FR2717498A1 - MHC class I HLA-G gene transcripts and their applications. - Google Patents
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Abstract
Transcrits du gène du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I HLA-G, présents dans les trophoblastes ftaux et/ou dans les lymphocytes circulants de l'adulte ainsi que leurs applications. Lesdits transcrits comprennent successivement de 5' en 3': un fragment codant pour le peptide signal (exon 1), un fragment codant pour le domaine alpha1 (exon 2), un fragment codant pour le domaine alpha2 (exon 3), un fragment codant pour le domaine transmembranaire TM (exon 5), un fragment codant pour le domaine cytoplasmique (exon 6) et le fragment 3' non traduit (exon 8), laquelle séquence est dénommée HLA-G 3-5.Transcripts of the major histocompatibility complex (MHC) class I HLA-G gene, present in fetal trophoblasts and/or in circulating lymphocytes of adults as well as their applications. Said transcripts comprise successively from 5' to 3': a fragment encoding the signal peptide (exon 1), a fragment encoding the alpha1 domain (exon 2), a fragment encoding the alpha2 domain (exon 3), a fragment encoding for the TM transmembrane domain (exon 5), a fragment coding for the cytoplasmic domain (exon 6) and the 3' untranslated fragment (exon 8), which sequence is called HLA-G 3-5.
Description
La présente invention est relative & desThe present invention relates to
transcrits du gène du complexe majeur d'histocom- transcripts of the major histocom-
patibilité (CMH) de classe I HLA-G, présents dans les trophoblastes foetaux et/ou dans les lymphocytes circulants de l'adulte ainsi qu'à leurs applications. HLA-G class I (MHC), present in fetal trophoblasts and / or circulating lymphocytes in adults, and their applications.
Les antigènes du complexe majeur d'histo- Antigens of the major histone complex
compatibilité (CMH), se divisent en plusieurs classes, les antigènes de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) qui présentent 3 domaines globulaires (a1, x2 et a3), et dont le domaine a3 est associé à la f2 microglobuline, les antigènes de classe II ((HLA-DP, HLA-DQ et HLA- DR) et les compatibility (MHC), are divided into several classes, the class I antigens (HLA-A, HLA-B and HLA-C) which have 3 globular domains (a1, x2 and a3), and whose a3 domain is associated with f2 microglobulin, class II antigens ((HLA-DP, HLA-DQ and HLA-DR) and
antigènes de classe III (complément). class III antigens (complement).
Les antigènes de classe I comprennent, outre Class I antigens include, in addition to
les antigènes précités, d'autres antigènes, dits anti- the aforementioned antigens, other antigen, so-called
gènes de classe I non classiques, et notamment les anti- non-classical class I genes, including
gènes HLA-E, HLA-F et HLA-G; ce dernier, en particulier, HLA-E, HLA-F and HLA-G genes; the latter, in particular,
est exprimé par les trophoblastes extravilleux du pla- is expressed by the extravillous trophoblasts of the
centa humain normal.normal human centa.
La séquence du gène HLA-G (gène HLA-6.0) a été décrite par GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, al, 9145-9149): il comprend 4396 paires de bases et présente une organisation intron/exon homologue à celle des gènes HLA-A, -B et -C. De manière plus précise, ce gène comprend 8 exons et une extrémité non traduite 3'UT, correspondant respectivement: exon 1: séquence signal, exon 2: domaine al, exon 3: domaine a2, exon 4: domaine a3, exon 5: région transmembranaire, exon The sequence of the HLA-G gene (HLA-6.0 gene) has been described by GERAGHTY et al., (Proc Natl Acad Sci USA, 1987, al, 9145-9149): it comprises 4396 base pairs and presents an intron / exon organization homologous to that of the HLA-A, -B and -C genes. More precisely, this gene comprises 8 exons and a 3'UT untranslated end, respectively corresponding to: exon 1: signal sequence, exon 2: al domain, exon 3: a2 domain, exon 4: a3 domain, exon 5: region transmembrane, exon
6: domaine cytoplasmique I, exon 7: domaine cytoplas- 6: cytoplasmic domain I, exon 7: cytoplasm domain
mique II, exon 8: domaine cytoplasmique III et région 3' non traduite (GERAGHTY et al., précité, ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731735). Toutefois le gène HLA-G diffère des autres gènes de classe I, en ce que le codon de terminaison de traduction, en phase, est localisé au niveau du deuxième codon de l'exon 6; en conséquence, la région cytoplasmique de la protéine codée par ce gène 2 HLA-6.0 est considérablement plus courte que celle des régions cytoplasmiques des protéines HLA-A, -B et -C. Contrairement aux autres antigènes de classe I, cet antigène HLA-G (clones G 6.0 et BeWO.G7) ne serait pas polymorphique et ne serait pas exprimé dans d'autres types cellulaires que les trophoblastes (ELLIS et al., II, exon 8: cytoplasmic domain III and 3 'untranslated region (GERAGHTY et al., cited above, ELLIS et al., J. Immunol., 1990, 144, 731735). However, the HLA-G gene differs from other class I genes, in that the translation termination codon, in phase, is located at the second codon of exon 6; therefore, the cytoplasmic region of the protein encoded by this HLA-6.0 gene 2 is considerably shorter than that of the cytoplasmic regions of the HLA-A, -B and -C proteins. Unlike other class I antigens, this HLA-G antigen (clones G 6.0 and BeWO.G7) would not be polymorphic and would not be expressed in other cell types than trophoblasts (ELLIS et al.
J. Immunol., 1990, précité).J. Immunol., 1990, supra).
D'autres clones HLA-G ont été isolés (TAMAKI et ai., Microbiol. Immunol., 1993, 37, 8, 633-640); en particulier, le clone HLA-G, dénommé 7.0E, a été isolé d'un placenta japonais et sa séquence en aminoacide s'est révélée identique à celle des clones précités G6.0 et BeWO.G7. Les Auteurs de cet article montrent, en outre, qu'il peut exister une certaine hétérogénéité dans les Other HLA-G clones have been isolated (TAMAKI et al., Microbiol Immunol., 1993, 37, 8, 633-640); in particular, the HLA-G clone, designated 7.0E, was isolated from a Japanese placenta and its amino acid sequence was found to be identical to that of the aforementioned clones G6.0 and BeWO.G7. The authors of this article show, moreover, that there may be some heterogeneity in
gènes HLA-G.HLA-G genes.
Ces antigènes HLA-G sont essentiellement These HLA-G antigens are essentially
exprimés par les cellules cytotrophoblastiques du pla- expressed by the cytotrophoblastic cells of the
centa; toutefois, l'ARNm HLA-G a été retrouvé dans les tissus de l'oeil et dans le foie foetal (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, a9, 3947-3951; dont la numérotation correspond à celle de la séquence HLA 6.0 telle que décrite dans SHUKLA et al., Nucleic Acids centa; however, HLA-G mRNA was found in the tissues of the eye and in the fetal liver (ISHITANI et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1992, a9, 3947-3951; corresponds to that of the HLA 6.0 sequence as described in SHUKLA et al., Nucleic Acids
Research, 1990, 18, 8, 2189).Research, 1990, 18, 8, 2189).
Les antigènes HLA-G exprimés par les cytotro- HLA-G antigens expressed by cytotropic
phoblastes sont considérés comme jouant un rôle dans la protection du placenta (absence de rejet). En outre, dans la mesure o l'antigène HLAG'est monomorphique, il peut également être impliqué dans la croissance ou la fonction des cellules placentaires (KOVATS et al., Science, 1990, Phoblasts are considered to play a role in the protection of the placenta (absence of rejection). In addition, since the HLAG antigen is monomorphic, it may also be involved in the growth or function of placental cells (KOVATS et al., Science, 1990,
248, 220-223).248, 220-223).
D'autres recherches concernant cet antigène non classique de classe I (ISHITANI et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951) ont montré que le transcrit primaire du gène HLA-G peut être épissé de plusieurs manières et produit au moins 3 ARNm matures distincts: le transcrit primaire d'HLA-G fournit une 3 copie complète (G1) de 1 200 bp, un fragment de 900 bp Further research concerning this class I non-classical antigen (ISHITANI et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89, 3947-3951) has shown that the primary transcript of the HLA-G gene can be spliced in several ways and produces at least 3 distinct mature mRNAs: the primary HLA-G transcript provides a complete copy (G1) of 1200 bp, a fragment of 900 bp
(G2) et un fragment de 600 bp (G3).(G2) and a fragment of 600 bp (G3).
Le transcrit G1 ne comprend pas l'exon 7 et correspond à la séquence décrite par ELLIS et al. (précité), c'est-à-dire qu'il code pour une protéine qui comprend une séquence leader, trois domaines externes, Transcript G1 does not include exon 7 and corresponds to the sequence described by ELLIS et al. (supra), i.e., it encodes a protein that includes a leader sequence, three external domains,
une région transmembranaire et une séquence cytoplas- a transmembrane region and a cytoplasmic sequence
mique. L'ARNm G2 ne comprend pas l'exon 3, c'est-à-dire qu'il code pour une protéine dans laquelle les domaines al et a3 sont directement joints; l'ARNm G3 ne contient ni l'exon 3, ni l'exon 4, c'est-à-dire qu'il code pour une protéine dans laquelle le domaine al et la séquence transmembranaire sont directement joints. L'épissage qui prévaut pour l'obtention de l'antigène HLA-G2 entraîne la jonction d'une adénine (A) (provenant du domaine codant pour al) avec une séquence AC (issue du domaine codant pour a3), ce qui entraîne la création d'un codon AAC (asparagine) à la place du codon GAC (acide aspartique), rencontré au début de la séquence nomic. G2 mRNA does not include exon 3, i.e. it encodes a protein in which the α1 and α3 domains are directly joined; G3 mRNA contains neither exon 3 nor exon 4, i.e. it encodes a protein in which the α1 domain and the transmembrane sequence are directly joined. The splicing that prevails to obtain the HLA-G2 antigen results in the junction of an adenine (A) (from the coding domain for α1) with an AC sequence (resulting from the α3 coding domain), which leads to creation of a codon AAC (asparagine) instead of the codon GAC (aspartic acid), encountered at the beginning of the sequence
codant pour le domaine a3 dans HLA-G1. coding for the a3 domain in HLA-G1.
L'épissage généré pour l'obtention de HLA-G3 n'entraine pas la formation d'un nouveau codon dans la The splicing generated to obtain HLA-G3 does not lead to the formation of a new codon in the
zone d'épissage.splicing area.
Les Auteurs de cet article ont également ana- The authors of this article also
lysés les différentes protéines exprimées: les 3 ARNm sont traduits en protéine dans la lignée cellulaire lysed the different proteins expressed: the 3 mRNAs are translated into protein in the cell line
221-G.221-G.
Les Auteurs de cet article concluent à un r81e fondamental de 1'HLA-G dans la protection du placenta vis-à-vis d'une réponse immune maternelle (induction d'une tolérance immune). Toutefois, il est précisé que le rôle de la protéine G3, qui ne contient pas le domaine a3 The authors of this paper conclude that HLA-G has a fundamental role in protecting the placenta from a maternal immune response (induction of immune tolerance). However, it is specified that the role of G3 protein, which does not contain the a3 domain
n'est pas établi.is not established.
La complexité du CMH et le rôle de l'antigène HLA-G dans les mécanismes de tolérance ont conduit les Inventeurs à rechercher un transcrit HLA-G, qui pourrait à la fois: - aisément être mis en évidence dans le sang périphérique, - serait apte à exprimer, dans des conditions appropriées, une protéine convenable en tant qu'agent de tolérance, - permettrait de sélectionner des cellules souches immatures aptes à être utilisées dans des greffes de moelle osseuse, The complexity of the MHC and the role of the HLA-G antigen in the mechanisms of tolerance led the inventors to look for an HLA-G transcript, which could be: - easily detected in the peripheral blood, - would be capable of expressing, under appropriate conditions, a protein suitable as a tolerance agent, - would make it possible to select immature stem cells suitable for use in bone marrow transplants,
- et permettrait également de mettre en évi- - and would also help to highlight
dence dans le sang maternel, des cellules foetales dans dence in the maternal blood, fetal cells in
lesquelles ce gène s'exprime.which this gene expresses itself.
En conséquence, la présente invention s'est donné pour but de pourvoir à une séquence issue d'un ARNm du gène HLA-G apte à résoudre l'ensemble des problèmes Accordingly, it has been the object of the present invention to provide a sequence derived from a mRNA of the HLA-G gene capable of solving all the problems
exposés ci-dessus.outlined above.
Une telle séquence trouve application notam- Such a sequence finds application particularly
ment: - dans la séparation, dans un échantillon de sang maternel, des cellules foetales, - dans un procédé d'enrichissement en cellules souches immatures, aptes à être utilisées dans les greffes de la moelle et - in the separation, in a maternal blood sample, of fetal cells, - in an immature stem cell enrichment process, suitable for use in bone marrow transplants and
- dans la séparation spécifique des lympho- - in the specific separation of lympho-
cytes. La présente invention a pour objet une séquence d'ADNc issue d'un ARNm du gène HLA-G humain du CMH, caractérisée en ce qu'elle comprend successivement de 5' en 3': - un fragment codant pour le peptide signal (exon 1), - un fragment codant pour le domaine al (exon 2), - un fragment codant pour le domaine a2 (exon 3), - un fragment codant pour le domaine transmem- branaire TM (exon 5), - un fragment codant pour le domaine cytoplas- mique (exon 6) et - le fragment 3' non traduit (exon 8), cytes. The subject of the present invention is a cDNA sequence derived from a mRNA of the human HLA-G gene of the MHC, characterized in that it comprises successively from 5 'to 3': a fragment coding for the signal peptide (exon 1), - a fragment coding for the α1 domain (exon 2), - a fragment coding for the α2 domain (exon 3), - a fragment coding for the transmembrane TM domain (exon 5), - a fragment coding for the cytoplasmic domain (exon 6) and the 3 'untranslated fragment (exon 8),
laquelle séquence est dénommée HLA-G 3-5. which sequence is called HLA-G 3-5.
Une telle séquence a la particularité de ne pas inclure l'exon 4 et de présenter l'ensemble des pro- Such a sequence has the particularity of not including exon 4 and presenting all
priétés énumérées ci-dessus.10 Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence comprend successivement de ' en 3': - le fragment codant pour le domaine o2 (exon 3), - le fragment codant pour le domaine trans- membranaire TM (exon 5), - le fragment codant pour le domaine cytoplas- mique (exon 6) et According to an advantageous embodiment of the invention, said sequence comprises, successively from 'to 3': the fragment coding for the o2 domain (exon 3), the fragment coding for the trans domain; TM membrane (exon 5), the coding fragment for the cytoplasmic domain (exon 6) and
- le fragment 3' non traduit (exon 8). the 3 'untranslated fragment (exon 8).
Conformément à l'invention, une telle séquence qui code pour une protéine dans laquelle le domaine o2 et la séquence transmembranaire HLA- G sont directement joints, présente la formule I suivante: According to the invention, such a sequence which encodes a protein in which the o2 domain and the HLA-G transmembrane sequence are directly joined, has the following formula I:
CC AAT GTG GCT GAA CAA AGG AGA GCC TAC CTG GAG GGC ACG CC AAT GTG GCT GAA CAA AGG AGA GCC TAC CTG GAG GGC ACG
TGC GTG GAG TGG CTC CAC AGA TAC CTG GAG AAC GGG AAG GAG TGC GTG GAG TGG CTC CAC AGA TAC CTG GAG AAC GGG AAG GAG
ATG CTG CAG CGC GCG G3/5AG CAG TCT TCC CTG CCC ACC ATC ATG CTG CAG CGC GCG G3 / 5AG CAG TCT TCC CTG CCC ACC ATC
CCC ATC ATG GGT ATC GTT GCT GGC CTG GTT GTC CTT GCA GCT CCC ATC ATG GGT ATC GTT GCT GGC CTG GTT GTC CTT GCA GCT
GTA GTC ACT GGA GCT GCG GTC GCT GCT GTG CTG TGG AGX1 AAG GTA GTC ACT GGA GCT GCG GTC GCT GCT GTG TGG TGG AGX1 AAG
AAG AGC TCA G5/6AT TGA AAA GGA GGG AGC TAC TCT CAG GCT AAG AGC TCA G5 / 6AT TGA AAA GGA GGG AGC TAC TCT CAG GCT
GCA A6/8TG TGA8/ AACAGCTGCCCTGTGTGGGACTGAGTGGCAAGTCCCTTT GCA A6 / 8TG TGA8 / AACAGCTGCCCTGTGTGGGACTGAGTGGCAAGTCCCTTT
GTGACTTCAAGAACCCTGACTTCTCTTTX2TGCAGAGACCAGCCCACCCCTGTGCCC GTGACTTCAAGAACCCTGACTTCTCTTTX2TGCAGAGACCAGCCCACCCCTGTGCCC
ACCATGACCCTCTTX3CTCATGCTGAACTGCATTCCTTCCCCAATCACCTTTCCTGT ACCATGACCCTCTTX3CTCATGCTGAACTGCATTCCTTCCCCAATCACCTTTCCTGT
TCCAGAAAAGGGGCTGGGATGTCTCCGTCTCTGTCTCA TCCAGAAAAGGGGCTGGGATGTCTCCGTCTCTGTCTCA
dans laquelle X1 représente G ou A, X2 représente C ou G, X3 représente T ou C, wherein X1 is G or A, X2 is C or G, X3 is T or C,
et comprend 0,43 kb.and comprises 0.43 kb.
De manière inattendue, un tel transcrit est détecté aussi bien dans les trophoblastes (premier Unexpectedly, such a transcript is detected both in trophoblasts (first
trimestre de gestation) que dans les lymphocytes circu- trimester of gestation) only in circulating lymphocytes
lants chez l'adulte. La présente invention a également pour objet un produit de transcription du gène HLA-G humain du CMH, caractérisé en ce qu'il inclut, à partir de l'extrémité ' - un fragment codant pour le peptide signal, - un fragment codant pour le domaine al, - un fragment codant pour le domaine a2, in adults. The subject of the present invention is also a product for transcription of the human HLA-G gene of the MHC, characterized in that it includes, from the end of a fragment coding for the signal peptide, a fragment coding for the al domain, a fragment coding for the a2 domain,
- un fragment codant pour le domaine trans- a fragment coding for the trans domain
membranaire TM, etMembrane TM, and
- un fragment codant pour le domaine cytoplas- a fragment encoding the cytoplasm domain
mique de HLA-G et en ce qu'il comprend 0,43 kb. of HLA-G and in that it comprises 0.43 kb.
La présente invention a également pour objet des fragments oligonucléotidiques de la séquence conforme à l'invention; parmi ces fragments, dont la numérotation correspond à celle de la séquence HLA 6. 0, telle que décrite dans SHUKLA et al. précité, on peut citer: - GGA AGA GGA GAC ACCG GAA CA (formule II), The present invention also relates to oligonucleotide fragments of the sequence according to the invention; among these fragments, whose numbering corresponds to that of the sequence HLA 6. 0, as described in SHUKLA et al. above, mention may be made of: GGA AGA GGA GAC ACC GA GAA CA (formula II),
dénommé G.257 (+), situé au niveau de l'exon 2 et corres- referred to as G.257 (+), located in exon 2 and corresponding to
pondant au fragment 257-276 de ladite séquence d'ADNc; - CCA ATG TGG CTG AAC AAA GG (formule III), spanning at the 257-276 fragment of said cDNA sequence; CCA ATG TGG CTG AAC AAA GG (formula III),
dénommé G.526 (+), situé au niveau de l'exon 3 et corres- referred to as G.526 (+), located at Exon 3 and corresponding to
pondant au fragment 526-545 de ladite séquence d'ADNc; - CCC CTT TTC TGG AAC AGG AA (formule IV), dénommé G.1200 (-) et correspondant au fragment 1200-1219 de ladite séquence d'ADNc; - TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (formule V), dénommé G.1225 (-) et correspondant au fragment 1225-1244 de ladite séquence d'ADNc; - CAG CGC GCG GAG CAG TCT TC (formule VI), spawning at the 526-545 fragment of said cDNA sequence; TTC CTT TTC TGG AAC AGG AA (formula IV), designated G.1200 (-) and corresponding to the fragment 1200-1219 of said cDNA sequence; - TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (Formula V), denominated G.1225 (-) and corresponding to the fragment 1225-1244 of said cDNA sequence; - CAG CGC GCG GAG CAG TC TCT (formula VI),
dénommé G.3.5 (+) et correspondant à la jonction exon 3- called G.3.5 (+) and corresponding to junction exon 3-
exon 5 de ladite séquence d'ADNc.exon 5 of said cDNA sequence.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une The present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they consist of a nucleotide sequence as defined above or a fragment thereof, labeled with a marker such as a radioactive isotope, a
enzyme appropriée ou un fluorochrome. appropriate enzyme or a fluorochrome.
Selon un mode de réalisation avantageux de According to an advantageous embodiment of
ladite sonde, elle présente la séquence de formule VI ci- said probe, it has the sequence of formula VI
dessus, spécifique du transcrit conforme à l'invention. above, specific to the transcript according to the invention.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite sonde, elle présente la séquence de formule IV ci-dessus; une telle sonde est apte à détecter tous les According to another advantageous embodiment of said probe, it has the sequence of formula IV above; such a probe is able to detect all
produits de transcription du gène HLA-G humain du CMH. human MHC HLA-G gene transcripts.
La présente invention a également pour objet des amorces, aptes à être utilisées pour amplifier une The subject of the present invention is also primers that can be used to amplify a
séquence nucléotidique conforme à l'invention. nucleotide sequence according to the invention.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites amorces, une paire d'amorces préférée comprend: (1) GGA AGA GGA GAC ACCG GAA (formule II) According to an advantageous embodiment of said primers, a preferred pair of primers comprises: (1) GGA AGA GGA GAC ACCG GAA (Formula II)
(2) TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (formule V). (2) TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (Formula V).
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites amorces, une autre paire d'amorces préférée comprend: (3) CCA ATG TGG CTG AAC AAA GG (formule III) According to another advantageous embodiment of said primers, another preferred pair of primers comprises: (3) CCA ATG TGG CTG AAC AAA GG (formula III)
(4) TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (formule V). (4) TGA GAC AGA GAC GGA GAC AT (Formula V).
La présente invention a également pour objet des peptides ou fragments peptidiques, caractérisés en ce qu'ils sont codés par au moins un fragment tel que défini ci-dessus ou une portion de fragment ou une combinaison The subject of the present invention is also peptides or peptide fragments, characterized in that they are coded by at least one fragment as defined above or a portion of a fragment or a combination
de plusieurs fragments tels que définis ci-dessus. several fragments as defined above.
Selon un mode de réalisation avantageux de According to an advantageous embodiment of
l'invention, ledit peptide répond à la formule VII ci- according to the invention, said peptide corresponds to formula VII
apres:after:
Asn-Val-Ala-Glu-Gln-Arg-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Thr-Cys- Asn-Val-Ala-Glu-Gln-Arg-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Thr-Cys-
Val-Glu-Trp-Leu-His-Arg-Tyr-Leu-Glu-Asn-Gly-Lys-Glu-Met- Val-Glu-Trp-Leu-His-Arg-Tyr-Leu-Glu-Asn-Gly-Lys-Glu-Met-
Leu-Gln-Arg-Ala-Glu-Gln-Ser-Ser-Leu-Pro-Thr-Ile-Pro-Ile- Leu-Gln-Arg-Ala-Glu-Gln-Ser-Ser-Leu-Pro-Thr-Ile-Pro-Ile
8 Met-Gly-Ile-Val-Ala-Gly-Leu-Val-Val-Leu-Ala-Ala-Val-Val- 8 Met-Gly-Ile-Val-Ala-Gly-Leu-Val-Val-Leu-Ala-Ala-Val-Val-
Thr-Glu-Ala-Ala-Val-Ala-Ala-Val-Leu-Trp-Arg-Lys-Lys-Ser- Ser-Asp. Selon un autre mode de réalisation avantageux des peptides conformes à l'invention, ils peuvent être Thr-Glu-Ala-Ala-Val-Ala-Ala-Val-Leu-Trp-Arg-Lys-Lys-Ser-Ser-Asp. According to another advantageous embodiment of the peptides according to the invention, they can be
obtenus par synthèse.obtained by synthesis.
Conformément à l'invention, de tels peptides trouvent application en tant que médicaments, notamment According to the invention, such peptides find application as medicaments, in particular
dans des compositions immunotolérantes. in immunotolerant compositions.
La présente invention a également pour objet un procédé de sélection et d'enrichissement en cellules hématopoiétiques indifférenciées (cellules sanguines immatures ou cellules souches), caractérisé en ce qu'il comprend: The subject of the present invention is also a method for selecting and enriching undifferentiated hematopoietic cells (immature blood cells or stem cells), characterized in that it comprises:
(a) le prélèvement d'un échantillon sélec- (a) the taking of a selected sample
tionné, selon le cas, parmi le sang périphérique, le sang de cordon ombilical ou la moelle osseuse, (b) le mise en contact dudit échantillon avec des anticorps anti-CD34, (DYNABEADS; DYNAL/BIOSYS, Compiègne, France) (c) la séparation des complexes cellules contenant un antigène CD34-anticorps anti-CD34 formés, (d) la réalisation d'une RT- PCR in situ sur les cellules obtenues à l'étape (c) en présence d'une paire d'amorces marquées à l'aide d'un fluorochrome, conforme à l'invention, (e) la séparation des cellules fluorescentes, et as appropriate, from peripheral blood, umbilical cord blood or bone marrow, (b) bringing said sample into contact with anti-CD34 antibodies, (DYNABEADS, DYNAL / BIOSYS, Compiegne, France) (c) ) the separation of the CD34-anti-CD34 antigen-containing cell complexes formed, (d) performing in situ RT-PCR on the cells obtained in step (c) in the presence of a pair of primers labeled with the aid of a fluorochrome, according to the invention, (e) the separation of the fluorescent cells, and
(f) la sélection des cellules non fluores- (f) selection of non-fluorescent cells
centes immatures pluripotentes.pluripotent immature centes.
Les cellules obtenues en (f) sont des cellules CD34+ HLA-G-, qui sont les cellules les plus immatures. The cells obtained in (f) are CD34 + HLA-G- cells, which are the most immature cells.
Un tel procédé permet avantageusement d'obtenir un grand nombre de cellules souches immatures aptes à être utili-35 sées pour des greffes de cellules souches. Such a method advantageously makes it possible to obtain a large number of immature stem cells that can be used for stem cell transplants.
Selon un mode de mise oeuvre avantageux dudit procédé, la paire d'amorces est sélectionnée parmi les According to an advantageous mode of implementation of said method, the pair of primers is selected from among the
paires (1)-(2) et (3)-(4) telles que définies ci-dessus. pairs (1) - (2) and (3) - (4) as defined above.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection de cellules exprimant le trans- The present invention also relates to a method for detecting cells expressing the trans-
crit conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il com- crit in accordance with the invention, characterized in that
prend, in situ, la mise en oeuvre d'une RT-PCR, par: (a) mise en contact de cellules sanguines avec une paire d'amorces marquées, conforme & l'invention et (b) séparation des cellules marquées par tout takes, in situ, the implementation of an RT-PCR, by: (a) contacting blood cells with a pair of labeled primers, in accordance with the invention and (b) separation of the labeled cells by any
moyen convenable, notamment par cytofluorométrie. suitable medium, especially by cytofluorometry.
La RT-PCR est notamment décrite dans American RT-PCR is notably described in American
J. Pathol., 1993, 143, 6, 1527-1534. J. Pathol., 1993, 143, 6, 1527-1534.
La présente invention a également pour objet des anticorps dirigés contre les protéines HLA-G telles The subject of the present invention is also antibodies directed against HLA-G proteins such as
que définies ci-dessus.as defined above.
De manière préférée, de tels anticorps sont obtenus par irmmunisation d'un animal approprié, avec des Preferably, such antibodies are obtained by immunization of a suitable animal, with
peptides selon l'invention.peptides according to the invention.
La présente invention a également pour objet un procédé de séparation de cellules foetales nucléées, & partir d'un échantillon de sang maternel, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) la mise en contact de l'échantillon de The subject of the present invention is also a method for separating nucleated fetal cells from a maternal blood sample, characterized in that it comprises: (1) bringing the sample of
sang maternel avec des anticorps dirigés contre les pro- maternal blood with antibodies directed against
téines HLA-G telles que définies ci-dessus, et (2) la séparation des complexes cellules HLA-G teins as defined above, and (2) separation of the cell complexes
foetales-anticorps obtenus.fetal-antibody obtained.
Un tel procédé permet le dépistage prénatal d'anomalies foetales et notamment d'aberrations chromoso- miques ou d'aberrations géniques et un dépistage prénatal du sexe, à partir des cellules foetales circulantes ainsi isolées, de manière fiable, de la circulation sanguine maternelle, dans la mesure o seules ces cellules Such a method allows prenatal screening for fetal abnormalities and in particular chromosomal aberrations or gene aberrations and prenatal sex screening, from circulating fetal cells thus reliably isolated from maternal blood circulation. since only these cells
foetales sont porteuses desdites protéines HLA-G. La présente invention a également pour objet un procédé de séparation spécifique de lymphocytes circu- fetals are carriers of said HLA-G proteins. The subject of the present invention is also a process for the specific separation of circulating lymphocytes.
lants, caractérisé en ce qu'il comprend, la mise en oeuvre d'une RT- PCR in situ, par: (a) mise en contact de cellules sanguines avec une paire d'amorces marquées conforme à l'invention et (b) séparation des cellules marquées lants, characterized in that it comprises, the implementation of in situ RT-PCR, by: (a) contacting blood cells with a pair of labeled primers according to the invention and (b) separation of labeled cells
(cytofluorométrie...).(Flow cytometry ...).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui In addition to the foregoing, the invention also includes other provisions, which
ressortiront de la description qui va suivre, qui se will emerge from the description which follows, which
réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet refers to examples of implementation of the object process
de la présente invention.of the present invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not constitute any
manière une limitation.way a limitation.
ZSLL: Transcrit du gène HLA-G épissé, sans exon 4. ZSLL: Transcribed spliced HLA-G gene, without exon 4.
a) Obtention des cellules adultes et des tissus foetaux - Les trophoblastes du premier trimestre de gestation sont obtenus lors d'IVG (6-10 semaines de a) Obtaining Adult Cells and Fetal Tissues - The first trimester trophoblasts are obtained during abortion (6-10 weeks of
gestation).gestation).
- Les foies foetaux du deuxième trimestre sont obtenus, lors d'interruptions thérapeutiques de grossesse - Fetal livers of the second trimester are obtained during therapeutic interruptions of pregnancy
(16 semaines de gestation).(16 weeks of gestation).
Les tissus sont lavés dans un tampon PBS et The tissues are washed in PBS buffer and
les trophoblastes ou le foie sont identifiés au micro- trophoblasts or liver are identified in the micro-
scope et congelés dans de l'azote liquide. scope and frozen in liquid nitrogen.
- Des échantillons de sang périphérique humain - Human peripheral blood samples
sont obtenus chez des volontaires (homme normal). are obtained from volunteers (normal man).
Les mononucléaires sont séparés des poly- Mononuclear cells are separated from poly-
nucléaires par centrifugation de densité (Ficoll- centrifugation by density centrifugation (Ficoll-
Hypaque ) et l'ARNm est isolé des deux populations. Hypaque) and the mRNA is isolated from both populations.
l1 On obtient également des mononucléaires enri- chis en lymphocytes B par immunoabsorption sur billes Enriched mononuclear cells in B lymphocytes are also obtained by immunoabsorption on beads.
magnétiques recouvertes d'anticorps anti-CDl9 (Dynabeads- Dynal/Biosys, France) et des mononucléaires enrichis en5 lymphocytes T, par séparation sur Leuko-Pac (Fenwal Laboratories, USA). magnetic resins coated with anti-CD19 antibodies (Dynabeads-Dynal / Biosys, France) and mononuclear cells enriched in T lymphocytes, by Leuko-Pac separation (Fenwal Laboratories, USA).
L'enrichissement est d'environ 90 % pour les cellules B et d'environ 87 % pour les cellules T, après estimation par analyse FACS: évaluation des complexes formés respectivement avec des anticorps anti-CD20 ou des anticorps anti-CD3, marqués au FITC et 1.105 cellules de The enrichment is about 90% for B cells and about 87% for T cells, after FACS estimation: evaluation of the complexes formed respectively with anti-CD20 antibodies or anti-CD3 antibodies, labeled with FITC and 1,105 cells of
chaque sous-population.each subpopulation.
b) Isolement de l'ARN et amplification nar RT- b) Isolation of RNA and amplification nar RT-
PCR: L'ARNm total est isolé à partir d'l g de tissu congelé ou de 2.107 cellules, en utilisant le réactif RNA-Zol B (Bioprobe Systems, France), conformément aux recommandations du fabriquant; la qualité du produit obtenu est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose PCR: The total mRNA is isolated from 1 g of frozen tissue or 2.107 cells, using the RNA-Zol B reagent (Bioprobe Systems, France), according to the manufacturer's recommendations; the quality of the product obtained is verified by agarose gel electrophoresis
dénaturant à 1,5 %.denaturing at 1.5%.
L'ADNc est préparé à partir de 10 gg d'ARN total, en présence d'amorce oligo-dT et de transcriptase CDNA is prepared from 10 g of total RNA in the presence of oligo-dT primer and transcriptase
reverse M-MLV (Gibco-BRL, Life Technologies), par incuba- M-MLV (Gibco-BRL, Life Technologies), by incubation
tion de 20 pl du mélange à 42'C pendant 1 heure, puis à 20 μl of the mixture at 42 ° C for 1 hour, then at
95'C pendant 5 minutes.95 ° C for 5 minutes.
Les fragments PCR qui peuvent être obtenus selon les amorces utilisées (voir Tableau I ci-après), The PCR fragments that can be obtained according to the primers used (see Table I below),
sont représentés à la figure 1.are shown in Figure 1.
Pour amplifier le transcrit G.3-5 conforme à To amplify the G.3-5 transcript according to
l'invention (fragment de 0,43 kb), on utilise de préfé- the invention (0.43 kb fragment), it is preferable to use
rence les amorces G.526 et G.1225 (représentées par des flèches horizontales); la sonde utilisée pour détecter ce transcrit amplifié est la sonde G.3-5 (représentée par G.526 and G.1225 primers (represented by horizontal arrows); the probe used to detect this amplified transcript is the G.3-5 probe (represented by
une ligne épaisse).a thick line).
Les flèches verticales indiquent les sites de restriction spécifiques des exons 3, 4 et 5, utiles pour The vertical arrows indicate the specific restriction sites of exons 3, 4 and 5, useful for
l'analyse de restriction des produits de la RT-PCR, clo- restriction analysis of RT-PCR products, clo-
nés dans le vecteur pPCRII (B: BglI; St: StuI; Ss: SstI). born in the pPCRII vector (B: BglI; St: StuI; Ss: SstI).
TABLEAU ITABLE I
Amorce Séquence 5'-43' Localisation ADNc ADN génomique G.257(+) GGA AGA GGA GAC ACCG 257-276 Ex 2 Primer Sequence 5'-43 'Location cDNA genomic DNA G.257 (+) GGA AGA GGA GAC ACCG 257-276 Ex 2
GAA CAGAA CA
G.526(+) CCA ATG TGG CTG AAC 526-545 Ex 3 G.526 (+) CCA ATG TGG CTG AAC 526-545 Ex 3
AAA GGAAA GG
G.1200(-) CCC CTT TTC TGG AAC 1200-1219 3'-UT G.1200 (-) CCC CTT TTC TGG AAC 1200-1219 3'-UT
AGG AAAGG AA
G.1225(-) TGA GAC AGA GAC GGA 1225-1244 3'-UT G.1225 (-) TGA GAC AGA GAC GGA 1225-1244 3'-UT
GAC ATGAC AT
G.3-5(+) CAG CGC GCG GAG CAG 615-624/ Ex 3/Ex 5 G.3-5 (+) CAG GCG GCG GAG CAG 615-624 / Ex 3 / Ex 5
TCT TC 901-910TCT TC 901-910
Classe I (+) TCC CAC TCC ATG AGG 81-100 Ex 2 Class I (+) TCC CAC TCC ATG AGG 81-100 Ex 2
TAT TTCTAT TTC
Classe I (-) TCC AGA AGG CAC CAC 814-833 Ex 4 Class I (-) TCC AG AG AG CAC CAC 814-833 Ex 4
CAC AGCAC AG
Afin de réduire la quantité de produit ampli- In order to reduce the amount of product
fié non spécifique, l'amplification est réalisée en uti- nonspecific, the amplification is carried out using
lisant une technique dite 'hot-startu: dans un tube de réaction, 200 pM de chaque dNTP, 0,1 gg de chaque amorce et une pastille d'AmpliWax (Cetus-Perkin Elmer, France), reading a so-called hot-start technique: in a reaction tube, 200 μM of each dNTP, 0.1 μg of each primer and an AmpliWax pellet (Cetus-Perkin Elmer, France),
dans 50 g1 d'un tampon PCR lX, sont incubés à 75'C pen- 50 μl of 1X PCR buffer are incubated at 75 ° C.
dant 5 min; dans un second tube, 2 j1l de la solution de RT ou 1 gg d'ADN génomique et 3,5 U de Taq polymérase (Cetus-Perkin Elmer) dans 50 gl de tampon PCR 1X sont incubés à 95'C pendant 5 min. Le contenu des 2 tubes est ensuite mélangé et soumis à 35 cycles de PCR dans les conditions suivantes: 94'C pendant 1 minute, 61'C pendant 1 minute, 5 min; in a second tube, 2 μl of the RT solution or 1 μg of genomic DNA and 3.5 μl of Taq polymerase (Cetus-Perkin Elmer) in 50 μl of 1X PCR buffer are incubated at 95 ° C for 5 min. The contents of the 2 tubes are then mixed and subjected to 35 cycles of PCR under the following conditions: 94 ° C for 1 minute, 61 ° C for 1 minute,
72'C pendant 1 minute 30.72 ° C for 1 minute 30.
La dernière étape d'élongation à 72'C est de min. Les produits PCR sont analysés par électropho- rèse en gel d'agarose à 1 % et colorés au bromure d'éthidium. La spécificité des produits obtenus est confirmée par blotting alcalin des fragments (NaOH 0,4 N) The last stage of elongation at 72'C is min. The PCR products are analyzed by 1% agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide. The specificity of the products obtained is confirmed by alkaline blotting of the fragments (0.4 N NaOH)
sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amershamn, France), puis une hybridation est ensuite réalisée dans un tam- on a nylon membrane (Hybond N +, Amershamn, France), then a hybridization is then carried out in a drum.
pon: 5x SSPE, 5X Denhardt, SDS 0,5 %, ADN de sperme de saumon 100 ig/ml, pendant 2 h à 55'C, en présence d'une sonde oligonucléotidique G-1200 marquée au 32p ([y_15 32P]dATP) et d'un kit de marquage de l'extrémité 5' pon: 5x SSPE, 5X Denhardt, 0.5% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA, for 2 hours at 55 ° C, in the presence of a 32 P-labeled oligonucleotide probe G-1200 ([y_15 32 P] dATP) and a 5 'end labeling kit
(Boehringer-Mannheim, France).(Boehringer-Mannheim, France).
Différents contrôles d'amplification sont réa- Different amplification controls are
lisés: mélange réactionnel RT sans transcriptase reverse read: RT reaction mixture without reverse transcriptase
M-MLV (RT-) et mélange PCR sans matrice d'ADNc (blanc). M-MLV (RT-) and PCR mix without cDNA template (white).
Par ailleurs, des contrôles positifs sont réa- In addition, positive controls are
lisés avec des amorces ubiquitaires de la classe I des with ubiquitous class I primers
HLA (voir Tableau I).HLA (see Table I).
c) Rulaa: 1. Avec les amorces G.526 et G.1225, deux c) Rulaa: 1. With primers G.526 and G.1225, two
fragments (0,71 kb et 0,43 kb) sont observés après élec- fragments (0.71 kb and 0.43 kb) are observed after
trophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium qui s'hybride avec la sonde G1200 (voir figure 1 et gel trophoresis and ethidium bromide staining which hybridises with the G1200 probe (see Figure 1 and
figures 2A et B).Figures 2A and B).
2. La RT-PCR de l'ARNm du foie fétal du 2ème trimestre ne montre aucune bande sur le gel, ni aucun signal d'hybridation, alors que l'amplification avec des amorces des HLA de classe I entraîne un signal positif 2. RT-PCR of 2nd trimester fetal liver mRNA showed no gel bands or hybridization signal, whereas amplification with HLA class I primers resulted in a positive signal
(figure 2C).(Figure 2C).
L'amplification de l'ADN génomique présente une bande à environ 2,2 kb conformément à la séquence The amplification of the genomic DNA has a band at about 2.2 kb according to the sequence
génomique d'HLA-G.genome of HLA-G.
3. Le fragment de 0,71 kb correspond au trans- 3. The 0.71 kb fragment corresponds to the trans-
crit HLA-G complet tandis que 4. le fragment de 0,43 kb correspond à un written HLA-G complete while 4. the 0.43 kb fragment corresponds to a
transcrit ne contenant pas l'exon 4 (-*276 bp) (HLA-G.3- transcript not containing exon 4 (- * 276 bp) (HLA-G.3-
5). Pour confirmer l'absence de l'exon 4, la bande de 0,43 kb est découpée et séquencée selon la méthode suivante: Pour générer des matrices de séquençage, les fragments PCR sont séparés par électrophorèse sur gel de 5). To confirm the absence of exon 4, the 0.43 kb band is cut and sequenced according to the following method: To generate sequencing templates, the PCR fragments are separated by gel electrophoresis.
polyacrylamide à 4 %, coupés et élues avec un tampon acé- polyacrylamide at 4%, cut and eluted with an acetic
tate d'ammonium 0,5 M et EDTA 5 mM et réamplifiés par PCR 0.5 M ammonium titer and 5 mM EDTA and PCR re-amplified
asymétrique, de manière à générer des produits simple- asymmetrically, so as to generate simple products
brin.strand.
Le produit réamplifié est purifié par extrac- The reamplified product is purified by extrac-
tion au phénol-chloroforme, précipité 2 fois avec de phenol-chloroform, precipitated twice with
l'éthanol, puis séquencé en utilisant le kit de séquen- ethanol, then sequenced using the sequencing kit.
çage T7 Sequenase 2.0 (USB/Touzard-Matignon, France). T7 Sequenase 2.0 (USB / Touzard-Matignon, France).
De plus, les produits de la PCR sont clones dans le vecteur pPCRII, en utilisant le kit TA Cloning In addition, the PCR products are cloned into the pPCRII vector, using the TA Cloning kit.
System (Invitrogen, USA), puis séquences. System (Invitrogen, USA), then sequences.
Comme le montre la figure 3, le fragment de 0,43 kb présente clairement une jonction entre l'exon 3 As shown in Figure 3, the 0.43 kb fragment clearly shows a junction between exon 3
et l'exon 5, qui résulte de la perte de l'exon 4. and exon 5, which results from the loss of exon 4.
De plus, le séquençage montre que le transcrit In addition, sequencing shows that the transcript
conforme à l'invention ne comprend pas l'exon 7; la pré- according to the invention does not include exon 7; the pre-
sence d'un codon stop dans l'exon 6 est en outre obser- the presence of a stop codon in exon 6 is also observed
vée. 5. Evaluation de la fréquence du transcrit Vee. 5. Evaluation of the frequency of the transcript
HLA-G.3-5:HLA-G.3-5:
comme suggéré par la figure 2, l'intensité d'hybridation de la bande de 0,43 kb, correspondant au transcrit épissé, est plus faible que celle correspondant à la copie complète; ceci suggère que ce transcrit est as suggested by FIG. 2, the intensity of hybridization of the 0.43 kb band, corresponding to the spliced transcript, is weaker than that corresponding to the complete copy; this suggests that this transcript is
moins abondant dans la population ARNm d'HLA-G. less abundant in the HLA-G mRNA population.
De manière à évaluer les quantités relatives de ces 2 transcrits, les produits de l'amplification PCR In order to evaluate the relative quantities of these 2 transcripts, the PCR amplification products
de l'ARNm des trophoblastes du ler trimestre avec les amorces G.526-G. 1225 sont clones dans le vecteur pPCRII, 5 comme précisé ci-dessus. 1st quarter trophoblast mRNA with G.526-G primers. 1225 are cloned into the pPCRII vector, as specified above.
Sur 260 clones analysés par hybridation des réplicas, soit avec la sonde G1200, soit avec la sonde G.3-5, environ 210 clones présentent une hybridation positive avec la sonde G.1200 et seulement un clone est Of 260 clones analyzed by replica hybridization, either with the G1200 probe or with the G.3-5 probe, about 210 clones show positive hybridization with the G.1200 probe and only one clone is
positif avec la sonde G.3-5.positive with the G.3-5 probe.
Ce clone unique a été séquence, tandis que 5 clones positifs avec la sonde G.1200, choisis au hasard, sont analysés par leur carte de restriction vis-à-vis This unique clone was sequenced, while 5 randomly selected positive G.1200 probe clones were analyzed by their restriction map vis-à-vis
d'enzymes spécifiques des exons 3 et 4 (voir figure 1). specific enzymes of exons 3 and 4 (see Figure 1).
Une comparaison des séquences montre que le clone positif avec la sonde G.3-5 ne comprend pas l'exon A comparison of the sequences shows that the positive clone with the G.3-5 probe does not include the exon
4, tandis que les 5 autres clones correspondent au trans- 4, while the other 5 clones correspond to the trans-
crit complet.complete review.
Ainsi, la fréquence du transcrit conforme à l'invention par rapport au transcrit comprenant la Thus, the frequency of the transcript according to the invention with respect to the transcript comprising the
séquence complète peut être estimée à environ 1/200. complete sequence can be estimated at around 1/200.
La sélection de l'amorce G.526 (spécifique de l'exon 3) a permis d'obtenir., lors de l'amplification The selection of primer G.526 (specific for exon 3) made it possible to obtain, during amplification
PCR, la sélection d'un transcrit dépourvu d'exon 4. PCR, the selection of a transcript devoid of exon 4.
* L'absence d'exon 4 crée, à la jonction d'épissage un codon GAG (Glu) à la place du codon GAC* The absence of exon 4 creates a GAG (Glu) codon at the splice junction instead of the GAC codon
(Asp) que l'on retrouve dans le transcrit complet. (Asp) found in the complete transcript.
L'absence d'exon 4 exclut le domaine a3 de la protéine déduite correspondante et confère une nouvelle structure à l'antigène HLA-G, qui peut être exprimé & la The absence of exon 4 excludes the a3 domain from the corresponding deduced protein and confers a new structure on the HLA-G antigen, which can be expressed in the
surface des cellules trophoblastiques. trophoblastic cell surface.
Dans cette structure, le domaine x2 et la région transmembranaire sont reliés et peuvent induire des modifications conformationnelles de la protéine de In this structure, the x2 domain and the transmembrane region are related and can induce conformational changes in the
surface.area.
En particulier, ladite protéine peut présenter une capacité différente de se lier aux peptides. In particular, said protein may have a different ability to bind to peptides.
: Expression du transcrit HLA-G complet ou du transcrit sans exon 4 dans les lymphocytes périphriques de l'adulte. La figure 4 montre les résultats de Expression of the complete HLA-G transcript or transcript without exon 4 in the peripheral lymphocytes of the adult. Figure 4 shows the results of
l'amplification PCR obtenue avec les amorces G.257- the PCR amplification obtained with the primers G.257-
G.1225, à partir de matrices d'ADNc de cellules mononu- G.1225, from cDNA matrices of mononuclear cells
cléaires périphériques obtenues chez l'hommne (sujets peripheral keys obtained in humans (subjects
mâles).males).
Une bande de 1 kb est observée en gel d'agarose (Figure 4A); une hybridation avec la sonde A 1 kb band is observed in agarose gel (Figure 4A); hybridization with the probe
G.1200 révèle une bande de même dimension (figure 4B). G.1200 reveals a band of the same size (Figure 4B).
Conformément à la séquence d'ADNc, cette bande In accordance with the cDNA sequence, this band
correspond au transcrit HLA-G complet. corresponds to the complete HLA-G transcript.
Pour confirmer la production de ce transcrit, le produit de la PCR est cloné dans un vecteur pPCRII To confirm the production of this transcript, the PCR product is cloned into a pPCRII vector
puis séquencé, selon la méthode exposée ci-dessus. then sequenced, according to the method explained above.
Le fragment de 1 kb est entièrement homologue avec la séquence HLA-G décrite par SHUKLA et al. (Nucleic The 1 kb fragment is fully homologous with the HLA-G sequence described by SHUKLA et al. (Nucleic
Acids Research, 1990, 18, 8, 2189).Acids Research, 1990, 18, 8, 2189).
L'amplification PCR de l'ADNc à partir d'une population de polynucléaires avec des amorces spécifiques PCR amplification of cDNA from a polynuclear population with specific primers
HLA-G génère une bande de faible intensité de même dimen- HLA-G generates a low intensity band with the same
sion, 0,71 kb, que celle observée avec les mononucléaires 0.71 kb, than that observed with mononuclear
(contamination de la fraction polynucléaire par des mono- (Polynuclear fraction contamination by mono-
nucléaires). Pour préciser la spécificité cellulaire de Nuclear). To clarify the cellular specificity of
l'expression du gène HLA-G chez les lymphocytes circu- expression of the HLA-G gene in circulating lymphocytes
lants de l'adulte, les populations mononucléaires ont été adults, mononuclear populations have been
séparées et une PCR a été réalisée avec des amorces spé- separated and PCR was performed with specific primers
cifiques HLA-G sur l'ADNc obtenu à partir de sous-popula- HLA-G data on cDNA obtained from subpopulation
tions enrichies en cellules T ou en cellules B. enriched in T cells or B cells.
Une bande de 1 kb est observée pour les frac- A band of 1 kb is observed for the fractions
tions cellules T aussi bien en gel d'agarose qu'en ana- T cells, both in agarose gel and in
lyse par blot après hybridation avec la sonde G.1200 blot lysis after hybridization with G.1200 probe
(figures 4A et B) (transcrit complet). (Figures 4A and B) (complete transcript).
L'utilisation d'une technique PCR hot-start a permis de mettre en évidence la présence d'ARNm de HLA-G dans les lymphocytes périphériques de l'adulte, ce trans- crit étant présent à la fois dans les cellules B et les cellules T. Une bande de 0,43 kb pourrait également être observée. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement & ceux de ses modes de The use of a hot-start PCR technique has made it possible to demonstrate the presence of HLA-G mRNA in peripheral lymphocytes of the adult, this transcript being present both in B cells and in the cells. T cells. A 0.43 kb band could also be observed. As is apparent from the foregoing, the invention is in no way limited to those of its modes of
mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- implementation, implementation and application which has
nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- to be described more explicitly; on the contrary, it engages all the variants that can
nir à l'esprit du technicien en la matière, sans to the technician's mind without
s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven- deviate from the scope or scope of this invention.
tion.tion.
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