FR2714074A1 - Promoteurs des gènes GRA1, GRA2, GRA5 et GRA6 de toxoplasma gondii et vecteurs d'expression comprenant lesdits promoteurs. - Google Patents
Promoteurs des gènes GRA1, GRA2, GRA5 et GRA6 de toxoplasma gondii et vecteurs d'expression comprenant lesdits promoteurs. Download PDFInfo
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Abstract
L'Invention est relative à la séquence (I) suivante: 5' X1 GX2 GX3 X4 G 3' dans laquelle X1 et X2 représentent chacun indépendemment A, T, ou C, X3 représente A ou C, et X4 représente C ou T. La séquence (I) peut être utilisée pour la construction de promoteurs de transcription actifs chez les toxoplasmes.
Description
PROMOTEURS DES GENES GRA1, GRA2, GRA5 ET GRA6 DE TOXOPLASMA GONDII ET VECTEURS D'EXPRESSION COMPRENANT
LESDITS PROMOTEURS.
LESDITS PROMOTEURS.
La présente Invention est relative au clonage des promoteurs des gènes codant pour les antigènes d'excrétion-sécrétion des granules denses GRA1, GRA2,
GRAS et GRA6, et à l'utilisation desdits promoteurs pour la construction et l'expression de gènes recombinants.
GRAS et GRA6, et à l'utilisation desdits promoteurs pour la construction et l'expression de gènes recombinants.
Parmi les nombreuses utilisations de la technologie de l'ADN recombinant, la production d'antigènes protéiques, par expression dans une cellulehôte des gènes codant pour ces antigènes, en vue de la production de vaccins et/ou de réactifs de diagnostic, connait actuellement un grand développement.
Cependant, il est nécessaire de disposer de cellules-hôte adéquates pour permettre la reproduction des propriétés antigéniques de la protéine naturelle. En effet, les organismes hôtes disponibles, même eucaryotes, ne permettent en général pas de reproduire exactement les évènements post-traductionnels (glycosylation, repliement de la protéine, etc...) qui ont lieu chez l'organisme d'origine, ce qui peut avoir comme conséquence la perte des propriétés antigéniques intéressantes, lorsque celles-ci sont liées à des épitopes créés au cours de la maturation post-traductionnelle de la protéine.
Ce problème se pose de manière générale pour la production par génie génétique de protéines normalement produites par les cellules des eucaryotes, qu'il s'agisse des protéines codées par le génome de la cellule elle-même, ou de protéines d'origine virale, et en particulier dans le cas de la production de certains antigènes de protozoaires parasites tels que Toxoplasma,
Plasmodium, etc..., aucune des cellules-hôtes actuellement disponibles ne possédant de système de maturation post-traductionnelle comparable à ceux de ces protozoaires. Par exemple, dans le cas de l'antigène de surface SAG1 (P30) [BURG et al. J. Immunol., 141, 3584 3591, (1988)], qui est l'antigène immunodominant du
Toxoplasme, aucun des systèmes d'expression disponibles à l'heure actuelle n'a permis d'exprimer une protéine recombinante conservant les propriétés immunogènes et antigéniques de l'antigène natif. Les préparations d'antigène SAG1 qui sont actuellement utilisées comme marqueurs sérologiques dans des trousses de diagnostic de la toxoplasmose, sont des extraits membranaires du stade Tachyzolte.
Plasmodium, etc..., aucune des cellules-hôtes actuellement disponibles ne possédant de système de maturation post-traductionnelle comparable à ceux de ces protozoaires. Par exemple, dans le cas de l'antigène de surface SAG1 (P30) [BURG et al. J. Immunol., 141, 3584 3591, (1988)], qui est l'antigène immunodominant du
Toxoplasme, aucun des systèmes d'expression disponibles à l'heure actuelle n'a permis d'exprimer une protéine recombinante conservant les propriétés immunogènes et antigéniques de l'antigène natif. Les préparations d'antigène SAG1 qui sont actuellement utilisées comme marqueurs sérologiques dans des trousses de diagnostic de la toxoplasmose, sont des extraits membranaires du stade Tachyzolte.
Certains travaux réalisés récemment dans la manipulation génétique du Toxoplasme, appuyés par la facilité de propager ce parasite in vitro, permettraient de proposer l'utilisation de ce protozoaire comme hôte d'expression pour des gènes hétérologues codant pour des protéines d'intérêt. Toutefois, pour que cette utilisation puisse effectivement être envisagée, il faudrait disposer en outre de promoteurs fonctionnels chez ces organismes, et suffisamment forts pour assurer un niveau d'expression satisfaisant.
SOLDATI et BOOTHROYD [Science 260, 349-352 (1993)] sont parvenus à obtenir la transfection transitoire de T. gondii, par des plasmides dérivés d'un vecteur pBLUESCRIPT et comprenant une cassette constituée par la séquence codante du gène CAT (chloramphénicol acétyl transférase) insérée dans la séquence du gène SAG1 codant pour la P30, à la place d'un fragment compris entre le deuxième ATG et le codon stop (plasmide SAG1/2
CAT). D'autres plasmides ont été construits en introduisant le gène CAT à la place du fragment compris entre le premier ATG du gène SAG1 et le codon stop (SAGl/l CAT), en supprimant 400 pb en 5' de SAG1 (SAG1/2'
CAT), en remplaçant les séquences 5' de SAGI par des séquences 5' des gènes ROP ou TUB de T. gondii (ROPl/l
CAT, ROP1/2 CAT, TUB1 CAT et TUBl/inv CAT). Les plasmides
SAG 1/2, SAG 1/2' et ROP 1/2, ainsi que les plasmides TUB ont permis l'expression de l'activité CAT. Toutefois, les portions des séquences 5' des gènes SAG, ROP et TUB responsables de l'activité des promoteurs desdits gènes n'ont été identifiées dans aucun de ces plasmides.
CAT). D'autres plasmides ont été construits en introduisant le gène CAT à la place du fragment compris entre le premier ATG du gène SAG1 et le codon stop (SAGl/l CAT), en supprimant 400 pb en 5' de SAG1 (SAG1/2'
CAT), en remplaçant les séquences 5' de SAGI par des séquences 5' des gènes ROP ou TUB de T. gondii (ROPl/l
CAT, ROP1/2 CAT, TUB1 CAT et TUBl/inv CAT). Les plasmides
SAG 1/2, SAG 1/2' et ROP 1/2, ainsi que les plasmides TUB ont permis l'expression de l'activité CAT. Toutefois, les portions des séquences 5' des gènes SAG, ROP et TUB responsables de l'activité des promoteurs desdits gènes n'ont été identifiées dans aucun de ces plasmides.
La présente Invention s'est fixé pour but la recherche de promoteurs actifs chez le toxoplasme, en vue de l'utilisation de ces promoteurs pour contrôler l'expression de gènes hétérologues dans cet organisme.
Au sens de la présente Invention, on entend par "promoteur" un segment d'ADN comprenant les séquences essentielles à l'initiation de la transcription.
On sait que chez les eucaryotes aussi bien que chez les procaryotes, l'initiation de la transcription implique la reconnaissance, par 1'ARN polymérase et souvent par d'autres protéines de l'appareil de transcription, de certaines régions du promoteur, au niveau de séquences consensus présentes dans ces régions.
Cependant aucune séquence consensus susceptible de jouer un rôle dans l'initiation de la transcription n'avait jusqu'à présent été mise en évidence chez le toxoplasme.
Or, les Inventeurs sont maintenant parvenus à mettre en évidence chez T. gondii, des promoteurs forts, permettant d'assurer un niveau d'expression plus élevé que les promoteurs contenus dans les séquences 5' des gènes SAG clonées par SOLDATI et al : il s'agit des promoteurs des gènes GRA1, GRA2, GRA5, et GRA6 de T. gondil. Les Inventeurs sont en outre parvenus à cloner les fragments d'ADN portant les promoteurs des gènes GRA1, GRA2, GRA5, et GRA6 de T. gondi, et à identifier des séquences nécessaires à l'activité de ces promoteurs.
Les gènes GRA1, GRA2, GRA5, et GRA6, qui codent pour des antigènes d'excrétion-sécrétion de
Toxoplasma gondii, sont décrits dans les publications suivantes
- GRA1 (P23) : CESBRON-DELAUW et al., [Proc.
Toxoplasma gondii, sont décrits dans les publications suivantes
- GRA1 (P23) : CESBRON-DELAUW et al., [Proc.
Natl. Acad. Sci., n 86, p. 7537-7541, (1989)] ; Demande
PCT Wu/05658
- GRA2 (GP28.5) : Demande FR 92 07206 aux noms de INSTITUT PASTEUR, INSTITUT PASTEUR DE LILLE et
INSERM ; MERCIER et al., [Mol. Biochem. Parasitol., 58, 71-82, (1993)]
- GRAS (P21) : LECORDIER et al., [Mol.
PCT Wu/05658
- GRA2 (GP28.5) : Demande FR 92 07206 aux noms de INSTITUT PASTEUR, INSTITUT PASTEUR DE LILLE et
INSERM ; MERCIER et al., [Mol. Biochem. Parasitol., 58, 71-82, (1993)]
- GRAS (P21) : LECORDIER et al., [Mol.
Biochem. Parasitol., 59, 143-154, (1993)] ; Demande
Francaise 93 02891 aux noms de INSTITUT PASTEUR, INSTITUT
PASTEUR DE LILLE et INSERM
- GRA6 (P32) : Demande Francaise 93 02891.
Francaise 93 02891 aux noms de INSTITUT PASTEUR, INSTITUT
PASTEUR DE LILLE et INSERM
- GRA6 (P32) : Demande Francaise 93 02891.
La présente Invention a pour objet une séquence d'ADN double brin caractérisée en ce qu'elle constitue une séquence consensus nécessaire à la transcription chez les toxoplasmes, et en ce que l'un de ses brins répond à la séquence (I) suivante
5 X1GX2GX3X4G 3 (I) dans laquelle X1 et X2 représentent chacun indépendemment
A, T, ou C, X3 représente A ou C, et X4 représente C ou
T.
5 X1GX2GX3X4G 3 (I) dans laquelle X1 et X2 représentent chacun indépendemment
A, T, ou C, X3 représente A ou C, et X4 représente C ou
T.
Les Inventeurs ont mis en évidence la présence de séquences conformes à l'invention dans les promoteurs des gènes GRA1, GRA2, GRA5, et GRA6, soit en orientation directe, soit en orientation inverse ; l'orientation de la séquence consensus conforme à l'Invention est définie par rapport au brin codant du gène placé sous contrôle du promoteur comprenant ladite séquence : cette orientation est dite "directe" lorsque la séquence (I), lue dans le sens 5'3', est sur le brin codant, et "inverse" lorsque cette même séquence est sur le brin transcrit, le brin codant portant alors la séquence complémentaire inverse de (I).
Une ou plusieurs copies d'une séquence consensus conforme à l'invention peuvent être utilisées pour l'obtention d'un promoteur fonctionnel chez les toxoplasmes, en particulier T. gondii.
La présence d'une copie d'une séquence consensus conforme à l'invention en orientation inverse, confère l'activité basale du promoteur. L'activité optimale nécessite la présence d'au moins une deuxième copie de ladite séquence, en orientation directe ou inverse, et en amont de la première.
La présente Invention a pour objet un promoteur de transcription fonctionnel chez les toxoplasmes, et en particulier chez T. gondii, et caractérisé en ce qu'il comprend au moins une copie de la séquence consensus conforme à l'invention en orientation inverse.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit promoteur comprend en outre, en amont de ladite copie en orientation inverse, au moins une seconde copie de la séquence consensus conforme à l'Invention, en orientation directe.
Aucun élément indispensable au fonctionnement du promoteur n'a été mis en évidence dans les régions séparant les copies de la séquence consensus conforme à l'Invention ; une grande variabilité dans les séquences de ces régions intercalaires est admise. Toutefois, certaines séquences permettant la régulation de la force du promoteur conforme à l'Invention peuvent être insérées dans ces régions intercalaires. Par exemple, la présence d'une séquence CCAATT entre les copies de la séquence consensus conforme à l'Invention augmente la force du promoteur. La longueur de ces régions intercalaires peut également être très variable ; des copies de la séquence consensus conforme à l'Invention peuvent être séparées par des régions intercalaires de longueur variant entre 0 et 100 pb, de préférence entre 4 et 50 pb.
Avantageusement, un promoteur conforme à l'invention comprend, d'amont en aval, les éléments suivants
- au moins une copie de la séquence consensus conforme à l'Invention, en orientation directe
- une copie de la séquence CCAATT
- au moins une copie de la séquence consensus conforme à l'Invention en orientation inverse.
- au moins une copie de la séquence consensus conforme à l'Invention, en orientation directe
- une copie de la séquence CCAATT
- au moins une copie de la séquence consensus conforme à l'Invention en orientation inverse.
Des promoteurs conformes à l'invention sont par exemple représentés par
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (A) suivante
(A)
CGTCTCATTGCGGACCAATTCCCGGTCCACCGCTGCGTCTCGACTCGACGGTTGTGA
CCACCCCACTTCGCATTGGGCAGTCGGTAAAGCCAC
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (B) suivante
(B)
AGAGACGCAAAATGAACAGCGGAACCTGCGTCGCTGTCTGTCCTGCGAACTGATGAC
AGAAAGGGTCATTAAA
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (C) suivante
(C)
AGAGACGCACTGACGGTTGACGTCGATCGGCACTCGATCCTACCGTCAG
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (D) suivante
(D)
TGCGACGCGGAGCAGGAACGGCCGACCTGTACGAAACACGAGTCTCGCGCGTCTCAT
GCAAATGCCCACTGGCTGACTCTTCCCCAT
Les séquences (A), (B), (C), et (D) représentent respectivement des séquences situées en amont des sites de transcription des gènes GRA1, GRA2,
GRA5 et GRA6 de T. gondii, et comprenant les éléments nécessaires à l'activité des promoteurs desdits gènes.
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (A) suivante
(A)
CGTCTCATTGCGGACCAATTCCCGGTCCACCGCTGCGTCTCGACTCGACGGTTGTGA
CCACCCCACTTCGCATTGGGCAGTCGGTAAAGCCAC
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (B) suivante
(B)
AGAGACGCAAAATGAACAGCGGAACCTGCGTCGCTGTCTGTCCTGCGAACTGATGAC
AGAAAGGGTCATTAAA
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (C) suivante
(C)
AGAGACGCACTGACGGTTGACGTCGATCGGCACTCGATCCTACCGTCAG
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (D) suivante
(D)
TGCGACGCGGAGCAGGAACGGCCGACCTGTACGAAACACGAGTCTCGCGCGTCTCAT
GCAAATGCCCACTGGCTGACTCTTCCCCAT
Les séquences (A), (B), (C), et (D) représentent respectivement des séquences situées en amont des sites de transcription des gènes GRA1, GRA2,
GRA5 et GRA6 de T. gondii, et comprenant les éléments nécessaires à l'activité des promoteurs desdits gènes.
La présente Invention a également pour objet une cassette d'expression qui comprend au moins
- un promoteur conforme à l'Invention tel que défini ci-dessus, et
- un fragment d'ADN comprenant au moins un site de restriction permettant le clonage d'au moins un gène hétérologue sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
- un promoteur conforme à l'Invention tel que défini ci-dessus, et
- un fragment d'ADN comprenant au moins un site de restriction permettant le clonage d'au moins un gène hétérologue sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
La présente Invention englobe également des vecteurs recombinants (plasmides, virus, etc...) caracté risés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par insertion d'au moins un promoteur conforme à l'Invention dans un vecteur support.
Des vecteurs conformes à l'Invention ont été déposés le 30 Novembre 1993 auprès de la COLLECTION
NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES DE L'INSTITUT
PASTEUR (CNCM), 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS
CEDEX 15, FRANCE.
NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES DE L'INSTITUT
PASTEUR (CNCM), 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS
CEDEX 15, FRANCE.
Le plasmide pGRAl.7/CAT qui contient un fragment d'ADN portant le promoteur GRAlp a été déposé sous le numéro I-1379.
Le plasmide pGRA2.8/CAT qui contient un fragment d'ADN portant le promoteur GRA2p a été déposé sous le numéro I-1380.
Le plasmide pGRA5.7/CAT qui contient un fragment d'ADN portant le promoteur GRA5p a été déposé sous le numéro I-1381.
Le plasmide pGRA6.4/CAT qui contient un fragment d'ADN portant le promoteur GRA6p a été déposé sous le numéro I-1382.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits vecteurs recombinants sont des vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
L'Invention englobe également des cellules eucaryotes ou procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par transformation d'une cellule hôte par un ADN recombinant comprenant au moins un promoteur conforme à l'Invention. Selon un mode de réalisation préféré, ces cellules sont des toxoplasmes.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un fragment d'ADN comprenant au moins une séquence consensus conforme à l'Invention tel que définie ci-dessus, comme promoteur pour contrôler l'expression d'au moins un gène hétérologue chez le toxoplasme.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, ledit fragment d'ADN est constitué par le promoteur de l'un des gènes GRA1, GRA2, GRA5 ou
GRA6 de T. gondii.
GRA6 de T. gondii.
Au sens de la présente Invention on entend par "gène hétérologue" non seulement tout gène provenant d'un autre organisme que T. gondii, mais également tout gène autre que celui qui est naturellement exprimé dans
T. gondii sous contrôle du promoteur considéré.
T. gondii sous contrôle du promoteur considéré.
Les promoteurs conformes à l'Invention permettent en particulier l'expression de gènes hétérologues chez le toxoplasme.
L'utilisation de toxoplasmes comme hôtes d'expression de gènes hétérologues est particulièrement avantageuse pour l'expression des gènes codant pour des antigènes de toxoplasmes ou d'autres protozoaires parasites tels que Plasmodium, car elle permet de résoudre les problèmes d'immunogénicité des molécules recombinantes qui sont rencontrés lors de l'expression chez les organismes hôtes proposés dans l'art antérieur.
En outre, l'utilisation de promoteurs forts tels que ceux de GRA1, GRA2, GRA5 et GRA6 pour l'expression d'autres gènes de toxoplasme permet de surexprimer ces derniers au sein du toxoplasme lui-même. Par exemple, l'expression par les toxoplasmes du gène SAG1 sous la dépendance d'un de ces promoteurs permettrait d'enrichir les membranes parasitaires en protéine P30.
Le produit du gène exprimé sous contrôle d'un promoteur conforme à l'Invention peut ensuite être purifié à partir des cultures de toxoplasmes.
En outre, des toxoplasmes atténués transformés surexprimant un antigène de toxoplasme, ou exprimant des antigènes d'autres organismes pathogènes, en particulier de pathogènes intracellulaires, sous contrôle d'un promoteur conforme à l'invention, peuvent également être utilisés comme vaccins vivants.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant le clonage de fragments d'ADN portant les promoteurs GRAlp, GRA2p, GRA5p, et GRA6p, ainsi que l'expression transitoire d'un gène hétérologue chez T. gondii sous contrôle desdits promoteurs.
I1 va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : CLONAGE DE FRAGMENTS D'ADN PORTANT LES
PROMOTEURS DE GRA1, GRA2, GRA5 et GRA6.
PROMOTEURS DE GRA1, GRA2, GRA5 et GRA6.
I. - Amplification par PCR des régions potentiellement promotrices.
300 à 500 paires de bases situées en amont du codon ATG d'initiation de traduction de chacun des 4 gènes ont été amplifiées par PCR (Polymérase Chain
Reaction).
Reaction).
Les oligonucléotides amorces de ces réactions d'amplification sont indiqués ci-dessous
GRA1 * P241 5' GGATCGATGCATCTTGCTTGATTTCTTCAAAGAAC 3' * P242 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCGAAGGCTGCTAGTACTGGTGATC 3'
GRA2 * P281 5' ACGGATCGATGCATTGTGAGGCGATATGTGGAG 3 * P282 5' CACGACTCGAGAAGCTTACGCGTATCACGTCAGTCCTTAC 3
GRA5 * P211 5' GGATCGATGCATTTTGTTACTTCACGAAAATCGC 3' * P212 5' CATGCACTCGAGAAGCTTCGCATGACTCCCTCAG 3
GRA6 * P321 5' ACGGATCGATGCATTTCGCCGACACTCCCAAG 3' * P322 5' CATGCACTCGAGAAGCTTCCGTCACCACAACCTAGCAAC 3'
Le couple P241-P242 amplifie un fragment de 607 bp de la séquence 5' de GRA1 ; ce fragment comprend 379 pb en amont du site d'initiation de la transcription et 228 pb de séquence transcrite non traduite.
GRA1 * P241 5' GGATCGATGCATCTTGCTTGATTTCTTCAAAGAAC 3' * P242 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCGAAGGCTGCTAGTACTGGTGATC 3'
GRA2 * P281 5' ACGGATCGATGCATTGTGAGGCGATATGTGGAG 3 * P282 5' CACGACTCGAGAAGCTTACGCGTATCACGTCAGTCCTTAC 3
GRA5 * P211 5' GGATCGATGCATTTTGTTACTTCACGAAAATCGC 3' * P212 5' CATGCACTCGAGAAGCTTCGCATGACTCCCTCAG 3
GRA6 * P321 5' ACGGATCGATGCATTTCGCCGACACTCCCAAG 3' * P322 5' CATGCACTCGAGAAGCTTCCGTCACCACAACCTAGCAAC 3'
Le couple P241-P242 amplifie un fragment de 607 bp de la séquence 5' de GRA1 ; ce fragment comprend 379 pb en amont du site d'initiation de la transcription et 228 pb de séquence transcrite non traduite.
Le couple P281-P282 amplifie un fragment de 381 pb de la séquence 5' de GRA2 ; ce fragment comprend 276 pb en amont du site d'initiation de la transcription et 105 pb de séquence transcrite non traduite.
Le couple P211-P212 amplifie un fragment de 315 pb de la séquence 5' de GRA5 ; ce fragment comprend 209 pb en amont du site d'initiation de la transcription et 106 pb de séquence transcrite non traduite.
Le couple P321-P322 amplifie un fragment de 500 pb de de la séquence 5' de GRA6 ; ce fragment comprend 265 pb en amont du site d'initiation de la transcription et 235 pb de séquence transcrite non traduite.
Les portions des séquences 5' de GRA1, GRA2,
GRA5, et GRA6 correspondant aux fragments amplifiés sont représentées respectivement sur les figures 2, 3, 4, et 5.
GRA5, et GRA6 correspondant aux fragments amplifiés sont représentées respectivement sur les figures 2, 3, 4, et 5.
Les oligonucléotides amorces permettent en outre de générer
- un site NsiI au niveau de 1ATG d'initiation de traduction, dans la région 3' de la région amplifiée
- un site HindIII à l'extrémité 5' du fragment amplifié.
- un site NsiI au niveau de 1ATG d'initiation de traduction, dans la région 3' de la région amplifiée
- un site HindIII à l'extrémité 5' du fragment amplifié.
Ces deux sites de restriction enzymatique artificiellement introduits seront utilisés pour le clonage des fragments amplifiés.
Les régions amplifiées contiennent chacune une région 5' flanquante, suivie d'une région 5' transcrite mais non traduite.
II. - Clonage des fragments amplifiés dans le vecteur SAGl/2-CAT modifié
Le vecteur SAG1/2-CAT , dérivé du vecteur commercial pBLUESCRIPT (STRATAGENE) contient le gène bactérien indicateur CAT (codant pour l'enzyme
Chloramphénicol Acétyl Transférase) flanqué de la séquence 5' non-codante, et de la séquence 3' non-codante du gène SAG1 ainsi qu'un gène de résistance à l'ampicilline. Ce vecteur est représenté à la Figure 1.
Le vecteur SAG1/2-CAT , dérivé du vecteur commercial pBLUESCRIPT (STRATAGENE) contient le gène bactérien indicateur CAT (codant pour l'enzyme
Chloramphénicol Acétyl Transférase) flanqué de la séquence 5' non-codante, et de la séquence 3' non-codante du gène SAG1 ainsi qu'un gène de résistance à l'ampicilline. Ce vecteur est représenté à la Figure 1.
Les fragments amplifiés issus de GRA1, GRA2,
GRA5 et GRA6 sont ensuite clonés dans les sites HindIII (en 5') et NsiI (en 3') du vecteur SAG1/2-CAT (BOOTHROYD et SOLDATI, publication précitée), c'est-à-dire à la place de la séquence 5' non codante de SAGI, et en phase de lecture avec l'ATG d'initiation de traduction du gène
CAT.
GRA5 et GRA6 sont ensuite clonés dans les sites HindIII (en 5') et NsiI (en 3') du vecteur SAG1/2-CAT (BOOTHROYD et SOLDATI, publication précitée), c'est-à-dire à la place de la séquence 5' non codante de SAGI, et en phase de lecture avec l'ATG d'initiation de traduction du gène
CAT.
Quatre constructions initiales ont ainsi été obtenues, respectivement dénommées GRA1.1/CAT, GRA2.1/CAT, GRA5.1/CAT, et GRA6.1/CAT.
III. - Sous-clonage des régions promotrices de GRA1, GRA2, GRA5, et GRA6.
Différents sous-fragments ont été construits à partir des fragments initiaux de 607 pb, 381pb, 315pb et 500pb.
GRA1
. Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 607 pb initialement cloné (GRA1.2/CAT, GRA1.3/CAT, GRA1.4/CAT)
Sous-fragments construits par délétion à l'exonucléase III (Kit Erase A Base, PROMEGA) (GRA1.5/CAT, GRA1.6/CAT, GRA1.7/CAT, GRA1.8/CAT)
Sous-fragments construits par PCR - GRAl.9/CAT couple d'oligonucléotides P241-P243 * P243 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCCCGGTCCACCGCTGCG 3' - GRA1.10/CAT : couple d'oligonucléotides P241-P244
* P244 : 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCGGACCAATTCCCGGTCCAC 3'
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRAl.l/CAT est indiquée à la Figure 2.
. Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 607 pb initialement cloné (GRA1.2/CAT, GRA1.3/CAT, GRA1.4/CAT)
Sous-fragments construits par délétion à l'exonucléase III (Kit Erase A Base, PROMEGA) (GRA1.5/CAT, GRA1.6/CAT, GRA1.7/CAT, GRA1.8/CAT)
Sous-fragments construits par PCR - GRAl.9/CAT couple d'oligonucléotides P241-P243 * P243 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCCCGGTCCACCGCTGCG 3' - GRA1.10/CAT : couple d'oligonucléotides P241-P244
* P244 : 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCGGACCAATTCCCGGTCCAC 3'
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRAl.l/CAT est indiquée à la Figure 2.
GRA2
Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 381 pb initialement cloné (GRA2.2/CAT ; GRA2.3/CAT)
Sous-fragments construits par délétion à l'exonucléase III : (GRA2.4/CAT, GRA2.5/CAT, GRA2.6/CAT,
GRA2.7/CAT).
Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 381 pb initialement cloné (GRA2.2/CAT ; GRA2.3/CAT)
Sous-fragments construits par délétion à l'exonucléase III : (GRA2.4/CAT, GRA2.5/CAT, GRA2.6/CAT,
GRA2.7/CAT).
Sous-fragments construits par PCR - GRA2.8/CAT couple d'oligonucléotides P281-P283 * P283 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCGCCAGAGACGCAAAATG 3' - GRA2.9/CAT couple d'oligonucléotides P281-P284 * P284 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCAAAATGAACAGCGGAAC 3 - GRA2.10/CAT couple d'oligonucléotides P281-P285 * P285 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTGTCTGTCCTGCGAACTGATG 3'
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRAl.l/CAT est indiquée sur la Figure 3.
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRAl.l/CAT est indiquée sur la Figure 3.
GRA5
Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 315 pb initialement cloné (GRA5.2/CAT et GRA5.3/CAT)
Sous-fragments construits par délétion à l'exonucléase III : (GRA5.4/CAT ; GRA5.5/CAT
GRA5.6/CAT ; GRA5.7/CAT)
Sous-fragments construits par PCR - GRA5.8/CAT couple d'oligonucléotides P281-P283 * P283 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCGATCCTACCGTCAGTC 3'
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRA5.1/CAT est indiquée à la Figure 4.
Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 315 pb initialement cloné (GRA5.2/CAT et GRA5.3/CAT)
Sous-fragments construits par délétion à l'exonucléase III : (GRA5.4/CAT ; GRA5.5/CAT
GRA5.6/CAT ; GRA5.7/CAT)
Sous-fragments construits par PCR - GRA5.8/CAT couple d'oligonucléotides P281-P283 * P283 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCGATCCTACCGTCAGTC 3'
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRA5.1/CAT est indiquée à la Figure 4.
GRA6
Différents sous-fragments de délétion ont été construits, à l'aide de sites de restriction situés dans la région initialement amplifiée ou par PCR
Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 500 pb initialement cloné (GRA6.2/CAT et GRA6.3/CAT)
Sous-fragments construits par PCR - GRA6.4/CAT couple P321-P324 f P3a4 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCTGCGACGCGGAGCAGGAAC 3' - GRA6.5/CAT couple P321-P325 * P325 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTGCAAATGCCCACTGGCTGAC 3'
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRA6.1/CAT est indiquée à la Figure 5.
Différents sous-fragments de délétion ont été construits, à l'aide de sites de restriction situés dans la région initialement amplifiée ou par PCR
Sous-fragments construits par digestion enzymatique au niveau des sites de restriction présents dans le fragment de 500 pb initialement cloné (GRA6.2/CAT et GRA6.3/CAT)
Sous-fragments construits par PCR - GRA6.4/CAT couple P321-P324 f P3a4 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTCTGCGACGCGGAGCAGGAAC 3' - GRA6.5/CAT couple P321-P325 * P325 5' CTAGCACTCGAGAAGCTTGCAAATGCCCACTGGCTGAC 3'
L'emplacement de ces sous-fragments par rapport à la séquence du fragment initial GRA6.1/CAT est indiquée à la Figure 5.
Les sous-fragments issus de GRAlp, GRA2p,
GRA5p, GRA6p ont été reclonés dans le vecteur SAG1/2 en amont du gène CAT selon le protocole décrit en II cidessus.
GRA5p, GRA6p ont été reclonés dans le vecteur SAG1/2 en amont du gène CAT selon le protocole décrit en II cidessus.
EXEMPLE 2 : TRANSFECTION DES PLASMIDES RECOMBINANTS DANS
LES TACHYZOITES ET DETECTION DE L'EXPRESSION DU GENE CAT
CHEZ T. GONDII.
LES TACHYZOITES ET DETECTION DE L'EXPRESSION DU GENE CAT
CHEZ T. GONDII.
Les plasmides recombinants obtenus à l'exemple 1 ont été introduits par électroporation dans des tachyzoites obtenus après l'infestation 4 jours auparavant d'un tapis de cellules Hep2.
Le protocole de transfection transitoire utilisé est celui décrit par SOLDATI ET BOOTHROYD (publication précitée) : 107 tachyzoites sont mis en contact avec 10 Ag d'ADN plasmidique ; l'électroporation s'effectue à 2250V, 24 RF, 100fil(0.6 ms) à l'aide d'un appareil "Gene Pulser" (BIORAD). Les parasites électroporés sont ensuite maintenus en culture pendant 20 heures à 37 C, dans du milieu MEM-10% SVF.
Lors de la transfection d'une construction plasmidique sont réalisés
A) Plusieurs témoins négatifs
1) des tachyzoltes ne recevant pas d'ADN mais recevant le choc électrique de l'électroporation ;
2) des tachyzoltes mis en contact avec lADN plasmidique à transfecter mais ne subissant pas d'électroporation ;
3) des cellules Hep2 non infectées, mises en contact avec l'ADN plasmidique et électroporées dans les conditions mises au point pour les tachyzoltes. Dans la mesure où il est difficile, avant l'électroporation, d'éliminer toutes les cellules Hep2 sans endommager les tachyzoltes, il est en effet nécessaire de vérifier que les conditions d'électroporation décrites ci-dessus sont spécifiques des tachyzoltes, afin de vérifier que les résultats observés ne sont pas le fait de la transfection de cellules Hep2 contaminant les préparations parasitaires.
A) Plusieurs témoins négatifs
1) des tachyzoltes ne recevant pas d'ADN mais recevant le choc électrique de l'électroporation ;
2) des tachyzoltes mis en contact avec lADN plasmidique à transfecter mais ne subissant pas d'électroporation ;
3) des cellules Hep2 non infectées, mises en contact avec l'ADN plasmidique et électroporées dans les conditions mises au point pour les tachyzoltes. Dans la mesure où il est difficile, avant l'électroporation, d'éliminer toutes les cellules Hep2 sans endommager les tachyzoltes, il est en effet nécessaire de vérifier que les conditions d'électroporation décrites ci-dessus sont spécifiques des tachyzoltes, afin de vérifier que les résultats observés ne sont pas le fait de la transfection de cellules Hep2 contaminant les préparations parasitaires.
B) Un témoin positif qui est obtenu en procédant à la transfection par la construction plasmidique SAG1/2-CAT (décrite par SOLDATI et
BOOTHROYD).
BOOTHROYD).
L'activité de chacun des promoteurs est évaluée dans les toxoplasmes transfectés par mise en évidence de l'activité CAT, selon la méthode classique décrite par GORMAN et al. [Mol. Cell. Biol. n 2, pp.
1044-1051 (1982)] : l'extrait cellulaire total (soit l'équivalent de 107 tachyzoites transfectés) obtenu après lyse des tachyzoltes par congélation-décongélation, est incubé 4 heures à 37 C avec le substrat de l'enzyme CAT, le chloramphénicol marqué au 14C (0.1 Rci par essai). Si une activité CAT est présente dans l'extrait, le chloramphénicol est transformé en ses formes mono- et diacétylées. Les produits obtenus sont aisément séparables du substrat natif, par chromatographie ascendante sur couche mince de silice. Une exposition autoradiographique permet de visualiser les différentes formes de chloramphénicol.
Une série de transfections a été réalisée à l'aide des constructions GRAl.l/CAT, GRA2.1/CAT, GRA5.l/CAT, GRA6.1/CAT et SAG1/2-CAT dans les conditions suivantes - conditions d'électroporation : 107 tachyzoltes ; 10 g
ADN ; 2250 V, 25 AF, 100Q (0.6 ms) - conditions de détection de l'activité CAT : 4 h, 37 C, 0.1 WCi chloramphénicol[14 C] - exposition autoradiographique variable : 2 à 5 jours à température ambiante.
ADN ; 2250 V, 25 AF, 100Q (0.6 ms) - conditions de détection de l'activité CAT : 4 h, 37 C, 0.1 WCi chloramphénicol[14 C] - exposition autoradiographique variable : 2 à 5 jours à température ambiante.
Les résultats des mesures de l'activité CAT pour chacune des constructions obtenues sont illustrés par les Figures 6 à 9 qui représentent les autoradiographies des chromatogrammes sur couche mince.
L'activité CAT a été évaluée d'après l'intensité des taches correspondant au substrat natif, et aux formes mono- et di-acétylées. Les légendes des figures 6, 7, 8 et 9 sont respectivement indiquées dans les tableaux I, II, III, et IV ci dessous
(+) activité CAT forte
(+) activité CAT faible
(-) pas d'activité CAT.
(+) activité CAT forte
(+) activité CAT faible
(-) pas d'activité CAT.
GRA1 : Figure 6 et Tableau I - GRA1.7/CAT contient la séquence minimale nécessaire à l'obtention d'une activité CAT optimale (107 pb en amont du cap site).
Une souche de E. coli JM109 contenant le plasmide
GRA1.7/CAT a été déposée auprès de la CNCM, le 30
Novembre 1993 sous le numéro I-1379.
GRA1.7/CAT a été déposée auprès de la CNCM, le 30
Novembre 1993 sous le numéro I-1379.
- Le mutant GRA1.4/CAT (47 pb en amont du cap site) donne une activité CAT négative.
GRA2 : Figure 7 et Tableau II
- GRA2.8/CAT contient la séquence minimale nécessaire à l'obtention d'une activité CAT optimale (73 pb en amont du cap site).
- GRA2.8/CAT contient la séquence minimale nécessaire à l'obtention d'une activité CAT optimale (73 pb en amont du cap site).
Une souche de E. col i JM109 contenant le plasmide
GRA2.8/CAT a été déposée auprès de la CNCM, le 30
Novembre 1993 sous le numéro I-1380.
GRA2.8/CAT a été déposée auprès de la CNCM, le 30
Novembre 1993 sous le numéro I-1380.
GRA5 : Figure 8 et Tableau III
- GRA5.7/CAT contient la séquence minimale nécessaire à l'obtention d'une activité CAT optimale (51 pb en amont du cap site).
- GRA5.7/CAT contient la séquence minimale nécessaire à l'obtention d'une activité CAT optimale (51 pb en amont du cap site).
Une souche de E.coli JM109 contenant le plasmide
GRA5.7/CAT a été déposée auprès de la CNCM, le 30
Novembre 1993 sous le numéro I-1381
GRA6 : Figure 9 et Tableau IV
- GRA6.4/CAT contient la séquence minimale nécessaire à l'obtention d'une activité CAT optimale (85 pb en amont du cap site).
GRA5.7/CAT a été déposée auprès de la CNCM, le 30
Novembre 1993 sous le numéro I-1381
GRA6 : Figure 9 et Tableau IV
- GRA6.4/CAT contient la séquence minimale nécessaire à l'obtention d'une activité CAT optimale (85 pb en amont du cap site).
Une souche de E. col i JM109 contenant le plasmide GRA6.4/CAT a été déposée auprès de la CNCM, le 30 Novembre 1993 sous le numéro I-1382.
- L'analyse des sous-fragments et de leur activité promotrice a permis de mettre en évidence la présence d'un motif répété en sens direct ou en sens complémentaire inverse.
- Le nombre de ces séquences répétées présentes en amont des cap sites est variable selon le gène GRA considéré
* Pour GRA2, GRAS et GRA6, l'activité CAT optimale est encore obtenue lorsque le sous-fragment contient les 2 derniers motifs.
* Pour GRA2, GRAS et GRA6, l'activité CAT optimale est encore obtenue lorsque le sous-fragment contient les 2 derniers motifs.
* Pour GRA1, le dernier sous-fragment permettant une activité CAT optimale contient 2 motifs répétés dans le sens inversé mais également une boîte "CCAATT" comprise entre ces 2 motifs.
Les séquences consensus sont soulignées dans les séquences représentées aux figures 2, 3, 4 et 5. La boîte CCAAT est indiquée en caractères gras.
Les résultats d'évaluation de l'activité CAT pour chacune des constructions contenant les promoteurs des gènes GRA, ainsi que pour le témoin positif de transfection constitué par SAG1/2-CAT ont été observés de façon reproductible : ceci montre que les promoteurs des gènes GRA (en particulier le promoteur du gène GRA1 ) sont des promoteurs beaucoup plus forts que le promoteur SAG1.
TABLEAU I
<tb> DE <SEP> POT <SEP> PLASMIDE <SEP> ACTIVITE <SEP> CAT
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 1 <SEP> GRAl.l/CAT <SEP> (+)
<tb> 2 <SEP> GRA1.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 3 <SEP> GRA1.3/CAT <SEP> (+)
<tb> 4 <SEP> GRA1.4/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 5 <SEP> GRA1.5/CAT <SEP> (+)
<tb> 6 <SEP> GRA1.6/CAT <SEP> (+)
<tb> 7 <SEP> GRA1.7/CAT <SEP> (+)
<tb> 8 <SEP> GRA1.8/CAT <SEP> (+) <SEP>
<tb> 9 <SEP> GRAl.9/CAT <SEP> (+) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 25 <SEP> GRAl.l/CAT <SEP> (-)
<tb> 26 <SEP> GRA1.2/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 27 <SEP> GRA1.3/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 28 <SEP> GRA1.4/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 29 <SEP> GRA1.5/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 30 <SEP> GRA1.6/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 31 <SEP> GRA1.7/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 32 <SEP> GRA1.8/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 33 <SEP> GRAl.9/CAT <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 55 <SEP> aucun <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 44 <SEP> GRAl.l/CAT <SEP> <SEP> | <SEP> (-) <SEP>
<tb>
TABLEAU II
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 1 <SEP> GRAl.l/CAT <SEP> (+)
<tb> 2 <SEP> GRA1.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 3 <SEP> GRA1.3/CAT <SEP> (+)
<tb> 4 <SEP> GRA1.4/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 5 <SEP> GRA1.5/CAT <SEP> (+)
<tb> 6 <SEP> GRA1.6/CAT <SEP> (+)
<tb> 7 <SEP> GRA1.7/CAT <SEP> (+)
<tb> 8 <SEP> GRA1.8/CAT <SEP> (+) <SEP>
<tb> 9 <SEP> GRAl.9/CAT <SEP> (+) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 25 <SEP> GRAl.l/CAT <SEP> (-)
<tb> 26 <SEP> GRA1.2/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 27 <SEP> GRA1.3/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 28 <SEP> GRA1.4/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 29 <SEP> GRA1.5/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 30 <SEP> GRA1.6/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 31 <SEP> GRA1.7/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 32 <SEP> GRA1.8/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 33 <SEP> GRAl.9/CAT <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 55 <SEP> aucun <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 44 <SEP> GRAl.l/CAT <SEP> <SEP> | <SEP> (-) <SEP>
<tb>
TABLEAU II
<tb> DE <SEP> POT <SEP> PLASMIDE <SEP> ACTIVITE <SEP> CAT
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 1 <SEP> GRA2.l/CAT <SEP>
<tb> 2 <SEP> GRA2.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 3 <SEP> GRA2.3/CAT <SEP> (+)
<tb> 4 <SEP> GRA2.4/CAT <SEP> (+)
<tb> 5 <SEP> GRA2.5/CAT <SEP> (+)
<tb> 6 <SEP> GRA2.6/CAT <SEP> (+)
<tb> 7 <SEP> GRA2.7/CAT <SEP> (+)
<tb> 8 <SEP> GRA2.8/CAT <SEP> (+)
<tb> 9 <SEP> GRA2.9/CAT <SEP> (~) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 25 <SEP> GRA2.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 26 <SEP> GRA2.2/CAT <SEP> (-)
<tb> 27 <SEP> GRA2.3/CAT <SEP> (-)
<tb> 28 <SEP> GRA2.4/CAT <SEP> (-)
<tb> 29 <SEP> GRA2.5/CAT <SEP> (-)
<tb> 30 <SEP> GRA2.6/CAT <SEP> (-)
<tb> 31 <SEP> GRA2.7/CAT <SEP> (-)
<tb> 32 <SEP> GRA2.8/CAT <SEP> (-)
<tb> 33 <SEP> GRA2.9/CAT <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 55 <SEP> aucun <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 44 <SEP> GRA2.1/CAT <SEP>
<tb>
TABLEAU III
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 1 <SEP> GRA2.l/CAT <SEP>
<tb> 2 <SEP> GRA2.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 3 <SEP> GRA2.3/CAT <SEP> (+)
<tb> 4 <SEP> GRA2.4/CAT <SEP> (+)
<tb> 5 <SEP> GRA2.5/CAT <SEP> (+)
<tb> 6 <SEP> GRA2.6/CAT <SEP> (+)
<tb> 7 <SEP> GRA2.7/CAT <SEP> (+)
<tb> 8 <SEP> GRA2.8/CAT <SEP> (+)
<tb> 9 <SEP> GRA2.9/CAT <SEP> (~) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 25 <SEP> GRA2.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 26 <SEP> GRA2.2/CAT <SEP> (-)
<tb> 27 <SEP> GRA2.3/CAT <SEP> (-)
<tb> 28 <SEP> GRA2.4/CAT <SEP> (-)
<tb> 29 <SEP> GRA2.5/CAT <SEP> (-)
<tb> 30 <SEP> GRA2.6/CAT <SEP> (-)
<tb> 31 <SEP> GRA2.7/CAT <SEP> (-)
<tb> 32 <SEP> GRA2.8/CAT <SEP> (-)
<tb> 33 <SEP> GRA2.9/CAT <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 55 <SEP> aucun <SEP> (-)
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 44 <SEP> GRA2.1/CAT <SEP>
<tb>
TABLEAU III
<tb> DE <SEP> POT <SEP> PLASMIDE <SEP> ACTIVITE <SEP> CAT
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 1 <SEP> GRA5.1/CAT <SEP> (+)
<tb> 2 <SEP> GRA5.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 3 <SEP> GRA5.3/CAT <SEP> (+) <SEP>
<tb> 4 <SEP> GRA5.4/CAT <SEP> (+)
<tb> 5 <SEP> GRA5.5/CAT <SEP> (+)
<tb> 6 <SEP> GRA5.6/CAT <SEP> (+)
<tb> 7 <SEP> GRA5.7/CAT <SEP> (+)
<tb> 8 <SEP> SAG1/2-CAT <SEP> (~) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 24 <SEP> GRA5.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 25 <SEP> GRA5.2/CAT <SEP> (-)
<tb> 26 <SEP> GRA5.3/CAT
<tb> 27 <SEP> GRA5.4/CAT <SEP> (-)
<tb> 28 <SEP> GRA5.5/CAT <SEP> (-)
<tb> 29 <SEP> GRA5.6/CAT <SEP> (-)
<tb> 30 <SEP> GRA5.7/CAT <SEP> (-)
<tb> 31 <SEP> SAG1/2-CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 54 <SEP> aucun <SEP> <SEP> T <SEP> (, <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 42 <SEP> GRA5.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 43 <SEP> SAG1/2-CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb>
TABLEAU IV
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 1 <SEP> GRA5.1/CAT <SEP> (+)
<tb> 2 <SEP> GRA5.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 3 <SEP> GRA5.3/CAT <SEP> (+) <SEP>
<tb> 4 <SEP> GRA5.4/CAT <SEP> (+)
<tb> 5 <SEP> GRA5.5/CAT <SEP> (+)
<tb> 6 <SEP> GRA5.6/CAT <SEP> (+)
<tb> 7 <SEP> GRA5.7/CAT <SEP> (+)
<tb> 8 <SEP> SAG1/2-CAT <SEP> (~) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 24 <SEP> GRA5.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 25 <SEP> GRA5.2/CAT <SEP> (-)
<tb> 26 <SEP> GRA5.3/CAT
<tb> 27 <SEP> GRA5.4/CAT <SEP> (-)
<tb> 28 <SEP> GRA5.5/CAT <SEP> (-)
<tb> 29 <SEP> GRA5.6/CAT <SEP> (-)
<tb> 30 <SEP> GRA5.7/CAT <SEP> (-)
<tb> 31 <SEP> SAG1/2-CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 54 <SEP> aucun <SEP> <SEP> T <SEP> (, <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 42 <SEP> GRA5.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 43 <SEP> SAG1/2-CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb>
TABLEAU IV
<tb> DE <SEP> POT <SEP> PLASMIDE <SEP> ACTIVITE <SEP> CAT
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 16 <SEP> GRA6.1/CAT <SEP> (+)
<tb> 17 <SEP> GRA6.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 18 <SEP> GRA6.3/CAT <SEP> (i) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 34 <SEP> GRA6.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 35 <SEP> GRA6.2/CAT <SEP> (-)
<tb> 36 <SEP> GRA6.3/CAT
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 56 <SEP> aucun <SEP> <SEP> | <SEP> (-) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 52 <SEP> GRA6.1/CAT <SEP> <SEP> | <SEP> (-) <SEP>
<tb>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 16 <SEP> GRA6.1/CAT <SEP> (+)
<tb> 17 <SEP> GRA6.2/CAT <SEP> (+)
<tb> 18 <SEP> GRA6.3/CAT <SEP> (i) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (-), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 34 <SEP> GRA6.1/CAT <SEP> (-) <SEP>
<tb> 35 <SEP> GRA6.2/CAT <SEP> (-)
<tb> 36 <SEP> GRA6.3/CAT
<tb> ADN <SEP> (-) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> TACHYZOITE <SEP> (+)
<tb> 56 <SEP> aucun <SEP> <SEP> | <SEP> (-) <SEP>
<tb> ADN <SEP> (+) <SEP> ; <SEP> <SEP> ELECTROPORATION <SEP> (+), <SEP> CELLULES <SEP> HEP2 <SEP> (+)
<tb> 52 <SEP> GRA6.1/CAT <SEP> <SEP> | <SEP> (-) <SEP>
<tb>
Claims (22)
1) Séquence d'ADN double brin caractérisée en ce qu'elle constitue une séquence consensus nécessaire à la transcription chez les toxoplasmes, et en ce que l'un de ses brins répond à la séquence (I) suivante
5' X1GX2GX3X4G 3' dans laquelle X1 et X2 représentent chacun indépendemment
A, T, ou C, X3 représente A ou C, et X4 représente C ou
T.
2) Promoteur de transcription actif chez les toxoplasmes et caractérisé en ce qu'il comprend au moins une copie d'une séquence d'ADN selon la revendication 1, en orientation inverse.
3) Promoteur selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une seconde copie d'une séquence selon la revendication 1, en orientation directe.
4) Promoteur selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que les copies de la séquence selon la revendication 1 sont séparées par des régions intercalaires de longueur comprise entre 0 et 100 pb.
5) Promoteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la longueur des régions intercalaires est comprise entre 4 et 50 pb.
6) Promoteur selon lune quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend, d'amont en aval, au moins les éléments suivants
- une copie de la séquence selon la revendication 1 en orientation directe
- une copie de la séquence CCAATT
- une copie de la séquence selon la revendication 1 en orientation inverse.
7) Promoteur selon lune quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (A) suivante
(A)
CGTCTCATTGCGGACCAATTCCCGGTCCACCGCTGCGTCTCGACTCGACGGTTGTGA
CCACCCCACTTCGCATTGGGCAGTCGGTAAAGCCAC
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (B) suivante
(B)
AGAGACGCAAAATGAACAGCGGAACCTGCGTCGCTGTCTGTCCTGCGAACTGATGAC
AGAAAGGGTCATTAAA
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (C) suivante
(C)
AGAGACGCACTGACGGTTGACGTCGATCGGCACTCGATCCTACCGTCAG
- un fragment d'ADN comprenant la séquence (D) suivante
(D) TGCGACGCGGAGCAGGAACGGCCGACCTGTACGAAACACGAGTCTCGCGCGTCTCAT
GCAAATGCCCACTGGCTGACTCTTCCCCAT
8) Utilisation d'une séquence d'ADN selon la revendication 1 pour l'obtention d'un promoteur fonctionnel chez un toxoplasme.
9) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend au moins
- un promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et
- un fragment d'ADN comprenant au moins un site de restriction permettant le clonage d'un gène hétérologue sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
10) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par insertion d'au moins un promoteur, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans un vecteur support.
11) Vecteur recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les plasmides suivants, déposés le 30
Novembre 1993 auprès de la CNCM
- le plasmide pGRAl.7/CAT, déposé sous le numéro I-1379
- le plasmide pGRA2.8/CAT, déposé sous le numéro I-1380
- le plasmide pGRA5.7/CAT, déposé sous le numéro I-1381
- le plasmide pGRA6.4/CAT, déposé sous le numéro I-1382
12) Vecteur recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon la revendication 9.
13) Cellule eucaryote ou procaryote, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par transformation d'une cellule hôte par un ADN recombinant comprenant au moins une copie de la séquence d'ADN selon la revendication 1.
14) Cellule transformée selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un promoteur, selon l'une quelconque des revendications 2 à 7.
15) Utilisation d'un fragment d'ADN comprenant au moins une copie d'une séquence selon la revendication 1, comme promoteur pour contrôler l'expression d'au moins un gène hétérologue.
16) Utilisation selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN est constitué par le promoteur de l'un des gènes GRA1, GRA2, ou GRA5 ou
GRA6 de T. gondii.
17) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que l'hôte d'expression dudit gène hétérologue est le toxoplasme.
18) Utilisation selon la revendication 17, caractérisé en ce que le gène hétérologue exprimé code pour un antigène d'un protozoaire parasite.
19) Utilisation selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit protozoaire parasite est un toxoplasme.
20) Cellule transformée selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite cellule est un toxoplasme.
21) Utilisation de toxoplasmes transformés selon la revendication 20 pour la production d'un vaccin.
22) Utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit vaccin est constitué par les toxoplasmes entiers.
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|---|---|
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| WO2013034682A1 (fr) | 2011-09-08 | 2013-03-14 | Umc Utrecht Holding B.V. | Vaccin basé sur la protéine analogue à un superantigène staphylococcique 3 (ssl3) |
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- 1993-12-20 FR FR9315315A patent/FR2714074B1/fr not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| FR2714074B1 (fr) | 1996-03-01 |
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