CA2210166C

CA2210166C - Ultrasensitive process for assaying cardiac troponine i

Info

Publication number: CA2210166C
Application number: CA002210166A
Authority: CA
Inventors: Charles Calzolari; Odile Flecheux; Bernard Pau
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Europe GmbH
Priority date: 1995-01-19
Filing date: 1996-01-19
Publication date: 2006-04-11
Anticipated expiration: 2016-01-19
Also published as: CA2210166A1

Abstract

La présente invention concerne un procédé de dosage ultrasensible de la troponine I cardiaque effectuée par chemiluminescence.The present invention relates to a method of ultra-sensitive assay for cardiac troponin I performed by chemiluminescence.

Description

Procédé de dosage ultrasensible de la trononine I cardiacrue La présente invention concerne un procédé de dosage ultrasensible de la troponine I cardiaque, effectué par chimiluminescence.
L'infarctus du myocarde (IDM) représente toujours une urgence médicale et demeure la principale cause de mortalité et de morbidité cardio-vasculaire dans le monde.
Dans tous les cas, le traitement instauré. a pour but de protéger le tissu myocardique de la nécrose irréversible. De nouveaux moyens thérapeutiques, o comme les thrombolytiques ou l'angioplastie de première intention, permettent aujourd'hui de restaurer rapidement la circulation coronarienne, de façon à
limiter la taille de la zone infarcie et de réduire l'incidence de la mortalité et de la morbidité.
Ces outils thérapeutiques sont d'autant plus efficaces qu'ils sont mis ts en oeuvre au plus tôt après le début des manifestations cliniques. Les cliniciens confrontés à cette pathologie doivent pouvoir disposer d'outils diagnostiques de plus en plus performants.
Le dosage des protéines sériques et en particulier des enzymes est 2o devenu un élément déterminant pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde et pour l'appréciation du succès ou de l'échec d'une reperfusion.
On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de 3 protéines, les troponines C, I et T.
25 La troponine I cardiaque est une protéine contractile exclusivement présente dans le muscle cardiaque [Wilkinson J.M. et al, Nature (1978), 271, p. 31-35 ; Wade R. et ai, Genomics (1990), 7, p. 346-357].
Son rôle physiologique est d'inhiber, en l'absence de calcium, 30 l'activité ATPasique du complexe active-myosine et donc d'empêcher la contraction musculaire [ferry S.V., Biochem. Soc. Trans (1979), 7, p. 593-617].
Lors de l'infarctus dû à l'obstruction de l'une des artères nourricières du coeur (artère coronaire), il apparaît une ischémie puis une nécrose myocardique 35 qui se traduit par une destruction des cellules cardiaques et la libération de la troponine I cardiaque dans le sang. La troponine I représente donc un marqueur très spécifique de l'infarctus du myocarde.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~

WO 96/22535 _ 2 _ PCT/FR96/00095 Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine I pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde [Am. Heart J. (1981 ), 110, p.

1344 ; Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278].
De plus, il est désormais acquis que chez certains patients l'angor instable - qui représente une étape critique de l'ischémie myocardique -, peut être associé à un haut risque de survenue d'infarctus du myocarde ou de mort subite.
Les études post-mortem sur cette catégorie de patients ont montré que l'apparition de ces complications était très sowent précédée de micro-infarctus cardiaques i o [Davies M.J. et al, Circulation (1985), 71, p. 699-708].
Le dosage de la troponine I cardiâque semble donc être particulièrement intéressant dans la détection des sujets à risque, chez les patients atteints d'angor instable, plus spécialement pour le diagnostic des micro-infarctus.
Par ailleurs, le dosage de la troponine I peut être envisagé lors de la surveillance d'un traitement thrombolytique pour confirmer le succès ou l'échec de la reperfusion, comme aussi lors du suivi postopératoire des interventions en chirurgie cardiaque (pontages coronariens, angioplasties etc.). Le dosage de la troponine I
trouve aussi son application dans le diagnostic des rejets de greffes cardiaques 2o après transplantation et le suivi des thérapeutiques cardiotoxiques utilisant par exemple des anthracyclines.
On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29 2 , p. 271- Ultrasensitive assay method for cardiacrone trononin I
The present invention relates to an ultrasensitive dosage method cardiac troponin I, performed by chemiluminescence.
Myocardial infarction (MI) is always an emergency remains the leading cause of cardiovascular mortality and morbidity.
vascular in the world.
In all cases, the treatment established. is intended to protect the myocardial tissue irreversible necrosis. New ways therapeutic, o such as thrombolytics or first-line angioplasty, allow today to quickly restore coronary circulation, so as to limit the Infarcted area and reduce the incidence of mortality and morbidity.
These therapeutic tools are all the more effective if they are put ts implemented at the earliest after the beginning of the clinical manifestations. The clinicians confronted with this pathology must be able to have diagnostic tools Moreover in more powerful.
The determination of serum proteins and in particular enzymes is 2o become a determining factor for the diagnosis of myocardial infarction and for the assessment of the success or failure of a reperfusion.
Troponin is known to be a myofibrillar protein complex, consisting of 3 proteins, troponins C, I and T.
Cardiac troponin I is a contractile protein exclusively present in the heart muscle [Wilkinson JM et al, Nature (1978), 271, p. 31-35; Wade R. et al, Genomics (1990), 7, p. 346-357].
Its physiological role is to inhibit, in the absence of calcium, The ATPase activity of the active-myosin complex and thus to prevent the contraction muscle [SV ferry, Biochem. Soc. Trans (1979), 7, p. 593-617].
During infarction due to obstruction of one of the feeder arteries of the heart (coronary artery), it appears an ischemia then a necrosis myocardial 35 which results in a destruction of heart cells and the liberation of the cardiac troponin I in the blood. Troponin I is therefore a marker very specificity of myocardial infarction.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26 ~

WO 96/22535 _ 2 _ PCT / FR96 / 00095 Thus, it has recently been advocated for the determination of troponin I for early diagnosis of myocardial infarction [Am. Heart J. (1981), 110, p.

1344; Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278].
In addition, it is now accepted that in some patients angina unstable - which represents a critical stage of myocardial ischemia - can to be associated with a high risk of myocardial infarction or death sudden.
Post-mortem studies on this category of patients have shown that the appearance of these complications was very soon preceded by cardiac micro-infarction [Davies MJ et al, Circulation (1985), 71, p. 699-708].
The dosage of cardiac troponin I therefore seems to be particularly interesting in the detection of subjects at risk, among patients unstable angina, especially for the diagnosis of infarction.
In addition, the troponin I assay can be considered during the monitoring of thrombolytic therapy to confirm success or the failure of the reperfusion, as well as during postoperative follow-up of interventions surgery cardiac bypass (coronary artery bypass grafts, angioplasty, etc.). The dosage of the troponin I
also finds application in the diagnosis of graft rejection heart 2o after transplantation and follow-up of cardiotoxic therapies using by example of anthracyclines.
Immunoenzymatic methods are already known for determination of troponin I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29 2, p. 271-

2~ 27 ô ; Cli, ~. Cfiem. (1993), 39 6, p. 9r 2-979] décrivent un procécé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)- H2O2. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, selon les auteurs, est de 0,2 ~Cg/I.
Un autre procédé immunoenzymométrique de ia troponine I Cscr~t par Bodor et al permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1,5 à 3,1 Ng/I [Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38 11, p. 2203-2214 ; Adams J. et a., Circulation (1993), 88 1 , p. 101-706]. Ce dosage utilise pour la révélation 3s enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm.
Grâce à ces dosages, il a été possible de mettre en évidence la présence de la troponine I dans le plasma des patients, environ 4 heures après le FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~ 2 ~ 27 ô; Cli, ~. Cfiem. (1993), 396, p. 9r 2-979] describe a process of dosage enzyme immunoassay sandwich that uses for enzymatic revelation the chromogenic substrate tetramethylbenzydine (TMB) - H2O2. After the revelation, the Absorbance reading is made at 450 nm and the limit of detection, according to authors, is 0.2 ~ Cg / I.
Another immunoenzymometric method of troponin I Cscr ~ t by Bodor et al allows to detect the latter at concentrations of the order of 1.5 to 3.1 Ng / I [Bodor et al., Clin. Chem. (1992), 38 11, p. 2203-2214; Adams J. and a., Circulation (1993), 88 1, p. 101-706]. This dosage uses for revelation 3s enzymatic chromogenic substrate of alkaline phosphatase, the p-nitrophenylphosphate, and the measurement is carried out at 405 nm.
Thanks to these assays, it was possible to highlight the presence of troponin I in patients' plasma, approximately 4 hours later the SUBSTITUTE SHEET (RULE 26 ~

3 début des manifestations cliniques de l'infarctus du myocarde (Adams J. et al, Circulation (1993), 88(1), p. 101-106).
Toutefois, la sensibilité de ces dosages immunoenzymométriques est largement inférieure à celle obtenue par des dosages basés sur des méthodes très sophistiquées et difficiles â mettre en oewre, par exemple des dosages basés sur la mesure de 1a radioactivité [Am. Heart Journal, (Jupe 1987), 113 6 , p.

1334J.
On sait aussi que des dérivés cyclïques d'hydrazines, notamment les diacylhydrazines, pewent être utilisés comme réactifs de chimiluminescence [Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 5,~7, p. 409-423J. L'utilisation de ces 1 o réactifs a été envisagée ou effectuée lors de certains dosàges immunoenzymatiques [Thrope G.H.G. et al, Clin. Chem. (1985), 31, p. 1335-1341 ; Thrope G.H.G. et al, Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353J (Demande WO 88/00695). Par ailleurs, on connaît des méthodes de détection par chimïiuminescence mettant en oeuvre la décomposition enzymatique de dérivés du 1,2-dioxetane.
Toutefois, il est connu que la mise en oeuvre de ces réactifs nécessite des recherches intensives puisque l'homme de l'art est confronté à
de multiples facteurs limitant pour la mise au point des dosages sensibles (affinité des différents composants de dosage et notamment du système antigène/anticorps, marqueur enzymatique, substrat, principe de détection etc.). En effet, un choix adéquat des différents réactifs et conditions de dosage s'impose. II est évident que l'on ne peut pas imaginer un dosage sensible et spécifique lorsque le bruit de la 2 o mesure (bruit de fond ou bruit de blanc) est important ou lorsque le rapport signal/bruit de la mesure est trap petit. Or justement ce bruit de la mesure dépend des différents réactifs et conditions de dosage choisis.
II a été maintenant trauvé qu'il était possible, en utilisant un certain type d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque et de substrats adéquats pour la révélation enzymatique, de procéder au dosage par chimiluminescence de la troponine I avec une très grande sensïbüité. En effet, en appliquant le procédé de l'invention il est passible d'obtenir une sensibilité de l'ordre de 2 à 5 ng/l, ce qui représente une sensibilité 40 à environ 1500 fois supérieure à celles des procédés immunoenzymométriques de la troponine I les c.:~lus sensibles connus jusqu'à
3 0 ~resent.

i i ,. . , 3 onset of clinical manifestations of myocardial infarction (Adams J. et al, Circulation (1993), 88 (1), p. 101-106).
However, the sensitivity of these immunoenzymometric assays is much lower than that obtained by assays based on methods very sophisticated and difficult to implement, for example dosages based on the measurement of radioactivity [Am. Heart Journal, (Skirt 1987), 113 6, p.

1334J.
It is also known that cyclic derivatives of hydrazines, in particular diacylhydrazines can be used as chemiluminescence reagents [Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 5, 7, p. 409-423J. The use of these 1 o reagents has been considered or performed during certain dosages immunoassays [Thrope GHG et al, Clin. Chem. (1985), 31, p. 1335-1341; Thrope GHG and al Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353J (Application WO 88/00695). Otherwise, methods of detection by chemiluminescence are known the enzymatic decomposition of 1,2-dioxetane derivatives.
However, it is known that the use of these reagents requires intensive research as those skilled in the art are confronted with of multiple limiting factors for the development of sensitive assays (affinity of different assay components and in particular the antigen / antibody system, enzymatic marker, substrate, detection principle etc.). Indeed, a choice Adequate use of different reagents and assay conditions is required. II is obvious that one can not imagine a sensitive and specific dosage when the noise of the 2 o measurement (background noise or white noise) is important or when the report signal / noise of the measurement is small trap. But precisely this noise of the measure depends different reagents and assay conditions selected.
It has now been trapped that it was possible, using a certain type of cardiac anti-troponin I monoclonal antibodies and substrates adequate for enzymatic revelation, to carry out the chemiluminescence assay of the troponin I with a very great sensitivity. Indeed, by applying the process of the invention is liable to obtain a sensitivity of the order of 2 to 5 ng / l, which represents a sensitivity 40 to about 1500 times greater than those of processes immunoenzymetrics of troponin I the most sensitive known 3 0 ~ resent.

ii,. . ,

4 La présente invention vise un procédé de dosage immuno-enzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) des échantillons ou des standards sont mis en contact avec deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque pour former un mélange réactionnel, un des anticorps est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation IO à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, b) le mélange réactionnel est lavé, c) une révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé du diacyle hydrazine ou du 1,2-dioxétane, d) la quantité de troponine I cardiaque est évaluée par une lecture directe d'un signal lumineux obtenu.
De préférence, la présente invention a plus précisément comme objet, un procédé de dosage immuno-enzymatique de type sandwich, de la troponine I cardiaque:
20 - qui met en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps ont, soit naturellement, soit par coopérativité une grande affinité pour la troponine I cardiaque, donc une constante de dissociation à
l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M; et - qui utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent qui est soit un dérivé d'une diacylhydrazine, soit un dérivé de 1,2-dioxetane.
30 De préférence, la présente invention concerne un procédé de dosage immunoenzymatique quantitatif de type 4a sandwich de la troponi.ne I ca:â~d:iac.[ue, <<aractérisé en ce que l'on met en contact ~es échantil:.ons à doser ou les standards avec: un arti~.Jorps monocl ~rna1 anti-troponine I
cardiaque coLUplé à un marqtzeux~ en._.jrm~tr_que et avec un autre anticorps monoclonal ~.~rit_i l.rc.x~«r~ir~~_ I cardiaque, ces anticorps monoclonaux, ::soit :ua~~urellement, soit par effet de coopératiwi.té, ayant pou:r la t ro~onine 1 cardiaque une constante de dissociation a~ l'équi.~;_ii.,re égale ou inférieure à 10-8 M, de prêférenc;e égale ou infr~rieure à 10-~9 M, puis 1.0 que l'on effectue la révélation ena.ymatique par addition d' un substrat chz.m.i.lumircesceznt chc:>is i et ensuite que l' on procède â la lecture dirFact.e du sz.gnal lumineux obtenu.
Le procédé de l' irurention L~E:ut entre réalisé soit par un système manuel (ki.t de dosage de d:iagno~>tic) soit par un systëme automatisa. Selon .Le nuode de réalisation, il est possible d'effectuer soit. ~zn do..age en un temps, soit un dosage en deux temps.
La présente invention v:i.se aussi une utilisation du luminol comme substra.zt~ chïrtlilcnrnir.~escent pour le dosage 20 immunoenzymatique de t,rpF~ sanc:~w,_cr~ de la troponine I
cardiaque mettant, en c>euvre des_~x Ç~nticorps monoclonaux anti-troponine I ~;~~rdi_aquc~ dc_~,cnt. u~m couplé avec la peroxydase, -wesquels , nticvo:cl.~ :;o:it~ mt ur~el_Lement. soin par coopérativité, ont L..~our ~~.a tx:a.:>~>or~.s..cze I cardiaque une constante de diss~.~ci~zt iow ait 1 ' é ~uï_ LVL r~~ égale ol.z infér::ieure à 1C-~ M.
La p.nésez,Fte îr~rVerutz.or~ ~~-.à.~~e a~.assi une utilisation du lumigen PPD cc.~mme ~ubstr,ar c:r~:i ni.lun~inescent. pour le dosage immunoenz~y,nar_-wc~ue ~:~Fe tr~p~~ >a:2rïcïw:ich de la troponine I
30 cardiaque mettant, en «e~_'m~~~ ~am.~~~ <.tntic,orps monoclonaux anti-troponine I :-v~~-diaque dc.COt. ur. couplé avec la ~b phosphatase alcaline, lesquels anticorps soit naturellement soit par coopérativitë, ont pour la troponine I cardiaque une constante de di.ssmcâ.ation ~-i 1. ~ équilibre égale ou inférieure à 10-8 M.
La présente invente ion vi se a~uss i une trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps monoclonaux asti-trop>on:i.ne I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, :soit par cc>c~pérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation â
l'équilibre égale au inférieure â 1!~-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivTé d' une di.acy i hydrazine ou du 1, 2-dioxetane.
De préférence, pour le dosage en un temps, les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec. un ani~icorps mc~mocl~ona:l_ anti-tr_oponïne I
cardiaque couplé à un marqueur en-~ymatique et avec un deuxième anticorps mc.~no~lc~nal anti--~=roponine I cardiaque éventuellement fixé sur urr suppc~zt:, scl.ide. Après :incubation et lavage, on procède G. ~.a r_évélat_ion enzymatique. Cette dernière est ef fectuée ~e lon ~ ' .iruvent.ion par addition d' un substrat chimiluminesc.~ent dêri~~-é d'tne diacylhydrazine ou du 1, 2-dioxet;ane. I~~~ ~ya~ntit:.~-~ ~i~~ l.a t roponine I cardiaque présente dans les éc~:~.ant.:.Llons 4~ doser ou 1 es standards, est évaluée par 1a le~,tt:m.~e ~_~.=ir-e:ect~ï du signal lumineux obtenu.
De préférence, pv.~u.z: ïe ~:iosa<~e en deux temps, on met en contact: 1_es êc:ha.nt:i.l L~:n~ï ;'=v d.>;~er. ou les standards, WO 96/22534 The present invention is directed to an immunoassay method enzymatic sandwich type of cardiac troponin I, characterized in that it comprises the following steps:
(a) samples or standards are set contact with two anti-troponin I monoclonal antibodies heart to form a reaction mixture, one of antibody is coupled with an enzymatic marker, which antibodies, either naturally or cooperatively, have for cardiac troponin I a constant dissociation IO at equilibrium equal to or less than 10-8 M, b) the reaction mixture is washed, c) an enzymatic revelation is carried out by addition of a chemiluminescent substrate, derived from diacyl hydrazine or 1,2-dioxetane, d) the amount of cardiac troponin I is evaluated by a direct reading of a light signal obtained.
Preferably, the present invention has more precisely as an object, an immunoassay enzymatic sandwich type, cardiac troponin I:
20 - which uses two anti-monoclonal antibodies cardiac troponin one of which is coupled with a marker enzymatic, which antibodies have, either naturally, or by cooperativity a great affinity for the cardiac troponin I, so a constant dissociation at equilibrium equal to or less than 10-8 M, preferably equal to or less than 10-9 M; and - which uses for the enzymatic revelation a substrate chemiluminescent which is either a derivative of a diacylhydrazine, a derivative of 1,2-dioxetane.
Preferably, the present invention relates to a Quantitative enzyme immunoassay method 4a sandwich of the troponi.ne I ca: â ~ d: iac. [ue, << characterized in that the samples are put in contact with each other.
standards with: an arti ~ .body monocl ~ rna1 anti-troponin I
cardiac card with a tagger ~ en ._. jrm ~ tr_que and with another monoclonal antibody ~. ~ rit_i l.rc.x ~ "r ~ ir ~~ _ I cardiac, these monoclonal antibodies, either: ua ~~ urely, or by effect of co-operation, having the ability to treat cardiac constant of dissociation a ~ equi. ~; _ii., re equal or lower at 10-8 M, preferably equal to or less than 10- ~ 9 M, then 1.0 that ena.ymatic revelation is carried out by addition a substrate chz.milumircesceznt chc:> is i and then that one reads the direction of the light source obtained.
The process of irurention L ~ E: ut between realized either by a manual system (dosing dosage of d: iagno ~> tic) either by an automated system. According to .The nuode of realization, it is possible to perform either. ~ zn do..age in a time, either a two-step dosage.
The present invention also makes use of luminol as a substra.zt ~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
Immunoenzymatic t, rpF ~ sanc: ~ w, _cr ~ troponin I
cardiac system, using monoclonal antibodies anti-troponin I ~; ~~ rdi_aquc ~ dc_ ~, cnt. u ~ m coupled with the peroxidase, -which, nticvo: cl. ~:; o: it ~ mt ur ~ el_Lement. care by cooperativity, have L .. ~ our ~~ .a tx: a.:>~> or ~ .s..cze I cardiac a constant of diss ~. ~ ci ~ zt iow has the e ~ uï_ LVL r ~~ equal ol.z infér :: ieure at 1C- ~ M.
Take a look at it, do not use it.
of the lumigen PPD cc ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ubstr, ar c: r ~: i ni.lun ~ inescent. for the immunoenzyme assay, nar_-wc ~ ue ~: ~ Fe tr ~ p ~~> a: 2rïcïw: ich of troponin I
30 cardiac putting, in e ~ _'m ~~~ ~ am. ~~~ <.tntic, monoclonal orps anti-troponin I: -v ~~ -dial dc.COt. ur. coupled with the ~ b alkaline phosphatase, which antibodies are naturally either by cooperative, have for cardiac troponin I
a constant of di.ssmcâ.ation ~ -i 1. ~ equal equilibrium or less than 10-8 M.
The present invention has been made in a kit of cardiac troponin I assay comprising two monoclonal antibodies asti-trop> on: i.ne I cardiac including a is coupled with an enzymatic marker which antibodies, either naturally, or by means of Cardiac troponin I a constant dissociation equilibrium equal to less than 1 ~ 9M, and a substrate chemiluminescent derivative of a diacyl hydrazine or 1,2 -dioxetane.
Preferably, for the one-time assay, the samples to be assayed or standards are put in contact simultaneously with. a mcl ~ mocl ~ ona antibody: 1 anti-tr_oponin I
combined with an en ~ ymatic marker and with a second antibody mc. ~ no ~ lc ~ nal anti ~ ~ = roponin I cardiac possibly fixed on the top of the body, scl.ide. After: incubation and washing, the enzymatic evaporation is carried out. This the last is carried out by the addition of a chemiluminescent substrate ~ ent of ~ tne diacylhydrazine or 1, 2-dioxet; I ~~~ ~ ya ~ ntit: ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ r present in the ec ~: ~ .ant.:. Llons 4 ~ doser or 1 es standards, is evaluated by the ~, tt: m. ~ e ~ _ ~. = ir-e: ect ~ ï of the luminous signal got.
Preferably, pv. ~ Uz: ïe ~: iosa <~ e in two steps, one puts in contact: 1_es ec: ha.nt: il L ~: n ~ ï; '= v d.>; ~ er. or the standards, WO 96/2253

5 _ 5 _ PCT/FR96100095 - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé
à un marqueur enzymatique, puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide et ensuite on incube de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide, puis après incubation et un éventuel lavage, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à
' un marqueur enzymatique et ensuite on incube à nouveau.
Dans les deux cas, on procède ensuite éventuellement à un lavage, i o puis à la révélation enzymatique qui est effectuée selon l'invention, par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ôu du 1,2-dioxetane. La quantité de ta troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
Pour le dosage en deux temps, de manière préférentielle, les échantillons à doser et les standards sont mis en contact d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque fixé sur un support solide et ensuite incubés de nouveau.
Comme anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, on peut 2o utiliser tout anticorps monoclonal ayant une grande affinité pour la troponine I
cardiaque et dont la constante de dissociation à l'équilibre est égale ou inférieure à
10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M. On peut aussi utiliser tout couple d'anticorps monoclonaux ayant une liaison coopérative vis à vis de la troponine I cardiaque, cette coopérativité produisant comme résultat une augmentation de l'affinité de l'un des deux anticorps monoclonaux pour la troponine I
cardiaque (constante de dissociation à l'équilibre s 10-8 M) lorsque la troponine I
cardiaque est déjà liée avec le deuxième anticorps.
De manière préférentielle, comme anticorps monoclonaux anti troponïne I cardiaque, on peut utiliser les anticorps monoclonaux 11 E12 et 8E1 de 3o souris décrits dans Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. En effet, de manière surprenante il a été constaté que l'anticorps monoclonal 11 E12 bloque la libération de la troponine I cardiaque liée à l'anticorps 8E1. Ce phénomène a été mis en évidence en utilisant le système BIACORET" de PHARMACIA, et en mesurant les constantes cinétiques d'association et de dissociation de la troponine I
cardiaque (cTnl) sur l'anticorps monoclonal 8E1, en présence ou en l'absence de l'anticorps 11E12.
Les différents résultats sont donnés dans le Tableau I.
FEU~LI.E DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 5 _ 5 _ PCT / FR96100095 - either, first with a cardiac anti-troponin I monoclonal antibody coupled has a enzymatic marker, then after incubation, with a second antibody monoclonal anti-troponin I cardiac possibly fixed on a support strong and then we incubate again, - either, first with a cardiac anti-troponin I monoclonal antibody possibly fixed on a solid support, then after incubation and a prospective washing, with a second cardiac anti-troponin I monoclonal antibody coupled to an enzymatic marker and then incubate again.
In both cases, a subsequent washing is then carried out, and then to the enzymatic revelation which is carried out according to the invention, by addition of a chemiluminescent substrate derived from a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane. The amount of cardiac troponin I present in the samples to be assayed or the standards, is evaluated by the direct reading of the luminous signal obtained.
For two-step dosing, preferentially, the samples to be assayed and standards are put in contact first with a antibody monoclonal anti-troponin I cardiac coupled to an enzymatic marker then after incubation, with a second anti-troponin I monoclonal antibody cardiac fixed on a solid support and then incubated again.
As a cardiac anti-troponin I monoclonal antibody, one can 2o use any monoclonal antibody having a high affinity for the troponin I
cardiac and whose dissociation constant at equilibrium is equal to lower than 10-8 M, preferably equal to or less than 10-9 M. It is also possible to use all a pair of monoclonal antibodies having a cooperative relationship to the cardiac troponin I, this cooperativity producing as a result a increased affinity of one of the two monoclonal antibodies for the troponin I
(equilibrium dissociation constant at 10-8 M) when the troponin I
heart is already bound with the second antibody.
Preferably, as anti-monoclonal antibodies cardiac troponin I, monoclonal antibodies 11 E12 and 8E1 of 3o mice described in Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. Indeed, way surprisingly it has been found that the monoclonal antibody 11 E12 blocks the release cardiac troponin I linked to the 8E1 antibody. This phenomenon has been evidence using the BIACORET system "of PHARMACIA, and by measuring the kinetic constants of association and dissociation of troponin I
cardiac (cTn1) on the monoclonal antibody 8E1, in the presence or absence of antibody 11E12.
The different results are given in Table I.
REPLACEMENT LIGHT (RULE 26)

-6-TABLEAU I
AcM 8E1 : cTnl AcM 8E1 : cTnl+11E12 seule CONSTANTE CINETIQUE DE DISSOCIATION3,2.10-3 2,8.10-4 Koff(SW ) CONSTANTE CINETfQUE D'ASSOCIATION5,8.105 4,5.1 OS

Kon (M-1 x S-1 ) ' CONSTANTE DE DISSOCL4TION A 5,7.10-9 0,6.10-9 L'EQUILIBRE

Koff/ Kon (M) s Les résultats du Tableau I démontrent que pour l'anticorps 8E1, l'affinité est 10 fois plus élevée si la troponine I cardiaque est en présence de l'anticorps monoclonal 11 E12. Plus précisément, la constante de dissociation à
l'équilibre est 10 fois plus faible (la constante cinétique d'association ne varie pas). II
existe donc une coopérativité de la liaison des deux anticorps monoclonaux anti-io troponine I vis à vis de la troponine I cardiaque. Grâce à cette effet de "blocage" de la dissociation du complexe il est possible de réaliser le procédé de dosage immunoenzymatique, objet de la présente invention, avec ce couple d'anticorps monoclonaux.
15 Pour la formation du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque-marqueur enzymatique on utilise comme marqueur enzymatique soit la phosphatase alcaline soit la peroxydase.
On utilise la phosphatase alcaline lorsque le substrat chimiluminescent est un dérivé de 1,2-dioxetane et la peroxydase lorsque le 2o substrat chimiluminescent est un dérivé d'une diacylhydrazine.
On peut utiliser notamment les anticorps monoclonaux 8E1 ou 11 E12 pour préparer les conjugués avec un marqueur enzymatique. De préférence on prépare des conjugués de l'anticorps monoclonal 11 E12 avec la peroxydase et des conjugués de l'anticorps monoclonal 8E1 avec la phosphatase alcaline.
25 - Selon le mode de réalisation, on peut envisager somme support , solide soit des tubes en polystyrène sur lesquels est fixé l'anticorps anti-troponine I
cardiaque (cas du kit de diagnostic), soit des particules magnétiques (notamment ferriques) ou non sur lesquelles est fixé l'anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque (dosage automatisé).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) .7 Les conjugués anticorps monoclon~~l anti-troponine I - marqueur enzymatique sont préparés se~on les méthodes cornues [J. Histochem Cytochem (1974), 22, p 1084-1091].
La préparation des anticorps monoclonaux anti-troponine I fixés par exemple par des liaisons covalentes sur une phase solide, est aussi réalisée selon des méthodes décrites dans la littérature [J. Immunofogical Methods, (1979), ,~1, p.
231-23fiJ .
Lors de la mise en contact des échantillons à doser ou des standards avec un anticorps monoclonal antï-troponine I cardiaque et/ou un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, z o le pH du milieu réactionnel doit être de préférence légèrement acide. Le pH doit notamment être compris entre 5 et 6, plus prëcisément entre 5,4 et 5,7. Pour ajuster le pH on peut utiliser différents tampons adéquats ou des solutions d'acides organiques faibles, par exemple des solutions ou des tampons d'acide succinique ayant un pH de 5,2 à 5,4.
L'incubation entre le plasma ou 1e serum et les anticorps anti-troponine I ou les standards, est effectuée entre 20'C et 3TC et le temps d'incubation peut varier entre 5 et 20 minutes.
Après incubation, on procède à un ou plusieurs lavages qui sont effectués à une température de 2' à 3TC, de préférence à une température inférieure à 10'C. Pour les lavages, on utilise de manière préférentielle une solution de tampon phosphate pH 6,8 ou une solution tampon tris pH 8.
De ~~7_ms, de p-~~~êf ë:.re-nce , 1 ~:. s solut ions de lavage utilisées avant révé=!_~~tiori peuvcent avoir ~.~n pH égal â 6,8-8 et une températ:mre c:~e '~'" <-x 3'ï°C', <1e préférence à une température s_nférieure â 1ta°c~.
Comme il a été indiqué précédemment, comme substrat luminescent on utilise soit un dérivé de diacyihydrazine, plus spécialement le luminol [5-amino-2,3-dihydrophtalazine--1,4-dioneJ, soifi un dérivé de 1,2-dioxetane, plus spécialement le lumigen PPD [sel disodique de 4-methoxy 4-(3-phosphatephenyl) spiro (1,2-dioxetane 3-adamantane-2')J. Des sub:~trats luminescents contenant du ' o luminol sont disponibles dans le commerce comme par exemple le luminol ECL-immunoessai signal reagent HP~J 190*commercialisé par Amersharn ou le luminol BM Chimiluminescence ELISA reagent 1582950*commercialisé par Boehringer * (marques de cornme:rc~E

'i a Mannheim. On préfère des substrats qui contiennent un mélange de luminol et de iodophénol. Des substrats luminescents contenant du lumigen PPD sont aussi disponibles dans le commerce comme, par exemple, le Lurni-Phos 53U*
commercialisé par Analytical Luminescence i_aboratory. Ce réactif contient du lumigen PPD et un promoteur de la chimiluminescence qui est un tensioactif déri~ré
de la fluorescéine.
* (marque de cc~mmert=c La révélation enzymatique est aussi effectuée à une température comprise entre 20'C et 3TC. La lecture de la chimiluminescence est effectuée de préférence après environ 2-10 minutes.
Pour réaliser la gamme d'étalonnage d'un dosage quantitatif on utilise des solutions standards (standards) de la troponine I cardiaque humaine purifiée (Larve C. et al, Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979).
L'invention concerne aussi l'utilisation du luminol et du lumigen PPD
comme substrats chimiluminescents pour le dosage immunoenrymatique de type io sandwich de la troponine I cardiaque mettant en. oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un coûplé avec un marqueur enzymatique, en particulier la peroxydase, si le substrat est le luminol, et la phosphatase alcaline, si le substrat est le lumigen PPD, lesquels anticorps (soit naturellement, soit par coopérativité) ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M.
L'invention a également pour objet une trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenanf deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante 2o de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, de préférence le luminol ou un dérivé, de 1,2-dioxetane, de préférence le lumigen PPD.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent 2s l'invention.
EXEMPLE I
Dosage de la troponine I cardiaque avec un système automatisé
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Access~ immuoessai, système commercialisé par Sanofi Diagnostics Pasteur.
Le dosage est effectué de la manière suivante : Dans la cupule du dosage sont introduits 50 NI de l'échantillon à doser, 25 girl d'une solution ' d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 ~I d'une solution d'acide succinique 0,1 M, 50 girl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris ' 8E1-phosphatase alcaline (C = 5 ~Cg/ml).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Après incubation pendant 5 minutes à 37'C sont introduits 50 NI de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI---070!60) sur lesquelles sont fixés par des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de souris 11 E12.
Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 3TC, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon iris pH 8 on ajaute ensuite 200 ~I de substrat Lumi-Phos'" 530.
1 o La révélation est effectuée à 3TC et on mesure la iumïnescence générée par la réaction avec un luminomètre.
Le temps total d'analyse est de 15 minutes.
Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine I cardiaque humaine purifiée.
On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des concentrations comprises entre 0 et 50 ~g/I.
La sensibilité du procédé, évaluée par la courbe d'étalonnage, est de 3,5 ng/I.
EXEMPLE II
Dosage de la trooonine I cardiaque avec un kit immunoenzymatlaue Dans des tubes en polystyrène revétus d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de la souris 8E1, vn introduit 150 ul d'une solution tampon succincte contenant du Tween*20 â 0,2 %, des immunoglobulines de souris non spécifiques et 0,1 % de Kathon* 50 ~f du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 11 E12-peroxydase. et 200 NI d'échantillon â
doser ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage.
Pour la gamme ëtalonnage on utilise du sérum humain contenant de 3 0 0 â 2 ~g/I de troponine i cardiaque r7umaine purifiée.
* (marques de r_~omrnerrc,E-) ~0 On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à
température ambiante, puis on procède au lavage des tubes de la façon suivante - on renverse le contenu des tubes dans un récipïent et on éponge les tubes sur un papier absorbant, - on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0,1 P~", pH 6,8 contenant du Tween~20 à 0,1 '~'o et 0,3 % de Kathon* en maintenant la température au plus à 8'C. On répète cette étape 3 fois.
Après avoir procédé au lavage et élim'né toute trace de 1a soluticn utilisée pour ce dernier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant 1 o d'un mélange constitué de 100 parties de luminol (BM chimiluminescent ELISA
reagent~oehringer Mannheim) et 1 partie d'eau oxygénée.
On laisse à température ambiante et on mesure la luminescence avec un luminomètre après 3 minutes. Chaque tube est lu pendant exactement 30 secondes ou exactement 10 secondes.
La sensibilité de ce dosage est de 3 ng/I.
Les valeurs des rapports signal net/bruit de la mesure (S-B)/B
obtenues selon le procédé décrit ci-dessus et selon le procédé décrit par Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29(2), p. 271-278 ; Clin Chem. (1993), 39/f p. 972-979]
sont données dans le Tableau II ci-après.
TABLEAU Il Concentration en Procédé décrit par Procedé de I"exemple ~ponine I cardiaque _ _ Larue et al 5..~_ __..; ~QO - ~5;~5 _ __e S ~ 150 - 50 100 ngh _~_ - _ _.____~~-.. - i i ,g B - _ SO - 2,0 ng/I s~ _ ~5 ~5 95 ~ 1.~x SB = 0 ~S = B) Les valeurs des rapports signa.l/bruit de la mesure obtenue en appliquant le procédé de l'invention prouvent .sa grande sensibilité et sa spécificité
* (marqu.es de cornmerrE~; -6-TABLE I
MAb 8E1: cTnI mAb 8E1: cTn1 + 11E12 alone CONSTANT KINETIC DISSOCIATION3,2,10-3 2,8,10-4 Koff (SW) CONSTANT ASSOCIATION CINET5.8.105 4.5.1 OS

Kon (M-1 x S-1) CONSTANT OF DISSOCL4TION A 5.7.10-9 0.6.10-9 THE BALANCE

Koff / Kon (M) The results in Table I demonstrate that for the 8E1 antibody, the affinity is 10 times higher if cardiac troponin I is present of the monoclonal antibody 11 E12. Specifically, the dissociation constant at the equilibrium is 10 times lower (the kinetic constant of association not vary). II
there is therefore a cooperativity of the binding of the two monoclonal antibodies anti-troponin I with respect to cardiac troponin I. Thanks to this effect of "blocking" of the dissociation of the complex it is possible to realize the method of dosage immunoenzymatic subject of the present invention with this pair of antibodies monoclonal.
For the formation of the anti-troponin I monoclonal antibody conjugate cardiac enzyme marker is used as enzymatic marker is the alkaline phosphatase is peroxidase.
Alkaline phosphatase is used when the substrate chemiluminescent is a derivative of 1,2-dioxetane and peroxidase when the The chemiluminescent substrate is a derivative of a diacylhydrazine.
In particular, the monoclonal antibodies 8E1 or 11 E12 to prepare the conjugates with an enzymatic marker. Preferably Conjugates of monoclonal antibody 11 E12 with peroxidase are prepared and conjugates of monoclonal antibody 8E1 with alkaline phosphatase.
25 - According to the embodiment, it is possible to envisage a support sum, solid or polystyrene tubes to which the anti-troponin I
heart (diagnostic kit case) or magnetic particles (especially ferric acid) or not, to which the monoclonal antibody troponin I
heart rate (automated dosing).
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) .7 Conjugates monoclonal antibody ~~ 1 anti-troponin I - marker enzymatic are prepared if ~ the retorted methods [J. Histochem Cytochem (1974), 22, p 1084-1091].
The preparation of anti-troponin I monoclonal antibodies fixed by example by covalent bonds on a solid phase, is also carried out according to methods described in the literature [J. Immunofogical Methods, (1979), , ~ 1, p.
231-23fiJ.
When contacting the samples to be assayed or standards with a cardiac antithonin I monoclonal antibody and / or cardiac anti-troponin I monoclonal antibody coupled to a marker enzyme, the pH of the reaction medium should preferably be slightly acidic. The pH must in particular be between 5 and 6, more precisely between 5.4 and 5.7. For adjust the pH one can use different suitable buffers or acid solutions weak organic compounds, eg acid solutions or buffers succinic having a pH of 5.2 to 5.4.
Incubation between plasma or serum and antibodies troponin I or standards, is performed between 20'C and 3TC and the time incubation can vary between 5 and 20 minutes.
After incubation, one or more washings are carried out carried out at a temperature of 2 'to 3TC, preferably at a temperature of less than 10 ° C. For the washings, it is preferable to use a solution pH 6.8 phosphate buffer or tris pH 8 buffer solution.
~~ 7_ms, of p ~ ~~~ ef ë: .re-nce, 1 ~ :. s wash solut ions used before revelation can have ~. ~ n pH equal to 6.8-8 and a temperature of not more than one per cent.
temperature below 1 ° C.
As previously indicated, as a substrate luminescent one uses either a diacyihydrazine derivative, especially the luminol [5-amino-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dione], a 1,2-dioxetane derivative, more especially lumigen PPD [disodium salt of 4-methoxy 4- (3-phosphatephenyl) spiro (1,2-dioxetane 3-adamantane-2 ') J. Luminescent substrates containing of luminol are commercially available, for example luminol ECL-immunoassay signal reagent HP ~ J 190 * marketed by Amersharn or luminol BM Chemiluminescence ELISA Reagent 1582950 * sold by Boehringer * (marks of cornme: rc ~ E

AI
Mannheim. Substrates which contain a mixture of luminol and iodophenol. Luminescent substrates containing lumigen PPD are also commercially available, for example Lurni-Phos 53U *
marketed by Analytical Luminescence i_aboratory. This reagent contains lumigen PPD and a chemiluminescence promoter which is a surfactant bypa re ~
fluorescein.
* (cc mark = mmert = c The enzymatic revelation is also carried out at a temperature between 20'C and 3TC. The reading of the chemiluminescence is carried out of preferably after about 2-10 minutes.
To achieve the calibration range of a quantitative assay uses standard (standard) solutions of cardiac troponin I
human purified (Larve C. et al, Clin Chem (1993), 39, pp. 972-979).
The invention also relates to the use of luminol and lumigen PPD
as chemiluminescent substrates for the immunoenrymatic assay of the type cardiac troponin I sandwich. work two antibodies monoclonal anti-troponin I cardiac one of which is costed with a marker enzymatic, in particular peroxidase, if the substrate is luminol, and the alkaline phosphatase, if the substrate is lumigen PPD, which antibodies (is naturally, either by cooperativity) have for cardiac troponin I a constant dissociation at equilibrium equal to or less than 10-8 M.
The subject of the invention is also a kit for assaying the cardiac troponin I comprenanf two monoclonal antibodies anti-troponin I
which one is coupled with an enzymatic marker which antibodies, is naturally either by cooperatively have for cardiac troponin I a constant 2o equilibrium dissociation equal to or less than 10-9 M, and a substrate chemiluminescent derivative of a diacylhydrazine, preferably luminol or a derivative, 1,2-dioxetane, preferably lumigen PPD.
The following examples, given in a non-limiting way, illustrate 2s the invention.
EXAMPLE I
Cardiac troponin I assay with an automated system The automated system used for enzyme immunoassay is the system Access ~ immuoessai, system marketed by Sanofi Pasteur Diagnostics.
The dosage is carried out as follows: In the cup of the assay are introduced 50 NI of the sample to be assayed, 25 girl of a solution ' mouse immunoglobulin at 4 mg / ml, 10 ~ I of an acid solution 0.1 succinic M, 50 girl conjugated monoclonal antibody anti-troponin I cardiac mouse ' 8E1-alkaline phosphatase (C = 5 ~ Cg / ml).
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) After incubation for 5 minutes at 37 ° C., 50 NI of ferric latex beads (Rhône Poulenc MI-070! 60) on which are fixed by covalent binding of cardiac anti-troponin I monoclonal antibodies of mouse 11 E12.
The mixture is incubated for 36 seconds at 3TC, then the beads Ferric latexes are separated using a magnetic field. We proceed to washing with an iris buffer solution pH 8 is then added 200 ~ I of substratum Lumi-Phos'"530.
1 o The revelation is performed at 3TC and we measure the iumïnescence generated by the reaction with a luminometer.
The total analysis time is 15 minutes.
For the calibration range, solutions of troponin are used I purified human heart.
A calibration range corresponding to concentrations between 0 and 50 ~ g / I.
The sensitivity of the process, evaluated by the calibration curve, is 3.5 ng / I.
EXAMPLE II
Dosage of the cardiac trooonin I with an immunoenzymatlaue kit In polystyrene tubes coated with monoclonal antibodies cardiac anti-troponin I 8E1, vn introduced 150 μl of a buffer solution 20% Tween * 20, non-mouse immunoglobulins and 0.1% Kathon * 50 ~ f conjugated monoclonal antibody mouse cardiac troponin I 11 E12-peroxidase. and 200 NI sample at dose or a standard solution used for the calibration range.
For the calibration range, human serum containing 30% to 2% purified cardiac troponin.
* (marks of r_ ~ omrnerrc, E-) ~ 0 Incubate 15 minutes precisely with horizontal stirring at room temperature, then proceed to wash the tubes as follows - the contents of the tubes are spilled in a container and the tubes are sponged on a absorbent paper, washing is carried out by adding 1 ml of 0.1 P ~ phosphate buffer, pH 6.8 containing Tween ~ 20 at 0.1 '~' o and 0.3% of Kathon * while maintaining the temperature at most at 8'C. This step is repeated 3 times.
After washing and removing all traces of the soluticn used for the latter, the enzymatic revelation is carried out using 1 o a mixture of 100 parts of luminol (chemiluminescent BM) ELISA
reagent ~ oehringer Mannheim) and 1 part hydrogen peroxide.
It is left at ambient temperature and the luminescence is measured with a luminometer after 3 minutes. Each tube is read for exactly 30 seconds or exactly 10 seconds.
The sensitivity of this assay is 3 ng / I.
The values of the net signal / noise ratio of the measurement (SB) / B
obtained according to the process described above and according to the method described by Larue C. and al [Mol. Immunol. (1992), 29 (2), p. 271-278; Clin Chem. (1993), 39 / f p. 972-979]
are given in Table II below.
TABLE II
Process concentration described by Example procedure Cardiac ponin _ Larue et al 5 .. ~ _ __ ..; ~ QO - ~ 5; ~ 5 _ __e S ~ 150 - 50 100 ngh _ ~ _ - _ _.____ ~~ - .. - ii, g B - _ SO - 2.0 ng / I s ~ ~ ~ 5 ~ 5 95 ~ 1. ~ x SB = 0 ~ S = B) The values of the signa.l / noise ratios of the measurement obtained in applying the method of the invention prove its high sensitivity and its specificity * (markings of cornmerr ~;

Claims

1. Sandwich immunoenzymatic assay method of cardiac troponin I, characterized in that it includes the following steps:
a) samples or standards are set contact with two monoclonal anti-troponin I antibodies cardiac to form a reaction mixture, one of antibody is coupled with an enzyme label, which antibodies, either naturally or through cooperative action, have for cardiac troponin I a dissociation constant at equilibrium equal to or less than 10-8 M, b) the reaction mixture is washed, c) an enzymatic revelation is carried out by addition of a chemiluminescent substrate, derived from the diacyl hydrazine or 1,2-dioxetane, d) the amount of cardiac troponin I is evaluated by direct reading of a light signal obtained.

2. Method according to claim 1, comprising the following steps:
a) the samples to be assayed or the standards are set in simultaneous contact with an anti-monoclonal antibody cardiac troponin I coupled to an enzyme label and with a second monoclonal anti-troponin I antibody cardiac possibly attached to a solid support, b) the reaction mixture is incubated, c) then washed, d) the enzymatic revelation is carried out by addition of a chemiluminescent substrate, derived from a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane derivative, e) the quantity of cardiac troponin I present in the samples to be assayed or standards, is evaluated by direct reading of the light signal obtained.

3. Method according to claim 1, comprising the following steps:
a) the samples to be assayed or standards are brought into contact, - either, first with a monoclonal anti-troponin I antibody cardiac coupled to an enzymatic marker, then after incubation, with a second monoclonal anti-troponin I cardiac antibody possibly attached on a solid support, and incubated again, - either, first with a monoclonal anti-troponin I antibody fixed on a solid support then after incubation and possible washing, with a second monoclonal anti-troponin I antibody cardiac coupled to an enzyme marker and incubated again, b) the reaction mixture is then washed, c) the enzymatic development is carried out by addition of a substrate chemiluminescent derived from a diacylhydrazine or derived from 1,2-dioxetane, d) the amount of cardiac troponin I present in the samples to be assayed or in standards is evaluated by direct reading of light signal obtained.

4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that the chemiluminescent substrate is luminol.

5. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that the chemiluminescent substrate is the lumigen PPD.

6. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that anti-troponin I monoclonal antibodies are antibodies mouse monoclonals 11 E12 and 8E1.

7. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that the enzymatic marker coupled to the anti-troponin I monoclonal antibody, is alkaline phosphatase or peroxidase.

8. Method according to any one of claims 1 and 2, characterized in that that the cardiac anti-troponin I monoclonal antibody coupled to a marker enzymatic is a monoclonal anti-troponin I cardiac antibody conjugate peroxidase said antibody being a mouse monoclonal antibody 11 E12, and the chemiluminescent substrate is a derivative of a diacylhydrazine.

9. Method according to claim 1 or 3, characterized in that the antibody monoclonal cardiac anti-troponin I coupled to an enzyme label is a monoclonal anti-troponin I cardiac antibody-phosphatase conjugate alkaline, said antibody being a mouse antibody 8E1, and the substrate chemiluminescent is a derivative of 1,2-dioxetane.

10. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that the chemiluminescent substrate is a mixture of luminol and 4-iodophenol.

11. Method according to any one of claims 2 or 3, characterized in what bringing the samples to be assayed or standards into contact with a cardiac anti-troponin I monoclonal antibody coupled to a marker enzymatic and possibly a second anti-troponin I antibody, is carried out at a slightly acid pH between 5 and 6.

12. Method according to claim 11, characterized in that said pH
slightly acidic is between 5.4 and 5.7.

13. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the step where the reaction mixture is washed before the revelation stage uses solutions with a pH of 6.8 or 8 and a temperature included between 2 ° and 37 ° C.

14. Method according to claim 13, characterized in that said temperature is below 10 ° C.

15. Use of luminol as a chemiluminescent substrate for the assay cardiac troponin I sandwich immunoenzyme uses two cardiac anti-troponin I monoclonal antibodies, one of which is coupled with peroxidase, which antibodies either naturally or by cooperativeness, have for cardiac troponin I a dissociation constant at equilibrium equal to or less than 10 -8 M.

16. Use of lumigen PPD as a chemiluminescent substrate for sandwich enzyme immunoassay of cardiac troponin I
using two cardiac anti-troponin I monoclonal antibodies, one coupled with alkaline phosphatase, which antibodies are naturally either by cooperativity, have for cardiac troponin I a constant of dissociation at equilibrium equal to or less than 10 -8 M.

17. Cardiac troponin I assay kit comprising two cardiac anti-troponin I monoclonal antibodies one of which is coupled with a enzymatic marker which antibodies, either naturally or by cooperativity have a dissociation constant for cardiac troponin I
at equilibrium equal to or less than 10 -9 M, and a chemiluminescent substrate derivative a diacylhydrazine or 1,2-dioxetane.