FR2791362A1

FR2791362A1 - Procede de detection des bacteries sulfato-reductrices

Info

Publication number: FR2791362A1
Application number: FR9903637A
Authority: FR
Inventors: Michel Magot; Gilles Ravot
Original assignee: Elf Exploration Production SAS
Current assignee: Elf Exploration Production SAS
Priority date: 1999-03-24
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2000-09-29
Anticipated expiration: 2019-03-24
Also published as: FR2791362B1; NO20001490L; NO20001490D0; GB2354072B; GB2354072A; GB0006971D0; US6531281B1

Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection des bactéries sulfato-réductrices dans un échantillon susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant l'extraction de l'ADN ou de l'ARN dudit échantillon et la détection d'au moins un fragment du gène de l'APS-réductase ou d'au moins un fragment de l'ARNm transcrit à partir du gène de l'APS-réductase, indicateur de la présence de bactéries sulfato-réductrices dans ledit échantillon.

Description

La présente invention concerne un procédé de détection et dénombrement des bactéries sulfato-réductrices.

Les bactéries sulfato-réductrices (BSR) utilisent le sulfate comme accepteur d'électrons en anaérobiose, via la respiration anaérobie des sulfates (réduction énergétique), pour produire des sulfures tout en récupérant lors de cette réduction l'énergie nécessaire à leur croissance. Cette caractéristique métabolique constitue le point commun de ces organismes, quelle que soit leur position phylogénétique (Legall & Fauques, 1988).

Ces bactéries sont reconnues comme étant les principaux microorganismes responsables de la formation biologique d'hydrogène sulfuré (H2S). Cet H2S d'origine biologique en particulier, et le métabolisme des bactéries sulfato-réductrices en général, engendrent de nombreux problèmes pour les industriels comme la corrosion biologique de l'acier d'une part et le risque potentiel pour le personnel d'autre part (Postgate, 1979). Dans l'industrie pétrolière, outre les effets pernicieux cités ci-dessus, les bactéries sulfato-réductrices sont également impliquées dans l'altération de la qualité des pétroles bruts (Cord-Ruwich et al., 1987). La détection de ces bactéries sulfurogènes constitue donc un enjeu majeur pour la lutte contre la production d'H2S dans un grand nombre d'activités industrielles (Tatnall et al., 1988).

Des techniques de culture microbienne appliquées à la détection et au dénombrement de ces microorganismes ont été développées (API, 1982; Magot et al., 1988; Scott & Davies, 1992). Ces méthodes nécessitent un temps d'incubation de 10 à 21 jours et sont donc mal adaptées au suivi des contaminations de fluides en temps réel. Des méthodes alternatives permettant une mesure rapide du taux de contamination ont également été mises au point comme, par exemple, le Rapid CheckTM de Conocco, basé sur l'immunodétection de l'APS réductase (Horacek & Gawell, 1988, EP 272 916), ou l' "Hydrogénase testTM" (Caproco), qui détecte l'activité des hydrogénases, enzymes présentes chez les BSR mais non spécifiques de ces organismes (Scott & Davies, 1992).

Néanmoins, aucune de ces méthodes n'est suffisamment sensible ou spécifique.

Les auteurs de la présente invention ont mis au point un procédé de détection et dénombrement des bactéries sulfato-réductrices qui réunit ces deux avantages : sensibilité et spécificité et qui allie en outre rapidité et fiabilité. Ils se sont à cette fin intéressés à la voie de réduction énergétique des sulfates et plus précisément à celle de l'APS-réductase.

L'APS-réductase (ou Adenylylsulfate réductase) qui permet la réduction de l'adénosine phosphosulfate (APS) (produit de l'activation du sulfate par l'ATP sulfurylase), est une enzyme cytoplasmique à deux sous-unités (a et ss) connue pour n'intervenir que dans la respiration anaérobie du sulfate (Legall & Fauques, 1988). Cette enzyme n'est donc pas

présente dans des organismes non sulfato-réducteurs puisqu'elle n'intervient pas dans la réduction assimilatrice qui permet l'incorporation du soufre dans diverses molécules nécessaires à la vie telles que les amino-acides et les vitamines.

Sur la base de deux séquences du gène codant pour cette enzyme déposées dans les banques de données, l'une provenant d'un organisme du domaine des Bacteria (Desulfovibrio vulgaris, em~ba: Z69372) et l'autre du domaine des Archaea (Archaeoglobus fulgidus : em~ba: X63435), les auteurs de la présente invention ont pu amplifier et séquencer divers gènes codant pour l'APS-réductase. De manière surprenante, ils ont constaté que ce gène est remarquablement bien conservé alors que la diversité phylogénétique des organismes étudiés ne pouvait a priori pas le laisser penser. Ce résultat a ouvert la perspective d'utiliser ce gène comme cible pour la détection spécifique des bactéries sulfato-réductrices, notamment du domaine des Bacteria.

La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins une séquence nucléotidique hybridant spécifiquement avec un fragment du gène de l'APS-réductase ou un fragment de l'ARNm transcrit à partir du gène de l'APS-réductase pour détecter la présence de bactéries sulfato-réductrices dans un échantillon.

La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de détection spécifique, qualitative ou quantitative des bactéries sulfato-réductrices dans un échantillon susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant l'extraction de l'ADN ou de l'ARN dudit échantillon et la détection d'au moins un fragment du gène de l'APSréductase ou un fragment de l'ARNm transcrit à partir du gène de l'APS-réductase, indicateur de la présence de bactéries sulfato-réductrices dans ledit échantillon.

L'extraction de l'ADN ou de l'ARN dudit échantillon peut être réalisée par des techniques standards bien connues de l'homme du métier.

Plus particulièrement, la détection d'au moins un fragment du gène de l'APS-réductase comprend l'amplification génique spécifique d'au moins un fragment du gène de la sousunité a de l'APS-réductase. De manière avantageuse, les produits de l'amplification génique peuvent en outre être soumis à une hybridation avec une sonde spécifique dudit fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase, ladite sonde étant marquée de manière détectable.

Selon un autre mode de réalisation, la détection d'au moins un fragment du gène de l'APS-réductase comprend l'hybridation de l'ADN extrait avec une sonde spécifique dudit fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase, ladite sonde étant marquée de manière détectable.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend l'extraction de l'ARN d'un échantillon susceptible de contenir des bactéries sulfato-réductrices et la détection d'au moins un fragment de l'ARNm transcrit à partir du gène de l'APSréductase.

Dans ce cas, la détection peut être réalisée par hybridation directe d'une sonde nucléotidique spécifique marquée de manière détectable avec l'ARNm extrait, et/ou par amplification spécifique de l'ARNm codant pour l'APS-réductase, notamment par RT-PCR (transcription inverse suivie d'une réaction en chaîne par polymérase).

La présente invention a également pour objet un oligonucléotide ayant une séquence nucléotidique essentiellement identique à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n 1 à 25. Un tel oligonucléotide est notamment utile comme amorce pour amplifier un fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase, ou comme sonde hybridant avec un fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase ou le produit d'amplification de celui-ci.

De manière préférentielle, on peut utiliser comme amorce un oligonucléotide ayant une séquence essentiellement identique à l'une des séquences SEQ ID n 11 à 18, et comme sonde un oligonucléotide ayant une séquence essentiellement identique à l'une des séquences SEQ ID n 19 à 25.

Par "essentiellement identique", on entend que la séquence de l'oligonucléotide est identique à l'une des séquences SEQ ID n 1 à 25 ou qu'elle diffère de l'une de ces séquences sans affecter la capacité d'hybridation de ces séquences au gène de la sousunité a de l'APS-réductase. Une séquence "essentiellement identique" à l'une des séquences SEQ ID n 1 à 25 peut notamment différer de celle-ci par une substitution d'une ou plusieurs bases ou par délétion d'une ou plusieurs bases localisées aux extrémités de l'oligonucléotide, ou encore par addition d'une ou plusieurs bases aux extrémités de l'oligonucléotide. De manière préférentielle un tel oligonucléotide a une taille minimale de 10 nucléotides, préférentiellement d'au moins 14 nucléotides.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de détection des bactéries sulfato-réductrices dans un échantillon susceptible d'en contenir selon l'invention, comprend avantageusement les étapes consistant à : extraire l'ADN dudit échantillon ; mettre en contact l'ADN extrait à l'étape i) avec au moins une amorce constituée par un oligonucléotide ayant une séquence nucléotidique essentiellement identique à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n 1 à 25, de préférence n 1 à 18, dans des conditions permettant l'amplification spécifique

d'un fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase éventuellement présent dans l'extrait d'ADN ; mettre en contact le produit d'amplification avec une sonde constituée par un oligonucléotide ayant une séquence nucléotidique essentiellement identique à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n 1 à 25, de préférence n 19 à 25, ladite sonde étant marquée de manière détectable, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique dudit produit d'amplification et de ladite sonde ; détecter le complexe d'hybridation formé entre le produit d'amplification et ladite sonde, indicateur de la présence de bactéries sulfato-réductrices dans l'échantillon.

Par "conditions permettant l'amplification spécifique", on entend des conditions de température, des temps réactionnels et éventuellement la présence d'agents supplémentaires nécessaires pour que le fragment du gène de la sous-unité a de l'APSréductase, auquel les amorces telles que définies ci-dessus se sont hybridées, soit copié à l'identique.

De manière préférentielle, la méthode d'amplification mise en #uvre est une réaction en chaîne par polymérase (PCR) bien connue de l'homme du métier (Sambrook et al, 1989) qui met en oeuvre un couple d'amorces telles que définies ci-dessus.

Par "conditions permettant l'hybridation spécifique", on entend des conditions de forte stringence qui empêchent l'hybridation de l'oligonucléotide à des séquences autres que le gène de la sous-unité a de l'APS-réductase.

Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0,41 (%G+C)+16,6Log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) - (600/nombre de bases) (Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) 2 (A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.

Les sondes oligonucléotidiques utilisées dans le procédé de l'invention sont marquées de manière détectable. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.

Un contrôle interne d'amplification peut être utilisé de manière avantageuse, afin de s'affranchir d'une interprétation ambiguë de résultats négatifs du procédé d'amplification. En effet par exemple, une absence d'amplification par PCR peut être due à des problèmes d'inhibition de la réaction ou à l'absence de cible.

Les auteurs de la présente invention proposent d'utiliser comme contrôle interne un plasmide incluant des séquences oligonucléotides permettant l'amplification d'un fragment du gène de l'APS-réductase, lesdites séquences oligonucléotides encadrant une séquence différant dudit fragment du gène de l'APS-réductase par sa taille et/ou sa séquence. Lesdites séquences oligonucléotidiques spécifiques d'un fragment du gène de l'APS-réductase peuvent être notamment choisies parmi les séquences SEQ ID n 1 à 25, de préférence les séquences n 11à 18. Un exemple d'un tel plasmide est représenté à la figure 4.

Ajouté en concentration limitante au mélange de la réaction PCR, ce plasmide permet l'amplification d'un fragment d'ADN de 289 pb (paires de bases), dont la séquence est donnée à la figure 5, lorsque aucune cible spécifique n'est présente dans l'échantillon.

Ainsi, dans l'exemple retenu, la présence d'un fragment de 289 pb, sans fragment de 205 pb, témoigne du fonctionnement de la réaction et de l'absence de cible spécifique, c'est- à-dire de bactéries sulfato-réductrices dans l'échantillon étudié.

Les exemples et figures qui suivent illustrent l'invention sans en limiter la portée.

LEGENDE DES FIGURES La figure 1 représente l'alignement des séquences de la sous-unité a de l'APSréductase ayant permis la définition des amorces spécifiques des bactéries sulfato-réductrices du domaine Bacteria.

La figure 2 représente la position des différentes amorces décrites dans les exemples de la sous-unité a de l'APS-réductase.

La figure 3a représente un gel caractéristique d'une amplification avec le couple d'amorces [alpha]sp01-[alpha]sp11.

ligne 1 : Piste 1 et 10 : de poids moléculaire (100 pb, Gilco brl); piste 2 à 9 : SRL 4225 (Desulfovibrio "bastinii'); SRL 6143 (Desulfovibrio " tubi"), SRL 3851 (Desulfomicrobium baculatum); SRL 3492 (Desulfomicrobium baculatum); SRL 583 (Desulfotomaculum nigrificans); SRL 2668 (Thermodesulfobacterium mobile); SRL 2801

(Thermodesulfobacferium mobile); Contrôle interne ligne 2 : BSR. Piste 1 et 10 : de poids moléculaire (100 pb, Gilco brl); piste 2 à 9 : 4208 (bactérie anaérobie fermentaire non identifiée); SRL 4207 (Dethiosulfovibrio peptidovorans); SRL 4226 (Dethiosulfovibrio peptidovorans); SRL 6459 (Thermotoga elfii); SRL 5268 (Thermoanaerobacter brockii subsp.) ; SRL 7311 (Thermoanaerobacter brockii subsp. lactiethylicus) SRL 3138 (Thermotoga maritima); SRL 4224 (Haloanaerobacter congolense).

La figure 3b représente une hybridation sur membrane avec l'oligonucléotide Snbsr 3 des produits PCR de la figure 3a. (mêmes pistes) La figure 4a représente la carte de restriction du plasmide pCI BSR utilisé comme contrôle interne, obtenu à partir d'un plasmide pUC19.

La figure 5 représente la séquence du fragment inséré dans le plasmide pCI-BSR, utilisé comme contrôle interne d'amplification.

La figure 6 représente l'alignement des fragments amplifiés par les amorces a-sp01 et a- sp11ayant permis la définition des sondes de détection.

La figure 7 représente la position des différents oligonucléotides hybridant spécifiquement entre les amorces a-sp01 et a-sp11 dans l'APS-réductase.

EXEMPLES Introduction : La démarche expérimentale ayant abouti à la mise au point du procédé de l'invention consiste en : 1. l'exploitation des séquences de deux gènes de la sous-unité a de l'APS-réductase disponibles dans les banques de données pour construire différents jeux d'amorces d'amplification permettant la mise en évidence de nouveaux gènes codant pour cette même enzyme et leur séquençage.

2. l'alignement de 7 séquences (2 issues des banques de données et 5 obtenues selon la démarche explicitée au point 1), permettant de définir des zones conservées et d'identifier des séquences oligonucléotidiques spécifiques de ce gène.

3. l'évaluation de la spécificité et de la sensibilité des différents jeux d'amorces définis au point 2 sur 10 souches de bactéries sulfato-réductrices et 3 non sulfato-réductrices. Un couple d'amorces préférentiel, conduisant à l'amplification d'un fragment de 205 pb, a

été validé sur 36 autres souches. La taille du produit PCR issu du couple d'amorces asp01-asp11 est de 205 pb dans les exemples présentés. Cependant, on ne peut pas exclure que cette taille varie en fonction des souches considérées.

4. le contrôle de la spécificité de ce couple d'amorces par séquençage de 5 fragments amplifiés de 205 pb issus de nouvelles BSR (par rapport au point 2). Les 11 séquences de BSR du domaine Bacteria ont été alignées, ce qui a permis de définir des sondes nucléiques, dans les zones conservées du fragment de 205 pb, susceptibles de permettre l'amplification ou la détection spécifique de tout ou partie du gène.

5. l'évaluation de la spécificité et de la sensibilité de ces oligonucléotides par hybridation sur membrane (Southern blotting).

6. l'essai en microplaques d'un protocole d'hybridation non radioactif de type "sandwich" permettant la révélation spécifique du produit d'amplification d'un fragment de ce gène.

7. la définition d'un protocole complet permettant la détection à partir d'échantillons de terrain.

8. la corrélation des résultats obtenus par cette méthode avec ceux obtenus par la méthode des "Kits Labège BSRTM" à partir d'échantillons de terrain.

Les noms d'espèces bactériennes mentionnés entre guillemets font référence à des espèces décrites dans la thèse de C. Tardy-Jacquenod (1996). Ces espèces n'ont pas été validées par les comités internationaux de nomenclature car elles n'ont pas encore fait l'objet d'une publication.

EXEMPLE 1 : de séquences codant pour l'APS-réductase chez Desulfovibrio tubi , Desulfotomaculum nigrificans, Desulfomicrobium baculatum et Thermodesulfobacterium mobile. Définition d'amorces spécifiques et conservées. a) Introduction.

Sur la base de deux séquences de l'APS-réductase déposées dans les banques de données internationales (Achaeoglobus fulgidus : EMBL : X63435 ; Desulfovibrio vulgaris : EMBL n Z69372), les auteurs de la présente invention ont pu définir plusieurs couples d'amorces susceptibles de permettre l'amplification de fragments de l'APSréductase. Ces fragments amplifiés ont pu être séquences permettant la comparaison après alignement des différentes séquences. Ainsi, les auteurs de la présente invention ont pu construire différentes amorces pour l'amplification spécifiques des bactéries sulfato-réductrices.

b) Matériel et Méthodes.

- Séquences déposées dans les banques de données. Deux séquences codant pour l'APS-réductase sont déposées dans les bases de données internationales (GenBank et
EMBL).

Achaeoglobus fulgidus : EMBL n X63435 Desulfovibrio vulgaris : EMBL n Z69372 - Souches utilisées.

SRL 7861 Archeoglobus fulgidus SRL 4208 Bactérie anaérobie fermentaire non identifiée (NI) SRL 3491 Desulfomicrobium baculatum SRL 3096 Desulfomicrobium baculatum SRL 583 Desulfotomaculum nigrificans SRL 4225 Desulfovibrio bastinii SRL 2840 Desulfovibrio gabonensis SRL 3851 Desulfovibrio sp.

SRL 6143 Desulfovibrio tubi SRL 4207 Dethiosulfovibrio peptidovorans SRL 2668 Thermodesulfobacterium mobile SRL 2801 Thermodesulfobacterium mobile SRL 3138 Thermotoga maritima Extractions d'ADN.

L'extraction des ADN de souches pures a été effectuée en utilisant le kit QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Allemagne) selon le protocole donné par le fabriquant.

- Réactions PCR.

Les amorces utilisées pour cette études sont données dans le tableau 1.

Tab. 1. Amorces construites pour l'amplification du gène de l'APS-réductase

<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> n <SEP> Nom <SEP> de <SEP> l'amorce <SEP> Séquence <SEP> oligonucléotidique <SEP> Position <SEP> Orientation
<tb> D. <SEP> vulgaris
<tb> 1 <SEP> APS01 <SEP> 5'-CGGCGCCGTTGCCCAGGG-3' <SEP> 957-974 <SEP> Sens
<tb> 2 <SEP> APS02 <SEP> 5'-TCTGTTCGAAGAGTGGGG-3' <SEP> 1110-1127 <SEP> Sens
<tb> 3 <SEP> APS03 <SEP> 5'-TTCAAGGACGGTTACGGC-3' <SEP> 1603-1620 <SEP> Sens
<tb> 4 <SEP> APS04 <SEP> 5'-CTTCAAGGACGGTTACGG-3' <SEP> 1602-1619 <SEP> Sens
<tb> 5 <SEP> APS05 <SEP> 5'-TCNGCCATHAAYACNTAC-3' <SEP> 979-996 <SEP> Sens
<tb> 6 <SEP> APS06 <SEP> 5'-GCAGATCATGATCAACGG-3' <SEP> 1239-1256 <SEP> Sens
<tb> 7 <SEP> APS11 <SEP> 5'-GGGCCGTAACCGTCCTTG-3' <SEP> 1605-1624 <SEP> Antisens
<tb> 8 <SEP> APS12 <SEP> 5'-TCACGAAGCACTTCCACT-3' <SEP> 2260-2677 <SEP> Antisens
<tb> 9 <SEP> APS13 <SEP> 5'-GCACATGTCGAGGAAGTC-3' <SEP> 1897-1914 <SEP> Antisens
<tb> 10 <SEP> APS14 <SEP> 5'-ACCGGAGGAGAACTTGTG-3' <SEP> 2161-2178 <SEP> Antisens
<tb>
où N:A,C,GouT H:A,CouT Y:CouT

Les composants des réactions d'amplification génique (PCR) sont données au tableau 2.

Tab. 2. Composants des réactions d'amplification génique

<tb>
<tb> Réactifs <SEP> Volumes <SEP> Concentrations <SEP> finales
<tb> Amorce <SEP> sens <SEP> (20 <SEP> pM) <SEP> 1,25 <SEP> l <SEP> 0,5 <SEP> M
<tb> Amorce <SEP> antisens <SEP> (20 <SEP> M) <SEP> 1,25 <SEP> l <SEP> 0,5 <SEP> M
<tb> dNTP <SEP> (10 <SEP> mM <SEP> each)1 <SEP> 1 <SEP> NI <SEP> 200 <SEP> M
<tb> Tampon <SEP> PCR <SEP> 10X1 <SEP> 5 <SEP> l <SEP> MgCl2 <SEP> = <SEP> 1,5 <SEP> mM
<tb> DNA <SEP> x <SEP> l <SEP> 2 <SEP> ng/pl <SEP> (soit <SEP> 100 <SEP> ng)
<tb> Taq <SEP> DNA <SEP> pol1 <SEP> 0,4 <SEP> l <SEP> 2 <SEP> U
<tb> H20 <SEP> qsp <SEP> 50 <SEP> l
<tb>
1 : Boehringer Mannheim SA (Meylan, France) Programme PCR : 1 cycle: 3 min 95 C 5 cycles: 1 min94 C
30 s X C T s 72 C 35 cycles: 30 s 94 C
30 s X C
T s 72 C 1 cycle: 5 min 72 C hold 4 C où T est fonction de la taille attendue du fragment amplifié : 1 min/kb
X est la température d'hybridation fonction du couple d'amorces considéré Pour une amorce donnée X C = Tm - 4 = 4x (C+G) +2x(A+T) - 4 Pour l'analyse sur gel d'agarose à 1 ou 2%, 4 l de produit PCR ont été déposés, 1 l Bleu (Sambrook et al., 1989).

- Séquençage des acides nucléiques amplifiés. Le séquençage des acides nucléiques amplifiés a été réalisé directement sur les produits PCR bruts.

- Traitement informatique des séquences : Les programmes du Wisconsin Package, version 9.1-unix, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc. ont été utilisés. c) Résultats Les séquences des gènes de l'APS-réductases de Desulfovibrio vulgaris et Archaeoglobus fulgidus disponibles dans les banques de données ont été alignées. Dans

les zones d'homologies mises en évidence, 10 séquences oligonucléotidiques susceptibles de permettre l'amplification de fragments de la sous unité a de l'APSréductase ont été définies (cf tableau 1). Un fragment de 1580 pb du gène de L'APSréductase de Desulfovibrio tubi et Desulfomicrobium baculatum a pu être amplifié en utilisant les amorces APS02 et APS12. Chez Desulfotomaculum nigrificans et les deux souches de Thermodesulfobacterium mobile (SRL2668 et SRL2801), ce même fragment a été amplifié, en deux étapes, à l'aide des couples d'amorces APS04-APS12 et APS02APS13. La séquence nucléotidique des fragments amplifiés a été déterminée. L'alignement multiple de ces séquences, ainsi que des séquences de référence, est donné figure 1. Cet alignement montre que ce gène est étonnamment bien conservé chez les bactéries sulfato-réductrices du domaine des Bacteria bien que les microorganismes étudiés soient phylogénétiquement éloignés. Ce résultat suggère l'utilisation potentielle de ce gène dans le cadre de la détection des BSR à l'aide de méthodes moléculaires de diagnostic. Les auteurs de la présente invention ont donc, afin de valider cette hypothèse, entrepris la construction de nouvelles amorces dans certaines régions du gène de la sous unité a de l'APS réductase. Ces amorces, localisées sur la figure 2, sont présentées dans le tableau 3.

Tab. 3. Amorces spécifiques de la sous unité a de l'APS réductase.

<tb>

SEQ <SEP> ID <SEP> n <SEP> Nom <SEP> de <SEP> l'amorce <SEP> Séquence <SEP> oligonucléotidique <SEP> position <SEP> Orientation
<tb> D. <SEP> vulgaris
<tb> 11 <SEP> asp01 <SEP> 5'-GATGGAAAACCGCTTCG-3' <SEP> 1575-1591 <SEP> Sens
<tb> 12 <SEP> asp02 <SEP> 5'-AAGTTCTCCTCCGGTTC-3' <SEP> 2164-2180 <SEP> Sens
<tb> 13 <SEP> asp03 <SEP> 5'-ACCATGATGGAAAACCG-3' <SEP> 1570-1586 <SEP> Sens
<tb> 14 <SEP> asp04 <SEP> 5'-TGACCATGATGGAAAAC-3' <SEP> 1568-1584 <SEP> Sens
<tb> 15 <SEP> [alpha]sp11 <SEP> 5'-CGAAGCATCATGTGGTT-3' <SEP> 1765-1781 <SEP> Antisens
<tb> 16 <SEP> [alpha]sp12 <SEP> 5'-CCGGAGGAGAACTTGTG-3' <SEP> 2161-2177 <SEP> Antisens
<tb> 17 <SEP> asp13 <SEP> 5'-AGGCGCATCATGAAGTT-3' <SEP> 2371-2387 <SEP> Antisens
<tb> 18 <SEP> (xspl4 <SEP> 5'-ATGTGCTGCATGTGCAG-3' <SEP> 2572-2588 <SEP> Antisens
<tb> asp14
<tb>

Les différents jeux d'amorces ainsi construits ont été testés sur différents ADN génomiques de bactéries sulfato-réductrices (SRL 2668,2801, 2840,3096, 3491, 3851, 4225, 6143, et 7861) et non sulfato-réductrices (SRL 3138, 4207, et 4208). Tous les jeux d'amorces testés, à l'exception du jeux asp02-asp14 qui ne permet pas l'amplification de l'APS-réductase de Thermodesuffobacterium mobile dans les conditions du test, permettent une amplification spécifique de ce gène chez les BSR.

Le jeu d'amorces asp01-asp11, qui conduit à l'amplification d'un fragment de 205 paires de bases (pb), a été retenu pour un crible de contrôle sur un grand nombre de souches pour les raisons suivantes : - très bon rendement d'amplification - très peu d'aspécificité (amplification de fragments non spécifiques de la cible choisie, souvent de taille différente ; fig. 3a, ligne 2, pistes 3 et 4) - amorces bornant le site potentiel de fixation de l'APS (Speich et al, 1994) visiblement bien conservé ce qui devrait faciliter la construction d'autres oligonucléotides permettant la détection spécifique des amplifiats ou du gène lui-même.

EXEMPLE 2 : sur souches de référence de la spécificité des amorces asp01- asp11. Recherche de sondes nucléiques susceptibles de permettre la révélation des amplifiats et définition du seuil de détection en conditions de terrain. a) Introduction.

Les auteurs de la présente invention ont ensuite montré que le couple d'amorces retenu permet d'amplifier spécifiquement une séquence oligonucléotidique de 205 pb présente seulement chez les bactéries sulfato-réductrices. En outre, sur la base de nouvelles séquences nucléiques du fragment de 205 pb, un ensemble de sondes permettant de révéler, par exemple, l'amplification spécifique des BSR par hybridation, a pu être défini.

Nous présenterons également les résultats d'une étude visant à évaluer le seuil de sensibilité de la méthode proposée à partir d'une suspension calibrée de Desulfovibrio "tubi" (SRL 6143). b) Matériel et Méthodes.

1) - Souches utilisées. Outre les souches citées dans l'exemple 1, les souches utilisées spécifiquement dans cette partie sont mentionnées dans le tableau 4, présenté dans la partie c) de cet exemple.

2) - Extractions d'ADN. Deux méthodes d'extraction des acides nucléiques ont été utilisées, l'une pour la préparation des ADN de souches pures, l'autre pour la préparation des acides nucléiques à partir d'échantillons de terrain. Cette dernière méthode d'extraction est celle préconisée pour le kit lui même et utilisée pour l'étude présentée dans l'exemple 3.

L'extraction des ADN de souches pures est réalisée en utilisant le kit : QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Allemagne) selon le protocole du fournisseur.

L'extraction des acides nucléiques pour la détection des BSR dans des échantillons est réalisée comme suit : après centrifugation de 1 ml d'échantillon pendant 30 min à 15000 rpm, on élimine le surnageant. On ajoute 200 l de matrice InstaGeneTM (Bio-rad laboratories, Hercules, CA) (préalablement homogénéisée) sur le culot, on vortexe et on incube 30 min à 56 C. On vortexe et on place 8 min à 100 C. L'échantillon est alors centrifugé 2 min à 12000 rpm, 20 l de surnageant pouvant être utilisé directement dans les réactions PCR. Le reste du surnageant sera congelé si nécessaire.

3) - Réactions PCR.

La composition du milieu réactionnel est présentée au tableau 2.

Programme PCR 1 cycle: 3 min 95 C 5 cycles : 1min94 C
30 s 54 C
10 s 72 C 35 cycles: 30 s 94 C
30 s 54 C
10 s 72 C 1 cycle: 5 min 72 C hold 4 C Pour l'analyse des amplifiats sur gel agarose 2%, 5 l sont déposés, 1 l de Bleu (Sambrook et al., 1989) pour les souches pures.

4) Southern Blot.

- Dépôt sur gel d'agarose 2% de 8 l d'amplifiat + l de bleu (Sambrook et al., 1989) par puits - Migration à 100V pendant 2h00 - Coloration BET, décoloration, photographie - Traitement du gel :

Dépurination : HCI 0,25 M : 10min après décoloration bleu > jaune (rinçage H20) Dénaturation : NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M : 15 min après recoloration jaune > bleu (rinçage H20) Neutralisation : 0,5 M tris pH 8, NaC11,5 M : 2 x 10 min - Transfert sur film Hybond N+ pendant 4h30 à température ambiante par capillarité dans une solution 20 SSC - Traitements post-transfert : marquage des puits fixation de l'ADN à la membrane pendant 15 min sur une feuille de papier Whatman imbibé de NaOH 0,4 N rinçage 1 min avec 5 SSC - Préhybridation 1 h à 42 C dans :
5 SSC (Sambrook étal., 1989)
5X Denhardt's (Sambrook et al., 1989)
0,5% SDS
100 pg/ml d'ADN de sperme de poisson (soniqué et dénaturé) (DNA, MB grade, from fish sperm, Boehringer Mannheim S. A., Meylan, France) - Marquage de la sonde à la terminale transferase :
Réaction enzymatique :
2 l de sonde à 50 ng/ l
1 l de mélange TdT
5 l de dCTp32 soit 50 Ci
1 l de Terminale Transférase (Pharmacia Biotech)
1 l de DTT à 1mM
Incubation 15 min à 37 C
Ajout de 10 l d'H20 et 5 l de SDS 2%-EDTA 5 mM
Elimination des oligonucléotides non incorporés par colonne P6 (Bio-rad laboratories, Hercules, CA) - Hybridation 16h à 42 C dans tampon de préhybridation + sonde marquée activité = 106 cpm/ml de tampon - Rinçage : 2 SSC 0,1% SDS à température ambiante - Lavage : 2 SSC 0,1% SDS à température ambiante 15 min
2 SSC 0,1% SDS à 50 C 30 min
1 SSC 0,1% SDS à 50 C 30 min
0,1 SSC 0,1% SDS à 50 C 30 min

- Exposition à -80 C pendant 5h00 sur X-OMATTM (Kodak, Rochester, NY) 5) - Test des sondes en microplaques selon la méthode d'hybridation sandwich. Des microplaques ont été sensibilisées de façon passive avec la sonde Snbsr 2, utilisée comme sonde de capture interne au produit amplifié (cf tableau 5). Après incubation de 16 à 18 heures, les puits sont lavés et les plaques stockées à 4 C. La révélation des produits amplifiés est assurée par une sonde interne de révélation marquée à la péroxydase, (les sondes Snbsr 6 et Snbsr 7 ont été testées indépendamment lors de cette étude). Le protocole péconisé dans les trousses ProbéliaTM (SANOFI
Diagnostics Pasteur) a été utilisé pour la réalisation des étapes d'hybridation et de détection.

6) - Séquençage des acides nucléiques amplifiés. Le séquençage des acides nucléiques amplifiés a été réalisé directement sur les produits PCR brut.

7) - Traitement informatique des séquences. Les programmes du Wisconsin Package, version 9.1-unix, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc. ont été utilisés. c) Résultats La spécificité du jeux d'amorces asp01-asp11 a été évaluée sur 37 ADN génomiques de souches pures extraits de bactéries sulfato-rédcutrices et non sulfato-réductrices. Les résultats obtenus, donnés dans le tableau 4, montrent que le couple d'amorces défini permet bien une amplification spécifique d'un fragment du gène de l'APS-réductase des bactéries sulfato-réductrices.

Tab. 4. Evaluation de la spécificité du couple d'amorces asp01-asp11

<tb>
<tb> Souches <SEP> Nom <SEP> Amplification
<tb> du <SEP> fragment <SEP> spécifique
<tb> de <SEP> l'APS-réductase
<tb> BSR
<tb> SRL <SEP> 4594 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 6146 <SEP> Desulfovibrio <SEP> "gracilis" <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 422 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 4596 <SEP> Desulfovibrio <SEP> sp. <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3707 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3137 <SEP> Desulfovibrio <SEP> sp. <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 2811 <SEP> Desulfovibrio <SEP> "caledoniensis" <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 2976 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 1234 <SEP> BSR <SEP> NI* <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3688 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3920 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3663 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3698 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 2582 <SEP> Desulfovibrio <SEP> longus <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 2683 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 2810 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3664 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3920 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3096 <SEP> Desulfomicrobium. <SEP> baculatum <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3709 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3697 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3706 <SEP> Desulfovibrio. <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3101 <SEP> Desulfovibrio <SEP> Ionreachii <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3664 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3863 <SEP> Desulfovibrio <SEP> "gracilis" <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3699 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3685 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 3708 <SEP> Desulfovibrio <SEP> desulfuricans <SEP> +
<tb> SRL <SEP> 2979 <SEP> Desulfohalobium <SEP> retbaense <SEP> +
<tb> Non <SEP> BSR
<tb> SRL <SEP> 4227 <SEP> Fermentaire <SEP> NI* <SEP> SRL <SEP> 2471 <SEP> Haloanaerobium <SEP> acetoethylicus <SEP> SRL <SEP> 4226 <SEP> Dethiosulfovibrio <SEP> peptidovorans <SEP> SRL <SEP> 4234 <SEP> Geotoga <SEP> subterranea <SEP> SRL <SEP> 4224 <SEP> Haloanaerobium <SEP> congolense <SEP> SRL <SEP> 4205 <SEP> Fermentaire <SEP> NI* <SEP> SRL <SEP> 618 <SEP> Clostridium <SEP> glycolicum <SEP> -
<tb>
* NI : non identifiée

- Définition du contrôle interne d'amplification.

Pour s'affranchir d'une interprétation ambiguë des résultats négatifs des PCR (une absence d'amplification par PCR peut être due à des problèmes d'inhibition de la réaction ou à l'absence de cible), un plasmide (fig. 4) a été construit. Ajouté en concentration limitante au mélange de la réaction PCR, ce plasmide permet l'amplification d'un fragment d'ADN de 289 pb, dont la séquence est donnée à la figure 5, lorsque aucune cible spécifique n'est présente dans l'échantillon. Ainsi, dans l'exemple retenu, la présence d'un fragment de à 289 pb, sans fragment de 205 pb, témoigne du fonctionnement de la réaction et de l'absence de cible spécifique c'est-à-dire de bactéries sulfato-réductrices dans l'échantillon étudié. En outre, la séquence intercalée entre les amorces asp01 et asp11 dans le contrôle interne diffère par sa taille mais également par sa séquence (gène Leu2) permettant ainsi de ne pas confondre l'amplification du contrôle interne avec l'amplification spécifique d'un fragment du gène de l'APS-réductase que l'analyse de la PCR se fasse sur gel d'agarose ou par hybridation. Dans l'exemple retenu, un fragment de 255 pb du gène Leu2 de Saccharomyces cerevisiae a été choisi, mais n'importe qu'elle séquence nucléotiditiques peut être utilisée pourvu qu'elle n'ait pas d'homologie avec le fragment de 205 pb du gène de l'APS-réductase.

On remarquera que ce plasmide ne peut être utilisé comme contrôle interne que lors de la détection des bactéries sulfato-réductrices avec le jeu d'amorces asp01-asp11.

Néanmoins sur le même modèle des contrôles similaires peuvent être construits pour permettre de valider les résultats négatifs témoignant d'une absence de cible.

- Evaluation du seuil de sensibilité Une suspension cellulaire de Desulfovibrio tubi à 108 cellules/ml a été préparée. Elle a été calibrée par dilution en milieu liquide par la méthode du nombre le plus probable à 3 tubes dans le milieu de culture optimal de la souche (Tardy-Jacquenod, 1996).

L'évaluation du seuil de sensibilité de l'amplification génique a été effectuée par dilution en cascade au 1/10 de la suspension cellulaire et extraction des acides nucléiques selon la méthode InstaGeneTM. En soumettant chaque extrait d'acides nucléiques ainsi obtenue au test PCR, les auteurs de la présente invention ont pu montrer que la détection de 10 bactéries/ml était possible avec le jeu d'amorces développé en présence d'un contrôle interne permettant de valider les résultats négatifs. Ces expérimentations ont été révélées sur gel d'agarose.

- Sondes de révélation des amplifications spécifiques.

Cinq amplifiats obtenus avec le couple d'amorces asp01-asp11 à partir d'ADN génomique de Desulfomicrobium baculatum (SRL 3096), Desulfovibrio longreachii (SRL 3101), Desulfovibrio gracilis (SRL 6146), Desulfovibrio desulfuricans (SRL 3707) et

Thermodesulfobacterium mobile (SRL 2668) ont été séquences afin de vérifier la spécificité des amplifications. L'alignement de toutes les séquences disponibles (figure 6) montre que la remarquable conservation du gène dans cette région permet de définir 7 nouvelles séquences oligonucléotidiques pouvant être potentiellement utilisées pour la mise en évidence du gène, ou d'un fragment de ce gène par hybridation ou amplification génique (Tab. 5 et fig. 7).

Tab. 5. Oligonucléotides hybridant spécifiquement dans le fragment compris entre les amorces asp01 et asp11 1 de la sous unité a de l'APSréductase.

<tb>

SEQ <SEP> ID <SEP> n <SEP> Nom <SEP> Séquence <SEP> position <SEP> orientation
<tb> oligonucléotidique <SEP> D. <SEP> vulgaris
<tb> 19 <SEP> Snbsr1 <SEP> 5'-GACGGTTACGGHCCKGTYGGYGC-3' <SEP> 1609-1631 <SEP> Sens
<tb> 20 <SEP> Snbsr2 <SEP> 5'-GACGGTTACGGHCCKGTYGGYGCNTGGTTCCT-3' <SEP> 1609-1640 <SEP> Sens
<tb> 21 <SEP> Snbsr3 <SEP> 5'-GGHCCKGTYGGYGCNTGGTTCCT-3' <SEP> 1618-1640 <SEP> Sens
<tb> 22 <SEP> Snbsr4 <SEP> 5'-TGGTTCCTKCTSTTCAARGCBAA-3' <SEP> 1630-1655 <SEP> Sens
<tb> 23 <SEP> Snbsr5 <SEP> 5'-CTSTTCAARGCBAARGCYACCAAC-3' <SEP> 1642-1665 <SEP> Sens
<tb> 24 <SEP> Snbsr6 <SEP> 5'-AACCGCGCVATGCTSAARCCYTACGA-3' <SEP> 1693-1718 <SEP> Sens
<tb> 25 <SEP> Snbsr7 <SEP> 5'-TACGARGAWCGCGGHTACGCMAAGGG-3' <SEP> 1714-1739 <SEP> Sens
<tb>
où N:A,C,GouT H:A,CouT B:G,CouT V:A,CouG Y:CouT M:AouC W:AouTK:GouT S:CouG R:AouG

Ces oligonucléotides ont été testés comme sondes de détection de l'amplifiat de 205 pb par hybridation sur membranes (Southern Blot). Des amplifiats obtenus avec le couple d'amorces asp01-asp11 à partir d'ADN génomique de souches pures de bactéries sulfato-réductrices (SRL 4225, SRL 6143, SRL 3851, SRL 3492, SRL 2668, SRL 2801) ou non sulfato-réductrices (SRL 4208, SRL 4207, SRL 4226, SRL 6459, SRL 5268, SRL 7311, SRL 3138, SRL 4224) ont été utilisés dans cette étude.

Les résultats des expériences d'hybridation avec la sonde Snbsr 3 sont récapitulés dans le tableau 6 et illustrés aux figures 3a et 3b.

Tab. 6. Test des sondes de révélation des amplifiats sur membranes (Southern blotting).

<tb>
<tb> sonde <SEP> taille <SEP> spécificité <SEP> sensibilité'*' <SEP> remarques
<tb> Snbsr <SEP> 1 <SEP> 23-mers <SEP> OK <SEP> OK <SEP>
<tb> Snbsr <SEP> 2 <SEP> 32-mers <SEP> OK <SEP> OK <SEP> test <SEP> capture
<tb> Snbsr <SEP> 3 <SEP> 23-mers <SEP> OK <SEP> OK
<tb> Snbsr <SEP> 4 <SEP> 23-mers <SEP> OK
<tb> Snbsr <SEP> 5 <SEP> 24-mers <SEP> OK
<tb> Snbsr <SEP> 6 <SEP> 26-mers <SEP> OK <SEP> OK <SEP> test <SEP> révélation
<tb> Snbsr <SEP> 7 <SEP> 26-mers <SEP> OK <SEP> OK <SEP> test <SEP> révélation
<tb>
1. capacité à n'hybrider qu'avec les produits PCR spécifiques des BSR (fragment asp01- asp11) dans la sous-unité a de l'APS-réductase.

2. permet une hybridation avec tous les produits PCR spécifiques des BSR (fragment asp01-asp11) dans la sous-unité a de l'APS-réductase quelle que soit la souche d'origine.

Exemple d'utilisation des oligonucléotides définis dans ce travail dans un système d'hybridation non radioactive de type "sandwich".

Sur la base des résultats obtenus par hybridation sur membrane, une étude visant à évaluer un système de détection des amplifiats en microplaques, par une technique d'hybridation non radioactive de type "sandwich", a été entreprise.

Les résultats présentés dans les tableau 7a, 7b et 7c montrent que l'utilisation des sondes retenues (Snbsr 2 avec Snbsr 6 ou Snbsr 7) est possible en termes de sensibilité et de spécificité pour la détection d'amplifiats obtenus avec le couple d'amorces asp01asp11. Néanmoins, le couple Snbsr 2-Snbsr 6 sera préféré pour sa sensibilité (écart de valeurs entre les blancs et les échantillons positifs).

Tab. 7a. Résultats des tests d'hybridation en microplaques avec la sonde Snbsr 2 utilisée en capture et Snbsr 6 ou Snbsr 7 marquée à la péroxydase en révélation. Expérience d'amplification en absence de contrôle interne sur souches pures

<tb> SR <SEP> Snbsr <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Snbsr <SEP> 6 <SEP> Snbsr <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Snbsr <SEP> 7
<tb>

L Amplif. asp01-aspll de 00405 nm Interprét. 00405 nom Interprét.

<tb>

Blancs <SEP> sans <SEP> ampl. <SEP> 0,159 <SEP> 0,045
<tb> sans <SEP> ampl. <SEP> 0,174 <SEP> 0,052
<tb> H20 <SEP> 0,096 <SEP> 0,018
<tb> H20 <SEP> 0,137/ <SEP> 0,027/
<tb> BSR <SEP> 61 <SEP> Desulfovibrio <SEP> <SEP> tubi <SEP> >3 <SEP> + <SEP> 0,353 <SEP> +
<tb> 43 <SEP> Desulfovibrio <SEP> "bastinii" <SEP> >3 <SEP> + <SEP> 2,223 <SEP> +
<tb> 42 <SEP> Desulfomicrobium <SEP> baculatum <SEP> 2,150 <SEP> + <SEP> 1,053 <SEP> +
<tb> 25 <SEP> Desulfomicrobium <SEP> baculatum <SEP> 0,562 <SEP> + <SEP> 0. <SEP> 211 <SEP> +
<tb> 38 <SEP> Desulfotomaculum <SEP> nigrifians <SEP> >3 <SEP> + <SEP> 1,773 <SEP> +
<tb> 51 <SEP> Thermodesulfobacterium <SEP> mobile <SEP> 0,963 <SEP> + <SEP> 0,586 <SEP> +
<tb> 34 <SEP> Thermodesulfobacterium <SEP> mobile <SEP> 1,570 <SEP> + <SEP> 0,422 <SEP> +
<tb> 92
<tb> 58
<tb> 3
<tb> 26
<tb> 68
<tb> 28
<tb> 01
<tb> Non <SEP> BSR <SEP> 64 <SEP> Thermotoga <SEP> elfii <SEP> 0,117- <SEP> 0,025 <SEP> -
<tb> 59 <SEP> Fermentaire <SEP> NI* <SEP> 0,139- <SEP> 0,032
<tb> 42 <SEP> Dethiosulfovibrio <SEP> peptidovorans <SEP> 0,094- <SEP> 0,019
<tb> 08 <SEP> Thermoanaerobacter <SEP> brockii <SEP> subsp. <SEP> lactiethylicus <SEP> 0,098- <SEP> 0,017
<tb> 42 <SEP> Thermotoga <SEP> maritima <SEP> 0,099- <SEP> 0,021
<tb> 07 <SEP> Haloanaerobium <SEP> congolense <SEP> 0,106- <SEP> 0,014
<tb> 52 <SEP> Thiobacillus <SEP> ferroxydans <SEP> 0,181- <SEP> 0,041
<tb> 68
<tb> 31
<tb> 38
<tb> 42
<tb> 24
<tb> 78
<tb> 64
<tb>
* NI : non identifiée

Tab. 7b. Résultats des tests d'hybridation en microplaques avec la sonde Snbsr 2 utilisée en capture et Snbsr 6 ou Snbsr 7 marquée à la péroxydase en révélation. Expérience d'amplification en présence de contrôle interne sur souches pures

<tb> Snbsr <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Snbsr <SEP> 6 <SEP> Snbsr <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Snbsr <SEP> 7
<tb>

Amplif. asp01-aspll de D04osnm Interpr DO405nm Interprét.

Blancs <SEP> sans <SEP> ampl. <SEP> 0,159 <SEP> 0,045
<tb> sans <SEP> ampl. <SEP> 0,174 <SEP> 0,052
<tb> H20 <SEP> 0,271 <SEP> 0,051
<tb> H20 <SEP> 0,299/ <SEP> 0,069/
<tb> BSR <SEP> Desulfovibrio <SEP> <SEP> tubi <SEP> <SEP> >3 <SEP> + <SEP> 0,321 <SEP> +
<tb> Desulfovibrio <SEP> "bastinii" <SEP> >3 <SEP> + <SEP> 2,138 <SEP> +
<tb> Desulfomicrobium <SEP> baculatum <SEP> 2,28 <SEP> + <SEP> 1,160 <SEP> +
<tb> Desulfomicrobium <SEP> baculatum <SEP> 0,667 <SEP> + <SEP> 0,214 <SEP> +
<tb> Desulfotomaculum <SEP> nigrifians <SEP> >3 <SEP> + <SEP> 1,564 <SEP> +
<tb> Thermodesulfobacterium <SEP> mobile <SEP> 1,17 <SEP> + <SEP> 0,715 <SEP> +
<tb> Thermodesulfobacterium <SEP> mobile <SEP> 0,889 <SEP> + <SEP> 0,282 <SEP> +
<tb> Non <SEP> BSR <SEP> Thermotoga <SEP> elfii <SEP> 0,246- <SEP> 0,056Fermentaire <SEP> NI* <SEP> 0,098- <SEP> 0,037Dethiosulfovibrio <SEP> peptidovorans <SEP> 0,088- <SEP> 0,021Thermoanaerobacter <SEP> brockii <SEP> subsp. <SEP> 0,106- <SEP> 0,020lactiethylicus <SEP> 0,221- <SEP> 0,025Thermotoga <SEP> maritima <SEP> 0,039- <SEP> 0,029Haloanaerobium <SEP> congolense <SEP> 0,199 <SEP> - <SEP> 0,042Thiobacillus <SEP> ferroxydans
<tb>
* NI : non identifiée

Tab. 7c. Résultats des tests d'hybridation en microplaques avec la sonde Snbsr 2 utilisée en capture et Snbsr 6 ou Snbsr 7 marquée à la péroxydase en révélation. Expérience d'amplification en présence de contrôle interne sur échantillons de terrain

<tb>
<tb> BSR/ml <SEP> Snbsr <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Snbsr <SEP> 6 <SEP> Snbsr <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Snbsr <SEP> 7
<tb> SRL <SEP> Amplif. <SEP> "Kits <SEP> DO405 <SEP> nm <SEP> Interprét. <SEP> DO <SEP> 405 <SEP> nm <SEP> Interprét.
<tb> asp01-asp11 <SEP> Labège
<tb> de <SEP> BSRTM"
<tb> Blancs <SEP> sans <SEP> ampl. <SEP> / <SEP> 0,159 <SEP> / <SEP> 0,045 <SEP> /
<tb> sans <SEP> ampl. <SEP> / <SEP> 0,174 <SEP> / <SEP> 0,052 <SEP> /
<tb> H20 <SEP> / <SEP> 0,271 <SEP> / <SEP> 0,051 <SEP> /
<tb> H20 <SEP> 0,299 <SEP> 0,069
<tb> Echant. <SEP> Cm <SEP> 2,5 <SEP> 105 <SEP> 2,475* <SEP> + <SEP> 0,663* <SEP> +
<tb> Cm <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 0,3 <SEP> 0,088- <SEP> 0,014-
<tb>
* mesurée à partir d'une amplification PCR réalisée à la dilution 10-4 de l'échantillon EXEMPLE 3 : des résultats obtenus par les méthodes d'amplification génique et de culture conventionnelle. a) Introduction.

Cet exemple a pour objet de comparer les résultats du dénombrement des BSR dans des échantillons par la méthode d'amplification génique (utilisant les oligonucléotides définis dans ce travail) et par une méthode de culture de référence. Pour cette dernière, les "Kits Labège BSRTM" (CFG, Orléans, France) ont été utilisés, ces kits constituant les tests les plus sensibles sur le marché. b) Matériels et méthodes.

- Echantillons :
Eaux d'aquifères, eaux de gisements pétroliers et fluides d'annulaires de puits pétroliers.

- Extractions d'ADN
L'extraction des acides nucléiques pour la détection des BSR à partir d'échantillons de terrain (méthode InstaGeneTM, Bio-rad laboratories, Hercules, CA) a été réalisée comme suit : Centrifuger 1 ml d'échantillon pendant 30 min à 15000 rpm puis éliminer le surnageant. Ajouter 200 l de matrice InstaGeneTM (préalablement homogénéisée) sur le culot, vortexer et incuber 30 min à 56 C. Vortexer et placer 8 min à 100 C.

L'échantillon est alors centrifugé 2 min à 12000 rpm. Dans les réactions PCR, 20 l de surnageant sont utilisés. Le reste du surnageant est congelé si nécessaire.

- Réactions PCR pour la détection des BSR
Pour la détection des bactéries sulfato-réductrices en routine, un système d'amplification permettant de limiter les risques de contamination des PCR dus à

l'extrême sensibilité de ce mode de détection peut être utilisé. Dans ce travail, le kit "Core kit PlusTM" (Boehringer Mannheim SA, Meylan, France) a été utilisé. Les conditions de réactions sont données dans le tableau 8.

Tab. 8. Réactions PCR pour la détection des BSR en conditions de terrain

<tb>
<tb> Réactifs <SEP> Volumes <SEP> Concentrations <SEP> finales
<tb> Amorce <SEP> asp01 <SEP> (20 <SEP> M) <SEP> 1,25 <SEP> l <SEP> 0,5 <SEP> M
<tb> Amorce <SEP> asp1 <SEP> 1 <SEP> (20 <SEP> M) <SEP> 1,25 <SEP> l <SEP> 0,5 <SEP> M
<tb> dNTP' <SEP> 1 <SEP> NI <SEP> 200 <SEP> M
<tb> Tampon <SEP> PCR <SEP> 10X1 <SEP> 25 <SEP> mM <SEP> MgCl2 <SEP> 5 <SEP> NI <SEP>
<tb> MgCl2 <SEP> (25 <SEP> mM)1 <SEP> 3 <SEP> l <SEP> 1,5 <SEP> mM <SEP> (+ <SEP> 2,5 <SEP> dans <SEP> Tp)
<tb> CI <SEP> (Mini-prep <SEP> à <SEP> 10-9) <SEP> 2 <SEP> l <SEP> ?
<tb> DNAprep <SEP> 20 <SEP> NI <SEP>
<tb> UDG <SEP> 1 <SEP> l <SEP> 1 <SEP> U <SEP>
<tb> Taq <SEP> DNA <SEP> pol1 <SEP> 0,5 <SEP> l <SEP> 2,5 <SEP> U
<tb> H20 <SEP> qsp <SEP> 50 <SEP> l
<tb>
1 : Réactifs Boehringer Mannheim S. A. (Meylan, France) PCR Core Kit Plus Analyse sur gel : 16 l de produits PCR + 4 l bleu (Sambrook et al., 1989) Dénombrement PCR Le dénombrement des BSR est réalisée par dilution en cascade de l'extrait d'acides nucléiques de 10 en 10, chaque dilution étant alors soumise à une réaction PCR.

L'interprétation du résultat, en termes de nombre de BSR/ml, est donné par le tableau 9 défini sur la base du seuil de sensibilité mesuré sur une suspension cellulaire calibrée de souche pure (cf. exemple 2).

Tab. 9. Principe du dénombrement des BSR par PCR.

Lecture <SEP> de <SEP> l'amplification <SEP> Lecture <SEP> de <SEP> l'amplification <SEP> Dénombrement
<tb> spécifique <SEP> des <SEP> BSR <SEP> spécifique <SEP> du <SEP> contrôle
<tb> Positive <SEP> jusqu'à <SEP> la <SEP> dilution:
<tb> Non <SEP> Dilué <SEP> Sans <SEP> objet <SEP> 10 <SEP> à <SEP> 102 <SEP> BSR/ml
<tb> 10-1 <SEP> Sans <SEP> objet <SEP> 102 <SEP> à <SEP> 103 <SEP> BSR/ml
<tb> 10-2 <SEP> Sans <SEP> objet <SEP> 103 <SEP> à <SEP> 104 <SEP> BSR/ml
<tb> 10-3 <SEP> Sans <SEP> objet <SEP> 104 <SEP> à <SEP> 105 <SEP> BSR/ml
<tb> 10-4 <SEP> Sans <SEP> objet <SEP> 105 <SEP> à <SEP> 106 <SEP> BSR/ml
<tb> 10-5 <SEP> Sans <SEP> objet <SEP> 106 <SEP> à <SEP> 107 <SEP> BSR/ml
<tb> 10-6 <SEP> Sans <SEP> objet <SEP> > <SEP> 107 <SEP> BSR/ml
<tb> Négative <SEP> Positive <SEP> < <SEP> 10 <SEP> BSR/ml
<tb> Négative <SEP> Positive <SEP> à <SEP> partir <SEP> 10-1(1) <SEP> < <SEP> 100 <SEP> BSR/ml
<tb> Négative <SEP> Négative <SEP> Anomalie <SEP> bzz~
<tb>
1 : dans ce cas, la réaction PCR est seulement inhibé lorsque l'échantillon n'est pas dilué. 2 : absence d'amplification due à une anomalie expérimentale

Dénombrements par culture : "Kits Labège BSRTM" Les dénombrements sont réalisés selon le protocole du fabriquant (CFG, Orléans, France). Les deux méthodes proposées ont été utilisées selon les échantillons : - Séries de dilutions à 3 tubes (méthode du nombre le plus probable - NPP) interprétées par les tables de Mc Crady.

- Dilutions simples (1 tube) au 1/10eme en cascade. Le résultat obtenu est alors une fourchette . c) Résultats.

Les résultats obtenus sur divers échantillons de terrain (provenant d'eaux d'aquifères, de gisements pétroliers ou de fluides d'annulaires de puits pétroliers) sont récapitulés dans les tableaux 10a et 10b.

Tab. 10a. Récapitulatifs des essais effectuées à partir d'échantillon de terrain

<tb>
<tb> Nombre <SEP> total <SEP> Résultats <SEP> négatifs <SEP> par <SEP> Résultats <SEP> <10 <SEP> par <SEP> culture <SEP> Résultats <SEP> corréler <SEP>
<tb> d'analyses <SEP> les <SEP> 2 <SEP> méthodes <SEP> et <SEP> négatifs <SEP> par <SEP> PCR* <SEP> voir <SEP> tab. <SEP> 1 <SEP> b
<tb> 35 <SEP> 13 <SEP> 6 <SEP> 16
<tb> * <SEP> : <SEP> inférieur <SEP> au <SEP> seuil <SEP> de <SEP> détection <SEP> PCR
<tb> Les <SEP> résultats <SEP> négatifs <SEP> ont <SEP> été <SEP> validés <SEP> (Amplification <SEP> spécifique <SEP> du <SEP> contrôle <SEP> interne)
<tb> Tab. <SEP> 10b. <SEP> Corrélation <SEP> entre <SEP> les <SEP> dénombrements <SEP> microbiologiques <SEP> et <SEP> PCR
<tb> Résultats <SEP> en <SEP> BSR/ml
<tb> Echantillons <SEP> Cultures <SEP> PCR(2)
<tb> 1 <SEP> 2,5 <SEP> 101 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 2
<tb> 2 <SEP> 2,5 <SEP> 105 <SEP> 105 <SEP> - <SEP> 106
<tb> 3 <SEP> 9,5 <SEP> 104 <SEP> 104 <SEP> - <SEP> 105
<tb> 4 <SEP> <0,3 <SEP> 101 <SEP> - <SEP> 102
<tb> 5 <SEP> 0,9 <SEP> 102 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 3
<tb> 6 <SEP> <0,3 <SEP> 101 <SEP> - <SEP> 102
<tb> 7 <SEP> <0,3 <SEP> 101 <SEP> -
<tb> 8 <SEP> <0,3 <SEP> 101- <SEP> 102
<tb> 9 <SEP> 2,5 <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 102 <SEP> - <SEP> 103 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 10-1 <SEP> - <SEP> 102 <SEP> 102 <SEP> - <SEP> 103 <SEP>
<tb> 11 <SEP> 103 <SEP> - <SEP> 104 <SEP> 102 <SEP> - <SEP> 103
<tb> 12 <SEP> 103 <SEP> - <SEP> 104 <SEP> 102 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 3
<tb> 13 <SEP> 105 <SEP> - <SEP> 106 <SEP> 103 <SEP> - <SEP> 104
<tb> 14 <SEP> 9,5 <SEP> 104 <SEP> 104 <SEP> - <SEP> 105 <SEP>
<tb> 15 <SEP> 9,5 <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 102 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 3
<tb> 16 <SEP> 102 <SEP> < <SEP> 102
<tb>
1 : "Kits Labège BSRTM" : résultats obtenus après 21 jours d'incubation. 2 : Résultats obtenus en 4 heures.

Vingt six échantillons donnent un résultat cohérent par les deux méthodes (dont 20 dans le tableau 10a et 6 dans le tableau 10b.) La méthode d'amplification génique est plus sensible dans 6 cas.

La méthode par culture s'avère plus sensible pour 4 échantillons.

Il faut noter que lorsque des différences ont été observées, les dénombrements obtenus ne diffèrent le plus souvent que par un facteur 10, jamais par plus d'un facteur 100, et que ces différences sont en partie dues au fait que l'interprétation est faite sur une fourchette de valeurs.

Outre l'intérêt de la technique présentée en termes de rapidité, les études de corrélation présentées ci-dessus montrent que la méthode PCR appliquée au dénombrement des bactéries sulfato-réductrices selon le procédé d'utilisation présenté ici conduit à une estimation de la charge en bactéries sulfato-réductrices tout à fait comparable à celle données par les "Kits Labège BSRTM". Par ailleurs, ces résultats confirment le seuil de détection estimé sur souches pures dans des conditions de terrain, puisque les dénombrements effectués en PCR supposent que la sensibilité de détection est de 10 BSR/ml (cf test de sensibilité, exemple 2).

Le procédé de l'invention permet la détection et le dénombrement des bactéries sulfatoréductrices à partir d'échantillons de terrain. Elle permet également de répondre aux critères de sensibilité et de rapidité mais également de spécificité et de fiabilité intrinsèque à la technique. En outre, ce procédé ne souffre d'aucun artefact lié au procédé lui-même: pas de problème d'inhibition de la réaction d'amplification pour un seuil critique de détection inférieur à 100 BSR/ml (même lorsque l'échantillon prélevé provient d'une installation traitée par des biocides), pas de détection des bactéries mortes.

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Adenulylsulphate reductase from sulphate-reducing archaeon Archaeoglobus fulgidus: cloning and characterization of the genes and comparison of the enzyme with other iron sulphur flavoproteins. Microbiology 140 : 1273-1284.

- Tardy-Jacquenod C. (1996) Biodiversité, taxonomie et phylogénie des bactéries sulfato- réductrices isolées de champs pétroliers : exemples de gisements salés et chauds.

Thèse de doctorat. Université de Bordeaux I.

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Zehnder A. J.B. Biology of anaerobic microorganisms pp 469-585. John Wiley & Sons,
New York.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de détection des bactéries sulfato-réductrices dans un échantillon susceptible d'en contenir, ledit procédé comprenant l'extraction de l'ADN ou de l'ARN dudit échantillon et la détection d'au moins un fragment du gène de l'APS-réductase ou d'au moins un fragment de l'ARNm transcrit à partir du gène de l'APS-réductase, indicateur de la présence de bactéries sulfato-réductrices dans ledit échantillon.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel la détection d'au moins un fragment du gène de l'APS-réductase comprend l'amplification génique spécifique d'au moins un fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase.
3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel la détection d'au moins un fragment du gène de l'APS-réductase comprend l'hybridation de l'ADN extrait avec une sonde spécifique dudit fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase, ladite sonde étant marquée de manière détectable.
4. Procédé selon la revendication 2 dans lequel les produits de l'amplification génique sont soumis à une hybridation avec une sonde spécifique dudit fragment du gène de la sous-unité a de l'APS-réductase, ladite sonde étant marquée de manière détectable.
5. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 4 dans lequel on utilise, pour l'amplification du gène de l'APS-réductase, au moins une amorce constituée par un oligonucléotide ayant une séquence nucléotidique essentiellement identique à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 25.
6. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4 dans lequel ladite sonde a une séquence nucléotidique essentiellement identique à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 25.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 4 à 6, dans lequel l'amplification génique est réalisée en présence d'un plasmide incluant les séquences des amorces spécifiques d'un fragment du gène de l'APS-réductase qui encadrent une séquence différant d'un fragment du gène l'APS-réductase.
8. Oligonucléotide ayant une séquence nucléotidique essentiellement identique à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n 1 à 25.

<Desc/Clms Page number 30>
9. Plasmide incluant deux séquences spécifiques d'un fragment du gène de l'APS- réductase qui encadrent une séquence différant d'un fragment du gène l'APS- réductase.
10. Plasmide selon la revendication 9 dans lequel lesdites séquences spécifiques d'un fragment du gène de l'APS-réductase sont choisies parmi les séquences essentiellement identiques aux séquences SEQ ID n 1 à 25.
11. Utilisation d'au moins une séquence nucléotidique hybridant spécifiquement avec un fragment du gène de l'APS-réductase ou de l'ARNm transcrit à partir du gène de l'APS-réductase pour détecter la présence de bactéries sulfato-réductrices dans un échantillon.