplication. On peut citer également des plasmides portant des origines de réplication et/ou des marqueurs de sélection perfectionnés tels que décrits par exemple dans les demandes W096/26270 et W097/10343. Among the plasmid type vectors, mention may be made of all the cloning and / or expression plasmids known to those skilled in the art and which generally have an origin of replication. Mention may also be made of plasmids carrying origins of replication and / or improved selection markers as described for example in applications WO96 / 26270 and WO97 / 10343.

Parmi les vecteurs de type virus recombinant, on peut citer préférentiellement les virus adénovirus, rétrovirus, virus de l'herpès, les lentivirus, les virus adénoassociés recombinants ou le virus SV40. La construction de ce type de virus recombinants défectifs pour la réplication a été largement décrite dans la littérature, ainsi que les propriétés d'infection de ces vecteurs (voir notamment S. Baeck et K.L. Among the vectors of the recombinant virus type, there may preferably be mentioned adenovirus viruses, retroviruses, herpes virus, lentiviruses, recombinant adeno-associated viruses or the SV40 virus. The construction of this type of recombinant virus defective for replication has been widely described in the literature, as well as the infection properties of these vectors (see in particular S. Baeck and K.L.

March (1998), Circul. Research vol. 82, pp 295-305), T. Shenk, B.N. Fields, D. M. Knipe, P.M. Howley et al (1996), Adenoviridae : the viruses and their replication (in March (1998), Circul. Research vol. 82, pp 295-305), T. Shenk, B.N. Fields, D. M. Knipe, P.M. Howley et al (1996), Adenoviridae: the viruses and their replication (in

virology). Pp 211-2148, EDS - Ravenspublishers/Philadelphia, P. Yeh et M. virology). Pp 211-2148, EDS - Ravenspublishers / Philadelphia, P. Yeh and M.

Perricaudet (1997), FASEB Vol. 11, pp 615-623. Perricaudet (1997), FASEB Vol. 11, pp 615-623.

Un virus recombinant particulièrement préféré pour la mise en #uvre de l'invention est un adénovirus recombinant défectif. A particularly preferred recombinant virus for carrying out the invention is a defective recombinant adenovirus.

Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 (kilobases) kb environ. Il en existe différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adénovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les adénovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Ad 12). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par référence. Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses around 36 (kilobases) kb in size. There are different serotypes, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. More particularly, the recombinant adenoviruses can be of human or animal origin. As regards adenoviruses of human origin, mention may preferably be made of those classified in group C, in particular adenoviruses of type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) or 12 (Ad 12). Among the various adenoviruses of animal origin, mention may preferably be made of adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of the adenovirus CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR- 800) for example]. Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application WO94 / 26914 incorporated herein by reference.

Le génome des adénovirus comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Ll à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genbank M73260). The adenovirus genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes. The main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions. Among these, the genes contained in the El region in particular are necessary for viral propagation. The main late genes are contained in regions L1 to L5. The genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genbank M73260).

De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad 12, etc) ont également été séquencées. Likewise, parts or even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad 12, etc.) have also been sequenced.

Pour leur utilisation comme vecteurs recombinants, différentes constructions dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant différents gènes thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans For their use as recombinant vectors, various constructs derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different therapeutic genes. In each of these constructions, the adenovirus was modified so as to render it incapable of replication in the infected cell. Thus, the constructions described in

l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région El, essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195 ; et al., Gene 50 (1986) 161). Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant tsl25, permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., J. Virol., 1975, 15 (2) 348-354). D'autres vecteurs comprennent une délétion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions El et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes W094/28152, W095/02697, W096/22378). the prior art are adenoviruses deleted from the E1 region, essential for viral replication, at the level of which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; et al., Gene 50 (1986) 161). Furthermore, to improve the properties of the vector, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus. Thus, a heat-sensitive point mutation was introduced into the mutant ts125, making it possible to inactivate the DNA binding protein 72kDa (DBP) (Van der Vliet et al., J. Virol., 1975, 15 (2) 348-354). Other vectors include a deletion of another region essential for viral replication and / or propagation, the E4 region. The E4 region is in fact involved in the regulation of the expression of late genes, in the stability of late nuclear RNA, in the extinction of the expression of proteins of the host cell and in the efficiency of replication of l 'Viral DNA. Adenoviral vectors in which the E1 and E4 regions are deleted therefore have very reduced transcription background noise and expression of viral genes. Such vectors have been described by example in applications W094 / 28152, W095 / 02697, W096 / 22378).

En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (W096/10088). In addition, vectors carrying a modification at the level of the IVa2 gene have also been described (WO96 / 10088).

Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, il s'agit d'un adénovirus Ad2 ou Ad5. In a preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus is a human adenovirus of group C. More preferably, it is an adenovirus Ad2 or Ad5.

Avantageusement, l'adénovirus recombinant utilisé dans le cadre de l'invention comprend une délétion dans la région El de son génome. Encore plus particulièrement, il comprend une délétion des régions Ela et Elb. A titre d'exemple, on peut citer des délétions affectant les nucléotides 454-3328 ; ou 357-4020 (par référence au génome de l'Ad5). Advantageously, the recombinant adenovirus used in the context of the invention comprises a deletion in the E1 region of its genome. Even more particularly, it includes a deletion of the Ela and Elb regions. By way of example, mention may be made of deletions affecting nucleotides 454-3328; or 357-4020 (with reference to the Ad5 genome).

Selon une autre variante, l'adénovirus recombinant utilisé dans le cadre de l'invention comprend en outre une délétion dans la région E4 de son génome. Plus particulièrement, la délétion dans la région E4 affecte l'ensemble des phases ouvertes. According to another variant, the recombinant adenovirus used in the context of the invention also comprises a deletion in the E4 region of its genome. More particularly, the deletion in the E4 region affects all of the open phases.

On peut citer à titre d'exemple précis les délétions 33466-35535 ou 33093-35535. As a specific example, the deletions 33466-35535 or 33093-35535 can be cited.

D'autres types de délétions dans la région E4 sont décrites dans les demandes W095/02697 et W096/22378, incorporées à la présente par référence. Other types of deletions in the E4 region are described in applications W095 / 02697 and W096 / 22378, incorporated herein by reference.

La cassette d'expression contenant l'acide nucléique codant pour un facteur angiogénique peut être insérée en différents sites du génome recombinant. Elle peut être insérée au niveau de la région El, E3 ou E4, en remplacement des séquences délétées ou en surplus. Elle peut également être insérée en tout autre site, en dehors des séquences nécessaires en cis à la production des virus (séquences ITR et séquence d'encapsidation). The expression cassette containing the nucleic acid coding for an angiogenic factor can be inserted at different sites of the recombinant genome. It can be inserted at the level of the E1, E3 or E4 region, replacing the deleted or surplus sequences. It can also be inserted at any other site, apart from the sequences necessary in cis for the production of viruses (ITR sequences and packaging sequence).

Au sens de la présente invention on entend par "cassette d'expression" d'un acide nucléique, un fragment d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sites de restrictions spécifiques ; le fragment d'ADN comprend, outre la séquence nucléotidique codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt, les séquences nécessaires à l'expression (enhanceur(s) , promoteur(s), séquence de polyadénylation ...) de ladite séquence d'intérêt. Le fragment d'ADN et les sites de restriction sont conçus pour assurer une insertion dudit fragment dans un cadre de lecture approprié pour la transcription et/ou la traduction. For the purposes of the present invention, the term "expression cassette" of a nucleic acid means a DNA fragment which can be inserted into a vector at specific restriction sites; the DNA fragment comprises, in addition to the nucleotide sequence coding for an RNA or a polypeptide of interest, the sequences necessary for the expression (enhancer (s), promoter (s), polyadenylation sequence, etc.) of said sequence of interest. The DNA fragment and the restriction sites are designed to ensure insertion of said fragment into a reading frame suitable for transcription and / or translation.

Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation, c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou plusieurs des fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant. Parmi les lignées d'encapsidation connues par l'homme du métier, on peut citer par exemple la lignée 293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines de rein contenant l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région El, incluant Ela et Elb, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région codant pour la protéine pIVa2. Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la Recombinant adenoviruses are produced in an packaging line, that is to say a cell line capable of complementing in trans one or more of the deficient functions in the recombinant adenoviral genome. Among the packaging lines known to those skilled in the art, mention may be made, for example, of line 293 in which a part of the adenovirus genome has been integrated. More specifically, line 293 is a human embryonic kidney cell line containing the left end (approximately 11-12%) of the genome of the adenovirus serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the packaging region , the El region, including Ela and Elb, the region encoding the pIX protein and part of the region encoding the pIVa2 protein. This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the

région El, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés. Cette lignée est également capable de produire, à température permissive (32 C), des stocks de virus comportant en outre la mutation E2 thermosensible. D'autres lignées cellulaires capables de complémenter la région El ont été décrites, basées notamment sur des cellules de carcinome de poumon humain A549 (W094/28152) ou sur des rétinoblastes humains (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées capables de trans-complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont également été décrites. El region, and produce viral stocks with high titers. This line is also capable of producing, at permissive temperature (32 C), stocks of virus further comprising the thermosensitive E2 mutation. Other cell lines capable of complementing the E1 region have been described, based in particular on human lung carcinoma cells A549 (WO94 / 28152) or on human retinoblasts (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Furthermore, lines capable of trans-complementing several functions of the adenovirus have also been described.

En particulier, on peut citer des lignées complémentant les régions El et E4 (Yeh et al., J. Virol. Vol. 70 (1996) pp 559-565 ; Gen. Ther. 2 (1995) 322 ; et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant les régions El et E2 (W094/28152, W095/02697, W095/27071). In particular, mention may be made of lines complementing the El and E4 regions (Yeh et al., J. Virol. Vol. 70 (1996) pp 559-565; Gen. Ther. 2 (1995) 322; et al., Hum Gen. Ther. 6 (1995) 1575) and lines complementing the regions El and E2 (W094 / 28152, W095 / 02697, W095 / 27071).

Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures). Pour la mise en oeuvre du procédé, l'ADN viral introduit peut être le génome viral recombinant complet, éventuellement construit dans une bactérie (W096/25506) ou dans une levure (W095/03400), transfecté dans les cellules. Il peut également s'agir d'un virus recombinant utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN viral peut aussi être introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du génome viral recombinant et une zone d'homologie permettant, après introduction dans la cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome viral recombinant par recombinaison homologue entre les différents fragments. Recombinant adenoviruses are usually produced by the introduction of viral DNA into the packaging line, followed by lysis of the cells after approximately 2 or 3 days (the kinetics of the adenoviral cycle being 24 to 36 hours). For the implementation of the method, the viral DNA introduced can be the complete recombinant viral genome, optionally constructed in a bacterium (WO96 / 25506) or in a yeast (WO95 / 03400), transfected in the cells. It can also be a recombinant virus used to infect the packaging line. The viral DNA can also be introduced in the form of fragments each carrying a part of the recombinant viral genome and a zone of homology making it possible, after introduction into the packaging cell, to reconstitute the recombinant viral genome by homologous recombination between the different fragments .

Après la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées par centrifugation en gradient de chlorure de césium. Une méthode alternative a été décrite dans la demande W098/00528 incorporée à la présente par référence. After the lysis of the cells, the recombinant viral particles are isolated by centrifugation in a cesium chloride gradient. An alternative method has been described in application W098 / 00528 incorporated herein by reference.

A titre d'exemple de vecteur convenant pour la mise en oeuvre de la présente invention on peut notamment citer : l'adénovirus recombinant comprenant le gène codant pour le FGF-1 humain ou le VEGF-B humain tel que décrits dans la présente By way of example of a vector suitable for implementing the present invention, there may be mentioned in particular: the recombinant adenovirus comprising the gene coding for human FGF-1 or human VEGF-B as described in the present

invention , ou l'adénovirus recombinant comprenant le gène codant pour l'isoforme 165 du VEGF humain tel que décrit dans Mülhauser J et al (VEGF 165 expressed by a replication-deficient recombinant adenovirus vector induces angiogenesis in vivo. Cire Res. 195 ;77:1077-1086) par référence à la présente. invention, or the recombinant adenovirus comprising the gene coding for the isoform 165 of human VEGF as described in Mülhauser J et al (VEGF 165 expressed by a replication-deficient recombinant adenovirus vector induces angiogenesis in vivo. Wax Res. 195; 77 : 1077-1086) by reference to the present.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un vecteur tel que décrit ci-avant et un véhicule physiologiquement acceptable. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie orale, parentérale, intranasale, intraartérielle, intraveineuse, etc. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a vector as described above and a physiologically acceptable vehicle. The pharmaceutical compositions of the invention can be formulated for oral, parenteral, intranasal, intraarterial, intravenous, etc. administration.

Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation destinée à être administrée par voie intratrachéale, en particulier par instillation, ou par voie intraveineuse. II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés destinés à une instillation intratrachéale. Preferably, the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for a formulation intended to be administered by the intratracheal route, in particular by instillation, or by the intravenous route. They may in particular be saline solutions (monosodium phosphate, disodium phosphate, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as the case may be, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of solutes intended for intratracheal instillation.

Les doses utilisées pour l'instillation ou les injections peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, du gène à exprimer, ou encore de la durée de l'expression recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution virale, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. The doses used for instillation or injections can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the mode of administration used, of the gene to be expressed, or also of the duration of the expression sought. In general, the recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 104 and 1014 pfu, and preferably 106 to 1010 pfu. The term pfu ("plaque forming unit") corresponds to the infectious power of a viral solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measurement of the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.

En outre, les composition selon l'invention peuvent également comprendre un agent de transfert chimique ou biochimique. On entend par le terme "agent de transfert chimique ou biochimique " tout composé (i. e., autre qu'un virus recombinant) facilitant In addition, the compositions according to the invention can also comprise a chemical or biochemical transfer agent. The term "chemical or biochemical transfer agent" means any compound (ie, other than a recombinant virus) which facilitates

la pénétration d'un acide nucléique dans une cellule. Il peut s'agir d'agents non viraux cationiques comme des lipides cationiques, des peptides, des polymères (Polyéthylène Imine, Polylysine), des nanoparticules ; d'agents non viraux non cationiques comme des liposomes non cationiques, des polymères ou des nanoparticules non cationiques. the penetration of a nucleic acid into a cell. They can be cationic non-viral agents such as cationic lipids, peptides, polymers (Polyethylene Imine, Polylysine), nanoparticles; non-cationic non-viral agents such as non-cationic liposomes, polymers or non-cationic nanoparticles.

Selon un mode préféré, les compositions selon l'invention comprennent un vecteur recombinant défectif comprenant un gène codant pour un facteur de croissance des cellules endothéliales et sont formulées pour une administration intratrachéale. According to a preferred embodiment, the compositions according to the invention comprise a defective recombinant vector comprising a gene coding for a growth factor of endothelial cells and are formulated for intratracheal administration.

Avantageusement, les compositions de l'invention comprennent de 104 à 1014 pfu, et de préférence de 106 à 1010 pfu. Advantageously, the compositions of the invention comprise from 104 to 1014 pfu, and preferably from 106 to 1010 pfu.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un médicament utile pour la prévention, l'amélioration et/ou le traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire caractérisé en ce que l'on mélange un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant pour un facteur de croissance avec un ou plusieurs adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. A subject of the invention is also a process for preparing a medicament useful for the prevention, improvement and / or treatment of pulmonary arterial hypertension, characterized in that a recombinant vector comprising a coding nucleic acid is mixed for a growth factor with one or more compatible and pharmaceutically acceptable adjuvants.

L'invention concerne également une méthode de traitement d'un mammifère, et notamment de l'homme, présentant une hypertension artérielle pulmonaire comprenant l'administration d'une quantité efficace d'un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant pour un facteur de croissance des cellules endothéliales. The invention also relates to a method of treating a mammal, and in particular a man, exhibiting pulmonary arterial hypertension comprising the administration of an effective amount of a recombinant vector comprising a nucleic acid coding for a growth factor. endothelial cells.

La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent qui doivent être considérés comme illustratifset non limitatifs. The present invention will be described in more detail with the aid of the following examples which should be considered as illustrative and not limiting.

LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : du plasmide pXL3264 généré par double recombinaison à partir des plasmides pXL3208 et pXL3215 selon la méthode décrite par Crouzet et al (PNAS vol 94 pl414, 1997). Le plasmide pXL3264 contient le génome d'un adénovirus de type 5 délété pour la région El et E3 et contient la cassette d'expression CMV-spFGFl-SV40. LEGENDS TO THE FIGURES Figure 1: of the plasmid pXL3264 generated by double recombination from the plasmids pXL3208 and pXL3215 according to the method described by Crouzet et al (PNAS vol 94 pl414, 1997). Plasmid pXL3264 contains the genome of a type 5 adenovirus deleted for the E1 and E3 region and contains the expression cassette CMV-spFGF1-SV40.

Figure 2 : du vecteur pXL3179. Le plasmide pXL3179 est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/10343) dans lequel le gène codant pour une fusion entre le peptide signal de l'interféron de fibroblastes humain et l'ADNc du FGF1 (Fibroblast Growth Factorl) (sp-FGFl, Jouanneau et al., 1991 PNAS 88:2893- 2897) a été introduit sous contrôle du promoteur provenant de la région précoce du cytomegalovirus humain (hCMV IE) et du signal de poly-adénylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG). Figure 2: of the vector pXL3179. The plasmid pXL3179 is a vector derived from the plasmid pXL2774 (WO97 / 10343) in which the gene coding for a fusion between the signal peptide of human fibroblast interferon and the cDNA of FGF1 (Fibroblast Growth Factorl) (sp-FGFl, Jouanneau et al., 1991 PNAS 88: 2893-2897) was introduced under the control of the promoter originating from the early region of the human cytomegalovirus (hCMV IE) and of the polyadenylation signal from the late region of the SV40 virus (Genbank SV4CG) .

Figure 3 :représentation du vecteur pXL3636 et pXL3637. Ces vecteurs ont une structure comparable au plasmide pXL3208 et comprennent respectivement une séquence codant pour VEGF-B 167 (pXL3636) et VEGF-B 186 (pXL3637) en lieu et place du sp-FGF-1 (pXL3208, figure 1). Figure 3: representation of the vector pXL3636 and pXL3637. These vectors have a structure comparable to the plasmid pXL3208 and respectively comprise a sequence coding for VEGF-B 167 (pXL3636) and VEGF-B 186 (pXL3637) in place of sp-FGF-1 (pXL3208, FIG. 1).

MATERIEL ET METHODES
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982 ; F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987. MATERIAL AND METHODS
General molecular biology techniques
Classically used methods in molecular biology such as preparative extractions of plasmid DNA, centrifugation of plasmid DNA in cesium chloride gradient, electrophoresis on agarose or acrylamide gels, purification of DNA fragments by electroelution, the extraction of proteins with phenol or phenol-chloroform, the precipitation of DNA in a saline medium with ethanol or isopropanol, the transformation in Escherichia coli, etc. are well known in the art. skilled in the art and are abundantly described in the literature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982; FM et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987.

Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. For the ligations, the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.

Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI. The filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications. The destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations. The destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.

La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.

L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350- 1354 ; Mullis K.B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. The enzymatic amplification of DNA fragments by the technique called PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] can be performed using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's specifications.

La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham. Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.

Exemple 1 : Construction d'adénovirus recombinants exprimant la protéine FGF-1. Example 1: Construction of recombinant adenoviruses expressing the FGF-1 protein.

Cet exemple décrit la construction d'un vecteur adénoviral portant le gène codant pour la protéine FGF-1 opérationnellement lié au promoteur CMV. This example describes the construction of an adenoviral vector carrying the gene coding for the protein FGF-1 operably linked to the CMV promoter.

L'ADNc humain codant pour le FGF-1 humain comporte 490 paires de bases et code pour un polypeptide de 154 acides aminés nommé également ECGF(3 pour beta-endothelial cell growth factor . Il existe deux polypeptides naturels dérivés de la forme ECGFss par un mécanisme de maturation post-traductionnel, il s'agit du FGF The human cDNA coding for human FGF-1 comprises 490 base pairs and codes for a polypeptide of 154 amino acids also called ECGF (3 for beta-endothelial cell growth factor. There are two natural polypeptides derived from the ECGFss form by a post-translational maturation mechanism, this is the FGF

acide (acidic FGF : aa 15 à 154) et de l'ECGFa (alpha-endothelial cell growth factor; aa 21 à 154) ou FGF-1. acid (acidic FGF: aa 15 to 154) and ECGFa (alpha-endothelial cell growth factor; aa 21 to 154) or FGF-1.

La forme de FGF-1 (sp-FGF-1) présente dans l'adénovirus décrit ci-après est en fait une protéine de fusion entre le FGF-1 (aa 21-154) et un peptide signal de l'interféron beta humain décrite par Jouanneau et al (P.N.A.S. (1991) 88 : 2893 - 2897). The form of FGF-1 (sp-FGF-1) present in the adenovirus described below is in fact a fusion protein between FGF-1 (aa 21-154) and a signal peptide of human beta interferon described by Jouanneau et al (PNAS (1991) 88: 2893-2897).

L'expression du sp-FGF-1 est sous le contrôle de l'enhancer/promoteur du cytomégalovirus (CMV, nucléotides-522 à +72) (Boshart et al. 1985, Cell, 41 : 521 - 530). Le site de polyadénylation du virus SV40 (nucléotides 2538 à 2759 d'après génome de SV40, Genbank locus SV4CG) est inséré dans le sens tardif en 3' de l'ADNc du sp-FGF-1. L'ensemble formé par (i) l'enhancer/promoteur du cytomégalovirus , (ii) l'ADNc du sp-FGF-1 et (iii), le site de polyadénylation du virus SV40 est appelé ci-après la cassette d'expression de FGF-1. The expression of sp-FGF-1 is under the control of the cytomegalovirus enhancer / promoter (CMV, nucleotides-522 to +72) (Boshart et al. 1985, Cell, 41: 521-530). The polyadenylation site of the SV40 virus (nucleotides 2538 to 2759 according to the SV40 genome, Genbank locus SV4CG) is inserted late 3 ′ of the sp-FGF-1 cDNA. The assembly formed by (i) the enhancer / promoter of the cytomegalovirus, (ii) the sp-FGF-1 cDNA and (iii), the polyadenylation site of the SV40 virus is called the expression cassette below. of FGF-1.

L'adénovirus a été construit selon la méthode décrite par Crouzet et al (PNAS vol 94 pl414, 1997) par recombinaison homologue entre le plasmide pXL3208 et le plasmide pXL3215. Le plasmide pXL3215 contient le génome d'un adénovirus contenant une cassette RSV-LacZ insérée dans sa région El. Le principe de la construction est décrit dans la figure 1. Le plasmide pXL3264 généré par cette double recombinaison contient le génome d'un adénovirus de type 5 délété pour la région El et E3 et contenant la cassette d'expression CMV-spFGFl-SV40. Cette construction est vérifiée par séquençage de la cassette d'expression de FGF-1. The adenovirus was constructed according to the method described by Crouzet et al (PNAS vol 94 pl414, 1997) by homologous recombination between the plasmid pXL3208 and the plasmid pXL3215. The plasmid pXL3215 contains the genome of an adenovirus containing an RSV-LacZ cassette inserted in its E1 region. The principle of the construction is described in FIG. 1. The plasmid pXL3264 generated by this double recombination contains the genome of an adenovirus of type 5 deleted for the E1 and E3 region and containing the CMV-spFGF1-SV40 expression cassette. This construction is verified by sequencing the FGF-1 expression cassette.

L'adénovirus AV1.0 CMV-FGF1 est généré par transfection de l'ADN de pXL3264 digéré par Pacl dans la lignée 293 (ATCC CRL-1573). Les particules virales obtenues sont ensuite amplifiées dans cette même lignée et des stocks de virus produits par double gradient de CsCI. The adenovirus AV1.0 CMV-FGF1 is generated by transfection of the DNA of pXL3264 digested with Pacl in line 293 (ATCC CRL-1573). The viral particles obtained are then amplified in this same line and stocks of viruses produced by double gradient of CsCI.

Les particules virales sont ensuite utilisées pour étudier l'expression du gène spFGFl humain dans des cellules C2C12, des cellules myoblastiques de souris (ATCC The viral particles are then used to study the expression of the human spFGF1 gene in C2C12 cells, mouse myoblastic cells (ATCC

CRL-1772) ou les cellules W162 (Weinberg D. H. and Ketner G. A. 1983, PNAS 80 : 5383 - 5386). CRL-1772) or W162 cells (Weinberg D. H. and Ketner G. A. 1983, PNAS 80: 5383 - 5386).

Un Northern-blot est pratiqué sur les cellules W162 après infection à des MOI croissantes de 100 à 3000 particules virales (pv)/cellule ou transfection des cellules en présence de lipofectamine (Gibco-BRL) avec le plasmide pXL3179 qui contient la même cassette d'expression de FGF-1 comme contrôle. Le plasmide pXL3179 est représenté sur la figure 2. A Northern-blot is performed on W162 cells after infection with increasing MOIs of 100 to 3000 viral particles (pv) / cell or transfection of the cells in the presence of lipofectamine (Gibco-BRL) with the plasmid pXL3179 which contains the same cassette d expression of FGF-1 as a control. Plasmid pXL3179 is shown in Figure 2.

Un Westem-blot a été pratiqué sur des cellules C2C12 après infection à des MOI de 30 à 3000 et récolte des surnageant après 48 h. Le FGF1 est révélé par un anticorps anti-FGFl polyclonal de lapin purifié suivi par un anticorps anti lapin de chèvre conjugé à la peroxidase. L'activité peroxydase est ensuite révélé par chemiluminescence (ECL, Amersham) et détectée sur un Lumi-Imager (Roche diagnostics). A Westem-blot was performed on C2C12 cells after infection with MOIs from 30 to 3000 and harvesting of supernatants after 48 h. FGF1 is revealed by a purified polyclonal rabbit anti-FGF1 antibody followed by an anti goat rabbit antibody conjugated to peroxidase. The peroxidase activity is then revealed by chemiluminescence (ECL, Amersham) and detected on a Lumi-Imager (Roche diagnostics).

Le surnageant de culture des cellules C2C12 est utilisé pour vérifier que la forme exprimée du FGF est biologiquement active. Des dilutions sérielles (1/200 et 1/50) de ce surnageant ont ensuite été ajoutées à des cultures de cellules NIH 3T3. L'effet trophique sur ces cultures a été observé par incorporation de thymidine radiom arquée."
L'ensemble des résultats obtenus confirme que l'adénovirus AV1.0 CMVFGF1 exprime une forme biologiquement active de FGF-1. The culture supernatant of C2C12 cells is used to verify that the expressed form of FGF is biologically active. Serial dilutions (1/200 and 1/50) of this supernatant were then added to cultures of NIH 3T3 cells. The trophic effect on these cultures was observed by incorporation of radiolucent thymidine. "
All the results obtained confirm that the adenovirus AV1.0 CMVFGF1 expresses a biologically active form of FGF-1.

Exemple 2 : Construction d'adénovirus recombinants exprimant la protéine VEGF-B
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur adénoviral portant le gène codant pour la protéine VEGF-B opérationnellement lié au promoteur CMV. Example 2 Construction of Recombinant Adenoviruses Expressing the VEGF-B Protein
This example describes the construction of an adenoviral vector carrying the gene coding for the VEGF-B protein operably linked to the CMV promoter.

Il existe deux formes du VEGF-B humain : VEGF-B167 et VEFG-B186 ,dont les séquences nucléotidiques correspondantes sont accessibles sous les références HSU48801 (VEGF-B167) et HSU43368 (VEFG-B186 ) dans GenBank. There are two forms of human VEGF-B: VEGF-B167 and VEFG-B186, the corresponding nucleotide sequences of which are available under the references HSU48801 (VEGF-B167) and HSU43368 (VEFG-B186) in GenBank.

Les adénovirus AV1.0-CMV-VEGF-B,67 et AV1.0-CMV- VEFG-B186 ont été construits de manière similaire au vecteur AV1.0-CMV-spFGF-1 à partir des vecteurs pXL3636 et pXL3637 (figure 3). L'expression du VEGF-Bi67 ou du VEFG-B,86 est placée sous le contrôle de l'enhancer/promoteur du cytomégalovirus (CMV, nucléotides-522 à +72) (Boshart et al. 1985, Cell, 41 : 521 - 530). Le site de polyadénylation du virus SV40 (nucléotides 2538 à 2759 d'après génome de SV40, Genbank locus SV4CG) est inséré dans le sens tardif en 3' de l'ADNc du VEGF-B167 ou du VEFG-BI86
L'adénovirus a été construit selon la méthode décrite par Crouzet et al (PNAS vol 94 pl414, 1997) par recombinaison homologue entre le plasmide pXL3636 (VEGF-B167) et le plasmide pXL3215 ou le plasmide pXL3637 (VEFG-Bi86) et le plasmide pXL3215. Le plasmide pXL3215 contient le génome d'un adénovirus contenant une cassette RSV-LacZ insérée dans sa région El. Le principe de la construction est décrit dans la figure 1. The adenoviruses AV1.0-CMV-VEGF-B, 67 and AV1.0-CMV-VEFG-B186 were constructed in a similar manner to the vector AV1.0-CMV-spFGF-1 from the vectors pXL3636 and pXL3637 (FIG. 3 ). The expression of VEGF-Bi67 or VEFG-B, 86 is placed under the control of the enhancer / promoter of the cytomegalovirus (CMV, nucleotides-522 to +72) (Boshart et al. 1985, Cell, 41: 521 - 530). The polyadenylation site of the SV40 virus (nucleotides 2538 to 2759 according to the SV40 genome, Genbank locus SV4CG) is inserted late 3 'to the cDNA of VEGF-B167 or VEFG-BI86
The adenovirus was constructed according to the method described by Crouzet et al (PNAS vol 94 pl414, 1997) by homologous recombination between the plasmid pXL3636 (VEGF-B167) and the plasmid pXL3215 or the plasmid pXL3637 (VEFG-Bi86) and the plasmid pXL3215. The plasmid pXL3215 contains the genome of an adenovirus containing an RSV-LacZ cassette inserted in its E1 region. The principle of the construction is described in FIG. 1.

Le plasmide généré par cette double recombinaison contient le génome d'un adénovirus de type 5 délété pour la région El et E3 et contenant soit la cassette d'expression CMV- VEGF-B167-SV40, soit la cassette d'expression CMV- VEGFB186-SV40. The plasmid generated by this double recombination contains the genome of a type 5 adenovirus deleted for the E1 and E3 region and containing either the CMV-VEGF-B167-SV40 expression cassette or the CMV-VEGFB186- expression cassette. SV40.

Les adénovirus AV1.0-CMV-VEGF-Bi67 et AV1.0-CMV- VEFG-B186 sont générés par transfection des plasmides générés par la double recombinaison digérés par PacI dans la lignée 293 (ATCC CRL-1573). Les particules virales obtenues sont ensuite amplifiées dans cette même lignée et des stocks de virus produits par double gradient de CsCl. The adenoviruses AV1.0-CMV-VEGF-Bi67 and AV1.0-CMV-VEFG-B186 are generated by transfection of the plasmids generated by the double recombination digested by PacI in line 293 (ATCC CRL-1573). The viral particles obtained are then amplified in this same line and stocks of viruses produced by double gradient of CsCl.

Exemple 3 : transfert intrapulmonaire de AV 1. 0 CMV-FGF1 chez le rat. Example 3: Intrapulmonary transfer of AV 1.0 CMV-FGF1 in rats.

Cet exemple décrit le transfert du gène codant pour le FGF-1 humain chez le rat avec le vecteur AV1.0 CMV-FGF1 décrit ci-avant. Un adénovirus recombinant identique mais ne contenant pas la cassette d'expression du FGF-1 (AV 1. 0 CMV.Null) a été utilisé chez les animaux contrôles. This example describes the transfer of the gene coding for human FGF-1 in rats with the vector AV1.0 CMV-FGF1 described above. An identical recombinant adenovirus but not containing the FGF-1 expression cassette (AV 1.0 CMV.Null) was used in the control animals.

Des rats Wistars mâles d'un mois d'âge (200-250 gr) sont répartis de façon aléatoire en deux groupes. Après anesthésie par injection intrapéritonéale d'un mélange de Kétamine (100 mg/kg) et Xylasine (2 mg/kg), ils reçoivent soit le vecteur AV1.0 CMV-FGF1 soit le vecteur contrôle AV1.0 CMV.Null en instillation intratrachéale à la dose de 108 pfu (dilués dans du PBS pour un volume final de 150 l). Cette dose a été choisie après une étude dose-réponse comprenant un dosage ELISA de la protéine FGF-1 dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire et dans le sérum des animaux. 48 heures après l'administration du virus, les animaux sont exposés à un mélange gazeux hypoxique (Fio2 10%) dans des conditions normobariques (armoire Flufrance, Cachan, France) pour une durée de 15 jours. One month old male Wistar rats (200-250 g) are randomly divided into two groups. After anesthesia by intraperitoneal injection of a mixture of Ketamine (100 mg / kg) and Xylasine (2 mg / kg), they receive either the vector AV1.0 CMV-FGF1 or the control vector AV1.0 CMV.Null in intratracheal instillation at a dose of 108 pfu (diluted in PBS for a final volume of 150 l). This dose was chosen after a dose-response study comprising an ELISA assay of the protein FGF-1 in the bronchoalveolar lavage fluid and in the serum of the animals. 48 hours after the administration of the virus, the animals are exposed to a hypoxic gas mixture (Fio2 10%) under normobaric conditions (Flufrance cabinet, Cachan, France) for a period of 15 days.

Exemple 4 : intrapulmonaire de AV1.0-CMV-VEGF-B167 et AV1.0-CMV- VEFG-B,86 chez le rat. Example 4: intrapulmonary of AV1.0-CMV-VEGF-B167 and AV1.0-CMV-VEFG-B, 86 in rats.

Le transfert intrapulmonaire de AV1.0-CMV-VEGF-B167 et AV1.0-CMVVEFG-B186 chez le rat a été réalisé dans des conditions identiques à celles décrites à l'exemple 3. Un adénovirus recombinant ne contenant pas la cassette d'expression du VEGF-B (AV 1.0 CMV.Null) a été utilisé chez les animaux contrôles. The intrapulmonary transfer of AV1.0-CMV-VEGF-B167 and AV1.0-CMVVEFG-B186 in rats was carried out under conditions identical to those described in Example 3. A recombinant adenovirus not containing the cassette VEGF-B expression (AV 1.0 CMV.Null) was used in the control animals.

Exemple 5 : de l'efficacité du transfert intrapulmonaire du gène codant pour le VEGF-B humain chez le rat. Example 5: of the efficiency of the intrapulmonary transfer of the gene coding for human VEGF-B in the rat.

L'évaluation a lieu après 15 jours d'exposition à l'hypoxie selon les critères énumérés ci-dessous. The evaluation takes place after 15 days of exposure to hypoxia according to the criteria listed below.

a - Evaluation de l'efficacité de transduction par le dosage (ELISA) de la protéine FGF-1 dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire. b - Evaluation de l'HTAP par étude hémodynamique par cathétérisme cardiaque sous anesthésie, avec mesure de la pression artérielle pulmonaire, pression artérielle systémique et fréquence cardiaque. c - Evaluation de l'hypertrophie ventriculaire droite par le calcul de l'index de Fulton : poids du ventricule droit/ poids du ventricule gauche + septum d - Etude histologique et histomorphométrique des poumons avec évaluation du degré de la muscularisation des artérioles pulmonaires au niveau alvéolaire et canal alvéolaire (diamètre < 200p.m). a - Evaluation of the transduction efficiency by the assay (ELISA) of the protein FGF-1 in the bronchoalveolar lavage fluid. b - Assessment of PAH by hemodynamic study by cardiac catheterization under anesthesia, with measurement of pulmonary arterial pressure, systemic arterial pressure and heart rate. c - Evaluation of right ventricular hypertrophy by calculating the Fulton index: weight of the right ventricle / weight of the left ventricle + septum d - Histological and histomorphometric study of the lungs with evaluation of the degree of muscularization of the pulmonary arterioles at the level alveolar and alveolar canal (diameter <200 p.m).

2 a - Efficacité de la transduction
Le dosage ELISA de la protéine VEGF-B humaine est réalisé dans le sérum et le liquide broncoalvéolaire (LBA) des animaux après 15 jours d'exposition à l'hypoxie. 2 a - Efficiency of transduction
The ELISA assay of the human VEGF-B protein is carried out in the serum and the broncoalveolar liquid (LBA) of the animals after 15 days of exposure to hypoxia.

Le facteur VEGF-B n'est retrouvé dans le sérum d'aucun des animaux contrôle quelque soit les conditions appliquées {le. avec ou sans hypoxie). De même, la concentration de VEGF-B est nulle dans le LBA des animaux traités par les vecteurs adénovirus recombinants défectifs codant pour VEGF-B (forme 167 ou forme 186). The factor VEGF-B is not found in the serum of any of the control animals whatever the conditions applied to it. with or without hypoxia). Likewise, the concentration of VEGF-B is zero in the LBA of animals treated with defective recombinant adenovirus vectors encoding VEGF-B (form 167 or form 186).

2b - Evaluation de l'HTAP
L'évaluation de l'HTAP est réalisée par étude hémodynamique par cathétérisme cardiaque sous anesthésie, avec mesure de la pression artérielle pulmonaire, pression artérielle systémique et fréquence cardiaque. 2b - Assessment of PAH
The evaluation of PAH is carried out by hemodynamic study by cardiac catheterization under anesthesia, with measurement of the pulmonary arterial pressure, systemic arterial pressure and heart rate.

Le poids corporel est identique dans les deux groupes de rats 15 jours après le début d'exposition à l'hypoxie. Les rats traités par AV1.0 CMV.VEGF-B167 ou AV1.0 CMV-VEGF,86 ont une pression artérielle pulmonaire significativement moins élevée que les rats ayant reçu l'AdCMV.Null, alors que la pression artérielle systémique et la The body weight is identical in the two groups of rats 15 days after the start of exposure to hypoxia. Rats treated with AV1.0 CMV.VEGF-B167 or AV1.0 CMV-VEGF, 86 have significantly lower pulmonary arterial pressure than rats given AdCMV.Null, while systemic blood pressure and

fréquence cardiaque ne sont pas significativement différentes entre les deux groupes (traités et contrôle). heart rates were not significantly different between the two groups (treated and control).

Ces résultats montrent que le transfert de gène codant pour le VEGF-B permet de prévenir de manière très efficace l'augmentation de la pression artérielle liée à l'hypoxie. These results show that the transfer of the gene encoding VEGF-B very effectively prevents the increase in blood pressure linked to hypoxia.

2 c - Evaluation de l'hypertrophie ventriculaire droite
L'hypertrophie ventriculaire droite est évaluée par le rapport du poids du ventricule droit sur le poids du ventricule gauche + septum. 2 c - Evaluation of right ventricular hypertrophy
Right ventricular hypertrophy is evaluated by the ratio of the weight of the right ventricle to the weight of the left ventricle + septum.

Les résultats obtenus montrent que l'hypertrophie ventriculaire droite est significativement plus importante chez les rats ayant reçu AV 1. 0 CMV. Null que chez ceux traités par AV1.0 CMV.VEGF-B167 ou AV1.0 CMV-VEGF186'
2 d - Etude histologique des poumons
L'étude histologique des poumons montre qu'à la dose de 108 pfu, les lésions inflammatoires sont très limitées :absence d'oedème et d'hémorragie, absence de lésions des épithéliums bronchiques ou alvéolaires. Il est souvent observé un granulome interstitiel à dominante macrophagique et ceci, quelque soit le traitement administré. The results obtained show that the right ventricular hypertrophy is significantly greater in the rats having received AV 1.0 CMV. Null than in those treated with AV1.0 CMV.VEGF-B167 or AV1.0 CMV-VEGF186 '
2 d - Histological study of the lungs
The histological study of the lungs shows that at a dose of 108 pfu, the inflammatory lesions are very limited: absence of edema and hemorrhage, absence of lesions of the bronchial or alveolar epithelia. A macrophagic-dominant interstitial granuloma is often observed, regardless of the treatment administered.

L'étude histomorphométrique des poumons est réalisée selon deux critères (i) l'étude de l'épaisseur de la paroi artérielle (artérioles de diamètre < 200 m) normalisée à la taille de l'artère et (ii), l'étude de pourcentage d'artères non muscularisées, partiellement muscularisées ou complètement muscularisées au niveau alvéolaire et canal alvéolaire. The histomorphometric study of the lungs is carried out according to two criteria (i) the study of the thickness of the arterial wall (arterioles of diameter <200 m) normalized to the size of the artery and (ii), the study of percentage of non-muscularized, partially muscularized or completely muscularized arteries at the alveolar and alveolar canal level.

L'épaisseur de la paroi artérielle est déterminée et les résultats obtenus montrent que l'épaisseur de la paroi artérielle normalisée à la taille de l'artère est The thickness of the arterial wall is determined and the results obtained show that the thickness of the arterial wall normalized to the size of the artery is

significativement plus faible chez les rats ayant reçu le vecteur AV 1. 0 CMV.VEGF-B que chez ceux traités par AV1.0 CMV.Null. significantly lower in rats given the AV 1.0 CMV.VEGF-B vector than in those treated with AV1.0 CMV.Null.

Le pourcentage d'artères non muscularisées, partiellement muscularisées ou complètement muscularisées au niveau alvéolaire et canal alvéolaire a été déterminé et les résultats obtenus montrent que le pourcentage d'artères non muscularisées aussi bien au niveau alvéolaire que au niveau du canal alvéolaire est significativement plus importante chez les rats traités par les vecteurs adénovirus recombinants défectifs codant pour VEGF-B. The percentage of non-muscularized, partially muscularized or completely muscularized arteries at the alveolar and alveolar canal level has been determined and the results obtained show that the percentage of non muscularized arteries as well at the alveolar level as at the level of the alveolar canal. in rats treated with defective recombinant adenovirus vectors encoding VEGF-B.

Ces résultats démontrent clairement que la surexpression dans les poumons d'un facteur de croissance des cellules endothéliales tel que le. VEGF-B a un effet protecteur contre le développement de l'HTAP hypoxique. These results clearly demonstrate that overexpression in the lungs of an endothelial cell growth factor such as. VEGF-B has a protective effect against the development of hypoxic PAH.

Exemple 6 : évaluation de l'efficacité du transfert intrapulmonaire du gène de FGF-1 humain chez le rat. Example 6: Evaluation of the efficiency of the intrapulmonary transfer of the human FGF-1 gene in the rat.

L'évaluation a lieu après 15 jours d'exposition à l'hypoxie selon les critères énumérés ci-dessous. a - Evaluation de l'efficacité de transduction par le dosage (ELISA) de la protéine FGF-1 dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire. b - Evaluation de l'HTAP par étude hémodynamique par cathétérisme cardiaque sous anesthésie, avec mesure de la pression artérielle pulmonaire, pression artérielle systémique et fréquence cardiaque. c - Evaluation de l'hypertrophie ventriculaire droite par le calcul de l'index de Fulton : poids du ventricule droit/ poids du ventricule gauche + septum d - Etude histologique et histomorphométrique des poumons avec évaluation du degré de la muscularisation des artérioles pulmonaires au niveau alvéolaire et canal alvéolaire (diamètre < 200 m). The evaluation takes place after 15 days of exposure to hypoxia according to the criteria listed below. a - Evaluation of the transduction efficiency by the assay (ELISA) of the protein FGF-1 in the bronchoalveolar lavage fluid. b - Assessment of PAH by hemodynamic study by cardiac catheterization under anesthesia, with measurement of pulmonary arterial pressure, systemic arterial pressure and heart rate. c - Evaluation of right ventricular hypertrophy by calculating the Fulton index: weight of the right ventricle / weight of the left ventricle + septum d - Histological and histomorphometric study of the lungs with evaluation of the degree of muscularization of the pulmonary arterioles at the level alveolar and alveolar duct (diameter <200 m).

Les résultats obtenus montrent que la surexpression dans les poumons d'un facteur de croissance des cellules endothéliales tel que le FGF-1 a un effet protecteur contre le développement de l'HTAP hypoxique. The results obtained show that the overexpression in the lungs of an endothelial cell growth factor such as FGF-1 has a protective effect against the development of hypoxic PAH.

Claims

1. Use of a vector comprising a nucleic acid encoding an angiogenic factor for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the prevention, improvement and / or treatment of pulmonary arterial hypertension.

2. Use according to claim 1, characterized in that the angiogenic factor is a growth factor for endothelial cells chosen from the family of FGF or VEGF.

3. Use according to claim 2, characterized in that the endothelial cell growth factor is chosen from FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5, or their variants.

4. Use according to claim 2, characterized in that the growth factor of endothelial cells is chosen from VEGF, VEGF-B or VEGF-C or their variants.

5. Use according to one of claims 1 to 4, characterized in that the vector is a plasmid, a cosmid or any DNA not encapsidated by a virus.

6. Use according to one of claims 1 to 4 characterized in that the vector is a recombinant virus, preferably derived from an adenovirus, a retrovirus, a herpes virus or an adeno virus -associated.

7. Use according to claim 6, characterized in that the recombinant virus is a defective recombinant adenovirus.

8. Use according to claim 6 for the preparation of a pharmaceutical composition intended for administration by the intratracheal route comprising from 104 to 1014 pfu, and preferably from 106 to 1010 pfu.

9. A method of preparing a medicament useful for the prevention, improvement and / or treatment of pulmonary arterial hypertension, characterized in that a recombinant vector comprising a nucleic acid coding for an angiogenic factor is mixed with a or more compatible and pharmaceutically acceptable adjuvants.

10. Pharmaceutical composition comprising a defective recombinant vector comprising a nucleic acid coding for an angiogenic factor characterized in that it is formulated for intratracheal administration.

11. Pharmaceutical composition according to claim 10, characterized in that it comprises from 104 to 1014 pfu, and preferably from 106 to 1010 pfu.