FR2729761A1 - Sensitive enzyme immunoassay for cardiac troponine I - Google Patents

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Abstract

Sandwich type immunoassay of cardiac troponine I (I) uses 2 monoclonal antibodies (Ab) against (I), 1 being labelled with an enzyme. The Ab have, naturally or by cooperation, an equilibrium dissociation constant for (I) <= 10<-8> (pref. 10<-9>) M. A chemiluminescent substrate (II), derived from a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane, is used for enzymatic detection. Also claimed is a kit for carrying out the above assay.

Description

La présente invention concerne un procédé de dosage ultrasensible de la troponine I cardiaque, effectué par chimiluminescence. The present invention relates to a method for the ultrasensitive assay of cardiac troponin I, performed by chemiluminescence.

L'infarctus du myocarde (IDM) représente toujours une urgence médicale et demeure la principale cause de mortalité et de morbidité cardia vasculaire dans le monde. Myocardial infarction (MI) continues to represent a medical emergency and remains the leading cause of cardiovascular mortality and morbidity worldwide.

Dans tous les cas, le traitement instauré a pour but de protéger le tissu myocardique de la nécrose irréversible. De nouveaux moyens thérapeutiques, comme les thrombolytiques ou l'angioplastie de première intention, permettent aujourd'hui de restaurer rapidement la circulation coronarienne, de façon à limiter la taille de la zone infarcie et de réduire l'incidence de la mortalité et de la morbidité. In all cases, the purpose of the treatment initiated is to protect the myocardial tissue from irreversible necrosis. New therapeutic means, such as thrombolytics or first-line angioplasty, now make it possible to quickly restore coronary circulation, so as to limit the size of the infarcted area and reduce the incidence of mortality and morbidity. .

Ces outils thérapeutiques sont d'autant plus efficaces qu'ils sont mis en oeuvre au plus tôt après le début des manifestations cliniques. Les cliniciens confrontés à cette pathologie doivent pouvoir disposer d'outils diagnostiques de plus en plus performants. These therapeutic tools are all the more effective when they are implemented as soon as possible after the onset of clinical manifestations. Clinicians confronted with this pathology must have access to increasingly efficient diagnostic tools.

Le dosage des protéines sériques et en particulier des enzymes est devenu un élément déterminant pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde et pour l'appréciation du succès ou de l'échec d'une reperfusion. The assay of serum proteins and in particular of enzymes has become a determining element for the diagnosis of myocardial infarction and for the assessment of the success or failure of reperfusion.

On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de 3 protéines, les troponines C, I et T. We know that troponin is a myofibrillar protein complex, made up of 3 proteins, troponins C, I and T.

La troponine I cardiaque est une protéine contractile exciusivement présente dans le muscle cardiaque [Wilkinson J.M. et al, Nature (1978), 271. p. 3135; Wade R. et al, Genomics (1990), 7, p. 346 357]. Cardiac troponin I is a contractile protein found exclusively in heart muscle [Wilkinson J.M. et al, Nature (1978), 271. p. 3135; Wade R. et al, Genomics (1990), 7, p. 346,357].

Son rôle physiologique est d'inhiber, en l'absence de calcium, I'activité ATPasique du complexe actine-myosine et donc d'empêcher la contraction musculaire [Perry S.V., Biochem. Soc. Trans (1979), L. p. 59S617]. Its physiological role is to inhibit, in the absence of calcium, the ATPase activity of the actin-myosin complex and therefore to prevent muscle contraction [Perry S.V., Biochem. Soc. Trans (1979), L. p. 59S617].

Lors de l'infarctus dû à l'obstruction de l'une des artères nourricières du coeur (artère coronaire), il apparaît une ischémie puis une nécrose myocardique qui se traduit par une destruction des cellules cardiaques et la libération de la troponine I cardiaque dans le sang. La troponine I représente donc un marqueur très spécifique de l'infarctus du myocarde. During an infarction due to the obstruction of one of the nourishing arteries of the heart (coronary artery), ischemia and then myocardial necrosis appears which results in destruction of cardiac cells and the release of cardiac troponin I in the blood. Troponin I therefore represents a very specific marker for myocardial infarction.

Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine I pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde [Am. Heart J. (1981), 110, p. 13341344; Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278]. Thus, the dosage of troponin I has recently been recommended for the early diagnosis of myocardial infarction [Am. Heart J. (1981), 110, p. 13341344; Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278].

De plus, il est désormais acquis que chez certains patients l'angor instable - qui représente une étape critique de l'ischémie myocardique -, peut être associé à un haut risque de survenue d'infarctus du myocarde ou de mort subite. In addition, it is now recognized that in some patients unstable angina - which represents a critical stage in myocardial ischemia - can be associated with a high risk of onset of myocardial infarction or sudden death.

Les études post-mortem sur cette catégorie de patients ont montré que l'apparition de ces complications était très souvent précédée de micro-infarctus cardiaques [Davies M.J. et al, Circulation (1985), 2, p. 699-708]. Post-mortem studies on this category of patients have shown that the appearance of these complications was very often preceded by cardiac micro-infarction [Davies M.J. et al, Circulation (1985), 2, p. 699-708].

Le dosage de la troponine I cardiaque semble donc être particulièrement intéressant dans la détection des sujets à risque, chez les patients atteints d'angor instable, plus spécialement pour le diagnostic des micreinfarctus. The dosage of cardiac troponin I therefore seems to be particularly advantageous in the detection of subjects at risk, in patients with unstable angina, more especially for the diagnosis of micreinfarctus.

Par ait leurs, le dosage de la troponine I peut être envisagé lors de la surveillance d'un traitement thrombolytique pour confirmer le succès ou l'échec de la reperfusion, comme aussi lors du suivi postopératoire des interventions en chirurgie cardiaque (pontages coronariens, angioplasties etc.). Le dosage de la troponine I trouve aussi son application dans le diagnostic des rejets de greffes cardiaques après transplantation et le suivi des thérapeutiques cardiotoxiques utilisant par exemple des anthracyclines. Therefore, the dosage of troponin I can be considered when monitoring a thrombolytic treatment to confirm the success or failure of reperfusion, as also during the postoperative follow-up of cardiac surgery interventions (coronary bypass surgery, angioplasties etc.). The dosage of troponin I also finds its application in the diagnosis of rejection of cardiac transplants after transplantation and the monitoring of cardiotoxic therapies using, for example, anthracyclines.

On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29(2). p. 271278 ; Clin. Chem. (1993), 39/6. p. 972-979] décrivent un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)- H202. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, selon les auteurs, est de 0,2 pg/l. Immunoenzymatic methods are already known for determining troponin I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29 (2). p. 271278; Clin. Chem. (1993), 39/6. p. 972-979] describe a sandwich-type immunoenzymatic assay method which uses the chromogenic substrate tetramethylbenzydine (TMB) - H202 for the enzymatic detection. After revelation, the absorbance reading is taken at 450 nm and the detection limit, according to the authors, is 0.2 pg / l.

Un autre procédé immunoenzymométrique de la troponine I décrit par Bodor et al permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1,5 à 3,1 ug/l [Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38/11, p. 2203-2214; Mas J. et al,
Circulation (1993), 88(12. p. 101-106]. Ce dosage utilise pour la révélation enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm.Another immunoenzymometric method of troponin I described by Bodor et al makes it possible to detect the latter at concentrations of the order of 1.5 to 3.1 µg / l [Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38/11, p. 2203-2214; Mas J. et al,
Circulation (1993), 88 (12. P. 101-106] This assay uses for the enzymatic detection a chromogenic substrate of alkaline phosphatase, p-nitrophenylphosphate, and the measurement is carried out at 405 nm.

Grâce à ces dosages, il a été possible de mettre en évidence la présence de la troponine I dans le plasma des patients, environ 4 heures après le début des manifestations cliniques de l'infarctus du myocarde [Adams J. et al,
Circulation (1993), 88(1), p. 101-106].Thanks to these assays, it was possible to demonstrate the presence of troponin I in the plasma of patients, approximately 4 hours after the onset of clinical manifestations of myocardial infarction [Adams J. et al,
Circulation (1993), 88 (1), p. 101-106].

Toutefois, la sensibilité de ces dosages immunoenzymométriques est largement inférieure à celle obtenue par des dosages basés sur des méthodes très sophistiquées et difficiles à mettre en oeuvre, par exemple des dosages basés sur la mesure de la radioactivité [Am. Heart Joumal, (June 1987), 113(6). p. 1333 1334]. However, the sensitivity of these immunoenzymometric assays is much lower than that obtained by assays based on very sophisticated and difficult to implement methods, for example assays based on the measurement of radioactivity [Am. Heart Joumal, (June 1987), 113 (6). p. 1333 1334].

On sait aussi que des dérivés cycliques d'hydrazines, notamment les diacylhydrazines, peuvent être utilisés comme réactifs de chimiluminescence [Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 2, p. 409-423]. L'utilisation de ces réactifs a été envisagée ou effectuée lors de certains dosages immunoenzymatiques [rhrope G.H.G. et al, Clin. Chem. (1985), 31. p. 1335-1341; Thrope G.H.G. et al,
Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353] (Demande WO 88/00695). Par ailleurs, on connaît des méthodes de détection par chimiluminescence mettant en oeuvre la décomposition enzymatique de dérivés du 1,2-dioxetane.It is also known that cyclic hydrazine derivatives, in particular diacylhydrazines, can be used as chemiluminescence reagents [Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 2, p. 409-423]. The use of these reagents has been considered or carried out during certain immunoenzymatic assays [rhope GHG et al, Clin. Chem. (1985), 31. p. 1335-1341; Thrope GHG et al,
Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353] (Application WO 88/00695). Furthermore, methods of detection by chemiluminescence are known which make use of the enzymatic decomposition of 1,2-dioxetane derivatives.

Toutefois, il est connu que la mise en oeuvre de ces réactifs nécessite des recherches intensives puisque l'homme de l'art est confronté à de multiples facteurs limitant pour la mise au point des dosages sensibles (affinité des différents composants de dosage et notamment du système antigène/anticorps, marqueur enzymatique, substrat, principe de détection etc.). En effet, un choix adéquat des différents réactifs et conditions de dosage s'impose. II est évident que l'on ne peut pas imaginer un dosage sensible et spécifique lorsque le bruit de la mesure (bruit de fond ou bruit de blanc) est important ou lorsque le rapport signal/bruit de la mesure est trop petit. Or justement ce bruit de la mesure dépend des différents réactifs et conditions de dosage choisis. However, it is known that the use of these reagents requires intensive research since the person skilled in the art is confronted with multiple limiting factors for the development of sensitive assays (affinity of the various dosage components and in particular of the antigen / antibody system, enzyme marker, substrate, detection principle, etc.). Indeed, an adequate choice of the various reagents and assay conditions is essential. It is obvious that one cannot imagine a sensitive and specific assay when the measurement noise (background noise or white noise) is high or when the signal / noise ratio of the measurement is too small. However, precisely this measurement noise depends on the various reagents and assay conditions chosen.

II a été maintenant trouvé qu'il était possible, en utilisant un certain type d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque et de substrats adéquats pour la révélation enzymatique, de procéder au dosage par chimiluminescence de la troponine I avec une très grande sensibilité. En effet, en appliquant le procédé de l'invention il est possible d'obtenir une sensibilité de l'ordre de 2 à 5 ng/l, ce qui représente une sensibilité 40 à environ 1500 fois supérieure à celles des procédés immunoenzymométriques de la troponine I les plus sensibles connus jusqu'à présent. It has now been found that it was possible, using a certain type of monoclonal anti-cardiac troponin I antibody and suitable substrates for enzymatic detection, to carry out the chemiluminescence assay of troponin I with very high sensitivity. Indeed, by applying the method of the invention it is possible to obtain a sensitivity of the order of 2 to 5 ng / l, which represents a sensitivity 40 to approximately 1500 times greater than those of the immunoenzymometric methods of troponin. I the most sensitive known so far.

La présente invention concerne un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich permettant le dosage quantitatif de la troponine I cardiaque caractérisé en ce que les substrats utilisés pour la révélation enzymatique sont des substrats chimiluminescents, choisis parmi un grand nombre de substrats chimiluminescents, en particulier des dérivés d'une diacylhydrazine ou du 1,2-dioxetane. The present invention relates to an immunoenzymatic assay method of sandwich type allowing the quantitative assay of cardiac troponin I, characterized in that the substrates used for the enzymatic revealing are chemiluminescent substrates, chosen from a large number of chemiluminescent substrates, in particular derivatives. a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane.

La présente invention a plus précisément comme objet, un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich, de la troponine I cardiaque: - qui met en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps ont. soit naturellement, soit par coopérativité une grande affinité pour la troponine I cardiaque, donc une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10 8
M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M.The present invention more specifically relates to a sandwich-type immunoenzymatic assay method for cardiac troponin I: which uses two monoclonal anti-cardiac troponin antibodies, one of which is coupled with an enzymatic marker, which antibodies have. either naturally or by cooperativity, a high affinity for cardiac troponin I, therefore a dissociation constant at equilibrium equal to or less than 10 8
M, preferably equal to or less than 10-9 M.

et - qui utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent qui est soit un dérivé d'une diacylhydrazine, soit un dérivé de 1,2-dioxetane.and - which uses for the enzymatic development a chemiluminescent substrate which is either a derivative of a diacylhydrazine, or a derivative of 1,2-dioxetane.

En effet, la présente invention conceme un procédé de dosage immunoenzymatique quantitatif de type sandwich de la troponine I cardiaque, caractérisé en ce que l'on met en contact les échantillons à doser ou les standards avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un autre anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, ces anticorps monoclonaux, soit naturellement, soit par effet de coopérativité, ayant pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 1t8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M, puis que l'on effectue la révélation enzymatique par addition d'un substrat chimiluminescent choisi et ensuite que l'on procède à la lecture directe du signal lumineux obtenu. In fact, the present invention relates to a method for quantitative immunoenzymatic assay of the sandwich type of cardiac troponin I, characterized in that the samples to be assayed or the standards are brought into contact with an anti-cardiac troponin I monoclonal antibody coupled to cardiac troponin I. an enzymatic marker and with another anti-cardiac troponin I monoclonal antibody, these monoclonal antibodies, either naturally or by cooperative effect, having for cardiac troponin I a dissociation constant at equilibrium equal to or less than 1t8 M, of preferably equal to or less than 10-9 M, then the enzymatic development is carried out by adding a chosen chemiluminescent substrate and then the direct reading of the light signal obtained is carried out.

Le procédé de l'invention peut être réalisé soit par un système manuel (kit de dosage de diagnostic) soit par un système automatisé. Selon le mode de réalisation, il est possible d'effectuer soit un dosage en un temps, soit un dosage en deux temps. The method of the invention can be carried out either by a manual system (diagnostic assay kit) or by an automated system. Depending on the embodiment, it is possible to carry out either a one-step dosing or a two-step dosing.

Pour le dosage en un temps, les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec un anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide. Après incubation et lavage, on procède à la révélation enzymatique. Cette demière est effectuée selon l'invention par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ou du 1.2-dioxetane. Ls quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu. For the one-step assay, the samples to be assayed or the standards are brought into contact simultaneously with a cardiac antitroponin I monoclonal antibody coupled to an enzymatic marker and with a second cardiac troponin I monoclonal antibody optionally fixed on a solid support. After incubation and washing, the enzymatic revelation is carried out. The latter is carried out according to the invention by adding a chemiluminescent substrate derived from a diacylhydrazine or from 1,2-dioxetane. The amount of cardiac troponin I present in the samples to be assayed or in the standards is evaluated by direct reading of the light signal obtained.

Pour le dosage en deux temps, on met en contact les échantillons à doser ou les standards, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, puis apres incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide et ensuite on incube de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide, puis après incubation et un éventuel lavage, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et ensuite on incube à nouveau. For the two-stage assay, the samples to be assayed or the standards are brought into contact, - either, first with an anti-cardiac troponin I monoclonal antibody coupled to an enzymatic marker, then after incubation, with a second anti-cardiac monoclonal antibody. - cardiac troponin I optionally fixed on a solid support and then incubated again, - either, first with an anti-cardiac troponin I monoclonal antibody optionally fixed on a solid support, then after incubation and possible washing, with a second Cardiac anti-troponin I monoclonal antibody coupled to an enzyme label and then incubated again.

Dans les deux cas, on procède ensuite éventuellement à un lavage, puis à la révélation enzymatique qui est effectuée selon l'invention, par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ou du 1,2-dioxetane. La quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu. In both cases, one then proceeds optionally with washing, then the enzymatic development which is carried out according to the invention, by addition of a chemiluminescent substrate derived from a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane. The amount of cardiac troponin I present in the samples to be assayed or in the standards is evaluated by direct reading of the light signal obtained.

Pour le dosage en deux temps, de manière préférentielle, les échantillons à doser et les standards sont mis en contact d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonai anti-troponine I cardiaque fixé sur un support solide et ensuite incubés de nouveau. For the two-step assay, preferably, the samples to be assayed and the standards are brought into contact first with an anti-cardiac troponin I monoclonal antibody coupled to an enzymatic marker and then, after incubation, with a second anti- monoclonal antibody. Cardiac troponin I fixed on a solid support and then incubated again.

Comme anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, on peut utiliser tout anticorps monoclonal ayant une grande affinité pour la troponine I cardiaque et dont la constante de dissociation à l'équilibre est égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M. On peut aussi utiliser tout couple d'anticorps monoclonaux ayant une liaison coopérative vis à vis de la troponine I cardiaque, cette coopérativité produisant comme résultat une augmentation de l'affinité de l'un des deux anticorps monoclonaux pour la troponine I cardiaque (constante de dissociation à l'équilibre s 10-8 M) lorsque la troponine I cardiaque est déjà liée avec le deuxième anticorps. As the anti-cardiac troponin I monoclonal antibody, it is possible to use any monoclonal antibody having a high affinity for cardiac troponin I and whose equilibrium dissociation constant is equal to or less than 10-8 M, preferably equal to or less than 10-9 M. Any pair of monoclonal antibodies can also be used having a cooperative bond with respect to cardiac troponin I, this cooperativity producing as a result an increase in the affinity of one of the two monoclonal antibodies for troponin Cardiac I (equilibrium dissociation constant s 10-8 M) when cardiac troponin I is already bound with the second antibody.

De manière préférentielle, comme anticorps monoclonaux antitroponine I cardiaque, on peut utiliser les anticorps monoclonaux 11E12 et 8E1 de souris décrits dans Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. En effet, de manière surprenante il a été constaté que l'anticorps monoclonal 11E12 bloque la libération de la troponine I cardiaque liée à l'anticorps 8E1. Ce phénomène a été mis en évidence en utilisant le système BIACOREN de PHARMACIA, et en mesurant les constantes cinétiques d'association et de dissociation de la troponine I cardiaque (cTnl) sur l'anticorps monoclonal 8E1, en présence ou en l'absence de l'anticorps 11E12. Preferably, as cardiac antitroponin I monoclonal antibodies, it is possible to use the mouse monoclonal antibodies 11E12 and 8E1 described in Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. In fact, surprisingly, it has been observed that the monoclonal antibody 11E12 blocks the release of cardiac troponin I linked to the antibody 8E1. This phenomenon was demonstrated using the BIACOREN system from PHARMACIA, and by measuring the association and dissociation kinetic constants of cardiac troponin I (cTnl) on the monoclonal antibody 8E1, in the presence or in the absence of the 11E12 antibody.

Les différents résultats sont donnés dans le Tableau I. The different results are given in Table I.

TABLEAU I

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TABLE I
Figure img00060001

<tb> <SEP> ACi <SEP> 8E1 <SEP> : <SEP> CT <SEP> seul. <SEP> AcM <SEP> 8E1 <SEP> : <SEP> cTnl+11E12 <SEP>
<tb> <SEP> CONSTANTE <SEP> CINETIQUE <SEP> DE <SEP> DIS5AflON <SEP> 3,2.10-3 <SEP> 2.8.10-4 <SEP>
<tb> <SEP> Koff(S-1) <SEP>
<tb> <SEP> CONSTANTE <SEP> CINETIQUE <SEP> D'ASSOCtATION <SEP> 5,8.105 <SEP> 4,5.105 <SEP>
<tb> <SEP> KOfl(M-1X <SEP> 5-1) <SEP>
<tb> CONSTANTE <SEP> DE <SEP> DISSOCIATION <SEP> A <SEP> L'EeWBRE <SEP> 5,7.10-9 <SEP> 0,6.10-9 <SEP>
<tb> <SEP> KOff <SEP> I <SEP> KOf? <SEP> (M)
<tb>
Les résultats du Tableau I démontrent que pour l'anticorps 8E1, l'affinité est 10 fois plus élevée si la troponine I cardiaque est en présence de l'anticorps monoclonal 11E12. Plus précisément, la constante de dissociation à l'équilibre est 10 fois plus faible (la constante cinétique d'association ne varie pas). II existe donc une coopérativité de la liaison des deux anticorps monoclonaux antitroponine I vis à vis de la troponine I cardiaque. Grâce à cette effet de blocage de la dissociation du complexe ii est possible de réaliser le procédé de dosage immunoenzymatique, objet de la présente invention, avec ce couple d'anticorps monoclonaux.<tb><SEP> ACi <SEP> 8E1 <SEP>: <SEP> CT <SEP> only. <SEP> AcM <SEP> 8E1 <SEP>: <SEP> cTnl + 11E12 <SEP>
<tb><SEP> CONSTANT <SEP> KINETIC <SEP> OF <SEP> DIS5AflON <SEP> 3,2.10-3 <SEP> 2.8.10-4 <SEP>
<tb><SEP> Koff (S-1) <SEP>
<tb><SEP> CONSTANT <SEP> KINETIC <SEP> OF ASSOCtATION <SEP> 5.8.105 <SEP> 4.5.105 <SEP>
<tb><SEP> KOfl (M-1X <SEP> 5-1) <SEP>
<tb> CONSTANT <SEP> FROM <SEP> DISSOCIATION <SEP> TO <SEP> EeWBRE <SEP> 5.7.10-9 <SEP> 0.6.10-9 <SEP>
<tb><SEP> KOff <SEP> I <SEP> KOf? <SEP> (M)
<tb>
The results of Table I demonstrate that for the 8E1 antibody, the affinity is 10 times higher if the cardiac troponin I is in the presence of the 11E12 monoclonal antibody. More precisely, the dissociation constant at equilibrium is 10 times lower (the kinetic association constant does not vary). There is therefore a cooperativity of the binding of the two monoclonal antitroponin I antibodies with respect to cardiac troponin I. Thanks to this effect of blocking the dissociation of complex ii, it is possible to carry out the immunoenzymatic assay method, object of the present invention, with this pair of monoclonal antibodies.

Pour la formation du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque-marqueur enzymatique on utilise comme marqueur enzymatique soit la phosphatase alcaline soit la peroxydase. For the formation of the monoclonal anti-cardiac troponin I antibody-enzyme marker conjugate, either alkaline phosphatase or peroxidase is used as enzyme marker.

On utilise la phosphatase alcaline lorsque le substrat chimiluminescent est un dérivé de 1,2-dioxetane et la peroxydase lorsque le substrat chimiluminescent est un dérivé d'une diacylhydrazine. Alkaline phosphatase is used when the chemiluminescent substrate is a derivative of 1,2-dioxetane and peroxidase when the chemiluminescent substrate is a derivative of a diacylhydrazine.

On peut utiliser notamment les anticorps monoclonaux 8E1 ou 11E12 pour préparer les conjugués avec un marqueur enzymatique. De préférence on prépare des conjugués de l'anticorps monoclonal 11E12 avec la peroxydase et des conjugués de l'anticorps monoclonal 8E1 avec la phosphatase alcaline. In particular, the monoclonal antibodies 8E1 or 11E12 can be used to prepare the conjugates with an enzymatic label. Preferably, conjugates of the monoclonal antibody 11E12 with peroxidase and conjugates of the monoclonal antibody 8E1 with alkaline phosphatase are prepared.

Selon le mode de réalisation, on peut envisager somme support solide soit des tubes en polystyrène sur lesquels est fixé l'anticorps anti-troponine I cardiaque (cas du kit de diagnostic), soit des particules magnétiques (notamment ferriques) ou non sur lesquelles est fixé l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque (dosage automatisé). Depending on the embodiment, it is possible to envisage a solid support sum either of polystyrene tubes on which the cardiac anti-troponin I antibody is fixed (in the case of the diagnostic kit), or of magnetic particles (in particular ferric) or not on which is fixed. fixed anti-cardiac troponin I monoclonal antibody (automated assay).

Les conjugués anticorps monoclonal anti-troponine I - marqueur enzymatique sont préparés selon les méthodes connues [J. Histochem Cytochem (1974), 22, p. 1084-1091]. The anti-troponin I monoclonal antibody - enzyme marker conjugates are prepared according to known methods [J. Histochem Cytochem (1974), 22, p. 1084-1091].

La préparation des anticorps monoclonaux anti-troponine I fixés par exemple par des liaisons covalentes sur une phase solide, est aussi réalisée selon des méthodes décrites dans la littérature [J. Immunological Methods, (1979), X, p. The preparation of anti-troponin I monoclonal antibodies fixed, for example by covalent bonds on a solid phase, is also carried out according to methods described in the literature [J. Immunological Methods, (1979), X, p.

231-2361. 231-2361.

Lors de la mise en contact des échantillons à doser ou des standards avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque et'ou un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, le pH du milieu réactionnel doit être de préférence légèrement acide. Le pH doit notamment être compris entre 5 et 6, plus précisément entre 5,4 et 5,7. Pour ajuster le pH on peut utiliser différents tampons adéquats ou des solutions d'acides organiques faibles, par exemple des solutions ou des tampons d'acide succinique ayant un pH de 5,2 à 5,4. When bringing the samples to be assayed or the standards into contact with an anti-cardiac troponin I monoclonal antibody and / or an anti-cardiac troponin I monoclonal antibody coupled to an enzyme label, the pH of the reaction medium should preferably be slightly acidic. . The pH must in particular be between 5 and 6, more precisely between 5.4 and 5.7. To adjust the pH one can use various suitable buffers or solutions of weak organic acids, for example solutions or buffers of succinic acid having a pH of 5.2 to 5.4.

L'incubation entre le plasma ou le serum et les anticorps antitroponine I ou les standards, est effectuée entre 20-C et 3rC et le temps d'incubation peut varier entre 5 et 20 minutes. The incubation between the plasma or the serum and the antitroponin I antibodies or the standards, is carried out between 20-C and 3rC and the incubation time can vary between 5 and 20 minutes.

Après incubation, on procède à un ou plusieurs lavages qui sont effectués à une température de 2' à 3roc, de préférence à une temperature inférieure à 10'C. Pour les lavages, on utilise de manière préférentieile une solution de tampon phosphate pH 6,8 ou une solution tampon tris pH 8. After incubation, one or more washes are carried out which are carried out at a temperature of 2 'to 3roc, preferably at a temperature below 10 ° C. For the washes, a pH 6.8 phosphate buffer solution or a pH 8 tris buffer solution is preferably used.

Comme il a été indiqué précédemment, comme substrat luminescent on utilise soit un dérivé de diacylhydrazine, plus spécialement le luminol [5-amino-2,3-dihydrophtalazine-l ,4-dione], soit un dérivé de 1 ,2dioxetane, plus spécialement le lumigen PPD [sel disodique de 4-methoxy 4-(3-phosphatephenyl) spiro (1,2-dioxetane 3adamantane-2')]. Des substrats luminescents contenant du luminol sont disponibles dans le commerce comme par exemple le luminol ECLimmunoessai signal reagent RPN 190 commercialisé par Amersham ou le luminol
BM Chimiluminescence ELISA reagent 1582950 commercialisé par Boehringer
Mannheim.On préfère des substrats qui contiennent un mélange de luminol et de 4 iodophénol. Des substrats luminescents contenant du lumigen PPD sont aussi disponibles dans le commerce comme, par exemple, le Lumi-Phos 530 commercialisé par Analytical Luminescence Laboratory. Ce réactif contient du lumigen PPD et un promoteur de la chimiluminescence qui est un tensioactif dérivé de la fluorescéine. As indicated previously, as luminescent substrate is used either a derivative of diacylhydrazine, more especially luminol [5-amino-2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione], or a derivative of 1,2dioxetane, more especially lumigen PPD [4-methoxy 4- (3-phosphatephenyl) spiro (1,2-dioxetane 3adamantane-2 ') disodium salt]. Luminescent substrates containing luminol are commercially available such as luminol ECLimmunoassay signal reagent RPN 190 marketed by Amersham or luminol
BM Chemiluminescence ELISA reagent 1582950 marketed by Boehringer
Mannheim. Preferred are substrates which contain a mixture of luminol and 4 iodophenol. Luminescent substrates containing lumigen PPD are also commercially available such as, for example, Lumi-Phos 530 available from Analytical Luminescence Laboratory. This reagent contains lumigen PPD and a chemiluminescence promoter which is a surfactant derived from fluorescein.

La révélation enzymatique est aussi effectuée à une température compnse entre 20-C et 37'C. La lecture de la chimiluminescence est effectuée de préférence après environ 2-10 minutes. The enzymatic development is also carried out at a temperature between 20-C and 37 ° C. The chemiluminescence reading is preferably taken after about 2-10 minutes.

Pour réaliser la gamme d'étalonnage d'un dosage quantitatif on utilise des solutions standards (standards) de la troponine I cardiaque humaine purifiée [Lame C. et al, Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-9791. To achieve the calibration range of a quantitative assay, standard solutions (standards) of purified human cardiac troponin I are used [Lame C. et al, Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-9791.

L'invention conceme aussi l'utilisation du luminol et du lumigen PPD comme substrats chimiluminescents pour le dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque mettant en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un couplé avec un marqueur enzymatique, en particulier la peroxydase, si le substrat est le luminol, et la phosphatase alcaline, si le substrat est le lumigen PPD, lesquels anticorps (soit naturellement, soit par coopérativité) ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M. The invention also relates to the use of luminol and lumigen PPD as chemiluminescent substrates for the sandwich-type immunoenzymatic assay of cardiac troponin I using two monoclonal anti-cardiac troponin I antibodies, one of which is coupled with an enzyme marker, in particular. peroxidase, if the substrate is luminol, and alkaline phosphatase, if the substrate is lumigen PPD, which antibodies (either naturally or by cooperativity) have for cardiac troponin I an equilibrium dissociation constant equal to or less at 10-8 M.

Linvention a également pour objet une trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, de préférence le luminol ou un dérivé de 1,2-dioxetane, de préférence le lumigen PPD. A subject of the invention is also a cardiac troponin I assay kit comprising two monoclonal anti-cardiac troponin I antibodies, one of which is coupled with an enzymatic marker which antibodies, either naturally or by cooperativity, have a dissociation constant for cardiac troponin I. at equilibrium equal to or less than 10-9 M, and a chemiluminescent substrate derived from a diacylhydrazine, preferably luminol or a 1,2-dioxetane derivative, preferably lumigen PPD.

Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent l'invention. The following examples, given without limitation, illustrate the invention.

EXEMPLE I
Dosage de la troponine I cardiaque avec un système automatisé
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatlque est le système Access49 immuoessai, système commercialisé par Sanofi
Diagnostics Pasteur.EXAMPLE I
Cardiac troponin I assay with an automated system
The automated system used for the immunoenzymatic assay is the Access49 immuoassai system, a system marketed by Sanofi.
Pasteur diagnostics.

Le dosage est effectué de la manière suivante : Dans la cupule du dosage sont introduits 50 PI de l'échantillon à doser, 25 pI d'une solution d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 pI d'une solution d'acide succinique 0,1
M, 50 pI du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 8E1-phosphatase alcaline (C = 5 pg/ml). The assay is carried out as follows: Into the assay cup are introduced 50 μl of the sample to be assayed, 25 μl of a solution of mouse immunoglobulins at 4 mg / ml, 10 μl of a solution of succinic acid 0.1
M, 50 µl of the anti-mouse cardiac troponin I monoclonal antibody 8E1-alkaline phosphatase conjugate (C = 5 µg / ml).

Après incubation pendant 5 minutes à 3rC sont introduits 50 pi de billes de latex ferriques (phone Poulenc réf. Ml-070/60) sur lesquelles sont fixés par des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de souris 11E12. After incubation for 5 minutes at 3 ° C., 50 μl of ferric latex beads (Poulenc phone ref. M1-070/60) are introduced to which monoclonal anti-cardiac troponin I antibodies of 11E12 mice are fixed by covalent bonds.

Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 37 C, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon Tris pH 8 on ajoute ensuite 200 pi de substrat Lumi-Phos 530. The mixture is incubated for 36 seconds at 37 ° C., then the ferric latex beads are separated using a magnetic field. The washing is carried out with the aid of a Tris buffer solution, pH 8, then 200 μl of Lumi-Phos 530 substrate are added.

La révélation est effectuée à 37.c et on mesure la luminescence générée par la réaction avec un luminomètre. The visualization is carried out at 37 ° C. and the luminescence generated by the reaction is measured with a luminometer.

Le temps total d'analyse est de 15 minutes. The total analysis time is 15 minutes.

Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine
I cardiaque humaine purifiée.For the calibration range, troponin solutions are used
I purified human heart.

On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des concentrations comprises entre 0 et 50 /lg/l. A calibration range is carried out corresponding to concentrations between 0 and 50 µg / l.

La sensibilité du procédé, évaluée par la courbe d'étalonnage, est de 3,5 ng/l. The sensitivity of the process, evaluated by the calibration curve, is 3.5 ng / l.

EXEMPLE II
Dosage de la troponine I cardiaque avec un kit immunoenzvmatique
Dans des tubes en polystyrène revêtus d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de la souris 8E1, on introduit 150 pI d'une solution tampon succinate contenant du Tween 20 à 0,2 YO, des immunoglobulines de souris non spécifiques et 0,1 % de Kathon, 50 pI du conjugué anticorps monoclonal antitroponine I cardiaque de souris il El 2-peroxydase, et 200 ,ul d'échantillon à doser ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage.EXAMPLE II
Cardiac troponin I assay with an immunoassay kit
Into polystyrene tubes coated with anti-mouse cardiac troponin I monoclonal antibodies 8E1, 150 μl of a succinate buffer solution containing Tween 20 at 0.2 YO, unspecific mouse immunoglobulins and 0.1 % Kathon, 50 µl of mouse cardiac antitroponin I monoclonal antibody II E1 2-peroxidase conjugate, and 200 µl of test sample or standard solution used for the calibration range.

Pour la gamme étalonnage on utilise du sérum humain contenant de 0 à 2 pg/l de troponine I cardiaque humaine purifiée. For the calibration range, human serum containing 0 to 2 pg / l of purified human cardiac troponin I is used.

On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à température ambiante, puis on procede au lavage des tubes de la façon suivante: - on renverse le contenu des tubes dans un récipient et on éponge les tubes sur un
papier absorbant, - on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 6,8
contenant du Tween 20 à 0,1 % et 0,3 % de Kathon, en maintenant la
température au plus à 8*C. On répète cette étape 3 fois.Incubation is carried out for precisely 15 minutes with horizontal stirring at room temperature, then the tubes are washed as follows: - the contents of the tubes are inverted into a container and the tubes are sponge on a
absorbent paper, - washing is carried out by adding 1 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 6.8
containing 0.1% Tween 20 and 0.3% Kathon, maintaining the
temperature at most 8 * C. This step is repeated 3 times.

Après avoir procédé au lavage et éliminé toute trace de la solution utilisée pour ce demier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant 300 pi d'un mélange constitué de 100 parties de luminol (BM chimiluminescent EUSA reagent Boehringer Mannheim) et 1 partie d'eau oxygénée. After washing and removing all traces of the solution used for the latter, the enzymatic development is carried out using 300 μl of a mixture consisting of 100 parts of luminol (BM chemiluminescent EUSA reagent Boehringer Mannheim) and 1 part of water oxygenated.

On laisse à température ambiante et on mesure la luminescence avec un luminomètre après 3 minutes. Chaque tube est lu pendant exactement 30 secondes ou exactement 10 secondes. It is left at room temperature and the luminescence is measured with a luminometer after 3 minutes. Each tube is read for exactly 30 seconds or exactly 10 seconds.

La sensibilité de ce dosage est de 3 ng/l. The sensitivity of this assay is 3 ng / l.

Les valeurs des rapports signal neUbruit de la mesure (S-B)/B obtenues selon le procédé décrit ci-dessus et selon le procédé décrit par Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29(2), p. 271-278 ; Clin Chem. (1993), 39/6 p. 972-979] sont données dans le Tableau II ci-après. The values of the signal-to-noise ratios of the measurement (S-B) / B obtained according to the method described above and according to the method described by Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29 (2), p. 271-278; Clin Chem. (1993), 39/6 p. 972-979] are given in Table II below.

TABLEAU Il

Figure img00100001
TABLE II
Figure img00100001

<tb> <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> Procédé <SEP> de <SEP> l'exemple <SEP> Procédé <SEP> décrit <SEP> par
<tb> Troponine <SEP> cardiaque
<tb> <SEP> 100 <SEP> ng/l <SEP> S-B <SEP> 1200 <SEP> - <SEP> 95.95 <SEP> = <SEP> 11.6 <SEP> S-B <SEP> 150 <SEP> - <SEP> 50 <SEP> = <SEP> 2.0 <SEP>
<tb> <SEP> B <SEP> <SEP> 95 <SEP> B <SEP> <SEP> 50
<tb> <SEP> 10 <SEP> ng/l <SEP> S-B <SEP> = <SEP> 250 <SEP> - <SEP> 95 <SEP> = <SEP> 1,6 <SEP> S-B <SEP> = <SEP> 0 <SEP> (S=B)
<tb> <SEP> B <SEP> 95 <SEP> B
<tb>
Les valeurs des rapports signal/bruit de la mesure obtenue en appliquant le procédé de l'invention prouvent sa grande sensibilité et sa spécificité. <tb><SEP> Concentration <SEP> in <SEP> Method <SEP> of <SEP> the example <SEP> Method <SEP> described <SEP> by
Cardiac <tb> Troponin <SEP>
<tb><SEP> 100 <SEP> ng / l <SEP> SB <SEP> 1200 <SEP> - <SEP> 95.95 <SEP> = <SEP> 11.6 <SEP> SB <SEP> 150 <SEP> - <SEP> 50 <SEP> = <SEP> 2.0 <SEP>
<tb><SEP> B <SEP><SEP> 95 <SEP> B <SEP><SEP> 50
<tb><SEP> 10 <SEP> ng / l <SEP> SB <SEP> = <SEP> 250 <SEP> - <SEP> 95 <SEP> = <SEP> 1.6 <SEP> SB <SEP> = <SEP> 0 <SEP> (S = B)
<tb><SEP> B <SEP> 95 <SEP> B
<tb>
The values of the signal / noise ratios of the measurement obtained by applying the method of the invention prove its high sensitivity and its specificity.

Claims (7)

REVENDICATIONS 1- Procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I1- Sandwich type immunoassay method for troponin I cardiaque caractérisé en ce que l'on met en oeuvre deux anticorps cardiac characterized in that one uses two antibodies monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur cardiac anti-troponin I monoclonal drugs, one of which is coupled with a marker enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont enzymatic which antibodies, either naturally or by cooperativity, have pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale for cardiac troponin I a dissociation constant at equilibrium equals ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M et que l'on or less than 10-8 M, preferably equal to or less than 10-9 M and that utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent dérivé uses for enzymatic development a derivative chemiluminescent substrate d'une diacylhydrazine ou du 1,2-dioxetane. a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane. 2- Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes:2- The method of claim 1, comprising the following steps: a-les échantillons sont mis en contact avec un anticorps monoclonal anti a-the samples are brought into contact with an anti troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un cardiac troponin I coupled to an enzyme marker and with a deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, second anti-troponin I cardiac monoclonal antibody, b-la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat b-enzymatic revelation is carried out by adding a substrate chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ou du 1,2-dioxetane, chemiluminescent derivative of a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane, c-la quantité de la troponine I cardiaque est évaluée par la lecture directe du c-the amount of cardiac troponin I is evaluated by direct reading of the signal lumineux obtenu. light signal obtained. > Procédé selon les revendications 1 ou 2 comprenant les étapes suivantes: > Method according to claims 1 or 2 comprising the following steps: a-les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément a-the samples to be assayed or the standards are brought into contact simultaneously avec un anticorps monoclonai anti-troponine I cardiaque couplé à un with an anti-cardiac troponin I monoclonal antibody coupled to a marqueur enzymatique et avec un deuxième anticorps monoclonal anti enzymatic marker and with a second anti troponine I cardiaque fixé éventuellement à un support solide, cardiac troponin I possibly attached to a solid support, b-le mélange réactionnel est incubé, b-the reaction mixture is incubated, c- puis lavé, c- then washed, d-la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat d-enzymatic revelation is carried out by adding a substrate chimiluminescent, dérivé d'une diacylhydrazine ou dérivé du 1,2-dioxetane, chemiluminescent, derivative of a diacylhydrazine or derivative of 1,2-dioxetane, e-la quantité de la troponine I cardiaque présente dans des échantillons à e-the amount of cardiac troponin I present in samples at doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux meter or the standards, is evaluated by the direct reading of the light signal obtenu. got. 4- Procédé selon les revendications 1 ou 2 comprenant les étapes suivantes:4- A method according to claims 1 or 2 comprising the following steps: a-les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact, a-the samples to be assayed or the standards are brought into contact, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I - either, first with an anti-troponin I monoclonal antibody cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, puis après incubation, avec cardiac coupled to an enzymatic marker, then after incubation, with un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque a second anti-troponin I cardiac monoclonal antibody éventuellement fixé sur un support solide, et incubés de nouveau, possibly fixed on a solid support, and incubated again, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I - either, first with an anti-troponin I monoclonal antibody cardiaque éventuellement fixé sur un support solide puis après incubation cardiac optionally fixed on a solid support then after incubation et lavage éventuel, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine and possible washing, with a second anti-troponin monoclonal antibody I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et incubés à nouveau, I cardiac coupled to an enzymatic marker and incubated again, b-le mélange réactionnel est ensuite éventuellement lavé, b-the reaction mixture is then optionally washed, c-la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat c-enzymatic revelation is carried out by addition of a substrate chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ou dérivé de 1,2aioxetane, chemiluminescent derivative of a diacylhydrazine or derivative of 1,2aioxetane, d-la quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à d-the amount of cardiac troponin I present in the samples at doser ou dans les standards est évaluée par la lecture directe du signal metering or in the standards is evaluated by the direct reading of the signal lumineux obtenu. bright obtained. S Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce S Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that que le substrat chimiluminescent est le luminol. that the chemiluminescent substrate is luminol. ç Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce ç Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that que le substrat chimiluminescent est le lumigen PPD. that the chemiluminescent substrate is lumigen PPD. 7- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce7- A method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that que les anticorps monoclonaux anti-troponine I, sont les anticorps than the anti-troponin I monoclonal antibodies, are the antibodies monoclonaux de souris 11 E12 et 8E1. mouse monoclonal 11 E12 and 8E1. > Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce > Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that que le marqueur enzymatique couplé à l'anticorps monoclonal anti-troponine I, that the enzymatic marker coupled to the anti-troponin I monoclonal antibody, est la phosphatase alcaline ou la peroxydase. is alkaline phosphatase or peroxidase. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que 9 A method according to any one of claims 1 to 3 characterized in that l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur cardiac anti-troponin I monoclonal antibody coupled to a marker enzymatique est le conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque enzymatic is the anti-cardiac troponin I monoclonal antibody conjugate de souris 11E12-peroxydase et le substrat chimiluminescent est un dérivé mouse 11E12-peroxidase and the chemiluminescent substrate is a derivative d'une diacylhydrazine. of a diacylhydrazine. 10- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 4 caractérisé en ce10- A method according to any one of claims 1, 2 or 4 characterized in that que l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur that the anti-cardiac troponin I monoclonal antibody coupled to a marker enzymatique est le conjugué anticorps monoclonai anti-troponine I cardiaque enzymatic is the monoclonal anti-cardiac troponin I antibody conjugate de souris 8E1 -phosphatase alcaline et le substrat chimiluminescent est un mouse 8E1-alkaline phosphatase and the chemiluminescent substrate is a dérivé du 1,2-dioxetane. derivative of 1,2-dioxetane. 11- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que11- A method according to any one of claims 1 to 5 characterized in that le substrat chimiluminescent est un mélange de luminol et de 4-iodophéno(. the chemiluminescent substrate is a mixture of luminol and 4-iodopheno (. 12- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que12- A method according to any one of claims 1 to 4 characterized in that la mise en contact des échantillons à doser ou des standards, avec un bringing the samples to be assayed or the standards into contact with a anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur anti-cardiac troponin I monoclonal antibody coupled to a marker enzymatique et éventuellement à un deuxième anticorps anti-troponine I, est enzymatic and possibly a second anti-troponin I antibody, is effectuée à un pH légèrement acide compris entre 5 et 6, de préférence entre carried out at a slightly acidic pH between 5 and 6, preferably between 5,4 et 5,7. 5.4 and 5.7. 1S Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que les solutions de lavage utilisées avant révélation ont un pH égal à 6,8 8 et une 1S A method according to any one of claims 1 to 4 characterized in that the washing solutions used before development have a pH equal to 6.8 8 and a température de 2. à 37'C, de préférence à une température inférieure à 1 0"'C. temperature of 2. to 37 ° C, preferably at a temperature below 10 ° C. 14 Utilisation du luminol comme substrat chimiluminescent pour le dosage 14 Use of luminol as a chemiluminescent substrate for the assay immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque mettant en cardiac troponin I sandwich-type enzyme immunoassay oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un couplé uses two monoclonal anti-cardiac troponin I antibodies, one of which is coupled avec la peroxydase, lesquels anticorps soit naturellement soit par with peroxidase, which antibodies either naturally or by coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à cooperativity, have a dissociation constant for cardiac troponin I at l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M. balance equal to or less than 10-8 M. 1S Utilisation du lumigen PPD comme substrat chimiluminescent pour le dosage 1S Use of lumigen PPD as a chemiluminescent substrate for the assay immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque mettant en cardiac troponin I sandwich-type enzyme immunoassay oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un couplé uses two monoclonal anti-cardiac troponin I antibodies, one of which is coupled avec la phosphatase alcaline, lesquels anticorps soit naturellement soit par with alkaline phosphatase, which antibodies either naturally or by coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à cooperativity, have a dissociation constant for cardiac troponin I at l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M. balance equal to or less than 10-8 M. 16 Trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps 16 Cardiac troponin I assay kit comprising two antibodies monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur cardiac anti-troponin I monoclonal drugs, one of which is coupled with a marker enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont enzymatic which antibodies, either naturally or by cooperativity, have pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale for cardiac troponin I a dissociation constant at equilibrium equals ou inférieure à 10-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivé d'une or less than 10-9 M, and a chemiluminescent substrate derived from a diacylhydrazine ou du 1 ,2-dioxetane diacylhydrazine or 1, 2-dioxetane
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