FR2715660A1 - Composés organo-phosphorés activateurs des lymphocytes Tgammadelta, procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser ces composés, compositions et utilisations pharmaceutiques. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un composé organo-phosphoré hydrosoluble de nature non-peptidique, activateur des lymphocytes Tgamma 9 delta 2 humains, comprenant au moins une liaison ester acidolabile de l'acide phosphorique, le caractère activateur de ce composé vis-à-vis des lymphocytes disparaissant lorsqu'il est placé en présence d'un mélange enzymatique comprenant au moins une monoester phosphorique phosphohydrolase et au moins une diester phosphorique phosphohydrolase. L'invention concerne aussi un procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser un tel composé et des compositions et utilisations pharmaceutiques.
Description
COMPOSES ORGANO-PHOSPHORES ACTIVATEURS DES LYMPHOCYTES Tyol
PROCEDE POUR PREPARER ET/OU ISOLER ET/OU CARACTERISER CES
COMPOSES, COMPOSITIONS ET UTILISATIONS PHARMACEUTIQUES
L'invention concerne des composés organophosphorés hydrosolubles non-peptidiques stimulant des lymphocytes Tyô humains. L'invention concerne aussi un procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser de tels composés organo-phosphorés, une composition pharmaceutique, notamment vaccinante comportant au moins un tel composé organo-phosphoré, diverses utilisations de ces composés pour obtenir des compositions pharmaceutiques, une composition pharmaceutique inhibant l'activité de ces composés sur les lymphocytes Tyô et les utilisations de cette composition pour obtenir des médicaments.
PROCEDE POUR PREPARER ET/OU ISOLER ET/OU CARACTERISER CES
COMPOSES, COMPOSITIONS ET UTILISATIONS PHARMACEUTIQUES
L'invention concerne des composés organophosphorés hydrosolubles non-peptidiques stimulant des lymphocytes Tyô humains. L'invention concerne aussi un procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser de tels composés organo-phosphorés, une composition pharmaceutique, notamment vaccinante comportant au moins un tel composé organo-phosphoré, diverses utilisations de ces composés pour obtenir des compositions pharmaceutiques, une composition pharmaceutique inhibant l'activité de ces composés sur les lymphocytes Tyô et les utilisations de cette composition pour obtenir des médicaments.
On sait déjà que les lymphocytes Tyo humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables et et V6 (lymphocytes CD3+, ass-, CD4-, CD8-) jouent un rôle dans le système immunitaire de l'homme et de l'animal. Par exemple, leur présence a été démontrée dans le cadre de diverses maladies telles que les infections bactériennes, notamment mycobactériennes (en particulier la tuberculose et la lèpre) ou à streptocoques, les affections tumorales ou leucémiques, certains parasites, le SIDA et les maladies auto-immunes (sclérose en plaques, lupus, ...).
On sait aussi que dans le sang périphérique de l'adulte, les lymphocytes porteurs de TCR à régions variables Vyg V62 (lymphocytes Ty962) représentent la majorité (de l'ordre de 80 %) des lymphocytes Ty6.
On cherche ainsi depuis la découverte de lymphocytes Tyd à comprendre le mécanisme de leur activation et leurs fonctions physiologiques.
Certains auteurs ont pensé que les lymphocytes Tyd répondent à un antigène formé d'une protéine telle que HSP60. D'autres auteurs ont cependant contredit cette thèse. Néanmoins, il n'a pas encore été possible d'isoler un antigène des lymphocytes Ty6.
I1 a été aussi démontré que les lymphocytes
Ty6 reconnaissent et lysent les cellules cancéreuses et les cellules infectées par les mycobactéries, et s'accumulent sur certains sites infectieux.
Ty6 reconnaissent et lysent les cellules cancéreuses et les cellules infectées par les mycobactéries, et s'accumulent sur certains sites infectieux.
Or, les affections sus-mentionnées dans lesquelles les lymphocytes Ty6 interviennent sont pour la plupart considérées à ce jour comme particulièrement sévères. En conséquence, depuis la découverte des lymphocytes Ty6 on cherche à mettre en évidence le (les) antigène(s) susceptible(s) de les activer et à expliquer la raison de leur présence en grand nombre dans le sang périphérique de l'adulte.
Par ailleurs, dans certains cas, les lymphocytes Tyd apparaissent comme des agents pathogènes qu'il serait souhaitable de pouvoir inhiber. Tel est le cas en particulier dans le cadre des maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques.
L'invention vise donc, de façon générale, à proposer des moyens pour contrôler la prolifération et/ou l'activité cytotoxique des lymphocytes Typo, notamment des lymphocytes Ty962 humains, que ce soit pour les stimuler en vue de favoriser leur rôle immunitaire, ou pour les inhiber lorsqu'ils sont impliqués dans une pathologie, notamment auto-immune.
Ainsi, l'invention vise à proposer des composés isolés activateurs des lymphocytes Typo, notamment des lymphocytes Tu9621 leur procédé de préparation, leur utilisation dans une composition pharmaceutique, notamment vaccinante, et leurs diverses utilisations thérapeutiques pour le traitement préventif ou curatif de l'homme ou de l'animal.
L'invention vise en particulier à proposer un procédé et une composition pour stimuler la réponse immunitaire médiée par les lymphocytes Ty6. Et l'invention vise à proposer une utilisation de ce procédé ou de cette composition dans le traitement préventif (vaccin) ou curatif (immunomodulateur) : des maladies infectieuses à germes procaryotes ou eucaryotes -notamment mycobactériennes, à streptocoques ou à plasmodium- ; et/ou des pathologies tumorales ou leucémiques ; et/ou des pathologies d'immunodéficiences telles que le SIDA.
L'invention vise également à proposer un procédé pour isoler et/ou caractériser des composés activant les lymphocytes Ty6, notamment des lymphocytes
Ty962 humains.
Ty962 humains.
L'invention vise en outre à proposer une composition destinée à inactiver les lymphocytes Tyb I et plus particulièrement une composition thérapeutique inactivant la cytotoxicité des lymphocytes Tyb impliqués dans des pathologies auto-immunes telles que la sclérose en plaques.
Pour ce faire, l'invention concerne un composé organo-phosphoré hydrosoluble de nature nonpeptidique, activateur des lymphocytes Ty6 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables Vyg et V62, ce composé comprenant au moins une liaison ester acidolabile de l'acide phosphorique, le caractère activateur de ce composé vis-à-vis des lymphocytes Tyd disparaissant lorsqu'il est placé en présence d'un mélange enzymatique comprenant au moins une monoester phosphorique phosphohydrolase et au moins une diester phosphorique phosphohydrolase. Selon l'invention, le mélange enzymatique peut comprendre une pyrophosphohydrolase à titre de diester phosphorique phosphohydrolase.
Un composé selon l'invention présente un caractère anionique mesuré par chromatographie HPAEC à détection conductimétrique en mode de suppression chimique qui est supérieur à celui de l'acide phosphonoformique et inférieur à celui de la thymidine 5' triphosphate.
Egalement, l'invention concerne un composé caractérisé en ce que, après traitement par une enzyme diester phosphorique phosphohydrolase, il présente un caractère anionique mesuré par chromatographie HPAEC à détection conductimétrique en mode de suppression chimique qui est supérieur à celui de l'acide phosphonoformique et inférieur à celui de la thymidine 5' triphosphate. En effet, l'invention comprend les composés phosphodiester
X-Phosphate-R dont la dégradation par l'enzyme diesterase libère le principe actif minimum X-Phosphate.
X-Phosphate-R dont la dégradation par l'enzyme diesterase libère le principe actif minimum X-Phosphate.
Egalement, l'invention concerne un composé qui présente un caractère hydrophobe mesuré par chromatographie HPLC sur phase inverse de type C18 éluée en paire d'ions avec l'acétate d'ammonium qui est inférieur à celui de la thymidine 5' monophosphate. Plus particulièrement, un composé selon l'invention est caractérisé en ce que son activation sur les lymphocytes Tyd est inhibée en présence d'anticorps monoclonaux spécifiques des TCR humains comprenant les régions variables Vyg V62.
Un composé selon l'invention comprend au moins un substituant X de masse moléculaire inférieure à 500, qui est distinct d'un acide nucléique, d'un oligosaccharide, d'un acide gras, d'un protide, d'un alcaloïde et d'un stéroïde, et qui est lié dans le composé à un groupement phosphoryle par une liaison covalente acidolabile susceptible d'être clivée en présence d'une monoester phosphatase. En effet, il apparaît que la présence de la séquence X-Phosphate suffit pour conférer un pouvoir antigénique au composé selon l'invention à l'égard des lymphocytes Ty6.
Par ailleurs, au moins un des composés organo-phosphorés selon l'invention comporte au moins un groupement nucléosidique, notamment la thymidine liée à un groupement phosphoryle par le cinquième carbone de son radical 2-désoxyribose. En particulier, l'invention concerne un composé répondant à la formule X-Phosphate-R où
R est un hydrogène ou un substituant minéral ou organique, notamment un groupement nucléosidique, et X est un substituant tel que mentionné ci-dessus.
R est un hydrogène ou un substituant minéral ou organique, notamment un groupement nucléosidique, et X est un substituant tel que mentionné ci-dessus.
L'invention concerne aussi un composé constitué d'un produit d'hydrolyse obtenu à partir d'un composé selon l'invention qui comprend la thymidine liée à un groupement phosphoryle par le cinquième carbone de son radical 2-désoxyribose, cette hydrolyse pouvant notamment être obtenue par l'action enzymatique d'une nucléotide pyrophosphatase et/ou d'une phosphorique diester phosphohydrolase.
Egalement, l'invention concerne un composé constitué d'un monoester phosphorique acidolabile de masse moléculaire inférieure à 500 distinct de la thymidine 5' monophosphate, de la thymidine 5' diphosphate, de la thymidine 5' diphosphate glucose et de la thymidine 5' triphosphate.
Egalement, l'invention concerne un composé constitué d'un diester phosphorique acidolabile de masse moléculaire inférieure à 1 000, distinct de la thymidine 5' monophosphate, de la thymidine 5' diphosphate, de la thymidine 5' diphosphate glucose et de la thymidine 5' triphosphate.
Un composé selon l'invention constitue un antigène isolé des lymphocytes Ty6 humains, notamment des lymphocytes Tyg62 à récepteurs TCR comprenant les régions variables Vyg et V62, et peut être utilisé en tant que tel.
I1 est à noter que contrairement au préjugé général de l'art antérieur, et de façon surprenante, un antigène selon l'invention n'est pas peptidique. I1 n'est pas non plus constitué d'une protéine telle que hsp60 ou hsp65, ni d'un peptide ou d'un composé en dérivant. C'est pourquoi, les procédés traditionnels mis en oeuvre dans l'art antérieur pour isoler ces antigènes à partir d'une solution antigénique, et qui supposent que les antigènes sont de nature protéique, ont échoué.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique, et plus particulièrement une composition vaccinante comprenant au moins un composé organo-phosphoré selon 1' invention.
Et l'invention concerne l'utilisation d'au moins un composé organo-phosphoré selon l'invention pour le traitement préventif ou curatif des maladies infectieuses bactériennes, notamment mycobactériennes comme la lèpre ou la tuberculose, et/ou des affections tumorales ou leucémiques et/ou des parasitoses et/ou des maladies d'immunodéficiences telles que le SIDA, de l'homme ou de l'animal. L'invention concerne ainsi l'utilisation d'au moins un composé organo-phosphoré selon l'invention pour obtenir une composition pharmaceutique destinée au traitement préventif ou curatif de ces maladies, notamment par voie générale. Plus particulièrement, la composition pharmaceutique est formulée sous une forme galénique permettant son administration par voie intravasculaire ou intramusculaire, c'est-à-dire directement dans le sang au contact des lymphocytes Tyd qui doivent être activés.
L'invention concerne aussi un procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser au moins un composé selon l'invention, caractérisé en ce qu'on soumet une solution aqueuse activant les lymphocytes Tyô humains à au moins une étape de séparation par chromatographie préparative en différentes fractions, et en ce que l'on teste l'activité de chaque fraction sur des lymphocytes Ty6 humains. Le procédé selon l'invention pour isoler au moins un composé selon l'invention est caractérisé par les étapes suivantes
- on cultive une souche d'êtres vivants unicellulaires susceptible d'activer les lymphocytes Ty6 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables
Vy9 V621\
- on réalise un extrait brut de la souche dont on sépare les composants hydrosolubles,
- on sépare une solution aqueuse comprenant ces composants hydrosolubles par chromatographie préparative en différentes fractions susceptibles d'activer des lymphocytes Ty6 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables Vyg V62. De préférence, et selon l'invention, on cultive une souche de bactéries, notamment de mycobactéries, on effectue une extraction lipidique, et on sépare la phase aqueuse de l'extrait lipidique brut. En particulier, on cultive Mycobactérium tuberculosis souche
H37Rv ou H37Ra.
- on cultive une souche d'êtres vivants unicellulaires susceptible d'activer les lymphocytes Ty6 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables
Vy9 V621\
- on réalise un extrait brut de la souche dont on sépare les composants hydrosolubles,
- on sépare une solution aqueuse comprenant ces composants hydrosolubles par chromatographie préparative en différentes fractions susceptibles d'activer des lymphocytes Ty6 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables Vyg V62. De préférence, et selon l'invention, on cultive une souche de bactéries, notamment de mycobactéries, on effectue une extraction lipidique, et on sépare la phase aqueuse de l'extrait lipidique brut. En particulier, on cultive Mycobactérium tuberculosis souche
H37Rv ou H37Ra.
Selon l'invention, l'étape de séparation par chromatographie comprend une séparation anionique par chromatographie échangeuse d'anions avec une solution saline dont on récupère l'éluat qui active les lymphocytes Ty6. Avantageusement, on prévoit une séparation de la solution saline suivie d'un séchage des éluats non salins qui activent des lymphocytes Ty6.
Selon l'invention, l'étape de séparation par chromatographie comprend au moins une séparation préparative des différents principes actifs de l'éluat par chromatographie HPLC sur phase inverse C18 éluée en paire d'ions et/ou par chromatographie échangeuse d'anions HPAEC avec détection conductimétrique opérant en mode du suppression chimique, chaque étape de séparation étant suivie d'une mesure de l'activité des différentes fractions obtenues sur les lymphocytes Ty6.
Pour caractériser un composé organophosphoré selon l'invention, ou soumet une solution aqueuse de ce composé à un traitement enzymatique en l'incorporant dans un mélange comprenant au moins une monoester phosphorique phosphohydrolase et/ou au moins une diester phosphorique phosphohydrolase, et on mesure l'activité de ce mélange sur des lymphocytes Tro. Si la solution aqueuse de départ comprend un composé selon l'invention, on constate une disparition de son activité sur les lymphocytes Ty6. En outre, selon l'invention, on soumet la solution aqueuse de départ à au moins une analyse chromatographique de ses différents principes actifs par chromatographie HPLC sur phase inverse C18 éluée en paire d'ions et/ou par chromatographie échangeuse d'anions HPAEC avec détection conductimétrique opérant en mode de suppression chimique, chaque étape de séparation étant suivie d'une mesure de l'activité des différentes fractions obtenues sur les lymphocytes Typo.
L'invention concerne aussi les composés organo-phosphorés qui peuvent être isolés et/ou caractérisés selon le procédé selon l'invention.
Par ailleurs, l'invention concerne aussi une composition thérapeutique destinée à inhiber la prolifération et/ou la cytotoxicité des lymphocytes Ty962 caractérisée en ce qu'elle contient une proportion pharmaceutiquement acceptable d'au moins un principe présentant une activité enzymatique phosphatase qui est susceptible de cliver au moins un composé activant des lymphocytes Tyd humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables Vyg et V62. Selon l'invention, la composition comporte une monoester phosphorique phosphohydrolase. Avantageusement et selon 1 invention, la composition comporte en outre au moins une nucléotide pyrophosphatase et/ou au moins une diester phosphorique phosphohydrolase. Selon l'invention, la composition comporte au moins une enzyme phosphatase alcaline.
Selon l'invention, cette composition est formulée sous une forme galénique permettant son administration directement au contact du milieu incorporant les lymphocytes Tyo auto-immunes pathogènes ou au contact d'un milieu susceptible de transporter la composition au contact des lymphocytes Tyd auto-immunes pathogènes.
Ainsi, la composition selon 1 invention est avantageusement formulée sous une forme galénique permettant son administration par injection dans le sang circulant par exemple, par voie intravasculaire, notamment intraveineuse, ou intramusculaire, ou intradermique, ou autre.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'une composition selon l'invention pour obtenir un médicament inhibant la cytotoxicité des lymphocytes Ty962 impliqués dans au moins une pathologie auto-immune, notamment de la sclérose en plaques. En effet, les lymphocytes Ty962 sont impliqués dans les dégradations neurologiques de la sclérose en plaques, et la composition selon l'invention vise à inhiber l'activité cytotoxique in situ des lymphocytes Ty6r c'est-à-dire, leur activité destructrice des cellules du système nerveux central.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront de la description suivante des exemples et essais, qui se réfère aux figures annexées dans lesquelles
- la figure 1 est un chromatogramme par perméation de gel d'un extrait mycobactérien incorporant les composés organo-phosphorés selon l'invention, avec indication des masses moléculaires estimées,
- la figure 2 est un chromatogramme
HPLC C18 en paire d'ions obtenu par une étape de séparation chromatographique d'un procédé de préparation des composés organo-phosphorés selon 1' invention,
- la figure 3 est un graphe à points illustrant l'amplification des lymphocytes Ty6 en culture avec un composé organo-phosphoré selon l'invention,
- les figures 4a et 4b illustrent le profil cytofluorimétrique bidimensionnel des lymphocytes Ty962 en culture respectivement sans et avec un composé organophosphoré selon l'invention,
- la figure 5 est une courbe de titration de l'effet lymphoprolifératif d'un composé organo-phosphoré selon l'invention, pour un clone de lymphocytes Ty962.
- la figure 1 est un chromatogramme par perméation de gel d'un extrait mycobactérien incorporant les composés organo-phosphorés selon l'invention, avec indication des masses moléculaires estimées,
- la figure 2 est un chromatogramme
HPLC C18 en paire d'ions obtenu par une étape de séparation chromatographique d'un procédé de préparation des composés organo-phosphorés selon 1' invention,
- la figure 3 est un graphe à points illustrant l'amplification des lymphocytes Ty6 en culture avec un composé organo-phosphoré selon l'invention,
- les figures 4a et 4b illustrent le profil cytofluorimétrique bidimensionnel des lymphocytes Ty962 en culture respectivement sans et avec un composé organophosphoré selon l'invention,
- la figure 5 est une courbe de titration de l'effet lymphoprolifératif d'un composé organo-phosphoré selon l'invention, pour un clone de lymphocytes Ty962.
- la figure 6 est un spectre de résonance magnétique nucléaire 1H d'un composé organo-phosphoré selon 1' invention,
- la figure 7 est un spectre de masse d'un composé organo-phosphoré selon l'invention,
- la figure 8 illustre trois chromatogrammes superposés HPLC C18 en paire d'ions respectivement de molécules phosphorylées témoins inactives ; d'un composé organo-phosphoré selon l'invention traité par une monoester phosphohydrolase alcaline ; et une nucléotide pyrophosphatase,
- la figure 9 est un histogramme illustrant la cytotoxicité induite par un composé organo-phosphoré selon l'invention, sur les lymphocytes Ty6 en présence d'anticorps monoclonaux de différentes spécificités.
- la figure 7 est un spectre de masse d'un composé organo-phosphoré selon l'invention,
- la figure 8 illustre trois chromatogrammes superposés HPLC C18 en paire d'ions respectivement de molécules phosphorylées témoins inactives ; d'un composé organo-phosphoré selon l'invention traité par une monoester phosphohydrolase alcaline ; et une nucléotide pyrophosphatase,
- la figure 9 est un histogramme illustrant la cytotoxicité induite par un composé organo-phosphoré selon l'invention, sur les lymphocytes Ty6 en présence d'anticorps monoclonaux de différentes spécificités.
PREPARATION DES COMPOSES ORGANO-PHOSPHORES ISOLES
Pour préparer les composés organophosphorés isolés selon l'invention, on part d'une culture d'une souche d'êtres vivants unicellulaires susceptible d'activer des lymphocytes Ty6 humains. Plus particulièrement, on part d'une culture de Mycobactérium tuberculosis H37Rv (Institut Pasteur, PARIS - FRANCE) qui active les lymphocytes Ty962.
Pour préparer les composés organophosphorés isolés selon l'invention, on part d'une culture d'une souche d'êtres vivants unicellulaires susceptible d'activer des lymphocytes Ty6 humains. Plus particulièrement, on part d'une culture de Mycobactérium tuberculosis H37Rv (Institut Pasteur, PARIS - FRANCE) qui active les lymphocytes Ty962.
On réalise ensuite un extrait brut de la souche dont on sépare la phase aqueuse. Pour ce faire, on recueille le voile mycobactérien de la culture que l'on traite au chloroforme/méthanol de façon répétée afin de tuer les bactéries et d'en extraire les substances lipidiques. On réalise une partition des phases aqueuse et organique obtenues. La phase aqueuse contient les composés que l'on sépare par chromatographie préparative en fractions susceptibles d'activer les lymphocytes Tu962.
On détermine l'activité des fractions chromatographiques en examinant la prolifération induite d'un clone de lymphocytes Typo2 humains actifs sur les mycobactéries de départ (par exemple le clone G115) par la méthode décrite par F. DAVODEAU et al., Journal of
Immunology Vol. 151, P 1214 (1993) (test de lymphoprolifération).
Immunology Vol. 151, P 1214 (1993) (test de lymphoprolifération).
Les composés sont purifiés de l'extrait ME par une séparation chromatographique échangeuse d'anions, suivie d'une séparation chromatographique de la solution saline par une colonne d'acide silicique, et d'une séparation chromatographique HPLC sur phase inverse C18 en paires d'ions et/ou d'une séparation chromatographique échangeuse d'anions HPAE.
Plus précisément, les solutions de l'extrait ME sont passées dans une colonne échangeuse d'anions de type diéthylaminoéthyl (DEAE) dans laquelle les principes actifs sont élués par des concentrations croissantes de l'acétate d'ammonium. L'activité stimulatrice de chaque éluat est testée sur le clone G115 par le test de lymphoprolifération. Les éluants actifs sur le clone G115 sont traités ensuite dans une colonne chromatographique d'acide silicique pour les séparer de la solution saline d'acétate d'ammonium. Les éluants successifs utilisés sont l'éthanol 100 %, l'éthanol 90 %, le propanol 2 100 % et le propanol H20 (70 % - 30 %). Les éluats sont séchés et soumis au test de lymphoprolifération. On constate que le dernier éluat est actif, et contient les composés selon l'invention.
Les différents principes actifs de l'éluat ainsi obtenu sont ensuite soumis à une séparation chromatographique sur une colonne C18 de séparation de la phase hydrophile. Les produits élués en phase aqueuse sont ensuite soumis à une séparation chromatographique HPLC sur une colonne préparative 250/40 C18 telle que BISCHOFF (marque déposée) ULTRASEP 10pm éluée en paire d'ions avec l'acétate d' ammonium 0,1 M. L'absorption aux différentes longueurs d'ondes est contrôlée par un détecteur d'absorption dans l'ultraviolet. On collecte des fractions chromatographiques toutes les 30 secondes pendant une durée totale de 40 min.
Le chromatogramme à 260 nm est donné par la courbe en pointillés de la figure 2. La courbe en points blancs illustre l'activité des différentes fractions chromatographiques mesurée par le test de lymphoprolifération. Cette activité est exprimée en Kcpm (milliers de coups par minute) de la thymidine tritiée incorporée par le clone Gui 15. Par cette séparation chromatQgraphique, on constate la présence de quatre fractions comportant respectivement quatre composés selon l'invention désignés TUBagl, TUBag2, TUBag3 et TUBag4 dans leur ordre d'élution croissant. Comme on le voit, figure 2, chaque fraction active est de composition hétérogène.
Chaque fraction active est individuellement chromatographiée à nouveau par une séparation chromatographique HPLC conforme à la dernière étape susdécrite.
Chaque fraction est ensuite soumise à une séparation chromatographique échangeuse d'anions HPAE éluée par un gradient de soude 0,1 M et de méthanol dans l'eau.
Par ailleurs, cette chromatographie permet de mesurer le caractère anionique des différents composés selon l'invention révélé par un détecteur conductimétrique opérant en mode de suppression chimique. Cette séparation chromatographique permet aussi de contrôler l'homogénéité des composés ainsi purifiés.
Le tableau I fournit les temps de rétention des quatre composés purifiés et de diverses biomolécules étalons.
TABLEAU I
TEMPS DE RETENTION (RT)
(exprimés en minutes +/- 0,05 min.)
TEMPS DE RETENTION (RT)
(exprimés en minutes +/- 0,05 min.)
<tb> COMPOSE <SEP> RT <SEP> COMPOSE <SEP> RT <SEP> COMPOSE <SEP> RT
<tb> <SEP> TUBagl <SEP> 7,67 <SEP> Glucose <SEP> 7P <SEP> 1,46 <SEP> TMP5' <SEP> 7,67
<tb> <SEP> TUBag2 <SEP> 7,67 <SEP> Sérine <SEP> P <SEP> 6,26 <SEP> TDP5'Glc <SEP> 7,67
<tb> <SEP> TUBag3 <SEP> 14,0 <SEP> PF <SEP> 7,13 <SEP> TDP5' <SEP> 12,66
<tb> <SEP> TUBag4 <SEP> 13,0 <SEP> PEP <SEP> 7,97 <SEP> TTP5' <SEP> 17,27
<tb>
Abréviations : P : phosphate, PF : acide phosphonoformique,
PEP : acide phosphoénolpyruvique, TMP5' : thymidine 5' monophosphate, TDP5' : thymidine 5' diphosphate, TDP5'
Glc : thymidine 5' diphosphoryl-1 glucose, TTP5' thymidine 5' triphosphate.
<tb> <SEP> TUBagl <SEP> 7,67 <SEP> Glucose <SEP> 7P <SEP> 1,46 <SEP> TMP5' <SEP> 7,67
<tb> <SEP> TUBag2 <SEP> 7,67 <SEP> Sérine <SEP> P <SEP> 6,26 <SEP> TDP5'Glc <SEP> 7,67
<tb> <SEP> TUBag3 <SEP> 14,0 <SEP> PF <SEP> 7,13 <SEP> TDP5' <SEP> 12,66
<tb> <SEP> TUBag4 <SEP> 13,0 <SEP> PEP <SEP> 7,97 <SEP> TTP5' <SEP> 17,27
<tb>
Abréviations : P : phosphate, PF : acide phosphonoformique,
PEP : acide phosphoénolpyruvique, TMP5' : thymidine 5' monophosphate, TDP5' : thymidine 5' diphosphate, TDP5'
Glc : thymidine 5' diphosphoryl-1 glucose, TTP5' thymidine 5' triphosphate.
Colonne utilisée : échangeuse d'anions sur support pelliculaire modèle AS11 Dionex (marque déposée) 250/4 mm,
Eluant utilisé : 2 ml/min composé de la séquence suivante - de O à 1 min : isocratique 90 % H20 + 10 % NaOH (0,1 M), - de 1 à 12,5 min : gradient atteignant 50 % H20 + 50 %
NaOH (0,1 M) à 12,5 min, - de 12,5 à 22 min : gradient atteignant 5 % H20 +
50 % NaOH (0,1 M) + 45 % Méthanol à 22 min, - de 22 à 23 min : gradient atteignant 90 % H2O +
10 % NaOH (0,1 M) à 23 min, - de 23 à 28 min : isocratique 90 % H20 + 10 % NaOH
(0,1 M).
Eluant utilisé : 2 ml/min composé de la séquence suivante - de O à 1 min : isocratique 90 % H20 + 10 % NaOH (0,1 M), - de 1 à 12,5 min : gradient atteignant 50 % H20 + 50 %
NaOH (0,1 M) à 12,5 min, - de 12,5 à 22 min : gradient atteignant 5 % H20 +
50 % NaOH (0,1 M) + 45 % Méthanol à 22 min, - de 22 à 23 min : gradient atteignant 90 % H2O +
10 % NaOH (0,1 M) à 23 min, - de 23 à 28 min : isocratique 90 % H20 + 10 % NaOH
(0,1 M).
Détecteur utilisé : conductimètre précédé d'un suppresseur ionique à membrane.
Comme on le voit, le caractère anionique de TUBagl et TUBag2 est analogue à celui de la thymidine 5' monophosphaté (TMP). Egalement, le caractère anionique des antigènes isolés TUBag3 et TUBag4 est plus important que celui de la thymidine 5' diphosphate, mais moins important que celui de la thymidine 5' triphosphate.
Le caractère anionique des composés antigéniques TUBag1, TUBag2, TUBag3 et TUBag4 est donc supérieur à celui de l'acide phosphonoformique et inférieur à celui de la thymidine 5' triphosphate.
ANALYSE DE LA STIMULATION DES LYMPHOCYTES Ty962 PAR LE
COMPOSE TUBag4
On a recueilli les lymphocytes du sang circulant de quatre donneurs humains sains. Ces lymphocytes sont cultivés en présence d'interleukine 2 pendant 10 jours, avec ou sans le composé TUBag4, en quantité saturante. En fin de culture, les nombres de lymphocytes Tans, Ty6 ou CD3- (non T) sont comparés dans chacune des deux cultures.
COMPOSE TUBag4
On a recueilli les lymphocytes du sang circulant de quatre donneurs humains sains. Ces lymphocytes sont cultivés en présence d'interleukine 2 pendant 10 jours, avec ou sans le composé TUBag4, en quantité saturante. En fin de culture, les nombres de lymphocytes Tans, Ty6 ou CD3- (non T) sont comparés dans chacune des deux cultures.
La figure 3 présente le rapport d'amplification, soit le rapport du nombre de cellules en culture avec TUBag4 sur le nombre de cellules en culture sans TUBag4. Chaque point représente un donneur. Comme on le voit, TUBag4 induit en culture une amplification spécifique polyclonale des lymphocytes Ty6 d'un facteur comprisentre 40 et 500 selon les individus.
Les figures 4a et b présentent le phénotype du récepteur TCR des lymphocytes du sang circulant d'un donneur humain sain cultivés en l'absence (figure 4a) et en présence (figure 4b) de TUBag4. Comme on le voit, TUBag4 induit une amplification massive mais sélective des lymphocytes Typo2
La figure 5 présente la titration de l'effet prolifératif de TUBag4 sur un clone de lymphocytes
Tyg62 (G115) mesuré par le test de lymphoprolifération.
La figure 5 présente la titration de l'effet prolifératif de TUBag4 sur un clone de lymphocytes
Tyg62 (G115) mesuré par le test de lymphoprolifération.
Comme on le voit (courbe à points noirs), on a constaté un effet prolifératif de TUBag4 à partir d'une concentration de l'ordre de 1 ng/ml. La courbe en points blancs traduit l'effet prolifératif en l'absence de TUBag4.
Des résultats analogues obtenus avec TUBagl, TUBag2 et TUBag3 confirment le caractère antigénique commun de ces composés pour les lymphocytes
Ty6.
Ty6.
ANALYSE STRUCTURALE DES COMPOSES ISOLES
On a tout d'abord soumis la phase aqueuse de l'extrait mycobactérien (ME) mentionnée ci-dessus à deux expériences. Dans la première expérience, le test de lymphoprolifération sur le clone G115 a été conduit sur l'extrait ME seul, sur l'extrait ME en présence de protéinase K (Merck, 6 mU/mp, 2 h à 370 C), et sur l'extrait ME en présence de periodate (1OmM de NaHIO4, 2 h à 370 C). Dans la seconde expérience, le test a été conduit sur l'extrait ME seul, puis sur l'extrait ME en présence d'enzyme phosphorique monoester phosphohydrolase alcaline.
On a tout d'abord soumis la phase aqueuse de l'extrait mycobactérien (ME) mentionnée ci-dessus à deux expériences. Dans la première expérience, le test de lymphoprolifération sur le clone G115 a été conduit sur l'extrait ME seul, sur l'extrait ME en présence de protéinase K (Merck, 6 mU/mp, 2 h à 370 C), et sur l'extrait ME en présence de periodate (1OmM de NaHIO4, 2 h à 370 C). Dans la seconde expérience, le test a été conduit sur l'extrait ME seul, puis sur l'extrait ME en présence d'enzyme phosphorique monoester phosphohydrolase alcaline.
Les lymphoproliférations spécifiques obtenues sont exprimées dans le tableau II suivant, après soustraction de la prolifération spontanée (non stimulée) du clone G175 :
TABLEAU II
TABLEAU II
<tb> <SEP> prolifération <SEP> du <SEP> clone
<tb> <SEP> G <SEP> 115 <SEP> (cpm)
<tb> ExPérience <SEP> 1
<tb> ME <SEP> 12 <SEP> 000
<tb> ME <SEP> traité <SEP> avec <SEP> proteinase <SEP> K <SEP> 12 <SEP> 000
<tb> ME <SEP> tràité <SEP> avec <SEP> periodate <SEP> 2 <SEP> 000
<tb> ExPérience <SEP> 2
<tb> ME <SEP> 15 <SEP> 000
<tb> ME <SEP> traité <SEP> avec <SEP> phosphatase <SEP> 7 <SEP> 000
<tb> alcaline
<tb>
Ainsi, l'extrait antigénique ME active le clone G115 de lymphocytes Typo2. Cet extrait ME est résistant aux protéases, mais son activité sur le clone
G115 est inhibée en présence de périodate. L'extrait ME subit donc une dégradation par l'acide périodique. De plus, l'extrait ME est partiellement dégradé sous l'action enzymatique d'une phosphatase alcaline. En conséquence, les antigènes sont hydrosolubles, de nature non-peptidique, mais sont acidolabiles et organo-phosphorés.
<tb> <SEP> G <SEP> 115 <SEP> (cpm)
<tb> ExPérience <SEP> 1
<tb> ME <SEP> 12 <SEP> 000
<tb> ME <SEP> traité <SEP> avec <SEP> proteinase <SEP> K <SEP> 12 <SEP> 000
<tb> ME <SEP> tràité <SEP> avec <SEP> periodate <SEP> 2 <SEP> 000
<tb> ExPérience <SEP> 2
<tb> ME <SEP> 15 <SEP> 000
<tb> ME <SEP> traité <SEP> avec <SEP> phosphatase <SEP> 7 <SEP> 000
<tb> alcaline
<tb>
Ainsi, l'extrait antigénique ME active le clone G115 de lymphocytes Typo2. Cet extrait ME est résistant aux protéases, mais son activité sur le clone
G115 est inhibée en présence de périodate. L'extrait ME subit donc une dégradation par l'acide périodique. De plus, l'extrait ME est partiellement dégradé sous l'action enzymatique d'une phosphatase alcaline. En conséquence, les antigènes sont hydrosolubles, de nature non-peptidique, mais sont acidolabiles et organo-phosphorés.
A partir de cet extrait ME, on réalise une séparation chromatographique par filtration de taille avec une colonne permettant la résolution des masses moléculaires comprises entre 400 et 10000, et dans laquelle les principes actifs sont élués par une solution saline d'acétate d'ammonium 0,1 M. Le contenu osidique des fractions recueillies est testé (figure 1, points blancs) par réaction colorimétrique avec l'anthrone sulfurique mesurée à une longueur d'onde de 630 nm. Par ailleurs, l'activité antigénique de chaque fraction obtenue est testée sur le clone G115 (points noirs sur la figure 1) par le test de lymphoprolifération.
Il ressort de la figure 1 que les fractions actives sur les lymphocytes ont toutes un poids moléculaire inférieur à 1000, et qui peut être estimé de l'ordre de 500.
Par ailleurs, l'antigène TUBag4 isolé a été soumis à une analyse structurale par résonance magnétique nucléaire. Le spectre obtenu par l'analyse 1H unidimensionnelle (figure 6) démontre la présence des groupes 2-désoxyribose et de la thymine. De plus, des essais de résonance magnétique bidimensionnelle, homonucléaire 1H 1H et hétéronucléaire 1H 13C permettent d'identifier de façon claire la liaison du groupement thymine par son ces thymidines 5' phosphatées.
Par ailleurs, les quatre composés actifs obtenus par séparation chromatographique ont été soumis a des effets de dégradation enzymatique par des phosphatases.
Les enzymes utilisées ont été la monoester phosphorique phosphohydrolase alcaline MP (EC 3.1.3.1), la diester phosphorique phosphohydrolase DP (EC 3.1.4.1) de venin de crotale, et la nucléotide pyrophosphatase NPP (EC 3.6.1.9) de venin de crotale.
L'action de chacun des composés mis au contact respectivement avec chacune de ces enzymes sur le clone G115 est résumée dans le tableau III suivant dans lequel le signe + indique que le composé a conservé une activité alors que le signe - indique la disparition de toute activité à l'égard des lymphocytes.
TABLEAU III
<tb> <SEP> Avec <SEP> Avec <SEP> Avec <SEP> Avec <SEP> Avec
<tb> Antigène <SEP> MP <SEP> NPP <SEP> MP+NPP <SEP> DP <SEP> MP+
<tb> <SEP> DP
<tb> TUBagl <SEP> + <SEP> +
<tb> TUBag2 <SEP> + <SEP> ~~ <SEP> +
<tb> <SEP> o <SEP> <
<tb> TUBag3 <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> clivage <SEP> clivage
<tb> TUBag4 <SEP> + <SEP> + <SEP> (activité <SEP> (activité
<tb> <SEP> de <SEP> TUBagl) <SEP> de <SEP> TUBagl)
<tb>
Comme on le voit, la monoester phosphorique phosphohydrolase (MP) inactive TUBag1 et TUBag2, mais n'inactive pas TUBag3 et TUBag4. En conséquence, TUBag1 et
TUBag2 sont des monoesters phosphoriques.
<tb> Antigène <SEP> MP <SEP> NPP <SEP> MP+NPP <SEP> DP <SEP> MP+
<tb> <SEP> DP
<tb> TUBagl <SEP> + <SEP> +
<tb> TUBag2 <SEP> + <SEP> ~~ <SEP> +
<tb> <SEP> o <SEP> <
<tb> TUBag3 <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> clivage <SEP> clivage
<tb> TUBag4 <SEP> + <SEP> + <SEP> (activité <SEP> (activité
<tb> <SEP> de <SEP> TUBagl) <SEP> de <SEP> TUBagl)
<tb>
Comme on le voit, la monoester phosphorique phosphohydrolase (MP) inactive TUBag1 et TUBag2, mais n'inactive pas TUBag3 et TUBag4. En conséquence, TUBag1 et
TUBag2 sont des monoesters phosphoriques.
Par contre, la nucléotide pyrophosphatase (NPP) n'inactive pas TUBag1 et TUBag2, mais inactive TUBag3 et clive TUBag4. En conséquence, la présence d'un noyau nucléotidique est confirmée dans TUBag3 et TUBag4.
L'association d'une monoester phosphorique phosphohydrolase et d'une nucléotide pyrophosphatase sur les antigènes inactive l'intégralité de ces antigènes. Les mêmes résultats sont obtenus sur TUBag4 en remplaçant la nucléotide pyrophosphatase (NPP) par la diester phosphorique phosphohydrolase (DP) de venin de crotale.
Par ailleurs, l'activité des antigènes en présence des enzymes a été analysée par chromatographie
HPLC sur face inverse C18 en paire d'ions. Les résultats sont illustrés par la figure 8 sur laquelle la courbe supérieure en traits pointillés illustre le profil des thymidines TTP, TDP, TDPGlc et TMP. La courbe médiane illustre les résultats de la séparation chromatographique de TUBag4 préalablement traité par la monoester phosphorique phosphohydrolase, et la courbe inférieure illustre l'activité de TUBag4 préalablement traité par la nucléotide pyrophosphatase.
HPLC sur face inverse C18 en paire d'ions. Les résultats sont illustrés par la figure 8 sur laquelle la courbe supérieure en traits pointillés illustre le profil des thymidines TTP, TDP, TDPGlc et TMP. La courbe médiane illustre les résultats de la séparation chromatographique de TUBag4 préalablement traité par la monoester phosphorique phosphohydrolase, et la courbe inférieure illustre l'activité de TUBag4 préalablement traité par la nucléotide pyrophosphatase.
Comme on le constate sur cette dernière courbe, le composé TUBag4 soumis à l'enzyme nucléotide pyrophosphatase fournit le composé TUBag1.
En conséquence, l'ensemble de ces expérimentations démontre que les composés selon l'invention sont des esters phosphoriques.
Par ailleurs, TUBag3 et TUBag4 présentent un substituant qui est un groupement nucléosidique identifié dans TUBag4 comme la thymidine liée au groupement phosphoryle dans l'ester par le cinquième carbone de son radical 2-désoxyribose.
Egalement, TUBagl est le produit de l'hydrolyse de TUBag4 par l'action enzymatique d'une nucléotide pyrophosphatase ou d'une diester phosphorique phosphohydrolase.
Ainsi, TUBagl est un monoester phosphorique qui est le produit actif de l'hydrolyse spontanée ou enzymatique de TUBag4 ; TUBag2 est un monoester phosphorique de caractère an ionique analogue à celui de TUBagl mais de caractère hydrophobe supérieur ; TUBag3 est un diester pyrophosphorique nucléotidique ; et TUBag4 est un diester diphosphorique ou triphosphorique de la 5' thymidine incorporant TUBag7.
Pour caractériser un composé purifié selon l'invention, il suffit donc de
- démontrer qu'il induit une activation des lymphocytes Ty962, par exemple par un test de lymphoprolifération,
- démontrer que cette activité vis-à-vis des lymphocytes Ty962 disparaît soit en présence d'une monoester phosphorique phosphohydrolase (il comporte donc la structure de TUBagl ou de TUBag2), soit en présence d'une part d'une monoester phosphorique phosphohydrolase et, d'autre part, d'une diester phosphorique phosphohydrolase et/ou d'une pyrophosphohydrolase (il comporte donc la structure de TUBag3 ou de TUBag4),
- déterminer son temps de rétention en chromatographie HPAEC et le comparer au tableau I cidessus.
- démontrer qu'il induit une activation des lymphocytes Ty962, par exemple par un test de lymphoprolifération,
- démontrer que cette activité vis-à-vis des lymphocytes Ty962 disparaît soit en présence d'une monoester phosphorique phosphohydrolase (il comporte donc la structure de TUBagl ou de TUBag2), soit en présence d'une part d'une monoester phosphorique phosphohydrolase et, d'autre part, d'une diester phosphorique phosphohydrolase et/ou d'une pyrophosphohydrolase (il comporte donc la structure de TUBag3 ou de TUBag4),
- déterminer son temps de rétention en chromatographie HPAEC et le comparer au tableau I cidessus.
Pour identifier précisément la nature du composé, il suffit en outre d'observer son ordre d'élution à la chromatographie HPLC de type C18 éluée en paire d'ions avec l'acétate d'ammonium 0,1 M en le comparant à ceux obtenus avec une solution contenant les composés selon l'invention isolés à partir de l'extrait mycobactérien ME (figure 2).
Par ailleurs, si on dispose d'une solution hétérogqne incorporant un composé selon l'invention, on peut caractériser la présence de ce composé organophosphoré antigénique en soumettant cette solution aux étapes de séparation chromatographique mentionées ci-dessus pour l'extrait mycobactérien ME, notamment au moins une séparation préparative des différents principes actifs de l'éluat par chromatographie HPLC sur phase inverse C18 éluée en paire d'ions et/ou par chromatographie échangeuse d'anions HPAEC avec détection conductimétrique opérant en mode de suppression chimique, chaque étape de séparation étant suivie d'une mesure de l'activité des différentes fractions obtenues sur des lymphocytes Ty6.
CYTOTOXICITE DES LYMPHOCYTES Ty6 EN PRESENCE DES COMPOSES
ORGANO-PHOSPHORES ISOLES
L'activité cytolytique d'un clone de lymphocytes Ty962 (G115) et d'un clone contrôle de lymphocyte T non yd (BH) contre des cellules cibles est mesurée en l'absence ou en présence du composé TUBag4.
ORGANO-PHOSPHORES ISOLES
L'activité cytolytique d'un clone de lymphocytes Ty962 (G115) et d'un clone contrôle de lymphocyte T non yd (BH) contre des cellules cibles est mesurée en l'absence ou en présence du composé TUBag4.
Cette activité induite par TUBag4 est déterminée par la formule suivante : (% de lyse spécifique en présence de TUBag4) - (% de lyse spécifique sans
TUBag4).
TUBag4).
Cette cytotoxicité est estimée à un rapport de cellules tueuses sur cellules cibles de 20 pour 1.
Les résultats sont illustrés par le tableau
IV suivant
TABLEAU IV
IV suivant
TABLEAU IV
<tb> <SEP> CELLULES <SEP> CIBLES <SEP> LYSE <SEP> INDUITE
<tb> <SEP> PAR <SEP> TUBag4
<tb> ORIGINE <SEP> NOM <SEP> NATURE <SEP> G115 <SEP> BH
<tb> Humaine <SEP> DAB <SEP> BLCL <SEP> 32 <SEP> 0
<tb> <SEP> BL70 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 21 <SEP> 0
<tb> <SEP> BL2195 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 37 <SEP> 3
<tb> <SEP> RJ225 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> <SEP> RAJI <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 32 <SEP> 0
<tb> <SEP> BL30195 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 20 <SEP> 0
<tb> <SEP> BL <SEP> 30 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 34 <SEP> 5
<tb> <SEP> KGI <SEP> T <SEP> Lymphoma <SEP> 16 <SEP> 0
<tb> <SEP> THPI <SEP> T <SEP> Lymphoma <SEP> 12 <SEP> 0
<tb> <SEP> KE6TG <SEP> T <SEP> Lymphoma <SEP> 26 <SEP> 0
<tb> <SEP> HSB2 <SEP> T <SEP> Lymphoma <SEP> 21 <SEP> 0
<tb> <SEP> MRC5 <SEP> Fibroblast <SEP> 39 <SEP> 0
<tb> Murine <SEP> DA2 <SEP> Inconnue <SEP> 14 <SEP> 6
<tb> <SEP> BW5147 <SEP> Thymoma <SEP> 12 <SEP> 0
<tb> <SEP> A20 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 22 <SEP> 0
<tb> <SEP> SP20 <SEP> Myeloma <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> <SEP> P815 <SEP> Mastocytoma <SEP> 32 <SEP> <SEP> O <SEP>
<tb>
Comme on le voit, TUBag4 induit une lyse de toutes les cellules cibles par le clone G115 seulement, mais n'induit pas de lyse par le clone contrôle BH.
<tb> <SEP> PAR <SEP> TUBag4
<tb> ORIGINE <SEP> NOM <SEP> NATURE <SEP> G115 <SEP> BH
<tb> Humaine <SEP> DAB <SEP> BLCL <SEP> 32 <SEP> 0
<tb> <SEP> BL70 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 21 <SEP> 0
<tb> <SEP> BL2195 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 37 <SEP> 3
<tb> <SEP> RJ225 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 25 <SEP> 0
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<tb> <SEP> BL <SEP> 30 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 34 <SEP> 5
<tb> <SEP> KGI <SEP> T <SEP> Lymphoma <SEP> 16 <SEP> 0
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<tb> <SEP> KE6TG <SEP> T <SEP> Lymphoma <SEP> 26 <SEP> 0
<tb> <SEP> HSB2 <SEP> T <SEP> Lymphoma <SEP> 21 <SEP> 0
<tb> <SEP> MRC5 <SEP> Fibroblast <SEP> 39 <SEP> 0
<tb> Murine <SEP> DA2 <SEP> Inconnue <SEP> 14 <SEP> 6
<tb> <SEP> BW5147 <SEP> Thymoma <SEP> 12 <SEP> 0
<tb> <SEP> A20 <SEP> B <SEP> Lymphoma <SEP> 22 <SEP> 0
<tb> <SEP> SP20 <SEP> Myeloma <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> <SEP> P815 <SEP> Mastocytoma <SEP> 32 <SEP> <SEP> O <SEP>
<tb>
Comme on le voit, TUBag4 induit une lyse de toutes les cellules cibles par le clone G115 seulement, mais n'induit pas de lyse par le clone contrôle BH.
Cette activité lytique n'est pas spécifique de la cellule cible. Cette activité cytolytique n'est pas non plus restreinte par le complexe MHC. En particulier, le composé antigénique selon l'invention TUBag4 active la cytotoxicité du lymphocyte Tyd G115 sur différentes cellules cancéreuses issues de donneurs différents humains ou de souris.
De plus, il a été démontré que le composé
TUBag4 selon l'invention active directement l'activité cytotoxique du lymphocyte Ty6 G115 sans interférer avec la cellule cible.
TUBag4 selon l'invention active directement l'activité cytotoxique du lymphocyte Ty6 G115 sans interférer avec la cellule cible.
Cette démonstration a été effectuée par des essais de pré-incubation dont les résultats indiquent que
TUBag4 active directement le clone Ty962.
TUBag4 active directement le clone Ty962.
Cette interaction directe implique TUBag4 et le TCR Vyg V62 comme l'indique l'inhibition totale de cette activité cytotoxique lorsque l'expérience est effectuée en présence d'anticorps monoclonaux dirigés contre le TCR Vy962 (figure 9). Par contre, les anticorps anti-TCR V61, HLA DR, HLA DP/DR et HLA 1 n'inhibent pas cette activité cytotoxique. Cela confirme l'absence de restriction par le MHC de cette réponse lymphocytaire.
L'invention permet ainsi de stimuler ou d'inhiber, c'est-à-dire de moduler, la prolifération et/ou la cytotoxcité des lymphocytes Ty6. A ce titre, on peut donc utiliser un composé organo-phosphoré tel que TUBagl,
TUBag2, TUBag3, TUBag4, ou un composé incorporant ces composés organo-phosphorés ou un groupement similaire, pour obtenirvune composition pharmaceutique pour le traitement préventif ou curatif des maladies de l'homme ou de l'animal dans lesquelles les lymphocytes Tyd sont impliqués, notamment les maladies infectieuses (en particulier mycobactériennes telles que la lèpre ou la tuberculose) les affections tumorales ou leucémiques de l'homme ou de l'animal ; les parasitoses ; les pathologies immunodéficiences telles que le SIDA, ...
TUBag2, TUBag3, TUBag4, ou un composé incorporant ces composés organo-phosphorés ou un groupement similaire, pour obtenirvune composition pharmaceutique pour le traitement préventif ou curatif des maladies de l'homme ou de l'animal dans lesquelles les lymphocytes Tyd sont impliqués, notamment les maladies infectieuses (en particulier mycobactériennes telles que la lèpre ou la tuberculose) les affections tumorales ou leucémiques de l'homme ou de l'animal ; les parasitoses ; les pathologies immunodéficiences telles que le SIDA, ...
A l'inverse, on peut aussi inhiber l'activité des lymphocytes Ty6 in situ en utilisant une enzyme dégradant les antigènes formés des composés organophosphorés selon l'invention. Selon l'antigène concerné, on utilise une monoester phosphatase et/ou une diester phosphatase (y compris une pyrophosphatase telle qu'une nucléotide pyrophosphatase).
Claims (35)
1/ - Composé organo-phosphoré hydrosoluble de nature non-peptidique, activateur des lymphocytes Ty6 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables
Vy9 et V62, ce composé comprenant au moins une liaison ester acidolabile de l'acide phosphorique, le caractère activateur de ce composé vis-à-vis des lymphocytes Tyb disparaissant lorsqu'il est placé en présence d'un mélange enzymatique comprenant au moins une monoester phosphorique phosphohydrolase et au moins une diester phosphorique phosphohydrolase.
2/ - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente un caractère anionique mesuré par chromatographie HPAEC à détection conductimétrique en mode de suppression chimique qui est supérieur à celui de l'acide phosphonoformique et inférieur à celui de la thymidine 5' triphosphate.
3/ - Composé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que, après traitement par une enzyme diester phosphorique phosphohydrolase, il présente un caractère an ionique mesuré par chromatographie HPAEC à détection conductimétrique en mode de suppression chimique qui estsupérieur à celui de l'acide phosphonoformique et inférieur à celui de la thymidine 5' triphosphate.
4/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente un caractère hydrophobe mesuré par chromatographie HPLC sur phase inverse de type C18 éluée en paire d'ions avec l'acétate d'ammonium, inférieur à celui de la thymidine 5' monophosphate.
5/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que son effet d'activation sur les lymphocytes Tyd est inhibé en présence d'anticorps monoclonaux spécifiques de TCR humains comprenant les régions variables Vyg et V62.
6/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substituant X d'un atome de phosphore de masse moléculaire inférieure à 500, qui est distinct d'un acide nucléique, d'un oligosaccharide, d'un acide gras, d'un protide, d'un alcaloïde et d'un stéroïde, et qui est lié dans le composé à un groupement phosphoryle par une liaison covalente acidolabile susceptible d'être clivée en présence d'une monoester phosphatase.
7/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un groupement nucléosidique.
8/ - Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupement nucléosidique est la thymidine liée à un groupement phosphoryle par le cinquième carbone de son radical 2-désoxyribose.
9/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un produit de l'hydrolyse d'un composé selon la revendication 8 par l'action enzymatique d'une nucléotide pyrophosphatase et/ou d'une phosphorique diester phosphohydrolase.
10/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un monoester phosphorique acidolabile de masse moléculaire inférieure à 500 distinct de la thymidine 5' monophosiphate, de la thymidine 5' diphosphate, de la thymidine 5' diphosphate glucose et de la thymidine 5' triphosphate.
11/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un diester phosphorique acidolabile de masse moléculaire inférieure à 1 000, distinct de la thymidine 5' monophosphate, de la thymidine 5' diphosphate, de la thymidine 5' diphosphate glucose et de la thymidine 5' triphosphate.
12/ - Composé selon l'une des revendications 1 à 11 pour utilisation comme antigène des lymphocytes Tyd humains.
13/ - Procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser au moins un composé organo-phosphoré selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'on soumet une solution aqueuse activant les lymphocytes Tyd humains à au moins une étape de séparation par chromatographie préparative en différentes fractions, et en ce que l'on teste l'activité de chaque fraction sur des lymphocytes Ty6 humains.
14/ - Procédé selon la revendication 13 pour isoler au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé par les étapes suivantes
- on cultive une souche d'êtres vivants unicellulaires susceptible d'activer des lymphocytes Ty6 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables
Vy9 V62,
- on réalise un extrait brut de la souche dont on sépare les composants hydrosolubles,
- on sépare une solution aqueuse comprenant ces composants hydrosolubles par chromatographie préparative en différentes fractions susceptibles d'activer les lymphocytes Ty5 humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables Vyg V62.
15/ - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on cultive une souche de mycobactéries, on effectue une extraction lipidique, et on sépare la phase aqueuse de l'extrait lipidique brut.
16/ - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on cultive Mycobactérium tuberculosis.
17/ - Procédé selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que l'étape de séparation par chromatographie comprend une séparation anionique par chromatographie échangeuse d'anions avec une solution saline dont on récupère l'éluat qui active les lymphocytes Ty6.
18/ - Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on effectue ensuite une séparation de la solution saline suivie d'un séchage de l'éluat non salin qui active les lymphocytes Ty6.
19/ - Procédé selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que l'étape de séparation par chromatographie comprend au moins une séparation préparative des différents principes actifs de l'éluat par chromatographie HPLC sur phase inverse C18 éluée en paire d'ions et/ou par chromatographie échangeuse d'anions HPAEC avec détection conductimétrique opérant en mode de suppression chimique, chaque étape de séparation étant suivie d'une mesure de l'activité des différentes fractions obtenues sur des lymphocytes Tyo
20/ - Composé activant les lymphocytes humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables
Vy et V6 -notamment Vyg et V62 caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon l'une des revendications 13 à 19.
21/ - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un composé organophosphoré selon l'une des revendications 1 à 12 ou 20.
22/ - Composition vaccinante caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un antigène selon l'une des revendications 1 à 12 ou 20.
23/ - Utilisation d'au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 12 ou 20, pour obtenir une composition pharmaceutique pour le traitement préventif ou curatif des maladies infectieuses de l'homme ou de l'animal.
24/ - Utilisation d'au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 12 ou 20 pour obtenir une composition pharmaceutique pour le traitement préventif ou curatif des maladies infectieuses mycobactériennes notamment la lèpre ou la tuberculose- de l'homme ou de l'animal.
25/ - Utilisation d'au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 12 ou 20 pour obtenir une composition pharmaceutique pour le traitement préventif ou curatif des affections tumorales ou leucémiques de l'homme ou de l'animal.
26/ - Utilisation d'au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 12 ou 20 pour obtenir une composition pharmaceutique pour le traitement préventif ou curatif des parasitoses de l'homme ou de l'animal.
27/ - Utilisation d'au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 12 ou 20 pour obtenir une composition pharmaceutique pour le traitement préventif ou curatif des pathologies d'immunodéficiences telles que le SIDA.
28/ - Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle contient une proportion pharmaceutiquement acceptable d'au moins un principe présentant une activité enzymatique phosphatase susceptible de dégrader au moins un composé activant des lymphocytes Tyd humains à récepteurs TCR comprenant les régions variables Vyg et V62.
29/ - Composition selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une monoester phosphorique phosphohydrolase.
30/ - Composition selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins une nucléotide pyrophosphatase.
31/ - Composition selon l'une des revendications 29 et 30, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins une diester phosphorique phosphohydrolase.
32/ - Composition selon l'une des revendications 28 à 31, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une enzyme phosphatase alcaline.
33/ - Composition selon l'une des revendications 21, 22 ou 28 à 32, caractérisée en ce qu'elle est formulée sous une forme galénique destinée à son administration par injection dans le sang circulant.
34/ - Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 28 à 32 pour obtenir un médicament inhibant la cytotoxicité des lymphocytes TY6 impliqués dans au moins une pathologie auto-immune.
35/ - Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 28 à 32 pour obtenir un médicament destiné au traitement de la sclérose en plaques.
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|---|---|---|---|
| FR9401170A FR2715660A1 (fr) | 1994-01-28 | 1994-01-28 | Composés organo-phosphorés activateurs des lymphocytes Tgammadelta, procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser ces composés, compositions et utilisations pharmaceutiques. |
| PCT/FR1995/000092 WO1995020673A1 (fr) | 1994-01-28 | 1995-01-26 | Composes organo-phosphores activateurs des lymphocytes t gamma delta |
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| FR9401170A FR2715660A1 (fr) | 1994-01-28 | 1994-01-28 | Composés organo-phosphorés activateurs des lymphocytes Tgammadelta, procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser ces composés, compositions et utilisations pharmaceutiques. |
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| FR9401170A Pending FR2715660A1 (fr) | 1994-01-28 | 1994-01-28 | Composés organo-phosphorés activateurs des lymphocytes Tgammadelta, procédé pour préparer et/ou isoler et/ou caractériser ces composés, compositions et utilisations pharmaceutiques. |
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| WO (1) | WO1995020673A1 (fr) |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995020673A1 (fr) | 1995-08-03 |
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