FR2704235A1 - Séquences nucléotidiques codant pour le récepteur beta3-adrénergique (RAbeta3) bovin et leurs applications. - Google Patents
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Abstract
Séquences nucléotidiques codant pour le récepteur beta3-adrénergique (RAbeta3) bovin, utilisation desdites séquences comme sondes et pour l'expression de peptides et/ou de fragments de ceux-ci ayant une activité de Rabeta3 bovin, vecteur utile pour ladite expression ainsi que les hôtes cellulaires contenant ledit vecteur. Procédé de criblage d'une substance, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des peptides ayant une action de récepteur beta3-adrénergiques, particulièrement sélective vis-à-vis du récepteur bovin.
Description
La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques codant pour le récepteur ss3- adrénergique (RA3) bovin, à l'utilisation desdites séquences comme sondes et pour l'expression de peptides et/ou de fragments de ceux-ci ayant une activité de Rass3 bovin, au vecteur utile pour ladite expression ainsi qu'aux hôtes cellulaires contenant ledit vecteur.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des peptides d'origine bovine ayant une activité de récepteur 53-adrénergique.
Il est connu que les catécholamines telles que l'adrénaline et la noradrénaline, les agonistes synthétiques de ces catécholamines, qui miment leurs fonctions biologiques et les antagonistes, qui bloquent ces fonctions biologiques, exercent leurs effets en se liant à des sites de reconnaissance (récepteurs membranaires) spécifiques, situés sur les membranes cellulaires.
Deux classes principales de récepteurs adrénergiques ont été définies, les récepteurs adrénergiques a et les récepteurs adrénergiques ss.
Dans l'ensemble de ces deux classes, on distingue, maintenant, cinq sous-types de récepteurs aux catécholamines (al, a2, '31, ss 2 et 3RA). Leurs gènes ont été récemment isolés et identifiés (S. COTECCHIA et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7159-7163
B.K. KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656
T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924 ; L.J. EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad.
B.K. KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656
T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924 ; L.J. EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 84, 6995-6999 ; L.J. EMORINE et al., 1989,
Science, 245, 1118-1121). L'analyse de ces gènes a permis de reconnaître leur appartenance à une famille de récepteurs membranaires intégraux présentant certaines homologies (R.A.F. DIXON et al., 1998, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 221-233 ; L.J. EMORINE et al., 1988,
Proc. NATO Adv. Res. Workshop), notamment au niveau de 7 régions transmembranaires, qui sont couplées à des protéines régulatrices, appelées protéines G, susceptibles de fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP).
Science, 245, 1118-1121). L'analyse de ces gènes a permis de reconnaître leur appartenance à une famille de récepteurs membranaires intégraux présentant certaines homologies (R.A.F. DIXON et al., 1998, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 221-233 ; L.J. EMORINE et al., 1988,
Proc. NATO Adv. Res. Workshop), notamment au niveau de 7 régions transmembranaires, qui sont couplées à des protéines régulatrices, appelées protéines G, susceptibles de fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP).
Ces récepteurs membranaires, lorsqu'ils ont fixé le ligand approprié (agoniste ou antagoniste), subissent un changement de conformation, qui induit un signal intracellulaire, qui modifie le comportement de la cellule cible.
Dans le cas des récepteurs ss-adrénergiques, lorsqu'ils se lient avec des agonistes des catécholamines, ils catalysent l'activation d'une classe de protéines G, qui stimule à son tour l'activité de l'adénylate cyclase, alors que les antagonistes des RAss agissent en compétition avec les agonis tes pour la liaison au récepteur et empêchent l'activation de l'adénylate cyclase.
Lorsque l'adénylate cyclase est activée, elle catalyse la production d'un médiateur intracellulaire ou second messager, notamment l'AMP cyclique.
Les Inventeurs ont récemment mis en évidence de nouveaux récepteurs ss-adrénergiques chez l'Homme, dénommés RA-Huss3, et chez la souris (Demande Internationale WO 92/12246), dénommés RA-MuB3, et caractérisés par des propriétés différentes de celles des récepteurs ssl et ss2, notamment en ce qu'ils se comportent de façon différente vis-à-vis de substances respectivement antagonistes et agonis tes des récepteurs ssl et ss2 (Demande Internationale WO 90/08775).
En particulier, le récepteur RA-Huss3 est plus particulièrement constitué par une séquence de 408 aminoacides et est considéré comme comportant sept régions transmembranaires hydrophobes séparées par des boucles hydrophiles intra- et extra-cellulaires et le récepteur RA-Muss3 est constitué par une séquence de 400 aminoacides et comporte également 7 régions transmembranaires.
Les travaux antérieurs concernant le RA-Huss3 et le RA-Muss3 ont particulièrement montré que le récepteur ss3-adrénergique intervient dans les maladies telles que le diabète et/ou l'obésité, dans la mesure où il est exprimé dans des tissus qui jouent un rôle important dans le métabolisme (tissus adipeux, muscles squelettiques notamment)
Poursuivant ses travaux dans cette voie, l'un des Inventeurs a cherché à mettre en évidence un tel récepteur adrénergique ss3 chez les bovins (RA-Boss3), afin de pouvoir disposer d'un outil de régulation de la quantité de graisses chez ces animaux, notamment dans un but d'amélioration de la qualité de la viande.
Poursuivant ses travaux dans cette voie, l'un des Inventeurs a cherché à mettre en évidence un tel récepteur adrénergique ss3 chez les bovins (RA-Boss3), afin de pouvoir disposer d'un outil de régulation de la quantité de graisses chez ces animaux, notamment dans un but d'amélioration de la qualité de la viande.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'ADNc du gène bovin codant pour le récepteur adrénergique ss3 bovin.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence nucléotidique, elle comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en aminoacides de formule (I) suivante
1 CCCAGGCCAGGGAAATCGCTCCCACGCCCCG
Met Pro Pro Pro Leu Ser Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Ser Leu Ile Pro 17
32 ATG CCC CCG CCG CTG AGC AGG GTG AGC TGG GAG ACC CTT TCC CTC ATT CCT
Ser Arg Pro Thr Arg Asp Ala Gly Met Ala Pro Trp Pro Pro Gly Asn Ser 34
83 TCC CGC CCC ACG CGC GAC GCG GGG ATG GCT CCG TGG CCT CCT GGG AAC AGC
Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp Ile Pro Thr Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn 51
134 TCT CTG ACC CCG TGG CCA GAT ATC CCC ACC CTG GCA CCC AAT ACT GCC AAC
Ala Ser Gly Leu Pro Gly Val Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu 68
185 GCG AGT GGG CTG CCA GGG GTG CCC TGG GCG GTG GCG CTG GCG CGC GCG CTG
Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val 85 236 TTG GCG CTA GCG GTG CTG GCC ACC GTG GGA GGC AAC CTG CTG GTA ATC GTG
Ala Ile Ala Arg Thr Pro Arg Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr 102 287 GCC ATC GCC CGG ACG CCG AGA CTC CAG ACC ATG ACC AAC GTG TTC GTG ACT
Ser Leu Ala Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly 119 338 TCG CTG GCC ACA GCC GAC CTG GTG GTG GGG CTC CTG GTC GTG CCC CCG GGG
Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu 136 389 GCC ACG TTG GCG CTG ACC GGC CAC TGG CCC CTG GGC GTC ACC GGT TGC GAG
Leu Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu 153 440 CTG TGG ACC TCA GTG GAC GTG CTG TGT GTG ACC GCC AGC ATC GAA ACC CTG
Cys Ala Leu Ala Val ASp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro LEu Arg Tyr 170 491 TGC GCC GTG GCG GTG GAC CGC TAC CTG GCC GTG ACC AAC CCG CTG CGC TAC
Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu Val Trp 187
542 GGC GCG CTG GTC ACC AAA CGC CGC GCC CTA GCA GCC GTG GTC CTG GTG TGG
Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys Trp Trp Arg 204 593 GTG GTG TCC GCC GCG GTG TCG TTT GCG CCC ATC ATG AGC AAA TGG TGG CGC
Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn Pro Arg Cys Cys 221 644 ATC GGG GCC GAT GCC GAG GCG CAG CGT TGC CAC TCC AAC CCG CGC TGC TGC
Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Ser Ser Val Ser Phe 238 695 ACC TTC GCC TCC AAC ATG CCC TAC GCG CTG CTC TCC TCC TCG GTC TCG TTT
Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr Ala Arg Val Phe Val Val 255
746 TAT CTT CCC CTC CTG GTG ATG CTC TTC GTC TAC GCA CGA GTT TTC GTG GTG
Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro 272
797 GCC ACG CGC GAG CTG CGC TTC CTG CGC CGC GAG CTG GGT CGC TTC CCC CGA
Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly 289
848 GAG GAG TCT CCG CCG GCT CCT TCT CGC TCC GGA TCC CCT GGC CTG GCG GGG
Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val Pro Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ala Arg 306
899 CCG TGC GCC TCG CCC GCG GGG GTG CCC TCC TAC GGC CGC CGC CCC GCG CGC
Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met 323
950 CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG CGC ACC TTG GGG CTC ATC ATG
Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg 340 1001 GGA ACC TTC ACT CTC TGC TGG TTG CCT TTC TTT GTG GTC AAC GTG GTG CGC
Ala Leu Gly Gly Pro Ser Leu Val Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn 357 1052 GCC CTC GGG GGC CCC TCT CTG GTG TCC GGC CCC ACT TTC CTC GCC CTT AAC
Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser 374 1103 TGG CTG GGC TAT GCC AAC TCT GCC TTC AAC CCG CTC ATC TAC TGC CGC AGC
Pro Asp Phe Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu 391 1154 CCC GAC TTT CGC AGC GCC TTC CGC CGC CTG CTG TGT CGC TGC CGC CCC GAG
Glu His Leu Ala Ala Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr 408 1205 GAG CTC GGG GGC GCT GCC TCC CCG CCC CGA GCC CCC TCC GGC GCC CCC ACG
Ala Leu Thr Ser Pro Ala Gly Pro Met Gln Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala 425 1256 GCC CTG ACC AGC CCC GCT GGC CCC ATG CAG CCC CCA GAG CTC GAC GGG GCT
Ser Cys Gly Leu Ser Stop 430 1307 TCC TGC GGA CTT TCT TAG GCCTTGAAGAAACAACTCCATTGATCCGGAACCTTTGGAAAGC 1368 CTCTGGCCGGCCTCGGTTCAGAATGACCCCCGTGGAGTTTCCCAGCTGGAAAACTCTGCCCTCCCCA 1435 GCCTGACGACTGGGTCCTGGGAGGAGGCGCGGGGGCTGACTGGGGAGGGGAAATCCTTACCAAGTGG 1502 GTTTTCGCTCTCTTTCTGAGAGAAGTTTTCTACACCCCAGCCCTGAACTTCACCGCTGCCTCAGCAG 1569 CTCCCGCGTCTGGTTTCCCATGCCCAGGTGCCCGGGCAGGAGCTGGGCTGCGTTTAGCCCCGGGACC 1636 CGCACCTGTCCCACTCGGGTGCTGTGTGCGCAGGGGCAAGGCGGGCACCTTCATTCTGTTCCTTCTG 1703 CCGCCCAGACCCTGAGGAACCCACCGGGGTGCTGGAGGCCCAGGCTGAGAAGAGGAAGGTGGGGAAG 1770 GTCACGGTTTGGGCTTCTGTCCCTGGCTTCCTCACTGTAGACACACCTACCTCACAGCATTTTCAGG 1837 ACTTTACTTTAGCCTTTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCTCCTGGTTTCCTGGGAAGGTGAACCATTA 1904 GAATGGGTCCCTTTTCCTTTTGAATCAAATTAATAAATGTTACTGAATGCAGTTTAAAAAAAAAAAA 1971 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAFLAAAAA
(I)
Dans cette séquence, l'ATG souligné qui se trouve en position 107, correspond probablement au codon d'initiation de la synthèse protéique.
1 CCCAGGCCAGGGAAATCGCTCCCACGCCCCG
Met Pro Pro Pro Leu Ser Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Ser Leu Ile Pro 17
32 ATG CCC CCG CCG CTG AGC AGG GTG AGC TGG GAG ACC CTT TCC CTC ATT CCT
Ser Arg Pro Thr Arg Asp Ala Gly Met Ala Pro Trp Pro Pro Gly Asn Ser 34
83 TCC CGC CCC ACG CGC GAC GCG GGG ATG GCT CCG TGG CCT CCT GGG AAC AGC
Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp Ile Pro Thr Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn 51
134 TCT CTG ACC CCG TGG CCA GAT ATC CCC ACC CTG GCA CCC AAT ACT GCC AAC
Ala Ser Gly Leu Pro Gly Val Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu 68
185 GCG AGT GGG CTG CCA GGG GTG CCC TGG GCG GTG GCG CTG GCG CGC GCG CTG
Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val 85 236 TTG GCG CTA GCG GTG CTG GCC ACC GTG GGA GGC AAC CTG CTG GTA ATC GTG
Ala Ile Ala Arg Thr Pro Arg Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr 102 287 GCC ATC GCC CGG ACG CCG AGA CTC CAG ACC ATG ACC AAC GTG TTC GTG ACT
Ser Leu Ala Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly 119 338 TCG CTG GCC ACA GCC GAC CTG GTG GTG GGG CTC CTG GTC GTG CCC CCG GGG
Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu 136 389 GCC ACG TTG GCG CTG ACC GGC CAC TGG CCC CTG GGC GTC ACC GGT TGC GAG
Leu Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu 153 440 CTG TGG ACC TCA GTG GAC GTG CTG TGT GTG ACC GCC AGC ATC GAA ACC CTG
Cys Ala Leu Ala Val ASp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro LEu Arg Tyr 170 491 TGC GCC GTG GCG GTG GAC CGC TAC CTG GCC GTG ACC AAC CCG CTG CGC TAC
Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu Val Trp 187
542 GGC GCG CTG GTC ACC AAA CGC CGC GCC CTA GCA GCC GTG GTC CTG GTG TGG
Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys Trp Trp Arg 204 593 GTG GTG TCC GCC GCG GTG TCG TTT GCG CCC ATC ATG AGC AAA TGG TGG CGC
Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn Pro Arg Cys Cys 221 644 ATC GGG GCC GAT GCC GAG GCG CAG CGT TGC CAC TCC AAC CCG CGC TGC TGC
Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Ser Ser Val Ser Phe 238 695 ACC TTC GCC TCC AAC ATG CCC TAC GCG CTG CTC TCC TCC TCG GTC TCG TTT
Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr Ala Arg Val Phe Val Val 255
746 TAT CTT CCC CTC CTG GTG ATG CTC TTC GTC TAC GCA CGA GTT TTC GTG GTG
Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro 272
797 GCC ACG CGC GAG CTG CGC TTC CTG CGC CGC GAG CTG GGT CGC TTC CCC CGA
Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly 289
848 GAG GAG TCT CCG CCG GCT CCT TCT CGC TCC GGA TCC CCT GGC CTG GCG GGG
Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val Pro Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ala Arg 306
899 CCG TGC GCC TCG CCC GCG GGG GTG CCC TCC TAC GGC CGC CGC CCC GCG CGC
Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met 323
950 CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG CGC ACC TTG GGG CTC ATC ATG
Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg 340 1001 GGA ACC TTC ACT CTC TGC TGG TTG CCT TTC TTT GTG GTC AAC GTG GTG CGC
Ala Leu Gly Gly Pro Ser Leu Val Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn 357 1052 GCC CTC GGG GGC CCC TCT CTG GTG TCC GGC CCC ACT TTC CTC GCC CTT AAC
Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser 374 1103 TGG CTG GGC TAT GCC AAC TCT GCC TTC AAC CCG CTC ATC TAC TGC CGC AGC
Pro Asp Phe Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu 391 1154 CCC GAC TTT CGC AGC GCC TTC CGC CGC CTG CTG TGT CGC TGC CGC CCC GAG
Glu His Leu Ala Ala Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr 408 1205 GAG CTC GGG GGC GCT GCC TCC CCG CCC CGA GCC CCC TCC GGC GCC CCC ACG
Ala Leu Thr Ser Pro Ala Gly Pro Met Gln Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala 425 1256 GCC CTG ACC AGC CCC GCT GGC CCC ATG CAG CCC CCA GAG CTC GAC GGG GCT
Ser Cys Gly Leu Ser Stop 430 1307 TCC TGC GGA CTT TCT TAG GCCTTGAAGAAACAACTCCATTGATCCGGAACCTTTGGAAAGC 1368 CTCTGGCCGGCCTCGGTTCAGAATGACCCCCGTGGAGTTTCCCAGCTGGAAAACTCTGCCCTCCCCA 1435 GCCTGACGACTGGGTCCTGGGAGGAGGCGCGGGGGCTGACTGGGGAGGGGAAATCCTTACCAAGTGG 1502 GTTTTCGCTCTCTTTCTGAGAGAAGTTTTCTACACCCCAGCCCTGAACTTCACCGCTGCCTCAGCAG 1569 CTCCCGCGTCTGGTTTCCCATGCCCAGGTGCCCGGGCAGGAGCTGGGCTGCGTTTAGCCCCGGGACC 1636 CGCACCTGTCCCACTCGGGTGCTGTGTGCGCAGGGGCAAGGCGGGCACCTTCATTCTGTTCCTTCTG 1703 CCGCCCAGACCCTGAGGAACCCACCGGGGTGCTGGAGGCCCAGGCTGAGAAGAGGAAGGTGGGGAAG 1770 GTCACGGTTTGGGCTTCTGTCCCTGGCTTCCTCACTGTAGACACACCTACCTCACAGCATTTTCAGG 1837 ACTTTACTTTAGCCTTTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCTCCTGGTTTCCTGGGAAGGTGAACCATTA 1904 GAATGGGTCCCTTTTCCTTTTGAATCAAATTAATAAATGTTACTGAATGCAGTTTAAAAAAAAAAAA 1971 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAFLAAAAA
(I)
Dans cette séquence, l'ATG souligné qui se trouve en position 107, correspond probablement au codon d'initiation de la synthèse protéique.
Il existe 85 % d'homologie entre les séquences nucléotidiques bovine et humaine codant pour le récepteur adrénergique ss3 et il existe 76 % d'homologie entre les séquences nucléotidiques bovine et murine codant pour le récepteur adrénergique ss3.
Ladite séquence comprend notamment les sites de restriction uniques suivants
Bpu1102 I, Fok I, EcoR V, Bcg I, Nhe I,
BspM I, Afl III, Age I, BstE II, BspH I, Bsg I, Nsp I,
Nsp7524 I, NspC I, Sap I, BamH I, BstY I, Asc I, Sty I,
Hinc II, Apa I, Bsp120 I, Bbe I, Ehe I, Kas I, Nar I,
Ec1136 I, Sac I, Stu I, Fse I, Drd I, Tthlll I, Srf I,
Bsu36 I, Sfc I, BstX I, Ase I, Bsm I, Dra I.
Bpu1102 I, Fok I, EcoR V, Bcg I, Nhe I,
BspM I, Afl III, Age I, BstE II, BspH I, Bsg I, Nsp I,
Nsp7524 I, NspC I, Sap I, BamH I, BstY I, Asc I, Sty I,
Hinc II, Apa I, Bsp120 I, Bbe I, Ehe I, Kas I, Nar I,
Ec1136 I, Sac I, Stu I, Fse I, Drd I, Tthlll I, Srf I,
Bsu36 I, Sfc I, BstX I, Ase I, Bsm I, Dra I.
L'invention a également pour objet les frag ments de ladite séquence, utiles pour l'expression du peptide correspondant et/ou la détection du gène bovin codant pour le récepteur adrénergique ss3 bovin.
Parmi lesdits fragments, on peut citer
- le fragment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 218-295 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM1,
- le fragment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 332-403 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM2,
- le fragment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 434-499 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM3,
- le fragment de 69 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 572-640 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM4,
- le fragment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 713-784 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM5,
- le fragment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 983-1048 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM6,
- le fragment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1070-1147 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM7.
- le fragment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 218-295 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM1,
- le fragment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 332-403 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM2,
- le fragment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 434-499 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM3,
- le fragment de 69 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 572-640 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM4,
- le fragment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 713-784 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM5,
- le fragment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 983-1048 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM6,
- le fragment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1070-1147 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM7.
La présente invention a également pour objet des clones d'ADNc, caractérisés en ce qu'ils comprennent un fragment de séquence codant pour le récepteur ss3 bovin (RA-Boss3).
Conformément à l'invention, le clone dénommé
M13-6.6 comprend 2979 paires de bases, inclut la séquence de formule I et comprend les sites de restriction uniques suivants : EcoR V, Bcg I, Nhe I, BstE II, BspH I, Bsg I,
Sap I, BamH I, Asc I, Stu I, Fse I, Drd I, Srf I, Sfc I,
Ase I, Bsm I, Dra I, Bspl407 I, Csp6 I, Rsa I, Ssp I,
Dra III, Bgl II, Afl II, Spe I, Tfi I, Hpa I, Nde I,
EcoN I, BsaB I, Pvu I.
M13-6.6 comprend 2979 paires de bases, inclut la séquence de formule I et comprend les sites de restriction uniques suivants : EcoR V, Bcg I, Nhe I, BstE II, BspH I, Bsg I,
Sap I, BamH I, Asc I, Stu I, Fse I, Drd I, Srf I, Sfc I,
Ase I, Bsm I, Dra I, Bspl407 I, Csp6 I, Rsa I, Ssp I,
Dra III, Bgl II, Afl II, Spe I, Tfi I, Hpa I, Nde I,
EcoN I, BsaB I, Pvu I.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ou un fragment de celle-ci, marquée à laide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
Lesdites sondes nucléotidiques sont caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus mais ne s'hybrident pas avec les gènes codant pour les récepteurs 51 et 52 adrénergiques, ni avec l'ARN messager desdits récepteurs 51 et 52 adrénergiques.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite sonde, sa séquence est homologue ou complémentaire de celle d'un segment d'au moins 10 pb de la séquence I.
Au sens de la présente invention, "séquence homologue" englobe non seulement les séquences identiques à la séquence I, ou à un fragment de celle-ci, mais également celles n'en différant que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de nucléotides, à condition que les séquences ainsi modifiées aient une spécificité d'hybridation équivalente à celle de la séquence (I) ou du segment non modifié considéré.
De même, on entend par "séquence complémentaire", non seulement les séquences strictement complémentaires de la séquence (I) ou de ses segments, mais également des séquences modifiées, comme indiqué précédemment, possédant une spécificité d'hybridation équivalente à celle des dites séquences strictement complémentaires.
Les conditions d'hybridation sont définies comme suit
Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, les conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes 750 mM de NaCl, 75 mM de Tris-sodium citrate, 50 fg/ml d'ADN de sperme de saumon, 50 mM de phosphate de sodium, 1 mM de pyrophosphate de sodium, 100 iM d'ATP, 10 à 25 % de formamide, 1 % Ficoll ("PHARMACIA" poids moléculaire moyen de 400,00), 1 % de polyvinylpyrrolidone, 1 % de sérum albumine bovine, pendant 14 à 16 h à 42 C.
Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, les conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes 750 mM de NaCl, 75 mM de Tris-sodium citrate, 50 fg/ml d'ADN de sperme de saumon, 50 mM de phosphate de sodium, 1 mM de pyrophosphate de sodium, 100 iM d'ATP, 10 à 25 % de formamide, 1 % Ficoll ("PHARMACIA" poids moléculaire moyen de 400,00), 1 % de polyvinylpyrrolidone, 1 % de sérum albumine bovine, pendant 14 à 16 h à 42 C.
Pour les sondes les plus longues, c'est-à-dire présentant plus d'environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont celles indiquées précédemment pour les sondes les plus courtes, mais dans lesquelles le milieu sus-défini contient 40 % de formamide au lieu de 10 à 25 % de formamide.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite sonde peut être avantageusement définie par l'une quelconque des séquences nucléotidiques ci-dessus et notamment par le fragment de 2 kbases, qui correspond à la totalité de la séquence de formule I.
La présente invention a également pour objet un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus et en ce qu'il présente une activité de récepteur ss3-adrénergique.
Une activité de récepteur ss3-adrénergique est celle définie dans la Demande de Brevet français n 89 00918, à savoir que, lorsque le fragment est exposé à la surface d'une cellule, il est capable de participer à l'activation de l'adénylate cyclase en présence d'un des agonistes suivants : BRL 28410, BRL 37344,
CGP 12177A, (l)-isoprotérénol et carazolol ; soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur adrénergique pl, ni le récepteur adrénergique ss2 ; soit il est susceptible de gé nérer des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur ss1, ni le récepteur ss2.
CGP 12177A, (l)-isoprotérénol et carazolol ; soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur adrénergique pl, ni le récepteur adrénergique ss2 ; soit il est susceptible de gé nérer des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur ss1, ni le récepteur ss2.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il comprend 405 amino-acides et présente la séquence en amino-acides de formule II suivante BETA3~BOV MAPWPPGNSSLTPWPDIPTLAPNTANASGLPGVPWAVALAGALLALAVLATVGGNLLVIV
TM1
BETA3~BOV AIARTPRLQTMTNVFTVSLATADLVVGLLVVPPGATLALTGHWPLGVTGCELWTSVDVLG
TM2 TM3
BWTA3~BOV VTASIETLCALAVDRYLAVTNPLRYGALVTKRRALAAVVLWVVSAAVSFAPIMSKWWIHI
TM4
BETA3~BOV GADAEAQRCHSNPROOTFASNMPYALLSSSVSFYLPLLVMLFVYARVFVVATRQLRLLPH
TM5
BETA3-BOV ELGRFPPEESPPAPSRSGSPGLAGPCASPAGVPSYGRRPARLLPLREHRALRTLGLIMMM
BETA3~BOV FTLCWLPFFVVNVVRALGGPSLVSGPTFLALNWLGYANSAFNPLIYCRSPDFFSAFRMLI
TM6 TM7
BETA3~BOV CRORPEEHLAAAGPPRAPSGAPTALTSPAGHMVFTELDGASCGLS (II)
Ce peptide est dénommé ci-après récepteur ss3- andrénergique bovin (RA-Boss3)
L'invention comprend également les peptides variants de ceux définis ci-dessus, qui comportent certaines mutations, sans que les peptides ne perdent les propriétés de récepteur ss3-adrénergique.
TM1
BETA3~BOV AIARTPRLQTMTNVFTVSLATADLVVGLLVVPPGATLALTGHWPLGVTGCELWTSVDVLG
TM2 TM3
BWTA3~BOV VTASIETLCALAVDRYLAVTNPLRYGALVTKRRALAAVVLWVVSAAVSFAPIMSKWWIHI
TM4
BETA3~BOV GADAEAQRCHSNPROOTFASNMPYALLSSSVSFYLPLLVMLFVYARVFVVATRQLRLLPH
TM5
BETA3-BOV ELGRFPPEESPPAPSRSGSPGLAGPCASPAGVPSYGRRPARLLPLREHRALRTLGLIMMM
BETA3~BOV FTLCWLPFFVVNVVRALGGPSLVSGPTFLALNWLGYANSAFNPLIYCRSPDFFSAFRMLI
TM6 TM7
BETA3~BOV CRORPEEHLAAAGPPRAPSGAPTALTSPAGHMVFTELDGASCGLS (II)
Ce peptide est dénommé ci-après récepteur ss3- andrénergique bovin (RA-Boss3)
L'invention comprend également les peptides variants de ceux définis ci-dessus, qui comportent certaines mutations, sans que les peptides ne perdent les propriétés de récepteur ss3-adrénergique.
Parmi ces variants, on peut mentionner ceux qui sont reconnus par des anticorps reconnaissant les régions transmembranaires, ainsi que ceux qui sont reconnus par des anticorps reconnaissant les régions autres que les régions transmembranaires.
La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments du RA Boys3, conforme à l'invention, et notamment
- un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 38-63 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM1,
- un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 76-99 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM2,
- un fragment 22 amino-acides, correspondant au segment 110-131 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM3,
- un fragment de 23 amino-acides, correspondant au segment 156-178 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM4,
- un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 203-226 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM5,
- un fragment de 22 amino-acides, correspondant au segment 293-314 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM6,
- un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 322-347 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM7.
- un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 38-63 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM1,
- un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 76-99 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM2,
- un fragment 22 amino-acides, correspondant au segment 110-131 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM3,
- un fragment de 23 amino-acides, correspondant au segment 156-178 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM4,
- un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 203-226 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM5,
- un fragment de 22 amino-acides, correspondant au segment 293-314 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM6,
- un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 322-347 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM7.
Lesdits fragments peuvent avantageusement être obtenus par synthèse, notamment par la méthode de Merri fiels
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
On entend, au sens de la présente invention, par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cosmide, qu'un phage.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant approprié, comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçues ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence tels que définis ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptide ayant une activité de récepteur ss3 adrénergique bovin.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un vecteur d'expression pRc/CMV dans lequel est insérée, au niveau du lieur multisite, au moins le fragment codant pour le récepteur ss3-adrénergique bovin ; un tel plasmide a été dénommé pRc/CMV-Boss3-ADR, et a été déposé auprès de la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 15 avril 1993 sous le n I-1297.
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 15 avril 1993 sous le n I-1297.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention.
Une telle cellule est capable d'exprimer un peptide, d'origine bovine, ayant une activité de récepteur '33 -adrénergique.
Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment constituée par les cellules de la lignée CHO (Chinese Hamster Ovary).
Un autre des microorganismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment Escherichia coli
Il n'était pas évident que les bovins aient des récepteurs ss3-adrénergiques, dont l'activation permet, de manière inattendue, de réguler la quantité et la qualité des graisses, ce qui permet d'améliorer la qualité de la viande bovine
De manière avantageuse, les récepteurs ss3- adrénergiques bovins conformes à l'invention constituent un outil pour la sélection de ligands intervenant dans l'activation de ces récepteurs et permettent d'identifier et de sélectionner des ligands ss-adrénergiques spécifiques des récepteurs ss3-adrénergiques et en particulier des ligands plus affins et plus sélectifs pour le récepteur ss3-adrénergique bovin que pour le récepteur ss3- adrénergique humain.
Il n'était pas évident que les bovins aient des récepteurs ss3-adrénergiques, dont l'activation permet, de manière inattendue, de réguler la quantité et la qualité des graisses, ce qui permet d'améliorer la qualité de la viande bovine
De manière avantageuse, les récepteurs ss3- adrénergiques bovins conformes à l'invention constituent un outil pour la sélection de ligands intervenant dans l'activation de ces récepteurs et permettent d'identifier et de sélectionner des ligands ss-adrénergiques spécifiques des récepteurs ss3-adrénergiques et en particulier des ligands plus affins et plus sélectifs pour le récepteur ss3-adrénergique bovin que pour le récepteur ss3- adrénergique humain.
Conformément à l'invention, le procédé de sélection et d'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un peptide (récepteur ss3-adrénergique bovin) conforme à l'invention comprend
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, laquelle cellule hôte exprime ledit peptide bovin (récepteur adrénergique ss3 bovin), le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance s'il y a lieu, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-peptide.
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, laquelle cellule hôte exprime ledit peptide bovin (récepteur adrénergique ss3 bovin), le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance s'il y a lieu, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-peptide.
Un tel procédé permet la sélection, soit de ligands spécifiques du récepteur ss3-adrénergique, soit de ligands spécifiques du récepteur ss3-adrénergique bovin exclusivement.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, avec référence aux dessins annexés dans lesquels
- la figure la représente la carte de restriction du fragment codant de 2 000 pb, qui correspond à la formule I
- la figure lb représente la carte de restriction du clone 6.6 qui contient le gène ss3-adrénergique bovin et comprend 3 kb, en tout
- la figure 2 est une comparaison des récepteurs ss3 humain, murin (souris et rat) et bovin
- la figure 3 représente une comparaison des séquences codantes pour le RA-Huss3 et le RA-B3 bovin
- la figure 4 représente le vecteur d'expres sion pRc/CMV-Boss3-ADR ;;
- la figure 5 représente le vecteur d'expression pRc/CMV incluant un lieur multisite comprenant les sites uniques de restriction suivants : Hind III, BstX I,
Not I, Xba I et Apa I.
- la figure la représente la carte de restriction du fragment codant de 2 000 pb, qui correspond à la formule I
- la figure lb représente la carte de restriction du clone 6.6 qui contient le gène ss3-adrénergique bovin et comprend 3 kb, en tout
- la figure 2 est une comparaison des récepteurs ss3 humain, murin (souris et rat) et bovin
- la figure 3 représente une comparaison des séquences codantes pour le RA-Huss3 et le RA-B3 bovin
- la figure 4 représente le vecteur d'expres sion pRc/CMV-Boss3-ADR ;;
- la figure 5 représente le vecteur d'expression pRc/CMV incluant un lieur multisite comprenant les sites uniques de restriction suivants : Hind III, BstX I,
Not I, Xba I et Apa I.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Isolement et identification du gène ss3- adrénergique bovin.
- Précaration d'ARN
Le gène ss3-adrénergique bovin a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de tissu adipeux brun de veau, construite dans le bactériophage Xgtll.
Le gène ss3-adrénergique bovin a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de tissu adipeux brun de veau, construite dans le bactériophage Xgtll.
Pour ce faire, les ARN totaux sont extraits de tissu adipeux brun de veau, par la méthode utilisant le thiocyanate de guanidium, puis on purifie les ARN messagers poly A+ à l'aide de colonnes oligo(dT) (Pharmacia réf.: 27-9258-01).
Les ARN totaux et les ARN messagers ont été analysés en Northern blot pour vérifier la présence et la taille des messagers du gène recherché. Après électrophorèse, 1'ARN a été transféré sur une membrane de nylon chargée positivement (Amersham Hybonds N+ réf. RPN 203B).
Cette membrane est ensuite hybridée avec une sonde radiomarquée (radiomarquage voir criblage des phages recombinants, ci-après), constituée par un fragment d'ADN de 2900 paires de bases contenant la totalité du gène ss3- adrénergique murin précédemment isolé dans le laboratoire (NAHMIAS et al., 1991, EMBO J., 10, 3721-3727 ; Demande
Internationale WO 92/12246). Après hybridation avec la sonde radiomarquée, les filtres sont lavés et exposés pendant plusieurs jours sur film d'autoradiographie (KODAK X-OMAT AR), on observe un fragment d'environ 2,0 kilobases, aussi bien dans la fraction d'ARN totaux que dans la fraction des ARN messagers purifiés.Ceci confirme que le gène correspondant au récepteur ss3- adrénergique est exprimé dans le tissu adipeux brun de veau et que l'on peut construire la banque d'ADNc à partir de ces ARN messagers poly A+ purifiés.
Internationale WO 92/12246). Après hybridation avec la sonde radiomarquée, les filtres sont lavés et exposés pendant plusieurs jours sur film d'autoradiographie (KODAK X-OMAT AR), on observe un fragment d'environ 2,0 kilobases, aussi bien dans la fraction d'ARN totaux que dans la fraction des ARN messagers purifiés.Ceci confirme que le gène correspondant au récepteur ss3- adrénergique est exprimé dans le tissu adipeux brun de veau et que l'on peut construire la banque d'ADNc à partir de ces ARN messagers poly A+ purifiés.
Pour vérifier que la source d'ARN est bien du tissu adipeux brun, le Northern blot obtenu ci-dessus a été hybridé avec une sonde radiomarquée correspondant au gène de la protéine découplante humaine (hUCP). Cette protéine est seulement présente dans ce type de tissu adipeux, et peut être considérée comme une sorte de "marqueur" du tissu adipeux brun. Avec cette sonde, un signal fortement positif est décelé.
- Svnthèse d'ADNc
On synthétise ensuite l'ADNc correspondant, en prenant comme matrice les ARN messagers poly A+ purifiés, et comme amorce pour la synthèse du premier brin un primer oligo(dT)15 provenant du kit "RiboClone cDNA synthesis system" (Promega réf. C 2100). La synthèse du premier brin d'ADNc se fait en présence d'AMV réverse transcriptase, et la synthèse du deuxième brin est réalisée à l'aide de deux enzymes agissant simultanément (E. coli polymérase I et E. coli RNase H). Ensuite l'ADNc double brin est traité par la T4 DNA polymérase, afin d'obtenir des bouts francs. Le kit Promega C 2100 est utilisé pour l'ensemble de ces réactions.
On synthétise ensuite l'ADNc correspondant, en prenant comme matrice les ARN messagers poly A+ purifiés, et comme amorce pour la synthèse du premier brin un primer oligo(dT)15 provenant du kit "RiboClone cDNA synthesis system" (Promega réf. C 2100). La synthèse du premier brin d'ADNc se fait en présence d'AMV réverse transcriptase, et la synthèse du deuxième brin est réalisée à l'aide de deux enzymes agissant simultanément (E. coli polymérase I et E. coli RNase H). Ensuite l'ADNc double brin est traité par la T4 DNA polymérase, afin d'obtenir des bouts francs. Le kit Promega C 2100 est utilisé pour l'ensemble de ces réactions.
Ensuite, des adaptateurs comportant des sites
EcoRI sont ajoutés, afin de pouvoir insérer l'ADNc obtenu dans le bactériophage Agt11, dans les conditions suivantes, décrites dans le kit EcoR I Adaptor Ligation System I (Promega, réf.: C 1900)
l'ADNc est centrifugé à travers une matrice Sephacryls S-400 (kit) pour éliminer les molécules de petite taille ; puis les adaptateurs sont ajoutés à l'ADNc par ligature, en présence de T4 ADN ligase, pendant une nuit et une deuxième centrifugation est effectuée à travers une colonne SephacrylX S-400, de manière à éliminer les adaptateurs non fixés.
EcoRI sont ajoutés, afin de pouvoir insérer l'ADNc obtenu dans le bactériophage Agt11, dans les conditions suivantes, décrites dans le kit EcoR I Adaptor Ligation System I (Promega, réf.: C 1900)
l'ADNc est centrifugé à travers une matrice Sephacryls S-400 (kit) pour éliminer les molécules de petite taille ; puis les adaptateurs sont ajoutés à l'ADNc par ligature, en présence de T4 ADN ligase, pendant une nuit et une deuxième centrifugation est effectuée à travers une colonne SephacrylX S-400, de manière à éliminer les adaptateurs non fixés.
Avant d'insérer lADNc ainsi traité dans le vecteur Agt11, on phosphoryle les adaptateurs, en présence de T4 polynucléotide kinase.
- Insertion de l'ADNc dans le bactériophage tii
Le bactériophage kgtll, utilisé comme vecteur, provient du kit "Protoclone Lambda gtll System" (Promega réf. T 301/0-2). L'ADN du phage est digéré par EcoRI et déphosphorylé. La déphosphorylation empêche le vecteur de se refermer sur lui-même.
Le bactériophage kgtll, utilisé comme vecteur, provient du kit "Protoclone Lambda gtll System" (Promega réf. T 301/0-2). L'ADN du phage est digéré par EcoRI et déphosphorylé. La déphosphorylation empêche le vecteur de se refermer sur lui-même.
On effectue plusieurs ligations avec des quantités variables de l'ADNc obtenu, avec 0,5 g d'ADN de vecteur, dans les conditions suivantes, pour chaque liga tion : pendant 3 heures à température ambiante, en présence de T4 ADN ligase (kit Promega C1900).
On procède ensuite à une encapsidation in vitro, à l'aide des extraits "Packagene" présents dans le kit Promega T301/0-2.
Après une incubation à 22 C, durant 2 heures, les particules de phages reconstituées sont utilisées pour infecter des bactéries, notamment la souche
Y1090(r-) (Genotype : A(lacU169), proA+, A(lon), araD139, strA, supF, (trpC22::TnlO), (pMC9), hsd(r-, m+)), dans les conditions suivantes : on dilue très fortement (1/1 000 ou 1/10 000) les phages encapsidés ; chaque dilution de phages est incubée avec des cellules
Y1090(r-) à 37 C, durant 30 minutes, et ensuite, ces bactéries infectées sont étalées sur un milieu nutritif (LB agar) contenu dans des boîtes de Pétri.Les boîtes sont incubées une nuit à 37 C, et le lendemain, on observe des plages de lyse, chaque plage correspond à un phage recombinant En comptant les nombres de plages de lyse et en multipliant avec le facteur de dilution donné, le titre de la banque d'ADNc est déterminé et est d'environ 4 millions de phages recombinants. Le bruit de fond du vecteur seul sans insert est de 3,5 %, ce qui est tout à fait acceptable.
Y1090(r-) (Genotype : A(lacU169), proA+, A(lon), araD139, strA, supF, (trpC22::TnlO), (pMC9), hsd(r-, m+)), dans les conditions suivantes : on dilue très fortement (1/1 000 ou 1/10 000) les phages encapsidés ; chaque dilution de phages est incubée avec des cellules
Y1090(r-) à 37 C, durant 30 minutes, et ensuite, ces bactéries infectées sont étalées sur un milieu nutritif (LB agar) contenu dans des boîtes de Pétri.Les boîtes sont incubées une nuit à 37 C, et le lendemain, on observe des plages de lyse, chaque plage correspond à un phage recombinant En comptant les nombres de plages de lyse et en multipliant avec le facteur de dilution donné, le titre de la banque d'ADNc est déterminé et est d'environ 4 millions de phages recombinants. Le bruit de fond du vecteur seul sans insert est de 3,5 %, ce qui est tout à fait acceptable.
- Criblage des chapes recombinants
En se basant sur les résultats obtenus, environ 200 000 phages ont été étalés sur boîte de Pétri (milieu LB agar), afin de pouvoir les cribler avec une sonde radiomarquée, dans les conditions suivantes
- souche bactérienne utilisée : LE 392 (Genotype : F-, hsdR 574 (r-, m+), supE44, supF58, lacYl or A(laclZY)6, galk2, galT22, met1, trpR55, h-).
En se basant sur les résultats obtenus, environ 200 000 phages ont été étalés sur boîte de Pétri (milieu LB agar), afin de pouvoir les cribler avec une sonde radiomarquée, dans les conditions suivantes
- souche bactérienne utilisée : LE 392 (Genotype : F-, hsdR 574 (r-, m+), supE44, supF58, lacYl or A(laclZY)6, galk2, galT22, met1, trpR55, h-).
- sonde : fragment d'ADN de 2900 paires de bases (gène 3-adrénergique murin), tel que précisé cidessus pour le Northern Blot, radiomarqué par Random priming (Kit Boehringer réf. 1004 760), en incorporant 50 Ci de dATP (a32P) et 50 RCi de dCTP (a32P) (références Amersham : PB 10204 et PB 10205).
Après transfert de 1'ADN des plages de lyse sur des membranes HybondX N+ (Amersham réf. RPN 132B), ces dernières sont hybridées avec la sonde radiomarquée, puis lavées et exposées une nuit sur film d'autoradiographie.
17 signaux d'hybridation ont été observés, dont 11 se sont, par la suite, révélés être des faux positifs. Ces 6 clones restant (1, 3, 5, 6, 8 et 9) ont été purifiés par quatre isolements successifs, suivis d'une hybridation avec la sonde ss3-adrénergique murine décrite ci-dessus.
- Analvse des clones positifs
Pour identifier le(s) clone(s) contenant le gène 3-adrénergique bovin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, 2 méthodes ont été utilisées : l'amplification par PCR et la coupure par une endonucléase de restriction, avec le but de trouver parmi les clones positifs celui qui comporte l'insert le plus grand.
Pour identifier le(s) clone(s) contenant le gène 3-adrénergique bovin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, 2 méthodes ont été utilisées : l'amplification par PCR et la coupure par une endonucléase de restriction, avec le but de trouver parmi les clones positifs celui qui comporte l'insert le plus grand.
1) L'amplification par PCR a été faite sur lysat de phages (particules de phages encapsidées) à l'aide des deux amorces suivantes
1218 : amorce kgtll (brin sens) de 24 mers, de formule : 5' d(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3', et
1222 : amorce kgtll (brin anti-sens) de 24 mers également, de formule : 5' d(TTGACACCAGACCAACTGGTAATG)3' (New England Biolabs).
1218 : amorce kgtll (brin sens) de 24 mers, de formule : 5' d(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3', et
1222 : amorce kgtll (brin anti-sens) de 24 mers également, de formule : 5' d(TTGACACCAGACCAACTGGTAATG)3' (New England Biolabs).
Etant donné que ces amorces s'hybrident de part et d'autre du site d'insertion de l'ADNc dans le phage, il a été possible de connaître ainsi la taille des fragments insérés dans les différents clones positifs.
2) L'ADN des 6 phages intéressants a été préparé et coupé par l'enzyme de restriction EcoRi, afin de vérifier la taille des inserts ; l'hybridation avec la sonde 3-adrénergique murine a permis de déceler le clone comportant le plus grand insert positif.
Issu de ces deux approches, le clone n 6 a été choisi pour une analyse plus poussée étant donnée qu ' il comporte le plus grand insert d'ADNc recherché (3 kilobases).
Après coupure du phage X par l'enzyme de restriction EcoR I, le fragment comportant l'ADNc a été inséré dans le bactériophage M13 tg 131 afin de pouvoir séquencer le gène.
EXEMPLE 2 : Séquençage du gène 53-adrénergique bovin.
On a séquencé le fragment d'ADN d'environ 3 kb délimité par les sites de l'enzyme EcoR I.
Ce fragment d'ADN a été purifié à partir de l'ADN du clone 6 et sous-cloné dans le site EcoR I du vecteur M13tgl31. Les clones M13 ayant intégrés le fragment d'ADN dans les 2 orientations opposées (6.3 et 6.6) ont été identifiés et séquencés.
Pour effectuer les réactions de séquençage, le kit USB Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical réf.: 70770) a été utilise.
La séquence a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques, qui s'hybrident sur le brin sens (clone M13-6.6) ou sur le brin anti-sens (clone M13-6.3).
Ces amorces sont représentées dans les Tableaux I et II ci-après.
TABLEAU I
<tb> N <SEP> Séq. <SEP> N <SEP> des <SEP> oligo- <SEP> Séquence <SEP> oligonucléotique
<tb> <SEP> nucléotides
<tb> <SEP> 1 <SEP> A-l <SEP> 5' <SEP> ACCCAATACTGCCAACGCGAG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 2 <SEP> G-3 <SEP> 5' <SEP> GTTGGCGCTGACCGGCCACTGG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 3 <SEP> A-3 <SEP> 5' <SEP> ATCATGAGCAAATGGTGGCGCAT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 4 <SEP> A-7 <SEP> 5' <SEP> AGAGGAGTCTCCGCCGGCTCCTT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 5 <SEP> A-12 <SEP> 5' <SEP> TTCAACCCGCTCATCTA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 6 <SEP> A-18 <SEP> 5' <SEP> AGCCTGACGACTGGGTC <SEP> 3'
<tb> <SEP> 7 <SEP> A-20 <SEP> 5' <SEP> TTCCTTCTGCCGCCCAGA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 8 <SEP> A-24 <SEP> 5' <SEP> CGACAGCAACGGAATT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 9 <SEP> A-17 <SEP> 5' <SEP> TGTCCCTTTTGCACAGCAAAA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 10 <SEP> A-16 <SEP> 5' <SEP> CAAGGGTCTGAATCTGAGGTAAA <SEP> 3 <SEP>
<tb> <SEP> 11 <SEP> A-15 <SEP> 5' <SEP> AGCCATATGTATGGGTGTAGA <SEP> 3'
<tb>
TABLEAU II
<tb> <SEP> nucléotides
<tb> <SEP> 1 <SEP> A-l <SEP> 5' <SEP> ACCCAATACTGCCAACGCGAG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 2 <SEP> G-3 <SEP> 5' <SEP> GTTGGCGCTGACCGGCCACTGG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 3 <SEP> A-3 <SEP> 5' <SEP> ATCATGAGCAAATGGTGGCGCAT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 4 <SEP> A-7 <SEP> 5' <SEP> AGAGGAGTCTCCGCCGGCTCCTT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 5 <SEP> A-12 <SEP> 5' <SEP> TTCAACCCGCTCATCTA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 6 <SEP> A-18 <SEP> 5' <SEP> AGCCTGACGACTGGGTC <SEP> 3'
<tb> <SEP> 7 <SEP> A-20 <SEP> 5' <SEP> TTCCTTCTGCCGCCCAGA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 8 <SEP> A-24 <SEP> 5' <SEP> CGACAGCAACGGAATT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 9 <SEP> A-17 <SEP> 5' <SEP> TGTCCCTTTTGCACAGCAAAA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 10 <SEP> A-16 <SEP> 5' <SEP> CAAGGGTCTGAATCTGAGGTAAA <SEP> 3 <SEP>
<tb> <SEP> 11 <SEP> A-15 <SEP> 5' <SEP> AGCCATATGTATGGGTGTAGA <SEP> 3'
<tb>
TABLEAU II
<tb> N <SEP> Séq. <SEP> N <SEP> des <SEP> oligo- <SEP> Séquence <SEP> oligonucléotique
<tb> <SEP> nucléotides
<tb> <SEP> 1 <SEP> A-2 <SEP> 5' <SEP> TCTACACCCATACATATGGCT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 2 <SEP> A-4 <SEP> 5' <SEP> TTTACCTCAGATTCAGACCCTTG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 3 <SEP> A-6 <SEP> 5' <SEP> TTTTGCTGTGCAAAAGGGACA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 4 <SEP> A-23 <SEP> 5' <SEP> AAACTGCATTCAGTAACATTT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 5 <SEP> A-21 <SEP> 5' <SEP> ACAGCACCCGAGTGGGACA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 6 <SEP> A-19 <SEP> 5' <SEP> GACCCAGTCGTCAGGCT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 7 <SEP> A-14 <SEP> 5' <SEP> GGAAGGCGCTCCGAAAGT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 8 <SEP> A-13 <SEP> 5' <SEP> GCCGGCGGAGACTCCTCT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 9 <SEP> A-10 <SEP> 5' <SEP> GTGCGTAGACGAAGAGCATCA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 10 <SEP> G-4 <SEP> 5' <SEP> CCCACACCAGGACCACGGCTG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 11 <SEP> A-5 <SEP> 5' <SEP> ATGGCCACGATTACCAGCAGGTT <SEP> 3'
<tb>
Le Tableau I illustre les oligonucléotides synthétisés pour séquencer le brin sens 6.6 (ordre séquentiel des oligonucléotides) et le Tableau II illustre les oligonucléotides synthétisés pour séquencer le brin anti-sens 6.3 (ordre séquentiel des oligonucléotides).
<tb> <SEP> nucléotides
<tb> <SEP> 1 <SEP> A-2 <SEP> 5' <SEP> TCTACACCCATACATATGGCT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 2 <SEP> A-4 <SEP> 5' <SEP> TTTACCTCAGATTCAGACCCTTG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 3 <SEP> A-6 <SEP> 5' <SEP> TTTTGCTGTGCAAAAGGGACA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 4 <SEP> A-23 <SEP> 5' <SEP> AAACTGCATTCAGTAACATTT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 5 <SEP> A-21 <SEP> 5' <SEP> ACAGCACCCGAGTGGGACA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 6 <SEP> A-19 <SEP> 5' <SEP> GACCCAGTCGTCAGGCT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 7 <SEP> A-14 <SEP> 5' <SEP> GGAAGGCGCTCCGAAAGT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 8 <SEP> A-13 <SEP> 5' <SEP> GCCGGCGGAGACTCCTCT <SEP> 3'
<tb> <SEP> 9 <SEP> A-10 <SEP> 5' <SEP> GTGCGTAGACGAAGAGCATCA <SEP> 3'
<tb> <SEP> 10 <SEP> G-4 <SEP> 5' <SEP> CCCACACCAGGACCACGGCTG <SEP> 3'
<tb> <SEP> 11 <SEP> A-5 <SEP> 5' <SEP> ATGGCCACGATTACCAGCAGGTT <SEP> 3'
<tb>
Le Tableau I illustre les oligonucléotides synthétisés pour séquencer le brin sens 6.6 (ordre séquentiel des oligonucléotides) et le Tableau II illustre les oligonucléotides synthétisés pour séquencer le brin anti-sens 6.3 (ordre séquentiel des oligonucléotides).
Ceci a permis de séquencer l'ADNc sur les deux brins.
Les résultats obtenus, à partir de la séquence du fragment EcoR I de 3 kilobases, montrent la séquence nucléotidique du RAP3 bovin (1215 pb) et des régions non codantes (106 pb en 5' et 638 pb en 3') (formule I). Les sites de restriction contenus dans le fragment de 2 000 pb sont positionnés sur la figure la (bov 6.6 court(pA)).
La figure lb montre les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 3 kb qui a été séquence.
La comparaison des régions codantes des gènes ss3 humain et bovin (figure 3), indique une forte homologie (85 % au niveau des séquences nucléotidiques entre RA bovin et humain) ; la comparaison des régions codants des gènes 53 bovin et murin montre également une forte homologie (76 % au niveau des séquences nucléotidiques entre
RA bovin et RA murin).
RA bovin et RA murin).
Le gène 3 bovin code pour le peptide de 405 aminoacides, qui présente une très grande homologie avec le peptide ss3 humain ou le peptide 53 murin (figure 2), comme indiqué plus haut.
EXEMPLE 3 : Construction d'un vecteur pour l'expression du RA-ss3 bovin.
La carte de restriction du fragment de 2 kb qui a été séquencé (figure la) indique la présence d'un site de coupure par l'enzyme Srf I à la position 1598, soit 270 nucléotides en aval de la région codante du gène 53 de boeuf. L'ADN du clone M13-6.6 a été digéré avec les enzymes EcoR I et Srf I pour libérer le fragment de 1598 paires de bases contenant la région codante du gène 3 bovin et une partie de la région 3' non traduite. Ce fragment d'ADN a été purifié, puis inséré dans le vecteur d'expression pRc/CMV, aux sites de coupure Hind III et
Xba I (figure 5).
Xba I (figure 5).
Comme les extrémités générées par les enzymes
Hind III et Xba I d'une part et EcoR I et Sfr I d'autre part, ne sont pas compatibles, on a pris soin de traiter les extrémités EcoR I et Sfr I de l'insert d'une part avec le fragment Klenow de la polymérase I, et les extrémités Hind III et Xba I du vecteur d'autre part, avec le fragment Klenow de la polymérase I, de façon à obtenir des bouts francs (MANIATIS et al., Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40-5.42).
Hind III et Xba I d'une part et EcoR I et Sfr I d'autre part, ne sont pas compatibles, on a pris soin de traiter les extrémités EcoR I et Sfr I de l'insert d'une part avec le fragment Klenow de la polymérase I, et les extrémités Hind III et Xba I du vecteur d'autre part, avec le fragment Klenow de la polymérase I, de façon à obtenir des bouts francs (MANIATIS et al., Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40-5.42).
On a ainsi obtenu le plasmide recombinant pRc/CMV-BoB3-ADR, représenté sur la figure 4.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
Claims (3)
1 CCCAGGCCAGGGAAATCGCTCCCACGCCCCG
Met Pro Pro Pro Leu Ser Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Ser Leu Ile Pro 17
32 ATG CCC CCG CCG CTG AGC AGG GTG AGC TGG GAG ACC CTT CCT CTC ATT CCT
Ser Arg Pro Thr Arg Asp Ala Gly Met Ala Pro Trp Pro Pro Gly Asn Ser 34
83 TCC CGC CCC ACG CGC GAC GCG GGG ATG GCT CCG TGG CCT CCT GGG AAC AGC
Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp Ile Pro Thr Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn 51 134 TCT CTG ACC CCG TGG CCA GAT ATC CCC ACC CTG GCA CCC AAT ACT GCC AAC
Ala Ser Gly Leu Pro Gly Val Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu 68 185 GCG AGT GGG CTG CCA GGG GTG CCC TGG GCG GCG GCG CTG GGG GGG GCG CTG
Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val 85 236 TTG GCG CTA GCG CTG CTG GCC ACC GTG GGA GGC ACC CTG CTG GTA ATC GTG
Ala Ile Ala Arg Thr Pro Arg Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr 102 287 GCC ATC GCC CGG ACG CCG AGA CTC CAG ACC ATG ACC AAC GTG TTG GTG ACT
Ser Leu Ala Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly 119 338 TCG CTG GCC ACA GCC GAC CTG GTG GTG GGG CTC CTG GTC GTG CCC CCG GGG
Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu 136 389 GCC ACG TTG GCG CTG ACC GCG CAC TGG CCC CTG GGC GTC ACC GGT TGC GAG
Leu Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu 153 440 CTG TGG ACC TCA GTG GAC GTG CTG TGT GTG ACC GCC AGC ATC GAA ACC CTG
Cys Ala Leu Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg Tyr 170 491 TGC GCC CTG GCG GTG GAC CGC TAC CTG GCC GTG ACC AAC CCG CTG CGC TAC
Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu Val Trp 187 542 GGC GCG CTG GTC ACC AAA CGC CGC GCC CTA GCA GCC GTG GTC CTG GTG TGG
Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys Trp Trp Arg 204 593 GTG GTG TCC GCC GCG GTG TCG TTT GCG CCC ATC ATG AGC AAA TGG TGG CGC
Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn Pro Arg Cys Cys 221 644 ATC GGG GCC GAT GCC GAG GCG CAG CGT TGC CAC TCC AAC CGG CGC TGC TGC
Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Ser Ser Val Ser Phe 238 695 ACC TTC GCC TCC AAC ATG CCC TAC GCG CTG CTC TCC TCC TGC GTC TCG TTG
Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr Ala Arg Val Phe Val Val 255 746 TAT CTT CCG CTC CTG GTG ATG CTC TTC GTC TAC GCA CGA GTT TTC GTG GTG
Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro 272 797 GCC ACG CGC CAG CTG CGC TTG CTG CGC CGG GAG CTG GGT CGC TTC CCG CCA
Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly 289 848 GAG GAG TCT CCG CCG GCT CCT TCT CGC TCC GGA TCC CCT GGC CTG GCG GGG
Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val Pro Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ala Arg 306 899 CCG TGC GCC TCG CCC GCG GGG GTG CCC TCC TAC GGC CGG CGG CCG GCG CGC
Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met 323 950 CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC CGC CTG CGC ACC TTG GGG CTC ATC ATG
Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg 340 001 GGA ACC TTC ACT CTC TGC TGG TTG CCT TTC TTT GTG GTA AAC GTG GTG CGC
Ala Leu Gly Gly Pro Ser Leu Val Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn 357 052 GCC CTC GGG GGC CCC TCT CTG GTG TCC GGC CCC ACT TTC CTC GCC CTT AAC
Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser 374 103 TGG CTG GGC TAT GCC AAC TCT GCC TTC AAC CCG CTC ATC TAC TGC CGC AGC
Pro Asp Phe Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu 391 1154 CCG GAC TTT CGG AGC GCC TTC CGC CGC CTG CTG TGT CGC TGC CGC CCG GAG
Glu His Leu Ala Ala Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr 408 1205 GAG CAC CTC GCC GCT GCC TCC CCG CCC CGA GCC CCC TCC GGC GCC CCC ACG
Ala Leu Thr Ser Pro Ala Gly Pro Met Gln Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala 425 1256 GCC CTG ACC AGC CCC GCT GGC CCC ATG CAG CCC CCA GAG CTC GAC GGG GCT
Ser Cys Gly Leu Ser Stop 430 1307 TCC TGC GGA CTT TCT TAG GCCTTGAAGAAACAACTCCATTGATCCGGAACCTTTGGAAAGC 1368 CTCTGGCCGGCCTCGGTTCAGAATGAGCCCCGTGGAGTTTCCCAGCTGGAAAACTCTGCCCTCCCCA 1435 GCCTGACGACTGGGTCCTGGGAGGAGGCGCGGGGGCTGACTGGGGAGGGGAAATCCTTACCAAGTGG 1502 GTTTTCGCTCTCTTTCTGAGAGAAGTTTTCTACACCCCAGCCCTGAACTTCACCGCTGCCTCAGCAG 1569 CTCCCGCGTCTGGTTTCCCATGCCCAGGTGCCCGGGCAGGAGCTGGGCTGCGTTTAGCCCCGGGACC 1636 GCGACCTGTCCCACTCGGGTGCTGTGTGCGCAGGGGCAAGGCGGGCACCTTCATTCTGTTCCTTCTG 1703 CCGCCCAGACCCTGAGGAACCCACCGGGGTGCTGGAGGCCCAGGCTGAGAAGAGGAAGGTGGGGAAG 1770 GTCACGGTTTGGGCTTCTGTCCCTGGCTTCCTCACTGTAGACACACCTACCTCACAGCATTTTCAGG 1837 ACTTTACTTTAGCCTTTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCTCCTGGTTTCCTGGGAAGGTGAACCATTA 1904 GAATGGGTCCCTTTTCCTTTTGAAATCAAATTAATAAATGTTACTGAATGCAGTTTAAAAAAAAAAA 1971 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (I)
3 ) Séquence selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend notamment les sites de restriction uniques suivants
Bpu1102 I, Fok I, EcoR V, Bcg I, Nhe I,
BspM I, Afl III, Age I, BstE II, BspH I, Bsg I, Nsp I,
Nsp7524 I, NspC I, Sap I, BamH I, BstY I, Asc I, Sty I,
Hinc II, Apa I, Bsp120 I, Bbe I, Ehe I, Kas I, Nar I,
Ecl136 I, Sac I, Stu I, Fse I, Drd I, Tthlll I, Srf I,
Bsu36 I, Sfc I, BstX I, Ase I, Bsm I, Dra I.
4 ) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 218-295 de la séquence de formule I, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM1.
5') Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 332-403 de la séquence de formule I, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM2.
6 ) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 434-499 de la séquence de for mule I, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM3.
7 ) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 69 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 572-640 de la séquence de formule I, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM4.
8 ) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 713-784 de la séquence de formule I, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM5.
9 ) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 983-1048 de la séquence de formule I, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM6.
10-) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1070-1147 de la séquence de formule I, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM7.
11 ) Clones d'ADNc, caractérisés en ce qu'ils comprennent un fragment de séquence codant pour le récepteur ss3 bovin (RA-Boss3), selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12-) Clone selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend 2979 paires de bases, inclut la séquence de formule I selon la revendication 2 et comprend les sites de restriction uniques suivants : EcoR V,
Bcg I, Nhe I, BstE II, BspH I, Bsg I, Sap I, BamH I,
Asc I, Stu I, Fse I, Drd I, Srf I, Sfc I, Ase I, Bsm I,
Dra I, Bspl407 I, Csp6 I, Rsa I, Ssp I, Dra III, Bgl II,
Afl II, Spe I, Tfi I, Hpa I, Nde I, EcoN I, BsaB I,
Pvu I.
13-) Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un fragment de celles-ci, marquées à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome et en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 mais ne s'hybrident pas avec les gènes codant pour les récepteurs ss1 et ss2 adrénergiques, ni avec l'ARN messager desdits récepteurs B1 et ss2 adrénergiques.
14-) Sonde selon la revendication 13, caractérisée en ce que sa séquence est homologue ou complémentaire de celle d'un segment d'au moins 10 pb de la séquence de formule I.
15-) Peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et en ce qu'il présente une activité de récepteur ss3- adrénergique.
16-) Peptide selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend 405 amino-acides et présente la séquence en amino-acides de formule II suivante BETA3~BOV MAPWPPGNSSLTPWPDPTALAPNTANASGLPGVPWAVALAGALLALAVLATVGGNLLVIV
TM1
BETA3~BOV AIARTPRLQTMTNVFVTSLATADLVVGLLVVPPGATLALTGHWPLGVTGCELWTSVDVLQ
TM2 TM3
BETA3~BOV VTASIETLCALAVDRYLAVTNPLRYGALVTKRRALAAVVLVWVVSAAVSFAPIMSKWWRI
TM4
BETA3~BOV GADAEAQRCHSWPRCCTFASMMPYALLSSSVSFYLPLLVMLFVYARVFVVATRQLRLLPR
TM5
BETA3~BOV ELGRFPPEESPPAPVRSGSPGLAGPCASPAGVPSYGRPARLLPLPREHRALRTLGLIMGT
BETA3~BOV FTLCWLPFFVVNVVRALGGPSLVSGPTFLALNWLGYANSAFNPLIYCRSPDFFSAFRRLL
TM6 TM7
BETA3~BOV CRORPEEHLAAASHPRAPSGAPTALTSPAGPMQPPELDGASCGLS (II)
17') Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 38-63 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM1.
18-) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 76-99 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM2.
19 ) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment 22 amino-acides, correspondant au segment 110-131 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM3.
20') Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 23 amino-acides, correspondant au segment 156-178 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM4.
21-) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 203-226 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM5.
22 ) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 22 amino-acides, correspondant au segment 293-314 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM6.
23 ) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 322-347 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM7.
24 ) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
25 ) Vecteur selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur recombinant approprié, comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bac téries, soit des cellules eucaryotes ayant reçues ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptide ayant une activité de récepteur ss3 adrénergique bovin.
26 ) Vecteur selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un vecteur d'expression pRc/CMV dans lequel est insérée, au niveau du lieur multisite, au moins le fragment codant pour le récepteur 53-adrénergique bovin, et en ce qu'il a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 15 avril 1993 sous le n I-1297.
27 ) Cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 24 à 26.
28 ) Cellule hôte selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est constituée par les cellules de la lignée CHO (Chinese Hamster Ovary).
29 ) Cellule hôte selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une bactérie, notamment Escherichia coli.
30') Procédé de sélection et d'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un peptide (récepteur 53-adrénergique bovin) selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, lequel procédé comprend
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, laquelle cellule hôte exprime ledit peptide bovin (récepteur adrénergique ss3 bovin), le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance s'il y a lieu, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-peptide.
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| IL109365A0 (en) | 1994-07-31 |
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