FR2775694A1 - Test de toxicite - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à une méthode de détection d'une substance mutagène dans un échantillon ou d'un rayonnement mutagène basée sur l'effet des mutations induites par les substances dans des cellules présentant des anomalies de réparation de l'ADN, sur des produits d'expression hautement sensibles Hsens ou sur la persistance de la présence d'acides gras à très longue chaîne.

Description

La présente invention porte sur un nouveau procédé de détection et de

quantification de la présence d'un échantillon d'une substance à effet mutagène chez les eucaryotes. Elle porte sur une méthode de quantification directe, lorsque la substance est connue, de la dose présente dans cet échantillon. Elle porte également sur une méthode d'évaluation du pouvoir mutagène d'une substance quelconque. Elle porte également sur une méthode de détermination du pouvoir mutagène de

io rayonnements quelconques.

Chaque année, des milliers de composés chimiques nouveaux sont introduits sur le marché, et encore plus en sont exclus faute d'avoir pu en identifier l'impact réel sur le vivant. Paradoxalement, très peu d'entre eux (moins de 1 %) subissent une évaluation rigoureuse du risque mutagène. Cet état de fait est essentiellement lié à la durée et au coût financier d'une évaluation exhaustive (environ 1 an et 400 000 $ US pour une étude menée sur les mammifères et répondant aux normes de la FDA). A l'heure actuelle, le principal test utilisé pour la détection des substances mutagènes est le test d'Ames, réalisé sur la bactérie Salmonella typhimurium (1-5). Il correspond à une mesure du taux de mutations provoquées par un composé chimique par dénombrement sur boîte de Pétri des révertants d'une souche auxotrophe dans laquelle

l'auxotrophie est causée par une mutation ponctuelle dans un gène unique.

La souche utilisée est par ailleurs déficiente pour le système de réparation

de l'ADN afin d'augmenter la sensibilité aux mutations.

Le test d'Ames, très simple à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle, présente néanmoins à l'évidence un inconvénient majeur. En effet, un grand nombre de substances toxiques ne révèlent leur action mutagène qu'après une activation métabolique. Celle-ci a lieu

principalement dans le foie chez les mammifères.

De fait, la mise en oeuvre du test d'Ames impose un prétraitement de la substance à évaluer avec des extraits de foie de rat afin

de "mimer"' in vitro la voie naturelle d'activation eucaryote (Réf. 3).

Toutefois, la similarité de réaction des systèmes bactériens et eucaryotes

vis-à-vis des substances activées par cette voie reste encore à démontrer.

Enfin, le test d'Ames n'est utilisable que pour la détection de

la mutagénicité d'une substance, et non pour celle des rayonnements.

La présente invention porte sur un test d'évaluation du pouvoir mutagène d'une substance ou d'un rayonnement possédant une validité supérieure au test d'Ames car mettant en jeu un système

totalement eucaryote, et ce sans perte de sensibilité.

La présente invention porte également sur une méthode de

détection d'une substance à effet mutagène dans un échantillon.

La présente invention porte enfin sur les trousses ou kit de

diagnostic de la présence d'une substance mutagène dans un échantillon.

Ce test est basé sur la détection directe ou indirecte de mutations dans un gène cellulaire humain: le gène de l'adrénoleucodystrophie (gène ALD, GenBank 151107), ou de tout gène codant pour une protéine homologue ou associée de manière directe ou

indirecte au produit d'expression d'un gène ALD.

L'adrénoleucodystrophie liée au chromosome X (ALD, McKusick 300100) est une grave maladie neurodégénérative humaine qui affecte un individu mâle sur 20.000 dans la population. Elle est caractérisée sur le plan biochimique par un déficit de la beta-oxydation d'une classe particulière de lipides, les acides gras à très longue chaîne ou AGTLCs. Ces acides gras sont des lipides saturés avec 22 ou plus atomes de carbone qui s'accumulent de manière spécifique dans le plasma ou les cellules des patients, en particulier les cellules de la glande surrénale sous forme d'esters du cholestérol (6). Le gène responsable (gène ALD) de la maladie a été clone (7) et comporte 10 exons (8). Il code pour une protéine de 745 acides aminés (ALDP) appartenant à la famille des transporteurs

ATP-dépendant associés aux membranes.

La production et l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'ALDP ont permis de démontrer que cette protéine est associée à la membrane peroxisomale (9,10). Une recherche systématique des mutations chez les patients a été entreprise par plus de dix laboratoires dans le monde et a conduit à l'identification de plus de 200 mutations o0 indépendantes, réparties de manière assez homogène sur l'ensemble du

gène (11-19).

Feigenbaum et al. (réf. 19), d'une part, et Watkins et al. (réf. 20) et Kemp et ai (21) d'autre part, ont analysé l'expression de l'ALDP chez un groupe de patients porteurs de divers types de mutations dans le gène ALD. Leurs études, conduites à partir de fibroblastes ou de lymphoblastes en culture, soit en immunofluorescence sur cellules entières, soit en "Western Blot" sur des extraits protéiques bruts, ont montré que, dans environ 70 % des cas, une mutation dans le gène ALD était associée à une perte totale de la détection de la protéine par I'anticorps spécifique (respectivement 71 %, 69 % et 71 % des cellules testées). Par ailleurs, Feigenbaum et al. (réf. 19) d'une part et Kemp et ai (21) d'autre part ont montré que respectivement 13 % et 11 % des patients ayant une protéine ALDP détectable présentaient toutefois un signal plus faible que la normale, soit une altération notable (absence ou faible réponse) du signal spécifique de l'ALDP dans respectivement 84 % et 82 % des cas. Les deux études démontrent qu'il existe une bonne corrélation entre la présence d'une mutation dans le gène ALD et la perte de l'immunoréactivité, probablement liée à une instabilité, partielle ou

totale, de la protéine mutée".

Sur le plan biochimique, I'ALD se caractérise par un défaut du métabolisme cellulaire qui se manifeste dans certains tissus par une accumulation intracellulaire des acides gras à très longues chaînes (AGTLCs). Le site majoritaire de dégradation des AGTLCs est le péroxysome (au moins 75 % des AGTLCs dégradés) (22-24). Cette caractéristique est commune à un groupe de maladie, notamment I'ALD liée au chromosome X, I'ALD néonatale (McKusick: 202370), et le

syndrome cérébro-hépatorénal de Zellweger (McKusick: 214100).

appartenant toutes à la "famille" des maladies péroxisomales (25,26,27) io dont le syndrome de Zellweger (CHRS) est le "prototype" (28). Il a été démontré que, pour des cellules normales, une voie de beta- oxydation péroxisomale intacte conduit à une élimination des AGTLCs présents dans le milieu de culture par dégradation progressive. En revanche, dans les cellules de patients atteints d'une des trois maladies cités en référence, les AGTLCs intemalisés sont accumulés en proportion variable dans le cytoplasme. C'est le cas des cellules de patients atteints d'adrénoleucodystrophie qui sont porteuses d'une mutation dans le

gène ALD (22-24).

L'ensemble de ces observations a conduit les inventeurs à envisager l'utilisation du gène ALD comme marqueur de la présence de mutations induites dans des cellules humaines exposées en culture à une

condition toxique.

De façon plus générale, toute protéine homologue à l'ALDP, ou associée de manière directe ou indirecte à l'ALDP, peut être utilisée au même titre que V'ALDP dans les méthodes et les kits de l'invention tels que décrits ci-après. Au sens le plus large, toute protéine répondant à la caractéristique de produit d'expression Hsens tels que décrits ci- après fait

également partie de l'invention.

Dans la présente description, par protéine homologue, il est

entendu ici toute protéine présentant un taux de similarité significatif avec I'ALDP tel qu'on puisse inférer que cette protéine et l'ALDP appartiennent à la même famille de transporteur ATP-dépendant associé aux membranes; par protéine associée de manière directe, il est entendu ici toutes protéines X susceptibles de former un dimère ou tout autre type de multimères stables dans lequel l'ALDP est présente; par protéine associée de manière indirecte, il est entendu ici toute association stable ou instable de protéines à laquelle pourrait participer l'ALDP, même de manière transitoire, et dans laquelle le contact entre I'ALDP et la protéine se fait par

to une ou plusieurs protéines intermédiaires.

A titre d'exemple, un gène ALDR (pour "ALD related") a été isolé récemment (31,32). La protéine ALDRP, produit d'expression du gène

ALDR, est très similaire à I'ALDP et est susceptible de s'associer avec elle.

De même, les protéines humaines PMP70 (33), et PMP69 (34) similaires à I'ALDP, ou toute autre protéine du même type font partie de l'invention. Un exemple de protéine associée de manière indirecte est donnée par la lignocéroylCoA synthase (ou AGTLC-CoA synthase) et d'une manière générale par les enzymes participant au processus de la beta- oxydation

des lipides dans les péroxisomes.

Les protéines ALDRP ou leurs équivalents fonctionnels sont des transporteurs ATP dépendants. Ils sont constitués d'un nombre variable d'éléments, souvent de 1 à 4, ces éléments pouvant être identiques ou différents et diversement associés (29). A titre d'exemple dans le cas de 2 éléments homologues (A et B), le transporteur fonctionnel est organisé en dimère (AB). Toute autre type d'association aboutissant, quelque soit le nombre de protéines associées, à un transporteur fonctionnel est également possible. Ainsi, à titre d'exemple, le produit du gène CFTR est un transporteur dont l'ensemble des éléments est porté par

une seule protéine (30).

On sait par ailleurs que les gènes ALD, ALDR et PMP70 ont été clones chez la souris (31, 35, 36), le gène PMP70 a été cloné chez le rat (37), et ces gènes semblent conservés à travers l'évolution jusque dans la levure puisque des gènes orthologues au gène ALD comme PAL1 (38) PXA1 (39) PXA2 (40) ou ykl741 (41) ont été identifiés dans cette espèce qui présente un nombre élevé de transporteurs ATP-dépendant comme en témoigne une étude récente (42). En particulier, un système "levure" dans lequel les cellules Hrea sont constituées par une souche déficiente pour la réparation de l'ADN (à titre d'exemple, les mutants pour les différents gènes Rad (43) sont cités en référence, sans que cette citation soit limitative), et dans laquelle les gènes Hsens tels que décrits ci-après peuvent être soit les gènes PAL1, PXA1, PXA2 ou ykl741 ou tout autre transporteur ATP-dépendant de levure ou d'une autre espèce homologue ou orthologue à l'ALDP, que ce gène soit endogène ou introduit par génie

génétique, et permettant d'obtenir des effets similaires à ceux décrits ci-

dessus fait partie intégrante de la présente invention. Aussi les homologues de l'ALDP et des autres demi-transporteurs présents dans d'autres espèces eucaryotes, comme le gène PMP68 de souris récemment isolé (44), sont dans la portée de la présente invention au même titre que

I'ALD et l'ALDP.

Tout ce qui est décrit, dans ce qui suit, comme relatif à l'ALD ou î'ALDP au même titre que l'ALDRP, PMP70, PXA1, est transposable aux protéines péroxysomales présentant des caractéristiques métaboliques similaires. A titre d'exemple, les espèces considérées peuvent être notamment la souris, le rat ou la levure. Par ailleurs, I'utilisation de protéines pouvant être associées de manière directe ou indirecte à ces homologues sont également dans la portée de l'invention, ainsi que, par extension, les protéines homologues de I'ALDP ou celles pouvant lui être

associées et présentes dans les cellules végétales.

Ces observations sur les conséquences des mutations dans les gènes de protéines péroxysomales peuvent être utilisées tant pour tester la toxicité d'une nouvelle substance ou d'un rayonnement que pour

détecter la présence d'une substance toxique dans un milieu quelconque.

s Dans l'ensemble de ce texte, les définitions suivantes seront adoptées: Protéine péroxysomale: protéine membranaire ou soluble, ayant un rôle de transport, de structure ou enzymatique et participant à la

biogenèse et/ou à la fonction péroxysomale.

lo Produit d'expression hautement sensible (Hsens): produit d'expression (ARN ou protéine) pour lequel une mutation dans le gène d'origine aurait pour conséquence une altération de la capacité de détection de ce produit d'expression supérieure ou égale à 50 % (par perte

de stabilité par exemple).

Cellules en cultures hautement réactive (Hrea): désigne toute type cellulaire eucaryotes (préférentiellement de mammifères ou de levures) présentant des anomalies du système endogène de réparation des lésions telles que la fréquence des mutations spontanées soit significativement plus élevée que la normale. Un exemple de ce type d'anomalie est représenté par les lignées cellulaires humaines provenant de patients atteints de maladies génétiques telles que Xeroderma

pigmentosum, le syndrome de Cockayne ou la Trichothiodystrophie.

Un autre exemple est représenté par les mutants Rad de levure. Gène ALD désigne ici le gène responsable de l'adrénoleucodystrophie liée au chromosome X codant pour la protéine ALDP comme tout gène similaire, homologue, orthologue ou paralogue sans limitation d'espèce ou tout gène codant pour une protéine associée

de manière directe ou indirecte, même transitoirement, avec l'ALDP.

ALDP désigne ici le produit du gène ALD comme toute protéine homologue ou similaire telle que définie précédemment, ou toute protéine associée de manière directe ou indirecte, même transitoirement,

avec l'ALDP.

Substance toxique et/ou mutagène désigne tout atome, molécule ou mélange de ceux-ci qui, à l'état isolé ou dans un environnement quelconque, est susceptible, en présence d'une séquence

d'acides nucléiques, d'entraîner des altérations au sein de cette dernière.

Par altération, il est entendu tout type de modification pouvant affecter le io gène considéré ou directement son produit d'expression, comme des pontages entre résidus, modification par adjonction de radicaux, etc... ainsi que toutes modifications spécifiques des acides nucléiques (addition, délétions, mutations ponctuelles (transposition ou transversion), dimédsation, adjonction de radicaux (methyl ou autre), substitution par des

analogues de bases, etc...).

Rayonnement désigne ici tout type de propagation de l'énergie de type ondulatoire ou corpusculaire susceptible d'avoir un effet sur la structure et la composition d'un acide nucléique propre à générer des mutations. Les rayonnements infrarouges, ultra violets, les rayons X, les émissions des sources radioactives, les ondes radio, électriques ou électromagnétiques, les micro-ondes, les rayons lasers sont cités ici à titre

d'exemple de rayonnements sans que cette liste soit limitative.

Produit d'expression signifie toute séquence résultant de la transcription et/ou de la traduction d'une séquence génomique. Il s'agira d'un ARN messager, d'un ARN de transfert, d'un ADN complémentaire

(ADNc), d'une protéine ou d'un polypeptide ou d'un fragment de ceux-ci.

Couplage direct ou indirect signifie toute méthode connue ou susceptible d'être mise au point permettant d'associer une molécule émettrice d'un signal quelconque à une molécule par couplage direct ou indirect. Le signal peut également résulter du couplage direct d'une molécule quelconque fluorescente, phosphorescente, chemoluminescente, colorée ou affine (un exemple d'une telle molécule pouvant être la biotine), d'un ion métallique, etc... sur le ligand, I'anticorps ou un fragment réactif de celui-ci. La détection pourra alors être directe ou indirecte, et dans ce dernier cas aura lieu via un anticorps, ou une molécule affine (un exemple d'une telle molécule pouvant être l'avidine ou la streptavidine). Le signal peut résulter du couplage direct ou indirect d'une enzyme qui lui-même agira sur un substrat qui, après transformation par l'enzyme, émettra un o0 signal détectable, notamment fluorescent, phosphorent, chemoluminescent ou colorimétrique. Un type de couplage indirect est l'utilisation du couple avidine/biotine, l'une des molécules étant liée au ligand de la substance et l'autre étant liée par exemple à l'enzyme. Différents types de couplage de

traceurs sont donnés à titre indicatif, sans que cette liste soit limitative (45).

Un autre exemple d'un couplage indirect fait référence à l'utilisation d'un réactif chimique tel que l'acide 2-(4'-hydroxyazobenzene)

benzoique (HABA) permettant la complexation protéine-ligand (46).

Ligand signifie tout type de substance présentant une affinité et une spécificité vis-à-vis de la molécule, macromolécule ou fragment de celle-ci, dont on recherche l'absence ou la présence, notamment les

protéines péroxysomales comme I'ALDP ou les AGTLCs.

Fragment réactif désigne la partie du ligand qui interagit avec la substance à détecter. Si l'anticorps est un anticorps monoclonal le fragment réactif pourra être par exemple un fragment Fab ou Fab'2

comportant la séquence ayant une affinité pour un épitope donné.

AGTLCS sont des acides gras à longues chaînes d'au moins 22 atomes de Carbone résultant, soit d'un apport extérieur (en

particulier la diète alimentaire), soit de la synthèse endogène.

Sonde désigne un fragment d'acide nucléique complémentaire d'un produit d'expression tel que défini ci-dessus et

spécifique de ce dernier.

A titre d'exemple, une sonde de détection d'un ARN messager permettra de différencier cet ARN messager de l'ADN génomique dont il est issu si la séquence comporte un fragment de deux

exons adjacents.

La présente invention résulte des observations décrites ci-

avant; elle résulte de l'hypothèse selon laquelle la présence d'une mutation induite par la présence d'une substance toxique ou d'un

rayonnement peut être identifiée par les effets métaboliques décrits ci-

dessus. Deux approches ont été envisagées.

La première est une approche négative dans le sens o l'on recherche l'absence de la protéine codée par le gène de l'ALD, cette absence résultant, soit d'au moins une mutation induite par la substance toxique et/ou mutagène, soit d'un dysfonctionnement général des

péroxysomes induit par cette même substance.

La deuxième est une approche positive dans le sens o la présence d'une mutation se traduit par la présence d'AGTLCS cellulaires après un temps o normalement les AGTLCS internalisés par les cellules

auraient dû être dégradés par le métabolisme cellulaire.

La présente invention porte sur une méthode de détection d'une substance mutagène dans un échantillon ou d'un rayonnement comprenant: - la culture de cellules eucaryotes Hrea (en particulier des cellules issus de patients atteints de Xeroderma pigmentosum) comprenant soit un gène Hsens (en particulier le gène ALD) sauvage, soit une ou plusieurs copies d'un gène Hsens (en particulier le gène ALD) introduit de manière stable ou transitoire par manipulation génétique et ce par tout moyen naturel ou artificiel actuel ou futur permettant d'obtenir une cellule génétiquement l1 modifiée (par exemple: transfection, lipofection, infection, bombardement de particules, etc...); - I'exposition de ces cellules à l'échantillon à tester et/ou susceptible de contenir une substance toxique et/ou mutagène; - lI'addition d'un ligand direct ou indirect d'un produit de l'expression du gène ou du substrat ou du produit ou de tout intermédiaire réactionnel, chacun pouvant être naturels ou synthétiques, ledit ligand étant couplé ou susceptible d'être couplé directement ou indirectement a une molécule émettrice d'un signal de détection; - la détection de la présence ou de l'absence du signal, après un temps suffisant pour qu'un éventuel effet mutagène entraîne soit une modification du produit d'expression du gène, soi tune accumulation de substrat, ou l'absence d'apparition de produit ou d'intermédiaires réactionnels évoquant directement ou indirectement une perte de la fonction liée au produit d'expression. Dans la mesure o la dégradation des AGTLCs dans le péroxysome n'est pas le résultat direct de la fonction de l'ALDP, mais d'une enzyme associée de manière directe ou indirecte à l'ALDP, il est entendu par substrat, produit et intermédiaires réactionnels, tout composé naturel ou synthétique pouvant interagir avec cette enzyme associée et conduisant

à un événement de détection ou d'absence de détection similaire.

L'invention porte de la même façon sur une méthode d'évaluation de la mutagénicité de rayonnements mettant en oeuvre les mêmes étapes que celles proposées pour la détection d'une substance, sauf que la deuxième étape d'exposition à la substance est remplacée par une exposition aux rayonnements à tester. Ce procédé peut être particulièrement avantageux pour évaluer l'efficacité de substances protectrices, comme des crèmes de protection, ou des matériaux

protecteurs, comme ceux utilisables un radioprotection.

Un gage de la fiabilité de la détection de l'effet mutagène de la substance ou du rayonnement est que les cellules soient déficientes dans leur système de réparation de l'ADN. En effet, les cellules normales pourvues de systèmes endogènes de réparation des lésions de l'ADN, en particulier en ce qui concemrne les mutations ponctuelles, présentent une certaine résistance à l'effet toxique des substances, ladite résistance résultant d'un équilibre entre les mutations induites et les réparations

consécutives au fonctionnement du système de réparation de la cellule.

Pour augmenter la sensibilité du système de détection, la présente invention préconise la mise en oeuvre de tout type cellulaire déficient io précisément dans un ou plusieurs de ces systèmes de réparation. Les cellules déficientes dans leur système de réparation devront présenter un bon équilibre entre leur stabilité en culture in vitro, leur viabilité et leur taux

de mutations spontanées.

Toutes les cellules issues de patients porteurs de maladies génétiques résultant de la déficience d'un ou plusieurs de ces systèmes de réparation peuvent ainsi être envisagées. A titre d'exemple, on peut citer des cellules de patients atteints de xeroderma pigmentosum (XP), une maladie génétique comportant au moins sept groupes de complémentation et pour lesquels l'atteinte des mécanismes de réparation de l'ADN est bien documentée (47). On peut également citer des cellules de patients atteints de la trichothiodystrophie (TTD) (48) ou le syndrome de cockayne (CS) (49)

respectivement ou de façon, plus générale, les cellules Hrea définies ci-

dessus. Les levures sont également des cellules avantageuses pour les besoins des méthodes ou procédés de l'invention. En effet, les levures comportent de très nombreux mutants caractérisés par une déficience dans les systèmes de réparation, comme les différentes souches mutantes pour les gènes Rad. Ces mutants peuvent servir de souches Hrea. En outre, des gènes orthologues aux différents transporteurs ATP-dépendants

humains et murins (dont le gène ALD) y ont été identifiés.

Dans la méthode de détection de l'invention, la présence de l'effet mutagène d'une substance ou du rayonnement sera établie par

l'absence d'un produit d'expression du gène ALD.

Toutes les techniques connues de détection de la présence d'une protéine synthétisée dans une culture de cellules in vitro y sont utilisables, ceci sans préjuger du développement de techniques nouvelles

dont l'utilisation est incluse de fait dans la présente invention.

A titre d'exemple, on pourra utiliser comme ligand un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique ou un fragment réactif de celui-ci. Mosser et al. (réf. 9) ont décrit deux anticorps monoclonaux

reconnaissant respectivement les domaines N et C terminaux de I'ALDP.

Par ailleurs, Watkins et al. (20), d'une part, et Kobayashi et al. (50) ont

décrit chacun un anticorps monoclonal reconnaissant l'extrémité C-

terminale de I'ALDP.

Tous ces anticorps permettent la détection de I'ALDP par immunofluorescence indirecte. Leurs caractéristiques spécifiques sont

incorporées ici par référence.

L'anticorps ou le fragment réactif de celui-ci peut être modifié

chimiquement de façon à agir sur un substrat chromogène.

Tout ligand ou anticorps polyclonal ou monoclonal ou fragment réactif de ceux-ci est modifié de façon à obtenir de manière directe ou indirecte une évaluation de la présence ou l'absence de I'ALDP, d'une protéine homologue ou associée. En effet, la présence ou l'absence de î'ALDP peut être identifiée par tout type de signal de

détection: colorimétrique, fluorescent, phosphorescent, chemolumines-

cent turbidimétique ou électronique. Généralement, la production de ce type de signal est réalisée soit par action directe de la molécule couplée, soit par détection indirecte par une molécule affine ou un anticorps

secondaire, soit par transformation d'un substrat par une enzyme elle-

même couplée de façon directe ou indirecte au ligand. L'ensemble des méthodes de couplage aujourd'hui très nombreuses ou d'autres susceptibles d'être mises au point peuvent être utilisées aux fins précitées. Le moyen de détection et éventuellement de quantification du signal émis dépend de la nature de ce dernier. En cas de signal fluorescent, un trieur de cellules de type FACS (pour fluorescent absorbions cells sorter) pourrait être avantageusement utilisé. De la même façon, tout système basé sur une analyse microscopique couplée avec des analyseurs d'images peut permettre également la détection et la quantification des signaux. On pourra également citer à titre d'exemple les détecteurs de type ChemScan commercialisés par la société

CHEMUNEX (41 rue du 11 novembre 1918 94700 MAISONS ALFORT).

De la même façon, dans la méthode de détection de l'invention, le produit d'expression du gène peut être un ARN, le ligand une sonde de détection spécifique. On détecte l'effet d'une mutation potentielle par la diminution ou l'absence d'ARN messager spécifique du gène ALD synthétisé. Le ligand alors utilisé sera une sonde spécifique de l'ARN messager à savoir une sonde susceptible de différencier la séquence du messager de la séquence de I'ADN génomique correspondant. Un moyen simple pour ce faire est d'utiliser des sondes dont la séquence sera complémentaire de deux fragments non adjacents sur l'ADN génomique et adjacents sur l'ARN messager comme par exemple la partie 3' d'un exon n et la partie 5' d'un exon n+1. Tout autre moyen susceptible de différencier un ADN génomique de l'ARN messager ou de façon plus générale l'absence d'une transcription normale de l'ADN génomique pourra être mis à profit pour détecter la présence d'une substance potentiellement

mutagène dans un échantillon.

L'invention porte également sur une méthode de détection d'une substance mutagène dans un échantillon qui résulte de l'observation selon laquelle la mutation dans le gène ALD, de son équivalent ou d'une protéine associée est caractérisée sur le plan biochimique par un déficit de s la beta-oxydation des acides gras des AGTLCs. L'accumulation des acides gras ou plus exactement leur non-dégradation, révèle donc la présence d'une mutation dans ce gène comme dans tout gène impliqué directement ouindirectement dans le processus de beta-oxydation des AGTLCs et donc révèle probablement l'effet mutagène d'une substance dans

l'échantillon analysé.

Par ailleurs, les composés issus du métabolisme lipidique et mettant en jeu des AGTLCs, comme par exemple certains esters du cholestérol, ou des produits de dégradation de ceux-ci, comme par exemple l'acétyl-CoA, peuvent être mis en oeuvre au même titre que les

AGTLCs dans les méthodes et les kits de l'invention.

D'une manière générale, tout composé chimique naturel ou de synthèse, non marqué ou marqué de manière directe ou indirecte permettant de mettre en évidence la perte de fonction de l'ALDP, de ses homologues, ou des protéines associées à l'ALDP de manière directe ou indirecte, sans limitation d'espèce, fait partie intégrante de la présente invention. Dans ce qui suit, on distinguera, d'une part, les composés, marqués ou non, destinés à être mis au contact des cellules ab initio et pendant la culture (composés A), que ces composés soient naturels, ou artificiels et obtenus par voie chimique et, d'autre part, les composés recherchés spécifiquement lors de l'étape de détection (composés B) qu'ils soient métabolisés ou non par ces mêmes cellules, étant entendu que, quelque soit le composé A utilisé, le composé B détecté peut être soit strictement identique à A, soit un dérivé métabolique de A par métabolisme beta-oxydatif peroxisomal, soit d'analogues de ceux-ci issus de la synthèse chimique, et ce quelle que soit la méthode de détection employée. A titre d'exemple, dans le cas o le composé A mis au contact des cellules est constitués d'AGTLCs marqués, les composés B recherchés à l'étape de détection peuvent être soit ces mêmes AGTLCs marqués, soit un de leurs dérivés métaboliques comme l'acétyl-CoA, sans préjuger du fait que la méthode utilisée mette en évidence la présence ou l'absence du composé recherché. Dans ce contexte, I'invention porte également sur une méthode de détection d'une substance ou d'un rayonnement mutagène comprenant la culture de cellules eucaryotes porteuses d'un ou plusieurs gènes codant pour un produit Hsens, soit naturellement, soit introduit par génie génétique de manière stable ou transitoire et susceptible d'être mutées par une substance contenue dans un échantillon ou par un rayonnement, ces cellules étant déficientes dans le système de réparation de l'ADN. Dans la méthode de l'invention, la culture est préalablement réalisée en présence de composé A (en particulier des acides gras à très longue chaîne) marqués directement ou indirectement avec un marqueur générateur d'un signal notamment fluorescent, chemoluminescent ou

colorimétrique.

De la même façon, la culture peut être réalisée en présence

des composés issus du métabolisme lipidique et cités ci-dessus.

Ainsi, les acides gras qui ont été internalisés suite à la culture des cellules en leur présence pourront être détectés et leur quantité mesurée. Cette dernière reflète directement la présence de mutations dans le gène codant pour un produit Hsens comme dans tout gène impliqué directement ou indirectement dans le processus de beta-oxydation des AGTLCs. Un exemple avantageux des gènes codant pour un produit

Hsens est celui de l'ALD, codant pour I'ALDP.

La méthode de l'invention consiste à exposer ces cellules ayant préalablement internalisé le composé A à l'échantillon susceptible de contenir une substance mutagène ou à la source de rayonnement potentiellement mutagène, puis à détecter la persistance ou l'évanescence de composés B. Dans le cas o le produit Hsens est l'ALDP et le composé A correspond aux AGTLCs, cette détection (qui peut être la persistance de ces mêmes AGTLCs dans certaines cellules) reflète directement la présence de mutations dans l'ALDP, comme dans tout gène impliqué directement ou indirectement dans le processus de beta- oxidation peroxisomale. Dans la suite de ce document, les différentes étapes sont principalement décrites en référence aux AGTLCs en tant que composés A et B, étant entendu que la présente invention s'applique également à tout

type de composés A et B tels que décrits précédemment.

Différents types de marquage sont susceptibles d'être envisagés. Leur choix dépendra du moyen de détection et/ou de mesure

envisagé, à savoir de type de microscope ou de FACS tel que cités ci-

dessus. En revanche, et contrairement à l'approche négative précédente o l'effet mutagène induit une absence de la protéine correspondante, la présente approche positive permet d'envisager un marquage direct des AGTLCS. Le marquage à l'or colloïdal, est un moyen connu, mais non limitatif, particulièrement approprié pour cette mise en oeuvre et d'autres types de marquages direct ou indirect, en particulier fluorescent, phosphorescent, chemoluminescent, coloré, d'affinité (un exemple d'une telle molécule pouvant être la biotine) ou à l'aide d'un ion métallique sont inclus dans le présent procédé. Les méthodes turbidimétriques ou

électroniques peuvent également être utilisées.

Les AGTLCs pourront également être transformés chimiquement par la biotine, I'avidine ou un dérivé de ceux-ci de façon à être couplés indirectement à une enzyme qui agira sur un substrat chromogène. Dans tous les moyens de marquage utilisés, la quantité de marquage résiduelle après exposition à l'échantillon sera le reflet direct de lI'effet mutagène d'une substance sur le gène de l'ALD. Chaque fois que la nature du toxique pourra être connue à l'avance, le présent procédé permet l'évaluation de la dose présente, par mesure directe du nombre de cellules mutées, ce nombre étant sensiblement constant pour une dose donnée d'un composé donné. Le présent procédé permet la mise en place d'une gamme étalon permettant de relier directement le nombre de cellules mutées à la dose de composé toxique et/ou mutagène présente depuis le point zéro jusqu'au point de perte de viabilité cellulaire considéré comme la limite supérieure de mutagénicité et/ou de toxicité, point au-delà duquel la mort cellulaire des cellules exposées à la substance est supérieure de manière significative à celle observée pour une souche contrôle non exposée. Il permet en outre bien évidemment d'évaluer directement la LD50 (dose pour laquelle la

viabilité cellulaire est réduite de 50 %).

La présente invention inclut également l'utilisation dans la méthode exposée ci-dessus de composés A marqués ou non marqués, en particulier d'AGTLCs, ou de leurs dérivés ou d'analogues issus de la synthèse chimique, l'étape de détection étant constituée d'un dosage biochimique de ces mêmes composés ou de leurs dérivés métaboliques, en particulier par beta-oxidation peroxisomale, après un temps suffisant d'exposition à l'échantillon de substance ou à la source de rayonnement à tester. La variation de dosage observée par rapport à une culture témoin non-exposée est également une mesure de la présence d'un effet mutagène. La présence ou l'évanescence des AGTLCs peut également être détectée par couplage avec un ligand spécifique, lui-même, marqué directement ou indirectement par une molécule émettrice d'un signal de détection notamment fluorescent, phosphorescent, chemoluminescent ou colorimétrique. Ce ligand peut être un anticorps monoclonal spécifique des AGTLCs ou un fragment réactif de celui-ci. La présente invention porte également sur un procédé d'évaluation de la mutagénicité d'une substance ou d'un rayonnement quelconques. La recherche industrielle et notamment la recherche pharmaceutique utilise aujourd'hui de plus en plus le screening à grande échelle de substances ayant un effet pharmacologique. Des techniques sont aujourd'hui à la disposition des laboratoires pour mesurer un effet direct d'une substance par exemple sur une cible donnée. Ce sont les technique dites " throughput screening methods" et permettent très rapidement parmi des millions de molécules d'identifier des composants leaders (leads). Toute substance à effet pharmacologique doit bien entendu être active mais également ne pas être toxique. Le procédé de l'invention peut ainsi permettre avec beaucoup plus de fiabilité et de spécificité que celles décrites plus haut pour le test d'Ames d'évaluer l'effet toxique ou non toxique d'une substance candidate par exemple en pharmacologie ainsi identifiée. De la même façon, le procédé permet de valider une étape dans un procédé d'obtention et/ou de purification d'une

molécule à utilisation thérapeutique.

L'invention porte donc sur un procédé d'évaluation de la mutagénicité d'une substance ou d'un rayonnement identifiés mettant en oeuvre au moins les étapes suivantes: - la culture de cellules eucaryotes Hrea comprenant un gène ALD sauvage ou un homologue de celui-ci ou un gène d'une protéine associée susceptible d'être muté par ladite substance; - la détection de la présence ou de l'absence du signal, après un temps suffisant pour qu'un éventuel effet mutagène entraîne une modification de la nature ou de la quantité du produit d'expression du gène; - I'exposition de ces cellules eucaryotes à la substance susceptible d'être une substance mutagène; - la culture étant réalisée en présence d'acides gras à très longues chaînes (AGTLCs) marqués directement ou indirectement avec un marqueur; - la détection de la persistance ou de l'évanescence des AGTLCs marqués

reflétant la présence ou l'absence d'une mutation dudit gène.

Les cellules utilisées dans ce procédé sont comme pour les io méthodes décrites ci-dessus des cellules déficientes dans le système de réparation de l'ADN. Tous les moyens de détection, d'identification et de quantification sont également ceux décrits ci-dessus. Un marquage direct à

l'or colloïfdal est particulièrement adapté dans le cas présent.

Il en est de même pour un procédé d'évaluation de la mutagénicité d'une substance qui met en oeuvre les étapes suivantes: - I'exposition à l'échantillon de cellules eucaryotes en culture comprenant un gène ALD sauvage ou un homologue de celui-ci ou un gène d'une protéine associée susceptible d'être muté par ladite substance; - I'addition d'un ligand d'un produit d'expression du gène, ledit ligand étant couplé ou susceptible d'être couplé directement ou indirectement à une molécule émettrice d'un signal de détection; - la détection de la présence ou de l'absence du signal, après un temps suffisant pour qu'un éventuel effet mutagène entraîne une modification de la nature ou de la quantité du produit d'expression du gène; La notion de temps suffisant pour qu'un éventuel effet mutagène entraîne une modification métabolique de type arrêt ou diminution de la synthèse des protéines ALDP ou au contraire persistance ou non diminution de la présence des AGTLCs sera appréciée en fonction de la nature du système cellulaire utilisé et de la rapidité de son système métabolique. Aussi, sera-t-il toujours déterminé en fonction d'une étude sur un système témoin dans lequel aucune substance potentiellement toxique

ou mutagène n'aura été ajoutée.

s La mise en oeuvre des procédés et méthodes de l'invention sera toujours précédée d'une évaluation d'un éventuel bruit de fond du système cellulaire lié à l'anomalie de réparation. Cette évaluation pourra être réalisée par immunocytochimie par exemple. Par ailleurs, des tests d'activité enzymatique et immunocytochimiques à partir d'extraits cellulaires

bruts seront mis en place pour déterminer le degré d'atteinte cellulaire.

Pour chaque type cellulaire particulier, une attention particulière sera portée sur la durée nécessaire à l'extinction de l'expression. Comme cela a été dit plus haut, r'ALDP est une protéine de péroxysome. Il est admis que les péroxysomes se divisent par bourgeonnement, et donc l'effet mutagène se manifestant par une extinction de l'expression de l'ALDP devrait intervenir environ après cinq divisions cellulaires. Néanmoins, cette durée devra être validée dans chaque système. De la même façon, dans les cellules de xeroderma pigmentosum, non exposées à une condition toxique, I'évanescence des AGTLCs intervient environ en 24 h. L'invention porte également sur l'utilisation des procédés et méthodes de l'invention à l'évaluation de compositions notamment à usage cosmétique ou médical, ou à celle de matériaux de protection contre le rayonnement, quant à leur capacité de protection à l'égard dudit rayonnement. L'invention peut être particulièrement avantageuse dans une

utilisation pour la protection de la peau, ou d'un corps humain ou animal.

La présente invention porte sur des lignées cellulaires génétiquement modifiées porteuses du gène ALD, ALDR, d'un gène codant pour une protéine péroxysomale ou pour un demi-transporteur, ou encore pour toute protéine pouvant être associée à l'ALDP comme défini plus

haut. Ces lignées cellulaires peuvent être eucaryotes ou procaryotes.

Elles peuvent constituer un modèle de tissu artificiel, en

particulier la peau.

Dans le cas des lignées eucaryotes, un gène d'une autre espèce peut être introduit dans une lignée humaine comme, à titre d'exemple, et sans que cette liste soit limitative, les gènes ALD, ALDR, PMP70, PMP69, PMP68, PAL1 etc... de rat, de souris, de hamster. Dans la mesure o les anticorps dirigés contre les différents produits d'expression o0 ne présentent pas de réactions croisées, il est possible de distinguer les produits d'expression de chaque gène introduit de la ou des copies endogènes. Un exemple pourrait être l'intégration du gène ALD de souris dans une lignée humaine Hrea (type xeroderma). Le principe serait le suivant: à partir d'une culture de cellules humaines Hrea (type xeroderma) comportant d'une part un gène ALD humain endogène, d'autre part un ou plusieurs gènes ALD provenant d'une autre espèce et introduit par génie génétique de manière stable (intégré au génome) ou transitoire (extrachromosomique), I'exposition à une condition toxique peut conduire à une mutation dans un ou plusieurs des gènes présents. Si ces gènes sont tous issus d'une espèce différente, il est possible de suivre la présence de chaque protéine à l'aide d'un anticorps spécifique porteur d'un marquage différent. Le principe décrit ci-dessus s'applique également et en particulier à tout système mettant en jeu des cellules de levure génétiquement modifiées, sans limitation sur l'origine d'espèce du transgène. Les cellules de levure utilisées pourraient être, à titre

d'exemple, des cellules mutées dans les gènes Rad.

De cette façon, il est peut-être possible de quantifier combien de gènes (quelle que soit l'espèce d'origine) sont mutées par la mesure de la vitesse d'apparition du signal spécifique des AGTLCs. En effet, il est probable qu'il existe une corrélation entre la quantité de protéine

fonctionnelle résiduelle et la vitesse d'apparition du signal.

De la même façon, toute bactérie porteuse à l'état intégré ou sur un plasmide d'un gène de protéine péroxysomale de type ALD, quelle que soit l'espèce et permettant de réaliser le test dans un système procaryote fait également partie de l'invention. Ce test a un avantage considérable par rapport au test d'Ames car l'ALDP peut être exprimé dans les bactéries (cela nous a permis d'obtenir la quantité de protéine

nécessaire à la production des anticorps).

La présente invention porte également sur une trousse de diagnostic de la présence d'une substance mutagène dans un échantillon comprenant un ligand ou un fragment de celui-ci spécifique d'un produit d'expression Hsens comme I'ALDP, ou d'une protéine homologue ou associée, le ligand étant modifié chimiquement de façon à agir directement ou indirectement sur un substrat émetteur d'un signal. Le signal peut

notamment être luminescent, chemoluminescent, colorimé-

trique, turbidimétrique ou électronique; il peut être obtenu par

transformation d'un substrat chromogène par une enzyme.

L'invention porte également sur différentes trousses de diagnostic comprenant les moyens de détecter de façon quantitative et/ou

qualitative l'effet mutagène d'une substance ou d'un rayonnement.

Quand il s'agit d'une détection positive de la persistance ou de l'évanescence des AGTLCs ou des composés dérivés du métabolisme lipidique (composés B) dans des cellules précultivées en présence desdits composés A marqués, la trousse pourra comprendre à titre d'exemple des cellules Hrea et des cellules témoins, lesdits composés A, marqués par exemple directement à l'or colloïdal ou tout autre type de marquage direct ou indirect et un moyen de détection du composé B, comme par exemple, un anticorps monoclonal spécifique du composé B ou du marqueur couplé au composé A que ce composé soit métabolisé ou non, ou tout autre moyen approprié permettant de détecter de manière directe ou indirecte la

perte de fonction beta-oxidative.

Dans le cas d'une détection négative caractérisée par l'absence de synthèse d'une protéine Hsens, en partiuclier de l'ALDP ou d'une protéine homologue ou associée de manière directe ou indirecte à l'ALDP, la trousse pourra comprendre en particulier des cellules Hrea et des cellules témoins, et un anticorps monoclonal spécifique de ladite

protéine Hsens ou un fragment réactif de celui-ci.

L'anticorps monoclonal ou un fragment réactif de celui-ci sera modifié chimiquement de façon à agir directement ou indirectement sur un

substrat susceptible de donner un signal.

Le test est applicable à tout composé issu de l'industrie chimique ou isolé à partir d'éléments naturels, vivants ou non. Ceci comprend notamment les substances destinées à l'alimentation directement (colorants, conservateurs, arômes, etc...), ou indirectement (substances entrant dans la composition des emballages, composés chimiques destinés au traitement des végétaux dans un but de protection, conservation, croissance, etc...). Il est également applicable aux composés utilisés dans les traitements anticorrosion, les peintures et les vernis, aux produits synthétisés ou isolés pour un usage cosmétique ou thérapeutique (médicaments), etc... Le test peut être pratiqué plus généralement pour toute substance pouvant se trouver en contact direct ou indirect avec I'homme et les animaux ou les végétaux, ceci comprenant l'analyse des effluents industriels liquides, solides ou gazeux, des sols de sites pollués,

des nappes phréatiques, etc...

L'ensemble des exemples qui suivent sans être limitatifs sont de nature à illustrer l'invention et les performances qu'elle peut développer

au regard de l'évaluation de la toxicité mutagène d'une substance.

Exemple 1: Détection d'une persistance de la présence

d'AGTLCS cellulaires.

Cette approche, dite approche positive, permet de conclure à lI'existence d'une mutation dans le gène ALD quand il y a persistance de la

présence des acides gras dans la cellule.

Les fibroblastes de patients atteints de Xeroderma Pigmentosum sont cultivés en milieu Dulbecco's Minimal Essential Medium

(DMEM), 10 % FCS jusqu'à 107 cellules en enceinte à 37 C sous 5 % C02.

A ce stade, le milieu est renouvelé et supplémenté avec le composé toxique pendant 12 heures. Le milieu est alors éliminé et les cellules sont

lavées 3 fois dans du PBS pendant 2 mn.

La culture est à nouveau reprise durant 5 jours en milieu DMEM, 10 % FCS supplémenté avec un mélange VN d'acides lignocérique et cérotique (C24:0 et C26:0 respectivement) marqués à l'or colloïfdal (Nanoprobes) et solubilisés dans une solution Tris-HCI pH 8,5, alpha-cyclodextrine (10 mg/ml). Le milieu est écarté et les cellules sont lavées 3fois2 mn par du PBS, Triton X-1000,1 %, puis traitées à la trypsine et transférées dans des tubes de Leighton o elles sont cultivées

24hà37 C.

Après un lavage de 2 fois 2 mn par du PBS, Triton X-100 0,1 %, les cellules sont fixées dans une solution, paraformaldéhyde (PFA) 4 % pendant 4 mn, puis perméabilisées par deux passages successifs de mn dans PBS, Triton X-100 0,1 %. La présence de particules d'or intracellulaires est révélée par amplification à l'argent (Nanoprobes) et

observée en microscopie optique.

Exemple Il: Mesure de l'inhibition de la synthèse de l'ADLP après exposition à une substance potentiellement mutagène: Cette approche dite négative permet d'évaluer un effet mutagène en mesurant l'écart des taux de synthèse de l'ADLP obtenus après exposition avec une substance connue comme non mutagène et

avec la substance à tester.

Les lymphoblastes de patients atteints de Xeroderma Pigmentosum sont cultivés dans 15 ml de milieu RPMI, 10 % FCS jusqu'à atteindre 107 cellules. A ce stade, les cellules sont collectées par o centrifugation et remises en suspension dans 15 ml de milieu frais, en prenant soin de dissocier les amas cellulaires par des aspirations répétées à l'aide d'une pipette. La suspension cellulaire est alors supplémentée avec le composé toxique et incubée pendant 24 heures. Les cellules sont à nouveau collectées par centrifugation et remise en suspension dans 10 ml de PBSx1 pendant 5 mn. Cette étape est répétée 3 fois afin d'éliminer toute trace de mutagène dans la culture. Apres une dernière centrifugation, les cellules sont reprises dans 15 ml de milieu RPMI, 10 % FCS dans des flacons de 125 ml, les amas cellulaires sont dissociés à la pipette et la

culture est laissée au repos en incubateur pendant 5 jours.

Les cellules sont alors à nouveau collectées par centrifugation et fixées par remise en suspension dans une solution PBSxl, paraformaldéhyde (PFA) 4 % pendant 4 mn. La perméabilisation de la membrane cellulaire est obtenue par deux passages successifs de 5 mn dans PBSx1, Triton X-100 0,1 %. A ce stade, les cellules peuvent être

stockées à 4 C dans du PBSxl, Azide de Na 0,05 %.

Les cellules sont ensuite traitées pendant 1 heure dans une

solution PBSx1, BSA 3 %, puis lavées 2 fois 10 mn dans PBSxl, Triton X-

0,1 %, et remise en suspension dans 1 ml de PBS xl. Cette suspension est additionnée avec l'anticorps monoclonal anti-ALDP (ascite

diluée 1/2000, surnageant d'hybridome non-dilué) et incubée 1 heure-

12 heures à température ambiante.

Les cellules sont lavées 2 fois dans PBSxl, Triton X-

0,1 % et incubées en présence de l'anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-souris couplée à la Biotine, Jackson Immunoresearch Laboratories) dilué au 1/200 et d'lgG de chèvre (Jackson Immunoresearch

Laboratories) dans la solution de lavage pendant 1 heure.

Trois lavages successifs dans PBSxl, Triton X-100 0,1 % sont réalisés et les cellules sont mises en présence de Streptavidine-Cy3 (Jackson Immunoresearch Laboratories) diluée au 1/1000 dans la solution

de lavage pendant 30 mn.

Après deux lavages de 10 mn dans PBSxl, Triton X-

0,1 %, puis 10 mn dans PBSxl seul, le réactif de Hoechst (5pg/ml dans PBSxl) est ajouté. Les cellules sont alors lavées 2 fois 10 mn dans PBSx1 et remises en suspension dans 5 ml de PBSxl pour l'analyse en

cytométrie de flux.

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46) Wang Z.X., Kumar N.R. and Srivastana D.K. (1992) A novel spectroscopic titration method for determining the dissociation constant and

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48) Lehman A.R. (1989) Trichothiodystrophy and the relationship between

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Claims (23)

REVENDICATIONS

1. Méthode de détection d'une substance mutagène dans un échantillon ou d'un rayonnement mutagène comprenant: - I'exposition de cellules eucaryotes Hrea en culture comprenant au moins un gène codant pour un produit d'expression Hsens à un échantillon susceptible de contenir une substance mutagène ou à un rayonnement; - I'addition d'un ligand d'un produit d'expression du gène, ledit ligand étant couplé ou susceptible d'être couplé directement ou indirectement à une molécule émettrice d'un signal de détection, - la détection de la présence ou de l'absence du signal, après un temps suffisant pour qu'un éventuel effet mutagène entraîne une modification du

produit d'expression du gène.

2. Méthode de détection selon la revendication 1 caractérisée en ce que le gène est l'ALD, le produit d'expression Hsens est la protéine ALDP.

3. Méthode de détection selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le ligand est un anticorps monoclonal spécifique du

produit Hsens ou un fragment réactif de celui-ci.

4. Méthode de détection selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'anticorps ou le fragment de celui-ci est couplé directement ou

indirectement sur une molécule émettrice d'un signal de détection.

5. Méthode de détection selon la revendication 1 caractérisée en ce que le produit Hsens est le mARN et le ligand est une sonde de

détection spécifique.

6. Méthode de détection selon l'une des revendications 1 à 5

caractérisée en ce que le signal détecté est un signal fluorescent, phosphorescent, chemoluminescent, colorimétrique, turbidimétrique ou électronique.

7. Méthode de détection selon l'une des revendications 1 à 6

caractérisée en ce que les cellules eucaryotes sont des cellules Hrea

déficientes dans leur système de réparation de l'ADN.

8. Méthode de détection de la présence d'une substance ou s d'un rayonnement mutagène dans un échantillon comprenant: - la culture de cellules eucaryotes Hrea comprenant un gène codant pour un produit Hsens susceptible d'être muté par une substance contenue dans un échantillon ou par le rayonnement, - la culture étant réalisée en présence des composés interagissant avec le o0 produit Hsens de manière directe ou indirecte marqués directement ou indirectement avec une molécule émettrice d'un signal de détection, - I'exposition de ces cellules à l'échantillon susceptible de contenir une substance mutagène ou du rayonnement, - la détection de la persistance ou de l'évanescence des composés A ou is I'apparition des composés B reflétant la présence ou l'absence d'une

mutation dudit gène.

9. Méthode selon la revendication 8 caractérisée en ce que les composés A sont des acides gras à très longues chaînes AGTLCs ou des dérivés métaboliques, soit d'analogues de ceux-ci issus de la synthèse

chimique et mettant en jeu des AGTLCs.

10. Méthode selon la revendication 9 caractérisée en ce que les composés B sont des AGTLCs ou des dérivés métaboliques de ceux-ci par métabolisme beta-oxidatif peroxisomal, ou d'analogues de ceux-ci

issus de la synthèse chimique.

11. Méthode selon l'une des revendications8 à 10

caractérisée en ce que le gène est celui de l'ALD et le produit d'expression

Hsens est la protéine ALDP.

12. Méthode de détection selon l'une des revendication 8 à 1 1 caractérisée en ce que les cellules eucaryotes sont des cellules déficientes

dans leur système de réparation de l'ADN.

13. Méthode de détection selon la revendication 8 caractérisée en ce que les composés A sont marqués directement et la quantité de marquage résiduel détectée après exposition à l'échantillon est une mesure de la présence d'un effet mutagène de la substance ou du rayonnement.

14. Méthode de détection selon l'une des revendications 8 à

13 caractérisée en ce que les composés A sont marqués indirectement par couplage avec un ligand spécifique lui-même marqué directement ou o0 indirectement par une molécule émettrice d'un signal fluorescent, phosphorescent, chemoluminescent, colorimétrique, turbidimétrique ou électronique.

15. Méthode de détection selon la revendication 14 caractérisée en ce que le ligand est un anticorps monoclonal spécifique

des AGTLCS ou un fragment réactif de celui-ci.

16. Méthode de détection selon l'une des revendications 8 à

caractérisée en ce que la culture est réalisée en présence d'AGTLCs.

17. Procédé d'évaluation de la mutagénicité d'une substance ou d'un rayonnement quelconque mettant en oeuvre au moins les étapes suivantes: la culture de cellules eucaryotes Hrea comprenant au moins un gène codant pour un produit Hsens susceptible d'être muté par ladite substance ou le rayonnement, - la culture étant réalisée en présence des composés A qui sont: soit des acides gras à très longues chaînes AGTLCs; soit des composés issus du métabolisme lipidique et mettant en jeu des AGTLCs; marqués directement ou indirectement avec une molécule émettrice d'un signal fluorescent, chemoluminescent ou colorimétrique, turbidimétrique ou électronique, - I'exposition de ces cellules eucaryotes à la substance susceptible d'être une substance mutagène, ou au rayonnement, - la détection de la persistance ou de l'évanescence des composés A, ou lI'apparition de composés B issus du métabolisme des composés A

marqués reflétant la présence ou l'absence d'une mutation dudit gène.

18. Procédé d'évaluation de la mutagénicité d'une substance quelconque ou d'un rayonnement mettant en oeuvre au moins les étapes suivantes I'exposition de cellules eucaryotes en culture comprenant au moins un gène codant pour un produit d'expression Hsens à l'échantillon susceptible d'être muté par ladite substance, - I'addition d'un ligand d'un produit d'expression du gène, ledit ligand étant couplé ou susceptible d'être couplé directement ou indirectement à une molécule émettrice d'un signal de détection, - la détection de la présence ou de l'absence du signal, après un temps suffisant pour qu'un éventuel effet mutagène entraîne une modification du

produit d'expression du gène.

19. Procédé selon la revendication 17 ou 18 caractérisé en ce

que le gène est le gène ALD et son produit d'expression l'ALDP.

20. Trousse de diagnostic de la présence d'une substance mutagène dans un échantillon comprenant un anticorps monoclonal spécifique d'un produit d'expression Hsens, modifié chimiquement de façon

à générer directement ou indirectement un signal de détection.

21. Trousse de diagnostic de la présence d'une substance mutagène dans un échantillon comprenant au moins les composés A, marqués ou non, et un moyen de détection, soit de ces mêmes composés, soit de leurs dérivés métaboliques B.

22. Trousse de diagnostic de la présence d'une substance mutagène dans un échantillon comprenant un anticorps monoclonal ou un fragment réactif de celui-ci spécifique des composés A ou B et modifié chimiquement de façon à agir directement ou indirectement sur un substrat chromogène, turbidimétrique ou électronique.

23. Anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci

spécifique des AGTLCs.