FR2729674A1 - Cells for prodn. of recombinant adeno and adeno-associated virus - Google Patents

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Abstract

Cell for prodn. of defective adenovirus (AV) has inserted into its genome a part of the E4 region of the AV genome contg. the open reading frame ORF6 under control of a functional promoter. Also new are: (1) plasmids contg. the specified E4 region under control of an inducible promoter; (2) stocks of pure, recombinant defective AV lacking at least the E4 region, produced in the new cells; and (3) the recombinant defective AV DELTA E1,ORF3-, ORF6- (AV1), DELTA E1, DELTA E4,ORF1+ (AV2), DELTA E1, DELTA E4,ORF4+(AV3) and DELTA 1, DELTA E4 (AV4).

Description

La présente invention concerne de nouvelles lignées cellulaires utilisables pour la production d'adénovirus recombinants défectifs. Elle concerne également les préparations virales purifiées produites dans ces lignées, ainsi que les plasmides permettant leur construction. Plus particulièrement, les nouvelles lignées cellulaires selon l'invention permettent la transcomplémentation de la région E4 et une production clonale avec des titres élevés d'adénovirus recombinants défectifs notamment pour tout ou partie de la région E4. The present invention relates to novel cell lines useful for the production of defective recombinant adenoviruses. It also concerns the purified viral preparations produced in these lines, as well as the plasmids allowing their construction. More particularly, the new cell lines according to the invention allow transcomplementation of the E4 region and clonal production with high levels of recombinant adenovirus defective including all or part of the E4 region.

Les adénovirus présentent certaines propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation comme vecteur de transfert de gènes en thérapie génique. Adenoviruses have certain particularly advantageous properties for use as gene transfer vectors in gene therapy.

Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adênovirus ont ainsi été utilisés pour transférer des gènes d'intérêt dans le muscle (Ragot et aL,
Nature 361 (1993) 647), le foie staffe et al.. Nature genetics 1 (1992) 372), le système nerveux (Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224). etc.In particular, they have a broad host range, are able to infect quiescent cells, do not integrate into the genome of the infected cell, and have not been associated to date with significant pathologies in the body. man. The adenoviruses have thus been used to transfer genes of interest into the muscle (Ragot et al.
Nature 361 (1993) 647), liver staff et al., Nature genetics 1 (1992) 372), the nervous system (Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224). etc.

Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (rIR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1). Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceuxì, les gènes contenus dans la région El notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions L1 à L5. Les génome de l'adènovirus Ad5 a été entièrement séquencé et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260).  Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses of about 36 kb in size. Their genome includes a repeated inverted sequence (rIR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes (see Figure 1). The main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions. Among them, the genes contained in the El region in particular are necessary for viral propagation. The main late genes are contained in regions L1 to L5. The ad5 adenovirus genome has been fully sequenced and is available on a database (see in particular Genebank M73260).

De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad12, etc) ont également été séquencées.Likewise, parts or even all other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad12, etc.) have also been sequenced.

Pour leur utilisation en thérapie génique, différents vecteurs dérivés des adénovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (égal, OTC, a-lAT, cytokines, etc). Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la région El, essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al.,
Gene 50 (1986) 161). Ces adénovirus sont produits dans une lignée de complémentation (lignée 293) dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée.Plus précisément, la lignée 293 contient l'extrémité gauche (environ 11 12Q/o) du génome de l'adénovirtis sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation, la région El, incluant Ela, Elb, et une partie de la région codant pour la protéine pIX. Cette lignée est capable de trans complémenter des adénovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés
Cependant, les vecteurs déficients pour la région El (vecteurs El-, dits de première génération) présentent certains inconvénients pour une utilisation thérapeutique.En particulier, ils pourraient ne pas être totalement défectifs pour la réplication in vivo, en raison notamment de l'existence de certaines fonctions cellulaires transcomplémentantes. Ainsi. une activité de transcomplémentation de El a été mise en évidence dans les cellules de carcinome embryonnaire F9 (Imperiale et al.. 1984).For their use in gene therapy, various vectors derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different genes (equal, OTC, α-AT, cytokines, etc.). In each of these constructs, the adenovirus has been modified so as to render it incapable of replication in the infected cell. Thus, the constructs described in the prior art are adenoviruses deleted from the E1 region, essential for viral replication, at which the heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al.
Gene 50 (1986) 161). These adenoviruses are produced in a complementation line (line 293) in which part of the adenovirus genome has been integrated. More precisely, the 293 line contains the left end (approximately 11 12%) of the genome of the adenovirus. adenovirtis serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the encapsidation region, the E1 region, including Ela, Elb, and a portion of the pIX protein coding region. This line is capable of trans complementing recombinant adenoviruses defective for the El region, that is to say devoid of all or part of the El region, and to produce viral stocks with high titers.
However, the vectors deficient for the El region (El- vectors, called first-generation) have certain drawbacks for a therapeutic use. In particular, they may not be totally defective for in vivo replication, particularly because of the existence certain transcomplementing cellular functions. So. El transcomplementation activity has been demonstrated in F9 embryonic carcinoma cells (Imperiale et al., 1984).

Une activité de même type, régulée par l'interleukine-6, a également éte mise en évidence (Spergel et al., 1992). D'autres inconvénients liés à ces vecteurs sont la présence de nombreux gènes viraux, susceptibles d'être exprimés in vivo auprès transfert de gènes, et d'induire une réponse immunitaire et/ou inflammatoire.An activity of the same type, regulated by interleukin-6, has also been demonstrated (Spergel et al., 1992). Other disadvantages related to these vectors are the presence of numerous viral genes, which can be expressed in vivo with gene transfer, and to induce an immune and / or inflammatory response.

Pour palier à ces inconvénients, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant ts125, permettant d'inactiver la protéine de liaison à 1'ADN (DBP) de 72kDa (Van der Vliet et al., 1975). Ces vecteurs peuvent également être produits avec des titres élevés dans les cellules de la lignée 293 à la température permissive (32 C). Toutefois, ce type de vecteur présente aussi un certain nombre d'inconvénients tels qu'une surexpression in vivo de la région
E4; la présence d'une mutation ponctuelle, donc sujette à réversion, un risque d'activité partielle à 37 C, etc.To overcome these drawbacks, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus. Thus, a thermosensitive point mutation was introduced into the ts125 mutant, allowing inactivation of the 72kDa DNA binding protein (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). These vectors can also be produced with high titers in cells of line 293 at the permissive temperature (32 C). However, this type of vector also has a number of disadvantages such as in vivo overexpression of the region.
E4; the presence of a point mutation, therefore subject to reversion, a partial activity risk at 37 C, etc.

Une autre approche pour remédier à ces problèmes réside dans la délétion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale. A cet égard, la demanderesse s'est intéressée plus particulièrement à la région E4. La région
E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions El et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits voir notamment la demande PCT/FR94/00851).Toutefois, la construction et rexploitation industrielle et thérapeutique de tels vecteurs implique la mise à disposition d'un système efficace de transcomplémentation de ces deux fonctions pour la production des stocks viraux.Another approach to remedy these problems is the deletion of another region essential for replication and / or viral propagation. In this respect, the plaintiff was particularly interested in the E4 region. The region
E4 is indeed involved in the regulation of late gene expression, in the stability of late nuclear RNA, in the quenching of host cell protein expression and in the efficiency of DNA replication. viral. Adenoviral vectors in which the E1 and E4 regions are deleted therefore have a very low transcription background and expression of viral genes, in particular see the application PCT / FR94 / 00851). However, the industrial and therapeutic construction and exploitation of such vectors implies the provision of an efficient system for the transcomplementation of these two functions for the production of viral stocks.

La présente invention apporte une solution à ce problème. La présente invention fournit en effet des lignées cellulaires permettant la transcomplémentation de la région E4 et une production clonale et avec des titres élevés d'adénovirus recombinants défectifs pour cette région. Les lignées selon l'invention sont avantageusement capables de transcomplémenter les deux fonctions El et E4, et permettent donc de produire des virus déficients pour ces deux fonctions. La présente invention fournit également des plasmides permettant la construction de ces lignées; un procédé de préparation d'adénovirus recombinants défectifs et des stocks viraux purifiés. Plus particulièrement, la demanderesse a maintenant montré que des lignées de production capables de transcomplémenter efficacement la région E4 sont obtenues par introduction d'une partie seulement de la région E4.Ainsi des lignées ayant des propriétés particulièrement avantageuses sont obtenues lorsque seulement une unité fonctionnelle réduite de la région E4, correspondant à la phase de lecture ORF6 ou aux phases de lecture ORF6 et ORF6/7, sont présentes. The present invention provides a solution to this problem. The present invention indeed provides cell lines for transcomplementation of the E4 region and clonal production and with high titers of recombinant adenovirus defective for this region. The lines according to the invention are advantageously capable of transcomplementing the two functions E1 and E4, and thus make it possible to produce deficient viruses for these two functions. The present invention also provides plasmids for constructing these lines; a process for preparing defective recombinant adenoviruses and purified viral stocks. More particularly, the Applicant has now shown that production lines capable of efficiently transcomplementing the E4 region are obtained by introducing only a part of the E4 region. Thus lines with particularly advantageous properties are obtained when only a reduced functional unit is obtained. of the region E4, corresponding to the reading phase ORF6 or to the reading phases ORF6 and ORF6 / 7, are present.

Un premier objet de l'invention réside donc dans un cellule utilisable pour la production d'adénovirus recombinants défectifs comprenant, insérée dans son génome, une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus comportant la phase de lecture
ORF6 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. Selon un mode préféré, les cellules de l'invention comprennent une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus comportant les phases de lecture ORF6 et ORF6/7 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel.A first subject of the invention therefore resides in a cell that can be used for the production of defective recombinant adenoviruses comprising, inserted into its genome, a part of the E4 region of an adenovirus genome comprising the reading phase.
ORF6 under the control of a functional promoter. According to one preferred embodiment, the cells of the invention comprise a part of the E4 region of an adenovirus genome comprising the ORF6 and ORF6 / 7 reading phases under the control of a functional promoter.

Comme indiqué ci-avant, les lignées cellulaires selon la présente invention présentent des propriétés particulièrement avantageuses : Elles permettent tout d'abord la transcomplémentation des fonctions El et E4. Mais, de manière particulièrement avantageuse, elles sont capables d'induire la formation de plages de virus déficients dans ces fonctions, ce qui est indispensable au clonage des virus recombinants, puis à leur amplification et à leur purification. A cet égard, la demanderesse a en effet montré que des lignées possédant l'ensemble de la région E4 ou des unités fonctionnelles plus grandes, incluant par exemple la phase de lecture
ORF4, sont incapables de former des plages de virus déficients pour la région E4.As indicated above, the cell lines according to the present invention have particularly advantageous properties: They allow firstly the transcomplementation of the functions E1 and E4. But, particularly advantageously, they are capable of inducing the formation of deficient virus plaques in these functions, which is essential for the cloning of recombinant viruses, and then for their amplification and purification. In this respect, the applicant has indeed shown that lines having the entire region E4 or larger functional units, including for example the reading phase
ORF4, are unable to form deficient virus plaques for the E4 region.

L'identification d'unités fonctionnelles spécifiques de la région E4 permet la réalisation d'un système très efficace de transcomplémentation et de production de virus défectifs pour les fonctions El et M. D'autres avantages des lignées selon l'invention sont notamment leur aptitude pour l'amplification en milieu liquide de tels virus déficients pour les régions El et M, les titres élevés de tels virus qu'elles produisent, et l'absence de production de particule virale réplicative contaminante. The identification of specific functional units of the E4 region allows the realization of a very efficient system of transcomplementation and production of defective viruses for the functions E1 and M. Other advantages of the lines according to the invention are notably their ability. for the amplification in a liquid medium of such viruses deficient for the E1 and M regions, the high titers of such viruses that they produce, and the absence of production of contaminating replicative viral particles.

La région M du génome adénoviral est constituée de 7 phases ouvertes de lecture, désignées ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 et ORF6/7 (figure 2). The M region of the adenoviral genome consists of 7 open reading frames, designated ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3 / 4, ORF6 and ORF6 / 7 (FIG. 2).

Comme indiqué ci-avant, les cellules de l'invention sont caractérisées particulièrement par la présence d'une partie seulement de cette région, correspondant à la phase de lecture ORF6 éventuellement associée à la phase de lecture ORF6,'7. As indicated above, the cells of the invention are characterized in particular by the presence of only a part of this region, corresponding to the ORF6 reading phase possibly associated with the ORF6 reading phase, 7.

Ces différentes parties de la région M peuvent être obtenues par coupures enzymatiques selon les méthodes connues de l'homme du métier. A titre d'exemples préférés, la phase de lecture ORF6 peut être isolée de la région E4 sous forme d'un fragment BglII-PvuII, correspondant aux nucléotides 34115-33126, et les phases de lecture ORF6-ORF6/7 peuvent être isolées de la région M sous forme d'un fragment
BglII-BglII correspondant aux nucléotides 34115-32490 du génome de l'Ad5. n est particulièrement important que la partie de la région M présente dans les cellules de l'invention ne contiennent pas la phase de lecture ORF4 fonctionnelle.These different parts of the M region can be obtained by enzymatic cleavage according to the methods known to those skilled in the art. By way of preferred examples, the ORF6 reading phase can be isolated from the E4 region in the form of a BglII-PvuII fragment, corresponding to nucleotides 34115-33126, and the ORF6-ORF6 / 7 reading phases can be isolated from the region M in the form of a fragment
BglII-BglII corresponding to nucleotides 34115-32490 of the genome of Ad5. It is particularly important that the portion of region M present in the cells of the invention do not contain the functional ORF4 reading phase.

A cet égard, un mode de réalisation particuliérement préféré de l'invention est constitué par une cellule comprenant, inséré dans son génome, un fragment BglII BgllI correspondant aux nucléotides 34115-32490 du génome de rAd5. Ce fragment est présent notamment dans le plasmide pORF6Gen décrit dans les exemples, utilisé pour la construction de la lignée cellulaire clone#2. Un autre mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention est constitué par une cellule comprenant, inséré dans son génome, un fragment Bgln-PvuII correspondant aux nucléotides 34115- 33126 du génome de lAdS. In this respect, a particularly preferred embodiment of the invention consists of a cell comprising, inserted in its genome, a BglII BglII fragment corresponding to nucleotides 34115-32490 of the rAd5 genome. This fragment is present in particular in the plasmid pORF6Gen described in the examples, used for the construction of the cloned cell line # 2. Another particularly preferred embodiment of the invention consists of a cell comprising, inserted into its genome, a Bgln-PvuII fragment corresponding to nucleotides 34115-33126 of the AdS genome.

La partie de la région E4 présente dans les cellules selon l'invention peut être issue d'adénovirus de différentes origines ou sérotypes. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, la région E4 présente dans les cellules selon l'invention peut être issue d'un adénovirus d'origine humaine ou animale. The part of the E4 region present in the cells according to the invention may be derived from adenoviruses of different origins or serotypes. There are indeed different serotypes of adenovirus, whose structure and properties vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. More particularly, the E4 region present in the cells according to the invention may be derived from an adenovirus of human or animal origin.

Concernant les adénovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement encore.  As regards the adenoviruses of human origin, mention may be made preferably of those classified in group C. More preferably still.

parmi les différents sérotypes d'adénovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). Parmi les différents adénovirus d'origine animale, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemples.among the various serotypes of human adenovirus, it is preferred to use in the context of the present invention adenovirus type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5). Among the various adenoviruses of animal origin, it is preferred to use, in the context of the invention, adenoviruses of canine origin, and in particular all the CAV2 adenovirus strains [Manhattan strain or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example).

D'autres adénovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande
WO94/26914 incorporée à la présente par référence.Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in the application
WO94 / 26914 incorporated herein by reference.

Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, la partie de la région
E4 est issue d'un génome d'adénovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, elle est issue du génome d'un adénovirus Ad2 ou Ad5. In a preferred embodiment of the invention, the part of the region
E4 is derived from a group C human adenovirus genome. More preferably, it is derived from the genome of an Ad2 or Ad5 adenovirus.

Comme indiqué précédemment, la partie de la région E4 présente dans les cellules de l'invention est placée sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans lesdites cellules. Avantageusement, il s'agit d'un promoteur inductible, permettant de contrôler les niveaux et/ou les périodes d'expression de ces gènes. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit du promoteur du LTR de MMTV (Pharmacia > , qui est induit par la déxaméthasone ou d'un promoteur régulé par la tétracycline (demande US publiée n"08/076,327; W094/04672). Il est entendu que autres promoteurs peuvent être utilisés, et notamment des variants du LTR de MMTV portant par exemple des régions hétérologues de régulation (régions "enhancer" notamment). As indicated above, the part of the E4 region present in the cells of the invention is placed under the control of a functional promoter in said cells. Advantageously, it is an inducible promoter, making it possible to control the levels and / or the periods of expression of these genes. Particularly advantageously, it is the MMTV LTR promoter (Pharmacia>, which is induced by dexamethasone or a tetracycline-regulated promoter (published US application No. 08 / 076,327; WO94 / 04672). It is understood that other promoters may be used, and in particular MMTV LTR variants bearing, for example, heterologous regulatory regions ("enhancer" regions in particular).

Les cellules selon l'invention peuvent être préparées à partir de différentes cellules pharmaceutiquement utilisables, c'est-à-dire cultivables dans des conditions industriellement acceptables et n'ayant pas de caractère pathogène reconnu. ll pet s'agir de lignées cellulaires établies ou de cultures pnmaires. n s'agit avantageusement de cellules d'origine humaine, infectables par un adénovirus. A cet égard, on peut citer les cellules KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, etc
Les cellules de la lignée KB sont issues d'un carcinome épidermique humain
Elles sont accessibles à l'ATCC (ref. CCL17) ainsi que les conditions permettant leur culture. La lignée de cellules humaines Hela est issue d'un carcinome de l'épithelium humain.Elle est également accessible à l'ATCC (ref. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture. Les cellules de la lignée 293 sont des cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 (12 %). La lignée de cellules gm DBP6 ugh et al.,
Virology 190 (1992) 624) est constituée de cellules Hela portant le gêne E2 d'adénovirus sous le controle du LTR de MMTV.The cells according to the invention may be prepared from different pharmaceutically useful cells, that is to say those which can be cultured under commercially acceptable conditions and which have no recognized pathogenic character. These may be established cell lines or primary cultures. It is advantageously of cells of human origin, infectable by an adenovirus. In this respect, mention may be made of KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, etc. cells.
The cells of the KB line are derived from a human epidermal carcinoma
They are accessible to the ATCC (ref CCL17) and the conditions for their cultivation. The Hela human cell line is derived from carcinoma of the human epithelium.It is also accessible to ATCC (ref.CCL2) as well as the conditions allowing its cultivation. The cells of line 293 are human embryonic kidney cells (Graham et al., J. Gen. Virol 36 (1977) 59). This line contains, in particular, integrated in its genome, the left part of the genome of the Ad5 human adenovirus (12%). The gm DBP6 ugh et al.
Virology 190 (1992) 624) consists of Hela cells carrying the E2 adenovirus gene under the control of the MMTV LTR.

ll peut s'agir également de cellules d'origine canine (BHK, MDCK, etc). A cet égard, les cellules de la lignée canines MDCK sont préférées. Les conditions de culture des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al., Science 44 (1988) 9. It can also be cells of canine origin (BHK, MDCK, etc.). In this respect, the cells of the MDCK canine line are preferred. The conditions for culturing MDCK cells have been described in particular by Macatney et al., Science 44 (1988) 9.

Les lignées cellulaires selon l'invention peuvent être construites de différentes manières. De façon générale, elles sont préparées par transformation d'une culture cellulaire avec un plasmide portant le fragment sélectionné de la région E4 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. La transfection des cellules peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment en péseoce de phosphate de calcium, par électroporation, etc. Selon un mode particulier de réalisation, le plasmide utilisé porte également un gène marqueur permettant d'identifier et de sélectionner les cellules transformées. n peut s'agir notamment de tout gène de résistance à un antibiotique (généticine, hygromycine, etc).Le gène marqueur peut également être porté par une construction séparée, -transfectée avec le plasmide. Après transfection et sélection pour le gène marqueur, les cellules obtenues peuvent être sélectionnées pour leur capacité à transcomplémenter des adénovirus dépourvus de la région EA. Pour cela, différents adénovirus mutants défectifs pour différentes parties de la région E4 peuvent être utilisés, tels que notamment les adénovirus Ad2d1808 (Weinberg et al., 1986), Ad5dl1004, du1007 ou dl1014 (Bridge et al., 1989 > . dol1011 (Bridge et aI., 1993), comme indiqué dans les exemples. The cell lines according to the invention can be constructed in different ways. In general, they are prepared by transformation of a cell culture with a plasmid carrying the selected fragment of the E4 region under the control of a functional promoter. The transfection of the cells can be carried out by any technique known to those skilled in the art, and in particular calcium phosphate perescece, by electroporation, etc. According to a particular embodiment, the plasmid used also carries a marker gene making it possible to identify and select the transformed cells. It may be in particular any gene for resistance to an antibiotic (geneticin, hygromycin, etc.). The marker gene may also be carried by a separate construct, transfected with the plasmid. After transfection and selection for the marker gene, the resulting cells can be selected for their ability to transcomplement adenoviruses lacking the EA region. For this, different defective mutant adenoviruses for different parts of the E4 region can be used, such as in particular Ad2d1808 adenovirus (Weinberg et al., 1986), Ad5dl1004, 1007 or dl1014 (Bridge et al., 1989> dol1011 (Bridge et al., 1993), as shown in the examples.

Avantageusement, les cellules selon l'invention sont également capables de transcomplémenter pour la région E 1. Celles-ci peuvent être construites comme décrit ci-avant à partir de cellules qui transcomplémentent déjà la région El (exemple cellules 293), ou par introduction séquentielle d'une construction apportant la région E 1 et d'une construction apportant la partie de la région E4 selon l'invention.  Advantageously, the cells according to the invention are also capable of transcomplementing for the E 1 region. These can be constructed as described above from cells that already transcomplement the E1 region (eg 293 cells), or by sequential introduction. a construction providing the region E 1 and a construction providing the part of the region E4 according to the invention.

Selon un mode particuliérement préféré, les cellules selon l'invention dérivent de la lignée cellulaire 293. A cet égard, des résultats particulièrement avantageux ont été obtenus avec des cellules de la lignée 293 transformées par le plasmide pORF6Gen.  According to a particularly preferred mode, the cells according to the invention are derived from the 293 cell line. In this respect, particularly advantageous results have been obtained with cells of the 293 line transformed with the plasmid pORF6Gen.

La présente invention décrit également la construction de plasmides comprenant une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 ou 0RF6 et 0RF6/7 sous contrôle d'un promoteur inductible (voir notamment plasmide pORF6Gen). Ces plasmides peuvent être utilisés directement pour transfecter une population cellulaire choisie, puis, par sélection, pour l'identification de cellules ayant acquis stablement la fonction E4. The present invention also describes the construction of plasmids comprising part of the E4 region of an adenovirus genome carrying the reading phase ORF6 or ORF6 and ORF6 / 7 under control of an inducible promoter (see in particular plasmid pORF6Gen). These plasmids can be used directly to transfect a selected cell population, then, by selection, for the identification of cells having stably acquired the E4 function.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation des cellules décrites ciavant pour la production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région
E4. L'invention fournit en effet un procédé de production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région E4 particulièrement avantageux, mettant en oeuvre les cellules ci-avant. Selon ce procédé, on transforme une culture de cellules telles que décrites ci-avant avec un ou plusieurs plasmides apportant les différentes régions du génome dudit adénovirus recombinant défectif puis on récolte les virus produits. Ce procédé est particulièrement avantageux pour la production d'adénovirus possédant des régions El et E4 non fonctionnelles. Il s'agit notamment de vecteurs dans lesquels les régions El et E4 ont été inactivées ou rendues non fonctionnelles par délétion totale ou partielle.De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situe par exemple, au moyen des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. La ou lesdites modificatices génétiques peuvent être localisées dans une partie codante de la region, ou en d'une région codant, et par exemple dans les régions responsables de rvian et/ou de la régulation transcriptionelle desdits gènes. La délétion peut être effectuée par digestion au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques classiques de biologie moléculaire.Another subject of the invention lies in the use of the cells described above for the production of defective recombinant adenoviruses at least for the region
E4. The invention indeed provides a method for producing recombinant adenovirus defective at least for the particularly advantageous E4 region, using the cells above. According to this method, a culture of cells as described above is transformed with one or more plasmids supplying the different regions of the genome of said defective recombinant adenovirus and then the produced viruses are harvested. This method is particularly advantageous for the production of adenoviruses having nonfunctional E1 and E4 regions. These include vectors in which the E1 and E4 regions have been inactivated or rendered non-functional by total or partial deletion. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, at room temperature. techniques of genetic engineering, or by treatment with mutagens. The at least one genetic modification can be localized in a coding part of the region, or in a coding region, and for example in the regions responsible for rvian and / or the transcriptional regulation of said genes. The deletion can be performed by digestion with appropriate restriction enzymes and then ligation in accordance with standard molecular biology techniques.

Selon un mode particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est utilisé pour la production d'adénovirus recombinants dans lesquels la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-Bgln allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n"
M73260). Dans un autre mode de réalisation préféré, la région El est inactivée par délétion d'un fragment HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446.According to a particularly advantageous mode, the method of the invention is used for the production of recombinant adenoviruses in which the E1 region is inactivated by deletion of a PvuII-Bgln fragment ranging from nucleotide 454 to nucleotide 3328, on the sequence of the adenovirus Ad5. This sequence is accessible in the literature and also on the basis of data (see in particular Genebank no.
M73260). In another preferred embodiment, the E1 region is inactivated by deletion of an HinfII-Sau3A fragment from nucleotide 382 to nucleotide 3446.

Dans un mode particulier, le procédé permet la production de vecteurs comprenant une délétion de la totalité de la région E4. Ceci peut être réalisé par excision d'un fragment MaeII-MscI correspondant aux nucléotides 35835-32720. Les lignées cellulaires selon l'invention sont en effet capables de transcomplémenter et d'amplifier des adénovirus portant tout type de délétion ou inactivation de la région
E4. Dans un autre mode particulier, seule une partie fonctionnelle de E4 est délétée.In a particular embodiment, the method allows the production of vectors comprising a deletion of the entire region E4. This can be achieved by excision of a MaeII-MscI fragment corresponding to nucleotides 35835-32720. The cell lines according to the invention are indeed capable of transcomplementing and amplifying adenoviruses carrying any type of deletion or inactivation of the region.
E4. In another particular mode, only a functional part of E4 is deleted.

Cette partie comprend au moins les phases ORF3 et ORF6. A titre exemple, ces phases codantes peuvent être délétées du génome sous forme de fragments PvuII
AluI et BglII-PvuII respectivement, correspondant aux nucléotides 34801-34329 et 34115-33126 respectivement. Les délétions de la région E4 du virus Ad2 dl808 ou des virus Ad5 dl1004. Ad5 dl1007, Ad5 elle11 ou Ad5 dl1014 peuvent également être utilisées dans le cadre de l'invention.A cet égard, les cellules de Invention sont particulièrement avantageuses pour la production de virus comprenant une région El inactive et une délétion dans la région M du type de celle présente dans le génome de
Ad5 d11014. c'est-à-dire de virus E4- conservant la phase de lecture ORF4. This part comprises at least the ORF3 and ORF6 phases. For example, these coding phases can be deleted from the genome in the form of PvuII fragments
AluI and BglII-PvuII respectively, corresponding to nucleotides 34801-34329 and 34115-33126 respectively. Deletions of the E4 region of Ad2 d188 virus or Ad5 dl1004 viruses. Ad5 dl1007, Ad5 or Ad5 dl1014 can also be used in the context of the invention.In this respect, the cells of the invention are particularly advantageous for the production of viruses comprising an inactive El region and a deletion in the M region of the type of that present in the genome of
Ad5 d11014. that is to say virus E4- retaining the ORF4 reading phase.

Par ailleurs, les adénovirus produits peuvent posséder d'autres altérations au niveau de leur génome. En particulier, d'autres région peuvent être délétées pour augmenter la capacité du virus et réduire ces effets secondaires liés à l'expression de gènes viraux. Ainsi, tout ou partie de la région E3 ou IVa2 notamment peut être délétée. Concernant la région E3, il peut cependant être particulièrement avantageux de conserver la partie codant pour la protéine gpl9K. Cette protéine permet en effet d'éviter que le vecteur adénovirus fasse l'objet d'une réaction imrmmitaire qui (i) limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables. In addition, the adenoviruses produced may have other alterations in their genome. In particular, other regions can be deleted to increase the capacity of the virus and reduce these side effects related to the expression of viral genes. Thus, all or part of the E3 or IVa2 region in particular can be deleted. Regarding the E3 region, however, it may be particularly advantageous to preserve the coding portion for the gp19K protein. This protein makes it possible to prevent the adenovirus vector from being the subject of an imrmmitary reaction which (i) would limit its action and (ii) could have undesirable side effects.

Les adénovirus recombinants selon l'invention possédent des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie génétique. Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité (les risques de réaction immunitaire et/ou inflammatoire sont fortement réduits) et de capacité de transfert de gènes très élevées. The recombinant adenoviruses according to the invention possess particularly attractive properties for use in genetic therapy. These vectors combine indeed properties of infection, safety (the risks of immune and / or inflammatory reaction are greatly reduced) and very high gene transfer capacity.

Comme indiqué avant, les adénovirus constituent des vecteurs de transfert de gènes très efficaces pour des applications de thérapie génique et cellulaire. Pour cela.  As stated before, adenoviruses are highly efficient gene transfer vectors for gene and cell therapy applications. For that.

une séquence d'acides nucléiques hétérologue dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché peut être insérée dans leur génome. Cette séquence peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques, tels qu'un gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique.Parmi les produits thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les Iymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, i, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines: ApoAI, ApoAW. ApoE, etc (FR 9305125), la dysbFbine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb,
RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII.IX. etc, les gènes suicides : Thynudine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab. ScFv, etc), etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles sequences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.Le gène thérapeutique peut peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. 1l peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus Hnr, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).a heterologous nucleic acid sequence whose transfer and / or expression in a cell, organ or organism is desired can be inserted into their genome. This sequence may comprise one or more therapeutic genes, such as a gene whose transcription and possibly translation into the target cell generate products having a therapeutic effect.Among the therapeutic products, mention may be made more particularly of enzymes, blood derivatives , hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, i, NT3, NT5, etc .; apolipoproteins: ApoAI, ApoAW. ApoE, etc. (FR 9305125), dysbFbin or a minidystrophin (FR 9111947), tumor suppressor genes: p53, Rb,
RaplA, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), genes encoding factors involved in coagulation: Factors VII, VIII.IX. etc., the suicide genes: Thynudine kinase, cytosine deaminase, etc .; or all or part of a natural or artificial immunoglobulin (Fab ScFv, etc.), etc. The therapeutic gene may also be an antisense gene or sequence whose expression in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs. Such sequences may, for example, be transcribed into the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308. The therapeutic gene may also be a coding gene. for an antigenic peptide, capable of generating in humans an immune response, for the production of vaccines. These may be especially antigenic peptides specific for epstein-barr virus, Hnr virus, hepatitis B virus (EP 185 573), pseudo-rabies virus, or tumor-specific (EP 259 212).

Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotnce, il peut Sagir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. n peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes ElA, MLP,
CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissuspécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.Generally, the heterologous nucleic acid sequence also comprises a promoter region of functional transcription in the infected cell, as well as a region 3 'of the gene of interest, and which specifies a transcriptional end signal and a transcription site. polyadenylation. All of these elements constitute the expression cassette. Regarding the promoter region, it may be a promoter region naturally responsible for the expression of the gene when it is likely to function in the infected cell. n can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences derived from the genome of the cell that it is desired to infect. Similarly, they may be promoter sequences derived from the genome of a virus, including the adenovirus used. In this respect, mention may be made, for example, of the promoters of the ElA, MLP genes,
CMV, RSV, etc. In addition, these promoter regions may be modified by addition of activating sequences, regulation, or allowing specific tissue expression or majority. On the other hand, when the heterologous nucleic acid does not contain promoter sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.

Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. Furthermore, the heterologous nucleic acid sequence may also include, in particular upstream of the therapeutic gene, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell. This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.

La cassette d'expression du gène thérapeutique peut être inserée en différents sites du génome de l'adénovirus recombinant, selon les techniques décrites dans l'art antérieur. Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la délétion El. Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences. Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 inactivée. The expression cassette of the therapeutic gene can be inserted into different sites of the genome of the recombinant adenovirus, according to the techniques described in the prior art. It can first be inserted at the level of the deletion E1. It can also be inserted at the level of the region E3, in addition or in substitution of sequences. It can also be located at the inactivated E4 region.

La présente invention concerne également les préparations virales purifiées obtenues selon le procédé de l'invention, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs préparés selon ce procédé. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intrnasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. The present invention also relates to the purified viral preparations obtained according to the method of the invention, as well as any pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant adenoviruses prepared according to this process. The pharmaceutical compositions of the invention may be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.

Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. n peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, clone de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus utilisées pour l'irMection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée.D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1010 pfu Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure.  Preferably, the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation. It may be in particular salt solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium clone, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, addition of sterilized water or saline, as appropriate, allow the constitution of injectable solutions. The doses of virus used for the immunization can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or the duration of the desired treatment. in general, the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 104 and 1014 pfu, and preferably 106 to 1010 pfu. The term pfu ("plaque-forming unit") corresponds to the infectivity of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures.

généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.usually after 15 days, the number of infected cell plaques. The techniques for determining the pfu titre of a viral solution are well documented in the literature.

Selon le gène thérapeutique. les adénovirus ainsi produits peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), etc. According to the therapeutic gene. the adenoviruses thus produced can be used for the treatment or prevention of numerous pathologies, including genetic diseases (dystrophy, cystic fibrosis, etc.), neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's, ALS, etc.), cancers, pathologies related to disorders of coagulation or dyslipoproteinemias, pathologies related to viral infections (hepatitis, AIDS, etc.), etc.

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. The present invention will be more fully described with the aid of the following examples, which should be considered as illustrative and not limiting.

Légende des figures Figure : Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome.Figure legend Figure: Genetic organization of adenovirus Ad5. The complete sequence of the Ad5 is available on database and allows the skilled person to select or create any restriction site, and thus to isolate any region of the genome.

Figure2: Organisation génétique de la région M. Figure2: Genetic organization of region M.

Figure : Analyse de la production de la fibre adénovirale par détection immunologique à l'aide d'un sérum polyclonal contre la bibre (Boulanger et al.). Les extraits cellulaires sont préparés après 72h d'infection virale, la déxaméthazone est ajoutée en même temps que le virus (concentration finale 600 nM). (A) Infection par le virus dl1014 (MOI = 10); (B) Infection par le virus dl1001 (MOI = 1); Infection par le virus dli 004 (MOI = 10); (wt) Infection par le virus Ad5 (MOI = 10). Figure: Analysis of the production of adenoviral fiber by immunological detection using a polyclonal anti-bovine serum (Boulanger et al.). The cell extracts are prepared after 72 hours of viral infection, the dexamethazone is added at the same time as the virus (final concentration 600 nM). (A) Infection with the dl1014 virus (MOI = 10); (B) Infection with the virus dl1001 (MOI = 1); Infection with the virus dli 004 (MOI = 10); (wt) Infection with Ad5 virus (MOI = 10).

Flgure : Inductibilité de E4 dans les cellules du clone #2. Analyse des extraits cellulaires non infectés (contrôle inférieur à 0) ou infectés par le virus dol007, 72 après infection. DM = déxaméthazone (600 nM). Flgure: Inducibility of E4 in the cells of clone # 2. Analysis of uninfected cell extracts (control less than 0) or infected with dol007 virus, 72 after infection. DM = dexamethazone (600 nM).

Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénolchloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la Ineraure' [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982;Ausubel F.M. et al. (eds), "cures
Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].General techniques of molecular biology
The methods conventionally used in molecular biology such as the preparative extractions of plasmid DNA, the centrifugation of cesium chloride gradient plasmid DNA, the electrophoresis on agarose or acrylamide gels, the purification of DNA fragments by electroelution, the extraction of phenol or phenol chloroform proteins, the precipitation of DNA in saline medium with ethanol or isopropanol, the transformation in Escherichia coli, etc. are well known to the human being. occupation and are extensively described in the Ineray '[Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982, Ausubel FM et al. (eds), "cures
Protocols in Molecular Biology, "John Wiley & Sons, New York, 1987].

Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par élecrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoltchl ofofmes précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5 proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur.La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du pbage
T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.Plasmids of pBR322 type, pUC and M13 phages of commercial origin (Bethesda Research Laboratories). For ligations, the DNA fragments can be separated according to their size by elecrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or by a mixture of phenols of ethanol precipitated with ethanol and then incubated in the presence of DNA ligase. phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations. Filling of the prominent ends may be effected by the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I. coli (Biolabs) according to the specifications of the supplier. The destruction of the prominent 3 'ends is carried out in the presence of the DNA Polymerase pbage
T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations. The destruction of prominent 5 'ends is accomplished by treatment with S1 nuclease.

La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. Il (1985) 8749-8764 en utilisant le kit distribué par Amersham. L amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR olymérase- catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Muslis
K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.In vitro directed mutagenesis by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. He (1985) 8749-8764 using the kit distributed by Amersham. Enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR-polymerase chain reaction technique, Saiki RK et al., Science 230 (1985) 1350-1354; muesli
KB and Faloona FA, Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] can be performed using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's specifications. The verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 5467] using the kit distributed by Amersham.

Exemple 1. Construction de plasmides portant différentes unités fonctionnelles de la région E4 sous contrôle d'un promoteur
1.1. Construction du plasmide pE4Gen
Le plasmide pPY2 correspond au clonage du fragment Avr2-Sall (environ 1.3 kb incluant le promoteur du MMTV) du plasmide pMSG (Pharmacia) entre les sites Xbal et Sall du plasmide plC20H préparé à partir d'un contexte E. coli dam+.Example 1. Construction of plasmids carrying different functional units of the E4 region under the control of a promoter
1.1. Construction of the plasmid pE4Gen
The plasmid pPY2 corresponds to the cloning of the Avr2-SalI fragment (approximately 1.3 kb including the MMTV promoter) of the plasmid pMSG (Pharmacia) between the XbaI and SalI sites of the plasmid pC20H prepared from an E. coli dam + context.

Le plasmide pPY4 dérive du plasmide pPY2 par délétion d'un fragment de 35 pb après coupure par BamH1 et Bgl2 puis religature. Le plasmide pPY5 correspond au plasmide pIC20H dans lequel le fragment Taql-Bgl2 incluant la région E4 de l'adénovirus de type 5 située entre les positions 35576 (Taql) et 32490 (Bgl2) > a été cloné entre les sites Clal et BamH1. La région E4 du plasmide pPY5 est donc incluse dans un fragment EcoRV-Sphl que l'on peut cloner après digestion partielle entre les sites Smal et Sphl du plasmide pPY4, ce qui génère le plasmide pPY6.The plasmid pPY4 is derived from the plasmid pPY2 by deletion of a 35 bp fragment after cleavage with BamHI and Bgl2 and religation. Plasmid pPY5 corresponds to plasmid pIC20H in which the Taq1-Bgl2 fragment including the E4 region of adenovirus type 5 located between positions 35576 (Taql) and 32490 (Bgl2)> was cloned between the ClaI and BamH1 sites. The E4 region of the plasmid pPY5 is therefore included in an EcoRV-SphI fragment that can be cloned after partial digestion between the SmaI and SphI sites of the plasmid pPY4, which generates the plasmid pPY6.

L'insertion du fragment Xhol, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY6 génère le plasmide pE4GelL
Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et la totalité de la région E4 de l'adénovirus exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives portées par le même brin d'ADN.Dans ce plasmide, le site principal 5' donneur pour l'épissage localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) est donc conservé pour assurer un épissage alternatif correct, permettant de générer les différents produits d'expression de toutes les phases codantes de la région E4 et de manière comparable à l'épissage alternatif observé lors du cycle viral. The insertion of the XhoI fragment, which carries a gene conferring resistance to geneticin in 293 cells, in the plasmid pPY6 generates the plasmid pE4GelL
This plasmid therefore carries a selectable gene and the entire E4 region of the adenovirus expressed from the MMTV promoter. In this particular plasmid, these two genes follow each other and the respective coding sequences carried by the same DNA strand. In this plasmid, the main donor site for splicing located upstream of the reading phase ORF1 (to the position 35548) is thus conserved to ensure a correct alternative splicing, making it possible to generate the different expression products of all the coding phases of the E4 region and in a manner comparable to the alternative splicing observed during the viral cycle.

1.2. Construction du plasmide pORF6Gen
Le plasmide pPY13 correspond au clonage du fragment Bgl2-Xbal du plasmide pPY6 entre les sites correspondants du plasmide pIC2OH. Ce fragment de 1.6 kb inclus donc la séquence de l'adénovirus de type 5 de la position 34115 (Bgl2) à la position 32490 (Bgl2. suivi du site Xbal provenant du multisite de clonage du plasmide pIC20H). Le plasmide pPY13 contient donc la totalité des phases ouvertes de lecture ORF6 et ORF7 de l'adénovirus, maintenant incluses dans un fragment Xhol-Sphl. Le clonage de ce fragment entre les sites Sall et Sphl du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY15.L'insertion du fragment Xhol, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY15 génère le plasmide pORF6Gen. Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et les phases ouvertes de lecture ORF6 et ORF7 de la région E4 de l'adénoviims exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives sont portées par le même brin d'ADN.Dans la mesure ou l'épissage alternatif est séquentiel et implique en premier lieu la reconnaissance du site 5' donneur. le site principal 5' donneur localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) n'a donc pas été inclus dans la construction du plasmide pORF6Gen pour permettre ultkiewemfflt une expression efficace des produits des phases de lecture ORF6 et ORF6/7.1.2. Construction of the plasmid pORF6Gen
The plasmid pPY13 corresponds to the cloning of the Bgl2-XbaI fragment of the plasmid pPY6 between the corresponding sites of the plasmid pIC2OH. This 1.6 kb fragment thus includes the sequence of adenovirus type 5 from position 34115 (Bgl2) to position 32490 (Bgl2, followed by the XbaI site from the cloning multisite of plasmid pIC20H). The plasmid pPY13 therefore contains all the open ORF6 and ORF7 reading phases of the adenovirus, now included in an XhoI-SphI fragment. Cloning of this fragment between the SalI and SphI sites of plasmid pPY4 generates plasmid pPY15. Insertion of the XhoI fragment, which carries a gene conferring resistance to geneticin in 293 cells, in plasmid pPY15 generates the plasmid pORF6Gen. This plasmid therefore carries a selectable gene and the open ORF6 and ORF7 reading phases of the E4 region of the adenovirus expressed from the MMTV promoter. In this particular plasmid, these two genes follow each other and the respective coding sequences are carried by the same DNA strand. Inasmuch as the alternative splicing is sequential and primarily involves the recognition of the 5 'donor site. the main donor site located upstream of the ORF1 reading phase (towards the 35548 position) was therefore not included in the construction of the plasmid pORF6Gen to allow an efficient expression of the products of the ORF6 and ORF6 reading phases. 7.

1.3. Construction du plasmide pORF4Gen
Le plasmide pPY14 correspond au clonage du fragment Bgl2-Xba1 de 1,9 kb (obtenu après digestion partielle par l'enzyme Bgl2), du plasmide pPY6 entre les sites correspondants du plasmide pIC20H. Ce fragment de 1.9 kb inclus donc la séquence de l'adénovirus de type 5 de la position 34387 (Bgl2) à la position 32490 (Bgl2, suivi du site Xbal provenant du multisite de clonage du plasmide pIC20H).1.3. Construction of the plasmid pORF4Gen
The plasmid pPY14 corresponds to the cloning of the 1.9 kb Bgl2-Xba1 fragment (obtained after partial digestion with the enzyme Bgl2) of the plasmid pPY6 between the corresponding sites of the plasmid pIC20H. This 1.9 kb fragment therefore includes the sequence of adenovirus type 5 from position 34387 (Bgl2) to position 32490 (Bgl2, followed by the XbaI site from the cloning multisite of plasmid pIC20H).

Le plasmide pPY14 est donc isogénique au plasmide pPY13 à l'exception qu'il inclus en plus un fragment Bgl2 correspondant à la totalité de la phase ouverte de lecture ORF4. Ce plasmide contient donc la totalité des phases ouvertes de lecture
ORF4, ORF6 et ORF7 de l'adénovirus, maintenant incluses dans un fragment Xho1-
Sphl. Le clonage de ce fragment entre les sites Sall et Sphl du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY16. L'insertion du fragment Xhol, qui porte un gène conférant la résistance à la généticine chez les cellules 293, dans le plasmide pPY16 génère le plasmide pORF4Gen.Ce plasmide porte donc un gène sélectionnable et les phases ouvertes de lecture ORF4, ORF6 et ORF7 de la région E4 de l'adénovirus exprimée à partir du promoteur du MMTV. Dans ce plasmide particulier ces deux gènes se suivent et les séquences codantes respectives sont portées par le même brin d'ADN. Comme pour le plasmide pORF6Gen, le site principal 5' donneur localisé en amont de la phase de lecture ORF1 (vers la position 35548) n'a pas été inclus dans la construction du plasmide pORF4Gen pour permettre ultérieurement une expression efficace des produits des phases de lecture ORF4, ORF6 et ORF6n. The plasmid pPY14 is therefore isogenic to the plasmid pPY13 with the exception that it additionally includes a Bgl2 fragment corresponding to the entire ORF4 open reading phase. This plasmid therefore contains all the open reading phases
ORF4, ORF6 and ORF7 of adenovirus, now included in a Xho1-
SphI. Cloning of this fragment between the SalI and SphI sites of the plasmid pPY4 generates the plasmid pPY16. The insertion of the XhoI fragment, which carries a gene conferring resistance to geneticinin 293 cells, in the plasmid pPY16 generates the plasmid pORF4Gen. This plasmid thus carries a selectable gene and the open reading ORF4, ORF6 and ORF7 of the E4 region of the adenovirus expressed from the MMTV promoter. In this particular plasmid these two genes follow each other and the respective coding sequences are carried by the same DNA strand. As for the plasmid pORF6Gen, the main donor site 5 'located upstream of the ORF1 reading phase (towards the 35548 position) was not included in the construction of the plasmid pORF4Gen to subsequently allow efficient expression of the products of the reading ORF4, ORF6 and ORF6n.

Exemple 2 - Construction des lignées cellulaires
Cet exemple décrit la construction de lignées cellulaires complémentantes pour les régions El et E4 des adénovirus selon l'invention. Ces lignées permettent la construction et la propagation d'adénovirus recombinants délétés pour ces régions, sans avoir recours à un virus helper. Example 2 - Construction of Cell Lines
This example describes the construction of complementing cell lines for the E1 and E4 regions of the adenoviruses according to the invention. These lines allow the construction and propagation of recombinant adenoviruses deleted for these regions, without resorting to a helper virus.

Les lignées de l'invention ont été construites par co-transfection des cellules choisies en présence de phosphate de calcium, par les plasmides décrits dans l'exemple 1 et une construction codant pour le récepteur aux glucoeorticoïdes (Hollenberg et al., 1985). Plus précisément, les cellules de la lignée 293 en boites de 5cm de diamètre ont été transfectées par 1 à 5 tcg de plasmide E4 (pE4Gen, pORF6Gen ou pORF4Gen) et éventuellement 5 pg d'un plasmide d'expression du récepteur humain aux glucocorticoides exprimé à partir du promoteur précoce du virus SV40 (plasmide pSG5HGR construit par le Dr R.Foy), en présence de phosphate de calcium, selon le protocole décrit par Graham et Van der Eb (Virology 52 (1973) 456). Lines of the invention were constructed by co-transfection of the selected cells in the presence of calcium phosphate, by the plasmids described in Example 1 and a construct encoding the glucocorticoid receptor (Hollenberg et al., 1985). More specifically, the cells of the line 293 in dishes 5 cm in diameter were transfected with 1 to 5 tcg of plasmid E4 (pE4Gen, pORF6Gen or pORF4Gen) and optionally 5 μg of a plasmid expression of the human glucocorticoid receptor expressed from the SV40 early promoter (plasmid pSG5HGR constructed by Dr. R. Foy), in the presence of calcium phosphate, according to the protocol described by Graham and Van der Eb (Virology 52 (1973) 456).

2.1. Sélection des clones résistants à la généticine
Après transfection des cellules, celles ci sont lavées, puis le milieu de culture (MEM, Sigma) supplémenté en sérum de voeu foetal (7% final) est ajouté et les cellules sont mises à incuber pendant 20 heures. Le lendemain, on sélectionne les cellules en présence de généticine à la concentration effective de 400 mg/l. La généticine est changée tous les trois jours et les clones sélectionnables apparaissent après environ 3 semaines. Quand toutes les cellules non transfectées sont mortes, seules les cellules ayant inséré le gène de resistance subsistent et se divisent pour générer des clones cellulaires. Quand les clones cellulaires sont suffisamment gros pour être visibles à l'oeil nu, ils sont individuellement transférer dans les puits de culture d'une plaque de culture "24 trous".Chaque clone est ensuite progressivement amplifié en présence de généticine d'abord dans les puits d'une plaque de culture "12 trous", puis "6 trous" pour etre ensuite amplifié en boites de culture cellulaires.2.1. Selection of geneticin resistant clones
After transfection of the cells, the cells are washed, then the culture medium (MEM, Sigma) supplemented with fetal saline serum (final 7%) is added and the cells are incubated for 20 hours. The next day, the cells are selected in the presence of geneticin at the effective concentration of 400 mg / l. Geneticin is changed every three days and selectable clones appear after about 3 weeks. When all untransfected cells are dead, only those cells that have inserted the resistance gene subsist and divide to generate cell clones. When the cell clones are large enough to be visible to the naked eye, they are individually transferred to the culture wells of a "24-hole" culture plate. Each clone is then progressively amplified in the presence of geneticin first in the wells of a culture plate "12 holes", then "6 holes" to be then amplified in cell culture dishes.

Chaque clone cellulaire est alors conservé par congélation dans l'azote liquide.Each cell clone is then stored by freezing in liquid nitrogen.

2.2. Sélection des clones capables de produire des virus décifients pour E4. 2.2. Selection of clones capable of producing decisive viruses for E4.

Les adénovirus Ad2d1808 (Weinberg et Ketner, J. Virol. 57 (1986) 833),
Ad5dl1004, dl1007 ou d11014 (Bridge et Ketner, J. Virol. 63 (1989) 631), dIlOîl (Bridge et al., Virology 193 (1993) 794) sont des mutants de délétion portant des délétions importantes au niveau de la région E4. Ces mutants sont incapables de se répliquer dans les cellules 293. mais peuvent être produits dans les cellules W162 (Weinberg et Ketner, PNAS 80 (1983) 5383). Dans une seconde étape, les 50 clones résistants à la généticine ont été testés pour leur capacité à produire ces virus E4- et donc à transcomplémenter la région M. Adenovirus Ad2d1808 (Weinberg and Ketner, J. Virol 57 (1986) 833),
Ad5dl1004, dl1007 or d11014 (Bridge and Ketner, J. Virol 63 (1989) 631), dIlOl (Bridge et al., Virology 193 (1993) 794) are deletion mutants bearing significant deletions at the E4 region. . These mutants are unable to replicate in 293 cells but can be produced in W162 cells (Weinberg and Ketner, PNAS 80 (1983) 5383). In a second step, the 50 geneticin-resistant clones were tested for their ability to produce these E4- viruses and thus to transcomplement the M region.

Pour cela, chaque clone est infecté en milieu liquide par le virus dl808 à une multiplicité d'infection d'environ 0,1 PFU/cellule (le titre viral est obtenu sur la lignée W162). L'apparition d'un effet cytopathique amplifiable par réinfection successive des cellules par le lysat cellulaire obtenu est indicateur d'une certaine propagation virale de dl808 par les cellules du clone considéré. Cette transcomplémentation est ensuite objectivée à la fois par analyse du niveau de réplication virale et la faculté des cellules à former des plages virales (un protocole possible est décrit par Hitt, M.; Bett, AJ.; Prevec, L. et Graham, F.L. Coostron and propagation of human adenovirus vectors" in: Cell Biology; a LabofSy
Handbook. Volume 1. J.E.Celis (Ed); Academic Press Inc. (San Diego, CA, USA).For this purpose, each clone is infected in liquid medium with the d1808 virus at a multiplicity of infection of approximately 0.1 PFU / cell (the viral titre is obtained on the W162 line). The appearance of an amplifiable cytopathic effect by successive re-infection of the cells by the cell lysate obtained is indicative of a certain viral spread of d1808 by the cells of the clone under consideration. This transcomplementation is then objectified both by viral replication level analysis and the ability of cells to form viral plaques (a possible protocol is described by Hitt, M .; Bett, AJ; Prevec, L. and Graham, FL). Coostron and propagation of human adenovirus vectors "in: Cell Biology; a LabofSy
Handbook. Volume 1. JECelis (Ed); Academic Press Inc. (San Diego, CA, USA).

p479490) après infection par d1808.p479490) after infection with d1808.

Cette étape a permis de mettre en évidence 2 clones particuliers présentant des propriétés efficaces de transcomplémentation de la région E4. Le premier, désigné Clone#2, isolé après transfection du plasmide pORF6Gen; le second désigné Clone#4, isolé après transfection du plasmide pE4Gen.  This step made it possible to highlight 2 particular clones presenting effective properties of transcomplementation of the E4 region. The first, designated Clone 2, isolated after transfection of plasmid pORF6Gen; the second designated Clone # 4, isolated after transfection of the plasmid pE4Gen.

2.3 Capacité à propager des adénovirus déficients pour El. 2.3 Ability to propagate adenoviruses deficient for El.

La capacité des lignées préparées à complémenter la région El a été vérifiée après infection par l'adénovirus Ad-RSVBGal. Cet adénovirus de première génération (déficient dans El seulement), comprend le gêne LacZ de E.coli sous contrôle du promoteur du LTR du virus RSV (Strafford-Perricaudet et al., J. Clin. InvesL 2û (1992) 626). Les cellules des clones #2 et #4 ont été infectées par le virus Ad
RSVBGal et une propagation virale a été observée pour les deux clones.The ability of the lines prepared to complement the E1 region was verified after adenovirus Ad-RSVBGal infection. This first-generation adenovirus (deficient in E1 alone) comprises the LacZ gene of E. coli under the control of the RSV LTR promoter (Strafford-Perricaudet et al., J. Clin, InvesL 2 (1992) 626). Clone cells # 2 and # 4 were infected with Ad virus
RSVBGal and viral spread was observed for both clones.

Ces résultats montrent que la capacité des cellules à transcomplémenter la région El n'a pas été affectée par l'introduction supplémentaire de la partie distale de la région E4 (clone #2) ou de la région E4 complète (clone #4). These results show that the ability of the cells to transcomplement the E1 region has not been affected by the additional introduction of the distal portion of the E4 (clone 2) region or the complete E4 (clone 4) region. .

2.4. Analyse en Southern et Northern blot pour vérifier l'intégration d'une unité M fonctionnelle dans le génome. 2.4. Southern and Northern blot analysis to verify the integration of a functional M unit into the genome.

Les cellules des clones #2 et #4 ont été analysées en Southern blot pour vérifier l'expression des protéines virales. Plus particulièrement, l'analyse en
Southern Blot (analyse du DNA génomique hybridant avec une sonde radioactive provenant de la région E4 adénovirale) a été réalisée selon le protocole décrit par
Maniatis et al. L'analyse en Northern Blot (analyse des ARNs cellulaires des clones 2 et 4 hybridant avec une sonde radioactive provenant de la région E4 adénovirale) a été réalisée selon le protocole décrit par Maniatis et al., les ARNs cellulaires polyadénylés ayant été préparés selon le protocole décrit par R.E. Farrell Jr. "RNA isolation strategies". in: RNA Methodologies; a Laboratory Guide for Isolation and
Characterization. Academic Press Inc. (San Diego, CA, USA). p46-92).The cells of the clones # 2 and # 4 were analyzed in Southern blot to verify the expression of the viral proteins. In particular, the analysis in
Southern Blot (analysis of genomic DNA hybridizing with a radioactive probe from the adenoviral E4 region) was carried out according to the protocol described by
Maniatis et al. Northern Blot analysis (analysis of the cellular RNAs of clones 2 and 4 hybridizing with a radioactive probe from the adenoviral E4 region) was carried out according to the protocol described by Maniatis et al., The polyadenylated cellular RNAs having been prepared according to US Pat. protocol described by RE Farrell Jr. "RNA isolation strategies". in: RNA Methodologies; a Laboratory Guide for Insulation and
Characterization. Academic Press Inc. (San Diego, CA, USA). p46-92).

Ces analyses ont permis de montrer que ces 2 clones possèdent leur unité fonctionnelle E4 respective intégrée à raison de quelques copies par cellules. De plus, ces études démontrent que ces deux clones expriment la protéine de la fibre de l'adènovirus après infection avec les mutants de délétion Ad5dl1004, AdSdllOll et Ad5dl1014 (Figure 3). Cette protéine est une protéine tardive du cycle réplicatif et infectieux de l'adénovirus, dont la synthèse implique l'expression de E4. La présence de cette protéine dans les cellules infectées par les mutants E4- confirme que ces cellules expriment bien une activité E4 fonctionnelle. These analyzes have shown that these 2 clones have their respective functional unit E4 integrated at the rate of a few copies per cell. In addition, these studies demonstrate that these two clones express the protein of the adenovirus fiber after infection with the deletion mutants Ad5dl1004, AdSdllOll and Ad5dl1014 (Figure 3). This protein is a late protein in the replicative and infectious cycle of adenovirus, the synthesis of which involves the expression of E4. The presence of this protein in cells infected with E4 mutants confirms that these cells do indeed express functional E4 activity.

2.5. Formation de plages
Cette analyse montre clairement les propriétés particulièrement avantageuses des lignées selon l'invention. En effet, alors que les deux clones (clone#2 et clone#4) sont capables de transcomplémenter la région M et de propager avec une efficacité comparable les mutants Ad2d1808 ou Ad5dl1004 par exemple, ils présentent une différence très significative en ce qui concerne la formation de plages de virus après infection par les mutants Ad2dl808 ou Ad5dllO04. 2.5. Beach formation
This analysis clearly shows the particularly advantageous properties of the lines according to the invention. Indeed, while the two clones (clone # 2 and clone # 4) are capable of transcomplementing the M region and of propagating with comparable efficiency mutants Ad2d1808 or Ad5dl1004 for example, they have a very significant difference with respect to the formation of virus plaques after infection with Ad2dl808 or Ad5dllO04 mutants.

La capacité de former des plages de virus est une propnété essentielle des lignées de production. C'est en effet sous cette condition que des clones de virus recombinants peuvent être isolés, puis amplifiés et purifiés. Les résultats obtenus montrent clairement que la formation de plages de virus est toujours observée avec le clone#2, alors que cela ne se produit que rarement avec le clone#4. Ces résultats démontrent clairement les propriétés très supérieures des lignées de l'invention dans lesquelles seulement une unité fonctionnelle particulière de la région E4 est intégrée. The ability to form virus plaques is an essential property of production lines. It is indeed under this condition that clones of recombinant viruses can be isolated, then amplified and purified. The results obtained clearly show that virus plaque formation is always observed with clone # 2, whereas this rarely occurs with clone # 4. These results clearly demonstrate the very superior properties of the lines of the invention in which only a particular functional unit of the E4 region is integrated.

2.6. Expression régulée de l'activité E4
Une autres propriété avantageuse du clone#2 selon l'invention réside le caractère régulé et inductible de l'expression de l'activité M. Ainsi, les résultats obtenus montrent que la formation de plages de virus n'est observée qu'en présence de déxaméthazone. De même, dans le clone#2, l'expression de la protéine de fibre de l'adénovirus après infection par le mutant Ad5dl1007 est significativement augmentée dans les conditions d'induction (figure 4). En revanche, I'expression de l'activité E4 dans le clone#4 est constitutive.2.6. Regulated expression of E4 activity
Another advantageous property of the clone 2 according to the invention resides the regulated and inducible character of the expression of the activity M. Thus, the results obtained show that the formation of virus plaques is observed only in the presence of dexamethasone. Likewise, in clone # 2, the expression of the adenovirus fiber protein after infection with the Ad5dl1007 mutant is significantly increased under the induction conditions (FIG. 4). On the other hand, the expression of the E4 activity in clone 4 is constitutive.

L'ensemble de ces résultats démontre clairement les avantages des lignées cellulaires de l'invention dans lesquelles seulement une unité fonctionnelle particulière de la région E4 est intégrée. Ces avantages résident en particulier dans la capacité à former des plages de virus et à permettre l'amplification des virus défectifs en milieu liquide. Ces avantages sont également dans le caractère régulé de l'expression de l'activité E4, contrairement aux lignées dans lesquelles des lmiîés fonctionnelles plus grandes de M sont présentes. All of these results clearly demonstrate the advantages of the cell lines of the invention in which only a particular functional unit of the E4 region is integrated. These advantages lie in particular in the ability to form virus plaques and to allow the amplification of defective viruses in a liquid medium. These advantages are also in the regulated character of the expression of the E4 activity, unlike the lines in which larger functional M cells are present.

Exemple 3 - Production de virus défectifs pour les fonctions El et E4
Cet exemple décrit l'utilisation des lignées cellulaires selon l'invention pour la production de virus recombinants déficients dans les régions El et E4. Ces adénovirus ont été produits par recombinaison homologue, après co-transfection, dans les cellules de l'invention, de deux fragments d'ADN, l'un apportant la partie gauche du génome du virus recombinant (possédant une délétion dans la région El), l'autre apportant la partie droite du génome du virus recombinant (possédant une délétion dans la région E4).Example 3 - Production of defective viruses for the functions E1 and E4
This example describes the use of the cell lines according to the invention for the production of recombinant viruses deficient in the E1 and E4 regions. These adenoviruses were produced by homologous recombination, after co-transfection, in the cells of the invention, of two DNA fragments, one providing the left part of the genome of the recombinant virus (having a deletion in the El region). , the other bringing the right part of the genome of the recombinant virus (having a deletion in the E4 region).

Plus précisément, les cellules 293E4 (clone#2 et #4) ont été cotransfectées par 10 mg de 1' ADN du virus Ad-RSVBGal (Stratford-Perricaudet et at) digéré par Srfl (ou 5 mg d'ADN du plasmide ayant servi à la construction de ce virus et digéré par Xmnl), et 10 mg de l'ADN du virus apportant la délétion fonctionnelle de la région E4 (par exemple Ad2d1808, Ad5d11004, Ad5d11007 ou Ad5dl1014) digéré par l'enzyme Clal. Après apparition de l'effet cytopathique, les virus sont purifiés par au moins deux cycles consécutifs d'étalement en solide pour la formation de plages sur clone 2. Les plages correspondant à l'infection du virus recherché (analyse de l'ADN démontrant la double délétion El et E4) sont alors amplifiées par des cycles d'infection consécutives. Des stocks à titre élevés sont préparés par purification sur gradient de chlorure de césium. Les virus sont conservés à -80"C selon les techniques classiques de l'homme de l'art. Specifically, 293E4 cells (clone # 2 and # 4) were cotransfected with 10mg of Srfl-digested Ad-RSVBGal virus (Stratford-Perricaudet and at) DNA (or 5mg of plasmid DNA to the construction of this virus and digested with XmnI), and 10 mg of the DNA of the virus bringing the functional deletion of the E4 region (for example Ad2d1808, Ad5d11004, Ad5d11007 or Ad5dl1014) digested with the enzyme Clal. After appearance of the cytopathic effect, the viruses are purified by at least two consecutive cycles of solid spreading for the formation of plaques on clone 2. The ranges corresponding to the infection of the desired virus (DNA analysis demonstrating the double deletion E1 and E4) are then amplified by consecutive infection cycles. High titre stocks are prepared by cesium chloride gradient purification. The viruses are stored at -80 ° C according to standard techniques of the art.

Outre la faculté du clone 2 à faire des plages virales, il permet une propagation en milieu liquide particulièrement efficace pour le virus AD5dl1014 (E1+E4- mais ORF4+) ou pour le virus E1-E4- construit à partir du virus dl1014.  In addition to the ability of clone 2 to make viral plaques, it allows propagation in a liquid medium particularly effective for the AD5dl1014 virus (E1 + E4- but ORF4 +) or for the E1-E4- virus built from the dl1014 virus.

Par contre le clone 4 obtenu après transfection du plasmide pE4Gen n'est pas très performant pour faire des plages car il a du mal à tenir la confluence cellulaire pendant un temps suffisamment long pour que les plages de lyse virale soient facilement repérables (et surtout si le virus recombinant recherché ne code pas pour la bgalactosidase).  On the other hand, the clone 4 obtained after transfection of the plasmid pE4Gen is not very efficient for making plaques because it has difficulty in maintaining cellular confluence for a long enough time so that the viral lysis ranges are easily identifiable (and especially if the desired recombinant virus does not code for bgalactosidase).

Claims (12)

REVENDICATIONS 1 Cellule utilisable pour la production d'adénovirus défectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, insérée dans son génome, une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur fonctionnel. A cell that can be used for the production of defective adenoviruses, characterized in that it comprises, inserted in its genome, a part of the E4 region of an adenovirus genome carrying the ORF6 reading phase under the control of a functional promoter. E4 comprend les phases de lecture ORF6 et ORF6/7. E4 includes the ORF6 and ORF6 / 7 read phases. 2. Cellule selon la revendication 1 caractérisée en ce que la partie de la région 2. Cell according to claim 1 characterized in that the part of the region 3 Cellule selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que la partie de la région E4 est issue d'un génome d'adénovirus humain du groupe C. 3 Cell according to claim 1 or 2 characterized in that the portion of the E4 region is derived from a group C human adenovirus genome. 4. Cellule selon la revendication 3 caractérisée en ce que la région E4 est issue du génome d'un adénovirus Ad2 ou Ad5.  4. Cell according to claim 3 characterized in that the E4 region is derived from the genome of an adenovirus Ad2 or Ad5. 5. Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur inductible. 5. Cell according to one of the preceding claims characterized in that the promoter is an inducible promoter. 6. Cellule selon la revendication 5 caractérisée en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur MMTV et ses dénvés.  6. Cell according to claim 5 characterized in that the promoter is selected from the MMTV promoter and its denvés. 7. Cellule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle dérive d'une cellule qui transcomplémente pour la région El. 7. Cell according to one of the preceding claims characterized in that it derives from a cell which transcomplémente for the El region. 8. Cellule selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle dérive de la lignée cellulaire 293. 8. Cell according to claim 7 characterized in that it derives from the cell line 293. 9. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle dérive des cellules KB, Hela, MDCK, Véro ou gmDBP6. 9. Cell according to one of claims 1 to 6 characterized in that it derives cells KB, Hela, MDCK, Vero or gmDBP6. 10. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle dérive d'une culture de cellules primaires. 10. Cell according to one of claims 1 to 6 characterized in that it derives from a primary cell culture. 11. Cellule utilisable pour la production d'adénovirus défectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, insérée dans son génome, un fragment Bglll-Bglîl correspondant aux nucléotides 34115-32490 du génome de lAdS.  11. Cell usable for the production of defective adenovirus characterized in that it comprises, inserted into its genome, a BglII-BglII fragment corresponding to nucleotides 34115-32490 of the genome of ADS. 13. Cellule selon la revendication 11 ou 12 caractérisée en ce qu'il s'agit dune cellule de la lignée 293 transformée par le plasmide pORF6Gen. 13. The cell of claim 11 or 12 characterized in that it is a cell of the 293 line transformed with the plasmid pORF6Gen. 12. Cellule selon la revendication 1 1 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de la lignée 293 12. Cell according to claim 1, characterized in that it is a cell of line 293. 14. Cellule utilisable pour la production d'adénovirus défectifs caractérisée en ce qu'elle comprend, insérée dans son génome, un fragment BglII-PvuII correspondant aux nucléotides 34115-33126 du génome de l'Ad5. 14. Cell used for the production of defective adenovirus characterized in that it comprises, inserted into its genome, a BglII-PvuII fragment corresponding to nucleotides 34115-33126 of the genome of Ad5. 15. Plasmide comprenant une partie de la région E4 d'un génome d'adénovirus portant la phase de lecture ORF6 sous contrôle d'un promoteur inductible. A plasmid comprising a portion of the E4 region of an adenovirus genome carrying the ORF6 reading phase under the control of an inducible promoter. 16. Plasmide selon la revendication 15 caractérisé en ce que la partie de la région E4 du génome d'adénovirus porte les phases de lecture ORF6 et ORF6/7.  16. Plasmid according to claim 15, characterized in that the part of the E4 region of the adenovirus genome carries the reading phases ORF6 and ORF6 / 7. 17. Plasmide selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pORF6Gen. 17. Plasmid according to claim 16, characterized in that it is the plasmid pORF6Gen. 18. Utilisation d'une cellules selon l'une des revendications 1 à 14 pour la production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région E4. 18. Use of a cell according to one of claims 1 to 14 for the production of defective recombinant adenoviruses at least for the E4 region. 19. Procédé de production d'adénovirus recombinants défectifs au moins pour la région E4 caractérisé en ce que l'on transforme une culture de cellules selon l'une des revendications 1 à 14 avec un ou plusieurs plasmides apportant les différentes régions du génome dudit adénovirus recombinant défectif puis on récolte les virus produits. 19. Process for producing defective recombinant adenoviruses at least for the E4 region, characterized in that a cell culture according to one of Claims 1 to 14 is transformed with one or more plasmids supplying the different regions of the genome of said adenovirus. recombinant defective and then harvest the viruses produced. 21. Procédé selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que la culture de cellules est une culture de cellules selon l'une des revendications 1 1 à 14. 21. The method of claim 19 or 20 characterized in that the cell culture is a cell culture according to one of claims 1 1 to 14. 20. Procédé selon la revendication 19 pour la production d'adénovirus recombinants défectifs pour les régions El et E4  20. Process according to claim 19 for the production of defective recombinant adenoviruses for the E1 and E4 regions 22. Stock d'adénovirus recombinant défectifs purifié obtenu selon le procédé des revendications 19 à 21.  22. purified defective recombinant adenovirus stock obtained according to the method of claims 19 to 21.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998021350A1 (en) * 1996-11-13 1998-05-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Diminishing viral gene expression by promoter replacement

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994012649A2 (en) * 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
WO1994028152A1 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Transgene S.A. Defective adenoviruses and corresponding complementation lines
FR2707664A1 (en) * 1993-07-13 1995-01-20 Centre Nat Rech Scient Viral vectors and use in gene therapy
WO1995002697A1 (en) * 1993-07-13 1995-01-26 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994012649A2 (en) * 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
WO1994028152A1 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Transgene S.A. Defective adenoviruses and corresponding complementation lines
FR2707664A1 (en) * 1993-07-13 1995-01-20 Centre Nat Rech Scient Viral vectors and use in gene therapy
WO1995002697A1 (en) * 1993-07-13 1995-01-26 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. HEMSTRÖM ET AL.: "Adenovirus E4-dependent activation of the early E2 promoter is insufficient to promote early-to-late-phase transition", J. VIROLOGY, vol. 65, no. 3, AM.SOC.MICROBIOL.,WASHINGTON,US, pages 1440 - 1449 *
D.H. WEINBERG AND G. KETNER: "A cell line that supports the growth of a defective early region 4 deletion mutatnt of adenovirus type 2", PROC. NATL.ACAD SCI., vol. 80, NATL. ACAD SCI.,WASHINGTON,DC,US;, pages 5383 - 5386 *
D.H. WINBERGER AND G. KETNER: "Adenoviral region 4 is required for efficient viral DNA replication and for late gene expression", J. VIROLOGY, vol. 57, no. 3, AM.SOC.MICROBIOL.,WASHINGTON,US, pages 833 - 838 *
E. BRIDGE AND G. KETNER: "Redundant control of adenovirus late gene expression", J. VIROLOGY, vol. 63, no. 2, AM.SOC.MICROBIOL.,WASHINGTON,US, pages 631 - 638 *
E. BRIDGE ET AL.: "Adenovirus early region 4 and viral DNA synthesis", VIROLOGY, vol. 193, no. 2, ACADEMIC PRESS, INC.,NEW YORK, US, pages 794 - 801 *
G. KETNER ET AL.: "Complementation of adenovirus E4 mutants by transient expression of E4 cDNA and deletion plasmids", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 17, no. 8, IRL PRESS LIMITED,OXFORD,ENGLAND, pages 3037 - 3048 *
K. ÖHMAN ET AL.: "Two adenovirus proteins with redundant activities in virus growth facilities tripartie leader mRNA accumulations", VIROLOGY, vol. 194, ACADEMIC PRESS, INC.,NEW YORK, US, pages 50 - 58 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998021350A1 (en) * 1996-11-13 1998-05-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Diminishing viral gene expression by promoter replacement
US6110744A (en) * 1996-11-13 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Diminishing viral gene expression by promoter replacement
US6630344B1 (en) 1996-11-13 2003-10-07 Texas Systems, University Of The Board Of Regents Diminishing viral gene expression by promoter replacement
US7244617B2 (en) 1996-11-13 2007-07-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Diminishing viral gene expression by promoter replacement

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