FR2702491A1 - Cloning of genes encoding excretion-secretion antigens P21 and P32 of toxoplasma, preparations of such antigens, fragments thereof and their applications - Google Patents
Cloning of genes encoding excretion-secretion antigens P21 and P32 of toxoplasma, preparations of such antigens, fragments thereof and their applications Download PDFInfo
- Publication number
- FR2702491A1 FR2702491A1 FR9302891A FR9302891A FR2702491A1 FR 2702491 A1 FR2702491 A1 FR 2702491A1 FR 9302891 A FR9302891 A FR 9302891A FR 9302891 A FR9302891 A FR 9302891A FR 2702491 A1 FR2702491 A1 FR 2702491A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- antigen
- sequence
- sep
- excretion
- secretion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 139
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 133
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 130
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 241000223996 Toxoplasma Species 0.000 title claims abstract description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title abstract description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 23
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 101000577520 Chlamydomonas reinhardtii Photosystem I reaction center subunit III, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 210000000059 tachyzoite Anatomy 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 210000000061 bradyzoite Anatomy 0.000 description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 238000011795 OF1 mouse Methods 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 101001079625 Mus musculus Heme oxygenase 1 Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091601 21 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710134191 24 kDa antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710176159 32 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000609456 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P26 Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010062343 Congenital infection Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000005909 Fraise reaction Methods 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101150005926 Pc gene Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000881705 Porcine endogenous retrovirus Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 208000010362 Protozoan Infections Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035476 Serum paraoxonase/arylesterase 1 Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000000707 layer-by-layer assembly Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108700039855 mouse a Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 101150069452 z gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/45—Toxoplasma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
CLONAGE DE GENES CODANT POUR DES ANTIGENES D'EXCRETION
SECRETION P21 ET P32 DE TOXOPLASME, PREPARATIONS DE TELS
ANTIGENES, FRAGMENTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS
La présente Invention est relative au clonage de gènes codant pour les antigènes d'excrétion-sécrétion de 21 kDa et de 32 kDa de toxoplasme, à l'obtention de préparations desdits antigènes et de leurs fragments, et à leurs utilisations.CLONING GENES ENCODING EXCRETION ANTIGENS
SECRETION P21 AND P32 OF TOXOPLASM, PREPARATIONS OF SUCH
ANTIGENS, FRAGMENTS THEREFOR, AND THEIR APPLICATIONS
The present invention relates to the cloning of genes encoding the 21 kDa and 32 kDa toxoplasmic excretion-secretion antigens, obtaining preparations of said antigens and fragments thereof, and their uses.
La toxoplasmose est une des infections à protozoaires les plus répandues, aussi bien chez l'homme que chez l'animal. Bien que généralement bénigne, elle peut revêtir des formes graves chez certaines catégories de patients, en particulier les patients immunodéprimés elle est responsable d'environ 25% des décès chez les malades du SIDA. Toxoplasmosis is one of the most common protozoan infections in both humans and animals. Although generally benign, it can take severe forms in some categories of patients, especially immunocompromised patients it is responsible for about 25% of deaths among AIDS patients.
La toxoplasmose peut avoir également des conséquences graves en cas d'infection congénitale, qui est cause d'avortements ou de malformations néo-natales sévères chez l'homme et les animaux domestiques. Toxoplasmosis can also have serious consequences in cases of congenital infection, which causes abortions or severe neonatal malformations in humans and domestic animals.
On sait toutefois que la primo-infection induit une immunité de longue durée. I1 apparaît donc que cette maladie pourrait être prévenue par un vaccin qui permettrait de reproduire la réponse immune engendrant cette immunité. It is known, however, that primary infection induces long-lasting immunity. It appears therefore that this disease could be prevented by a vaccine that would reproduce the immune response generating this immunity.
Dans la recherche d'antigènes protecteurs permettant le développement d'un vaccin contre la toxoplasmose, différents antigènes ont été étudiés. L'équipe des Inventeurs s'est en particulier intéressée aux antigènes d'excrétion-sécrétion (AES) des tachyzoltes, qui constituent 90% des antigènes circulants. I1 a en effet été établi, au cours d'expérimentations aussi bien chez l'homme que chez l'animal, que les antigènes AES étaient de puissants immunogènes [DECOSTER et al., Clin. Exp. In the search for protective antigens allowing the development of a vaccine against toxoplasmosis, various antigens have been studied. The team of the inventors is particularly interested in excretion-secretion antigens (AES) tachyzoltes, which constitute 90% of circulating antigens. It has indeed been established, during experiments both in humans and animals, that AES antigens are potent immunogens [DECOSTER et al., Clin. Exp.
Immunol. n 73, p. 376-382 (1988) ; DUQUESNE et al.,
Infect. Immun. n 58, p. 2120-2126, (1990) ; DARCY et al., Gynécol. Int. n 1, p. 48-57 (1992)]. I1 a également été montré que certains des AES possèdent des épitopes communs avec des antigènes des bradyzoïtes. Or, les bradyzoites sont la forme résistante du parasite.Immunol. 73, p. 376-382 (1988); DUQUESNE et al.,
Infect. Immun. No. 58, p. 2120-2126, (1990); DARCY et al., Gynecol. Int. n 1, p. 48-57 (1992)]. It has also been shown that some of the ESAs have common epitopes with bradyzoite antigens. However, bradyzoites are the resistant form of the parasite.
Des anticorps monoclonaux dirigés contre plusieurs AES ont été produits. I1 apparaît que tous ces anticorps détectent des molécules stockées dans les granules denses du Toxoplasme et ce , quel que soit le stade, tachyzoite ou bradyzoite. Ces molécules ont également été observées dans la vacuole parasitophore ou le kyste et semblent donc sécrétées par les parasites lors de l'invasion. Cette localisation, au niveau de la surface d'échange entre le Toxoplasme et sa cellule-hôte, suggère une participation fondamentale de ces molécules dans les mécanismes d'échappement et dans le maintien de la relation hôte-parasite. Monoclonal antibodies against several AES have been produced. It appears that all these antibodies detect molecules stored in the dense granules of Toxoplasma, irrespective of the stage, tachyzoite or bradyzoite. These molecules have also been observed in the parasitophorous vacuole or cyst and thus appear to be secreted by parasites during invasion. This localization, at the level of the exchange surface between Toxoplasma and its host cell, suggests a fundamental participation of these molecules in the escape mechanisms and in the maintenance of the host-parasite relationship.
L'utilisation des sondes monoclonales dirigées contre trois de ces antigènes des granules denses (également dénommés protéines GRA), respectivement P23 (GRA1), GP28.5 (GRA2) et P21 (P21) a permis d'observer une localisation commune de ces antigènes dans les granules de sécrétion, et une localisation spécifique pour chacun d'entre eux après sécrétion dans la vacuole parasitophore ou le kyste. The use of the monoclonal probes directed against three of these antigens of the dense granules (also called GRA proteins), respectively P23 (GRA1), GP28.5 (GRA2) and P21 (P21) made it possible to observe a common localization of these antigens. in the secretory granules, and a specific localization for each of them after secretion into the parasitophorous vacuole or cyst.
P23, qui possède deux structures capables de lier le calcium, est observée dans l'espace vacuolaire. P23, which has two structures capable of binding calcium, is observed in the vacuolar space.
GP28.5 est associée spécifiquement aux microvillosités du réseau membranaire entourant les parasites ; sa structure moléculaire suggère une association possible aux lipides.GP28.5 is specifically associated with microvilli of the membrane network surrounding parasites; its molecular structure suggests a possible association with lipids.
P21 est très peu abondante dans le réseau membranaire sous-jacent mais au contraire associée spécifiquement à la membrane de la vacuole ou à la paroi du kyste.P21 is very scarce in the underlying membrane network but on the contrary specifically associated with the vacuole membrane or the cyst wall.
Deux de ces antigènes ont déjà été isolés, et les gènes correspondants ont été clonés : il s'agit de l'antigène P23 [CESBRON-DELAUW et al. Proc. Natl. Acad. Two of these antigens have already been isolated, and the corresponding genes have been cloned: this is the P23 antigen [CESBRON-DELAUW et al. Proc. Natl. Acad.
Sci., n 86, p. 7537-7541, (1989)], et de l'antigène
GP28.5 [PRINCE et al., Mol. Biochem. Parasitol., n 34, p. 3-14 (1989) ; Demande FR 92 072 06 du 15 Juin 1992 aux noms de INSTITUT PASTEUR, INSTITUT PASTEUR DE LILLE et
INSERM] ; des épitopes majeurs spécifiques des cellules B ont été localisés sur GP28.5.Sci., 86, p. 7537-7541, (1989)], and antigen
GP28.5 [PRINCE et al., Mol. Biochem. Parasitol., 34, p. 3-14 (1989); Application FR 92 072 06 of June 15, 1992 to the names of INSTITUT PASTEUR, INSTITUT PASTEUR DE LILLE and
INSERM]; major epitopes specific for B cells were located on GP28.5.
L'antigène P21 n'avait en revanche pas été isolé jusqu'à présent ; il avait été simplement identifié par sa réaction avec un anticorps monoclonal dénommé TG17-113 [CHARIF et al. Exp. Parasitol., n 71, p. 114124, (1990)] qui avait permis de le localiser dans les granules de secrétion. The P21 antigen, however, had not been isolated so far; it had been simply identified by its reaction with a monoclonal antibody called TG17-113 [CHARIF et al. Exp. Parasitol., 71, p. 114124, (1990)] which allowed to localize it in the granules of secretion.
Les Inventeurs se sont fixé pour but l'isolement et la caractérisation de nouveaux antigènes
AES, utilisables pour le traitement de la toxoplasmose.The inventors set themselves the goal of isolating and characterizing new antigens
AES, usable for the treatment of toxoplasmosis.
Dans ce but, ils ont entrepris le clonage du gène codant pour P21. Le criblage par l'anticorps monoclonal TG17-113 d'une banque d'expression d'ADNc de tachyzoltes de T gondii effectué dans un premier temps, n'ayant permis la détection d'aucun clone exprimant l'antigène P21, les
Inventeurs ont entrepris la purification de cet antigène
P21 par RP-HPLC à partir d'un extrait total de protéines de tachyzoites.For this purpose, they undertook the cloning of the gene coding for P21. Screening by the monoclonal antibody TG17-113 of a T gondii tachyzole cDNA expression library carried out initially, which did not allow the detection of any clone expressing the P21 antigen, the
Inventors undertook the purification of this antigen
P21 by RP-HPLC from a total extract of tachyzoite proteins.
Ils sont de la sorte parvenus à obtenir une préparation de l'antigène P21 natif, à partir de laquelle ils ont réussi à produire un immunsérum de rat et un immunsérum de souris qui leur ont permis de mettre en évidence dans la banque d'expression d'ADNc de tachyzoites, des clones exprimant l'antigène P21 recombinant. In this way, they were able to obtain a native P21 antigen preparation, from which they succeeded in producing a rat immune serum and a mouse immune serum which enabled them to be detected in the expression library. CDNA of tachyzoites, clones expressing the recombinant P21 antigen.
Ils ont en outre constaté que, malgré l'homogénéité des fractions HPLC enrichies en antigène
P21, les immunsérums produits contre l'antigène P21 natif reconnaissaient avec la même intensité sur les profils d'immunoélectrophorèse d'extrait total de tachyzoites, la bande correspondant à P21 et deux autres bandes correspondant à des antigènes de 32 et 28kDa.They furthermore found that, despite the homogeneity of the HPLC fractions enriched in antigen
P21, antisera produced against the native P21 antigen recognized with the same intensity on the immunoelectrophoresis profiles of total extract of tachyzoites, the band corresponding to P21 and two other bands corresponding to antigens of 32 and 28kDa.
La bande observée à 32 kDa ne correspond à aucun antigène AES connu. The band observed at 32 kDa does not correspond to any known AES antigen.
Les Inventeurs ont également obtenu à partir de la banque d'ADNc de tachyzoites, les clones exprimant cet antigène de 32 kDa. The inventors also obtained from the tachyzoite cDNA library clones expressing this 32 kDa antigen.
En comparant la séquence des clones d'ADNc de
P21 et P32 avec les séquences de clones obtenus parallèlement à partir d'une banque d'ADN génomique, les
Inventeurs ont obtenu les séquences des gènes codant pour les antigènes P21 et P32.Comparing the sequence of the cDNA clones
P21 and P32 with the sequences of clones obtained in parallel from a genomic DNA library, the
Inventors have obtained the gene sequences encoding the P21 and P32 antigens.
La présente Invention a pour objet un fragment d'acide nucléique, comprenant tout ou partie de la séquence du gène d'un antigène d'excrétion-secrétion de
Toxoplasme, lequel fragment est caractérisé en ce que ladite séquence est choisie dans le groupe constitué par
a) la séquence du gène de l'antigène d'excrétion-secrétion P21 de Toxoplasme
b) la séquence du gène de l'antigène d'excrétion-secrétion P32 de Toxoplasme
c) une séquence complémentaire de l'une ou l'autre des séquences a) ou b)
d) un segment de plus de 10 pb de l'une des séquences a), b) ou c).The subject of the present invention is a nucleic acid fragment, comprising all or part of the gene sequence of an antigen-excretion-secretion gene.
Toxoplasma, which fragment is characterized in that said sequence is selected from the group consisting of
a) Toxoplasma P21 excretion-secretion antigen gene sequence
b) Toxoplasma P32 excretion-secretion antigen gene sequence
c) a sequence complementary to one or other of the sequences a) or b)
d) a segment of more than 10 bp in any of sequences a), b) or c).
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, la séquence a) est la séquence nucléotidique représentée dans la liste des séquences en annexe, sous le numéro SEQ. ID N 1, qui est celle du gène de l'antigène P21 de Toxoplasma gondii. According to a preferred embodiment of the present invention, the sequence a) is the nucleotide sequence represented in the list of sequences in the appendix, under the number SEQ. ID N 1, which is that of the gene of the antigen P21 Toxoplasma gondii.
Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, la séquence b) est la séquence nucléotidique représentée dans la liste des séquences en annexe, sous le numéro SEQ. ID N 2, qui est celle du gène de l'antigène P32 de Toxoplasma gondii. According to another preferred embodiment of the present invention, the sequence b) is the nucleotide sequence represented in the list of sequences in the appendix, under the number SEQ. ID N 2, which is that of the P32 antigen gene of Toxoplasma gondii.
Selon encore un autre mode de réalisation préféré, la séquence d) est une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide représentant au moins une partie de la protéine P21 ou P32. According to yet another preferred embodiment, the sequence d) is a nucleotide sequence encoding a polypeptide representing at least a portion of the P21 or P32 protein.
Ceci englobe les séquences qui, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, codent pour ces mêmes antigènes ou polypeptides. This includes sequences which, given the degeneracy of the genetic code, encode these same antigens or polypeptides.
Avantageusement, la séquence d) est une séquence codant pour un fragment peptidique comprenant un épitope de l'antigène P21 et/ou un épitope de l'antigène
P32.Advantageously, the sequence d) is a sequence coding for a peptide fragment comprising an epitope of the P21 antigen and / or an epitope of the antigen
P32.
L'Invention a également pour objet des vecteurs recombinants (plasmides, virus, etc...) caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus, codant pour l'antigène P21 de toxoplasme, ou pour l'antigène P32, ou pour un peptide représentant un fragment de ceux-ci. The subject of the invention is also recombinant vectors (plasmids, viruses, etc.) characterized in that they comprise at least one DNA fragment as defined above, coding for the Toxoplasma P21 antigen, or for the P32 antigen, or for a peptide representing a fragment thereof.
Le plasmide pTG21-22 qui contient un insert d'ADNc (EcoRI-XhOI de 810 pb) codant pour P21, et le plasmide pTG32-43 qui contient un insert d'ADNc (EcoRI
XhOI de 159 pb) codant pour P32, ont été déposés à la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724
Paris Cédex 15, France, le 12 Mars 1993, sous les numéros de dépôt respectifs I-1288 et I-1289. The plasmid pTG21-22 which contains a cDNA insert (EcoRI-XhoI 810 bp) coding for P21, and the plasmid pTG32-43 which contains a cDNA insert (EcoRI
XhoI 159 bp) coding for P32, were deposited at
National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux, 75724
Paris Cédex 15, France, March 12, 1993, under the respective deposit numbers I-1288 and I-1289.
Avantageusement, lesdits vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant des séquences propres à contrôler l'expression du gène de l'antigène P21 (promoteur, terminateur, etc...)
La présente Invention a également pour objet des cellules eucaryotes ou procaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'acide nucléique conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus. Ce fragment d'acide nucléique peut être extra-chromosomique (par exemple porté par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus). I1 peut également être intégré dans le chromosome de la cellulehôte.Advantageously, said vectors are expression vectors, comprising sequences suitable for controlling the expression of the P21 antigen gene (promoter, terminator, etc.)
The present invention also relates to transformed eukaryotic or prokaryotic cells, characterized in that they contain at least one nucleic acid fragment according to the invention, as defined above. This nucleic acid fragment can be extra-chromosomal (for example carried by an expression vector as defined above). It can also be integrated into the chromosome of the host cell.
L'Invention a également pour objet une préparation purifiée d'une protéine constituant un antigène d'excrétion-secrétion de toxoplasme, laquelle préparation est caractérisée en ce que ladite protéine est choisie dans le groupe constitué par
- l'antigène d'excrétion-sécrétion P21 de toxoplasme
- l'antigène d'excrétion-sécrétion P32 de toxoplasme.The invention also relates to a purified preparation of a protein constituting a toxoplasma excretion-secretion antigen, which preparation is characterized in that said protein is selected from the group consisting of
- toxin excretion-secretion antigen P21
the toxin excretion-secretion antigen P32.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ladite préparation purifiée est une préparation de protéine native. According to a preferred embodiment of the present invention, said purified preparation is a native protein preparation.
Au sens de la présente Invention, on entend par : "préparation purifiée" une préparation de protéines ne comportant aucun contaminant détectable par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; par "protéine native" la protéine telle qu'exprimée par l'organisme eucaryote dont elle est issue (en l'occurrence T. gondii), en tenant compte des éventuelles modifications post-traductionnelles propres à cet organisme, et par : "protéine recombinante" toute protéine ou fragment peptidique obtenu par génie génétique, chez un hôte eucaryote ou procaryote. For the purposes of the present invention, the term "purified preparation" means a protein preparation containing no detectable contaminant by polyacrylamide gel electrophoresis; by "native protein" the protein as expressed by the eukaryotic organism from which it is derived (in this case T. gondii), taking into account any post-translational modifications peculiar to this organism, and by: "recombinant protein "any protein or peptide fragment obtained by genetic engineering, in a eukaryotic or prokaryotic host.
Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, ladite préparation purifiée est une préparation de protéine recombinante. According to another preferred embodiment of the present invention, said purified preparation is a recombinant protein preparation.
L'Invention a également pour objet un polypeptide, dont la séquence comprend tout ou partie d'un antigène d'excrétion-sécrétion de toxoplasme, lequel polypeptide est caractérisé en ce que ladite séquence d'antigène d'excrétion-sécrétion de toxoplasme est choisie dans le groupe constitué par
a) la séquence peptidique de l'antigène d'excrétion-sécrétion P21 de toxoplasme.The invention also relates to a polypeptide whose sequence comprises all or part of a toxoplasma excretion-secretion antigen, which polypeptide is characterized in that said toxoplasma excretion-secretion antigen sequence is chosen in the group constituted by
a) the peptide sequence of toxin excretion-secretion antigen P21.
b) la séquence peptidique de l'antigène d'excrétion-sécrétion P32 de toxoplasme. b) the peptide sequence of the toxin excretion-secretion antigen P32.
c) une séquence représentant un segment de plus de 5 acides aminés de l'une des séquences peptidiques a) ou b). c) a sequence representing a segment of more than 5 amino acids of one of the peptide sequences a) or b).
Selon un mode de réalisation préféré d'un polypeptide conforme à l'Invention, la séquence peptidique a) est la séquence du polypeptide codé par le gène de l'antigène P21 de T. gondil, laquelle séquence est représentée (en code une lettre) à la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ. ID N 1, en regard de la séquence d'acide nucléique correspondante. According to a preferred embodiment of a polypeptide according to the invention, the peptide sequence a) is the sequence of the polypeptide encoded by the T. gondil antigen P21 gene, which sequence is represented (in one letter code) to the list of sequences in annex under the number SEQ. ID N 1, opposite the corresponding nucleic acid sequence.
Selon un autre mode de réalisation préféré d'un polypeptide conforme à l'Invention, la séquence peptidique b) est la séquence du polypeptide codé par le gène de l'antigène P32 de T. gondii, laquelle séquence est représentée (en code une lettre) à la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ. ID N 2, en regard de la séquence d'acide nucléique correspondante. According to another preferred embodiment of a polypeptide according to the invention, the peptide sequence b) is the sequence of the polypeptide encoded by the T. gondii antigen P32 gene, which sequence is represented (in a letter code ) to the list of sequences in the Annex under the number SEQ. ID N 2, opposite the corresponding nucleic acid sequence.
Avantageusement la séquence peptidique c) comprend un épitope de l'antigène P21, un épitope de l'antigène P32 ou un épitope commun aux deux antigènes. Advantageously, the peptide sequence c) comprises an epitope of the P21 antigen, an epitope of the P32 antigen or an epitope common to both antigens.
L'Invention englobe, bien entendu, les polypeptides dont la séquence ne diffère de la séquence mentionnée ci-dessus que par quelques acides aminés, en particulier des polypeptides dont la séquence est dérivée de celle de variants alléliques ou d'isoformes de l'antigène
P21.The invention includes, of course, polypeptides whose sequence differs from the above-mentioned sequence only by a few amino acids, in particular polypeptides whose sequence is derived from that of allelic variants or isoforms of the antigen.
P21.
Des polypeptides conformes à l'Invention peuvent être obtenus par synthèse, ou par recombinaison génétique ; ils peuvent être des peptides de fusion comprenant la séquence de tout ou partie de l'antigène d'excrétion-sécrétion P21, ou de l'antigène d'excrétionsécrétion P32, avec une autre séquence polypeptidique. Polypeptides according to the invention can be obtained by synthesis, or by genetic recombination; they may be fusion peptides comprising the sequence of all or part of the P21 secretion-secretion antigen, or the P32 secretion-excretion antigen, with another polypeptide sequence.
L'Invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on procède à la mise en culture de cellules transformées telles que définies plus haut, comprenant au moins un fragment d'ADN conforme à 1 'Invention. The invention also relates to a process for producing a polypeptide as defined above, which process is characterized in that it comprises a step in which the culturing of transformed cells such as defined above, comprising at least one DNA fragment in accordance with the invention.
Les polypeptides recombinants exprimés chez E. Recombinant polypeptides expressed in E.
coli conservent des épitopes séquentiels ou des épi topes liés à la structure secondaire des protéines P21 et P32.coli retain sequential epitopes or epitopes related to the secondary structure of P21 and P32 proteins.
Pour permettre l'obtention d'autres épitopes tels que des épitopes de nature glucidique, ou des épitopes correspondant à des structures tertiaires et quaternaires, on choisira de produire les recombinants dans des systèmes eucaryotes tels que, par exemple, les levures ou les baculovirus. To make it possible to obtain other epitopes such as epitopes of carbohydrate nature, or epitopes corresponding to tertiary and quaternary structures, it will be chosen to produce the recombinants in eukaryotic systems such as, for example, yeasts or baculoviruses.
L'Invention a également pour objet des compositions antigéniques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un antigène pris dans le groupe constitué par
- une préparation purifiée de l'antigène P21 ou de l'antigène P32
- un polypeptide comprenant la séquence de l'antigène P21 ou de l'antigène P32, ou d'une partie de ceux-ci.The invention also relates to antigenic compositions characterized in that they comprise at least one antigen taken from the group consisting of
a purified preparation of the P21 antigen or the P32 antigen
a polypeptide comprising the sequence of the P21 antigen or of the P32 antigen, or of a part thereof.
L'Invention englobe également un procédé de préparation d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on immunise un animal avec une composition antigénique conforme à l'invention. The invention also encompasses a process for the preparation of antibodies, polyclonal or monoclonal, characterized in that it comprises a step during which an animal is immunized with an antigenic composition according to the invention.
Les compositions antigéniques conformes à l'invention permettent également la préparation de réactifs de diagnostic, ou de vaccins anti-toxoplasmes. The antigenic compositions according to the invention also allow the preparation of diagnostic reagents, or toxoplasma vaccines.
L'invention englobe également ces réactifs et ces vaccins.The invention also encompasses these reagents and vaccines.
Les Inventeurs ont en particulier montré que l'immunisation par P21 confère chez la souris une protection significative vis-à-vis d'une infestation létale par T. gondii, et que P32 recombinant est reconnu par l'ensemble de sérums-tests humains obtenus à partir de patients atteints de toxoplasmose en phase aiguë ou chronique
L'antigène P21 est donc plus particulièrement utilisable pour l'obtention de vaccins anti-toxoplasmes, et l'antigène P32 est plus particulièrement utilisable pour le diagnostic de la toxoplasmose.In particular, the inventors have shown that immunization with P21 confers in the mouse a significant protection against a lethal infection by T. gondii, and that recombinant P32 is recognized by the set of human test sera obtained. from patients with toxoplasmosis in the acute or chronic phase
The P21 antigen is therefore particularly useful for obtaining toxoplasma vaccines, and the P32 antigen is particularly useful for the diagnosis of toxoplasmosis.
Avantageusement, on peut associer les compositions conformes à l'invention à d'autres antigènes de toxoplasme, en particulier, des antigènes d'excrétionsécrétion, dans un même test de diagnostic, ou une même composition vaccinante. Advantageously, the compositions in accordance with the invention can be combined with other toxoplasma antigens, in particular secretion excretion antigens, in the same diagnostic test, or the same vaccinating composition.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui décrit le clonage des gènes codant pour les antigènes P21 et P32 de toxoplasme, et la caractérisation de ces antigènes. The present invention will be better understood with the aid of the following description which describes the cloning of the genes coding for the P21 and P32 toxoplasm antigens, and the characterization of these antigens.
il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. it goes without saying, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
EXEMPLE i : PURIFICATION DE L'ANTIGENE P21 NATIF
1]) Obtention des toxoplasmes.EXAMPLE 1 PURIFICATION OF THE NATIVE P21 ANTIGEN
1]) Obtaining toxoplasms.
Les tachyzoites de la souche RH sont obtenus à partir du liquide péritonéal de souris Swiss infectées trois jours auparavant. Les parasites sont repris en milieu RPMI-1640 (Gibco-BRL) et les cellules de souris contaminantes sont éliminées par filtration sur membrane de polycarbonate (3 prL, Nucléopore). The tachyzoites of the RH strain are obtained from the peritoneal fluid of Swiss mice infected three days earlier. The parasites are taken up in RPMI-1640 medium (Gibco-BRL) and the contaminating mouse cells are removed by filtration on polycarbonate membrane (3 PrL, Nucleopore).
2-) Purification de l'antigène P21 natif par
RP-HPLC
Les protéines de 1 x 1010 tachyzoltes sont extraites une nuit à 4 C en tampon TEN (Tris-HCl pH 7,4 10 mM, EDTA 2mM, NaCl 150 mM) contenant 1% de Nonidet P40, 100 U/ml d'Aprotinine et 40 pM de PMSF. Après centrifugation (20 min. à 3500 g), le surnageant est filtré sur 0,22 pm (MILLIPORE). Les protéines sont alors séparées par RP-HPLC (Reversed-Phase High Pressure Liquid
Chromatography) sur une colonne VYDAC C18 (300 A, particules de 7 clam, 500 x 9 mm) en 100% de solvant A (0,5% (v/v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans l'eau).2-) Purification of native P21 antigen by
RP-HPLC
The proteins of 1 × 10 10 tachyzoles are extracted overnight at 4 ° C. in TEN buffer (10 mM pH 7.4 Tris-HCl, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl) containing 1% Nonidet P40, 100 U / ml Aprotinin and 40 μM PMSF. After centrifugation (20 min at 3500 g), the supernatant is filtered through 0.22 μm (MILLIPORE). The proteins are then separated by RP-HPLC (Reversed Phase High Pressure Liquid
Chromatography) on a VYDAC C18 column (300 A, 7 clam particles, 500 x 9 mm) in 100% solvent A (0.5% (v / v) trifluoroacetic acid (TFA) in water).
Après 10 min. d'élution isocratique, les protéines sont éluées par un gradient de 0-10096 de solvant B (25/75/0,45 (v/v/v) d'eau/acétonitrile/TFA) pendant 180 min. à un débit de 2 ml/min. Les protéines sont détectées à 215 nm et chaque fraction est lyophilisée puis reprise dans 100 1 de TEN/PBS pH 8,0 10 mM (v/v).After 10 min. isocratic elution, the proteins are eluted by a 0-10096 gradient of solvent B (25/75 / 0.45 (v / v / v) water / acetonitrile / TFA) for 180 min. at a flow rate of 2 ml / min. The proteins are detected at 215 nm and each fraction is lyophilized and then taken up in 100 l of TEN / PBS pH 8.0 10 mM (v / v).
1 ,U1 de chaque fraction est alors testé en dot-blot avec les anticorps monoclonaux Tg 17-113 et
TG17-179 [CHARIF et al., Exp. Parasitol. n 71, p. 114124, (1990)]. 1, U1 of each fraction is then tested in dot-blot with the monoclonal antibodies Tg 17-113 and
TG17-179 [CHARIF et al., Exp. Parasitol. n 71, p. 114124, (1990)].
Le profil de purification est représenté à la
Figure 1 les antigènes de sécrétion GP28,5 ou GP28.5 (pic n 1) et P21 (pic n 2) sont élués successivement.The purification profile is represented at
Figure 1 secretion antigens GP28.5 or GP28.5 (peak n 1) and P21 (peak n 2) are eluted successively.
La pureté des fractions contenant l'antigène
P21 est analysée sur gel de polyacrylamide 13% (SDS-PAGE) coloré par le nitrate d'argent.The purity of the fractions containing the antigen
P21 is analyzed on 13% polyacrylamide gel (SDS-PAGE) stained with silver nitrate.
Cette coloration révèle deux bandes de poids moléculaires voisins dues à une dégradation de l'antigène
P21. En effet, ces bandes réagissent toutes deux avec l'anticorps monoclonal TG17-113.This staining reveals two bands of similar molecular weight due to a degradation of the antigen
P21. Indeed, these bands both react with the monoclonal antibody TG17-113.
Un premier essai de séquençage par la dégradation d'EDMAN a été effectué sur les fractions HPLC enrichies en antigène P21. Aucun résultat n'a pu être obtenu de cette façon, ce qui suggère un blocage de l'extrémité N-terminale par une modification posttraductionnelle. Une digestion partielle par la trypsine (clivage après les résidus Lysine et Arginine) des fractions contenant l'antigène P21 a donc été réalisée, afin de microséquencer les peptides ainsi obtenus. Ceuxci ont été séparés par chromatographie sur une colonne
VYDAC C18. Aucun pic contaminant n'a été observé sur le profil du chromatogramme, ce qui confirme l'homogénéité des fractions HPLC. Les peptides correspondant aux pics majeurs sont alors séquencés par la dégradation d'Edman sur un microséquenceur phase gaz (Applied Biosystem 470A).Les dérivés PTH-acides aminés sont identifiés par
HPLC (Applied Biosystem 120A).A first EDMAN degradation sequencing assay was performed on HPLC fractions enriched with P21 antigen. No results could be obtained in this way, suggesting N-terminal blockade by posttranslational modification. A partial digestion with trypsin (cleavage after the Lysine and Arginine residues) of the fractions containing the P21 antigen was therefore carried out in order to microsequencer the peptides thus obtained. These were separated by column chromatography
VYDAC C18. No contaminating peak was observed on the chromatogram profile, which confirms the homogeneity of the HPLC fractions. The peptides corresponding to the major peaks are then sequenced by the Edman degradation on a gas phase microsequencer (Applied Biosystem 470A). The PTH-amino acid derivatives are identified by
HPLC (Applied Biosystem 120A).
Six pics majeurs ont été purifiés en quantité suffisante pour être microséquencés. Six major peaks were purified in sufficient quantity to be microsequenced.
La séquence des peptides correspondants est la suivante
1 : DVGSGGDDSEGAR
2 : EQQQWQHQ?N(E,N) ? R
3 : SLFER
4 : A"A"VTGHPVR
5a : AIQEE (S,M)
5b : AIQEES (K,W) AEST?EE
EXEMPLE 2 : OBTENTION DES SERUMS ANTI-P21
Des rats Fisher et des souris OF1 ont reçu à 2 semaines d'intervalle 4 injections sous-cutanées de 15 Rg d'antigène P21 purifié par RP-HPLC, solubilisé dans 100 Cil de PBS pH 7,4 et émulsifié dans 100 l d'adjuvant complet de Freund.The sequence of the corresponding peptides is as follows
1: DVGSGGDDSEGAR
2: EQQQWQHQ? N (E, N)? R
3: SLFER
4: A "A" VTGHPVR
5a: AIQEE (S, M)
5b: AIQEES (K, W) AEST? EE
EXAMPLE 2: OBTAINING ANTI-P21 SERUMS
Fisher rats and OF1 mice received, at 2-week intervals, 4 subcutaneous injections of 15 μg of purified P21 antigen by RP-HPLC, solubilized in 100 μl of PBS pH 7.4 and emulsified in 100 μl of complete adjuvant of Freund.
L'immunsérum obtenu a été testé par Transfert immuno-électrophorétique et sur un extrait de tachyzoites. Cette analyse a révélé une polyspécificité inattendue, compte tenu de l'homogénéité de la fraction
HPLC. Trois bandes majeures sont en effet détectées sur l'extrait de tachyzoites : 21, 28 et 32 kDa. Ces trois bandes sont d'égale intensité, suggérant soit la présence dans les fractions de quantités minimes de contaminants très immunogènes, soit une réactivité croisée entre différents antigènes.The antiserum obtained was tested by immunoelectrophoretic transfer and on a tachyzoite extract. This analysis revealed an unexpected polyspecificity, given the homogeneity of the fraction
HPLC. Three major bands are indeed detected on the tachyzoite extract: 21, 28 and 32 kDa. These three bands are of equal intensity, suggesting either the presence in the fractions of minimal amounts of highly immunogenic contaminants, or cross-reactivity between different antigens.
La bande reconnue à 28 kDa pourrait être due à la présence de faibles quantités de l'antigène de sécrétion GP28.5 dans les fractions HPLC. En effet, lors de la purification par chromatographie, cet antigène très immunogène est élué dans les fractions qui précèdent celles contenant l'antigène P21. The band recognized at 28 kDa could be due to the presence of small amounts of GP28.5 secretion antigen in the HPLC fractions. Indeed, during purification by chromatography, this highly immunogenic antigen is eluted in the fractions that precede those containing the P21 antigen.
Malgré leur polyspécificité, ces sérums anti fraction HPLC ont été utilisés pour le criblage de la banque d'ADNc de tachyzoites construite dans le vecteur d'expression XZap II (cf exemple 3 ci-dessous). Despite their polyspecificity, these HPLC anti-fraction sera were used for screening of the tachyzoite cDNA library constructed in the XZap II expression vector (see Example 3 below).
EXEMPLE 3 : CLONAGE ET CARACTERISATION DES GENES CODANT
POUR LES ANTIGENES P21 ET P32
A -Techniques générales utilisées
Pour plus de précisions sur les techniques générales de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire qui ne sont pas détaillées dans les exemples qui suivent, on peut se reporter à l'ouvrage de
MANIATIS et al.[A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1990)].EXAMPLE 3: CLONING AND CHARACTERIZATION OF THE GENES ENCODING
FOR ANTIGENS P21 AND P32
A -General techniques used
For more details on the general techniques of manipulation of nucleic acids and molecular cloning which are not detailed in the examples which follow, reference may be made to
MANIATIS et al [A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1990)].
1- Banque d'ADNc de tachyzoïtes
a- Construction
L'ARN de tachyzoites de la souche RH est purifié par extraction au Lithium/urée. La construction de la banque est effectuée à l'aide de kits STRATAGENE.1- Tachyzoite cDNA bank
a- Construction
The tachyzoite RNA of strain RH is purified by lithium / urea extraction. The construction of the bank is performed using STRATAGENE kits.
L'ARN poly(A) est séparé par passage sur une colonne oligodT ("Poly(A) QuickTM mRNA Purification Kit"). 511g d'ARN poly(A) sont alors soumis à une transcription inverse ("Uni ZapTM XR Kit") initiée par un primer polyT.The poly (A) RNA is separated by passage over an oligodT column ("Poly (A) QuickTM mRNA Purification Kit"). 511 g of poly (A) RNA are then subjected to reverse transcription ("Uni ZapTM XR Kit") initiated by a polyT primer.
Après digestion de la matrice ARN par la RNase
H, le second brin de l'ADNc est synthétisé par la DNA polymérase I. Des adaptateurs EcoRI sont alors ligués de manière non sélective aux deux extrémités des ADNc double brin. Une digestion ultérieure par l'enzyme Xhol permet ainsi de libérer en 3' le site Xhol introduit par le primer de la transcription reverse, alors que l'extrémité 5' porte toujours le site EcoRI. Les ADNc sont ensuite séparés selon leur taille sur colonne ULTROGEL AcA34 (IBF
BIOTECHNICS). Les plus grands fragments sont alors ligués dans leur orientation 5'-3' dans le vecteur d'expression XZapII digéré par les enzymes EcoRI (5') et Xhol (3').After digestion of the RNA template with RNase
H, the second strand of the cDNA is synthesized by DNA polymerase I. EcoRI adapters are then ligated non-selectively at both ends of the double-stranded cDNAs. Subsequent digestion with the XhoI enzyme thus makes it possible to release the XhoI site introduced by the primer from the reverse transcription at 3 ', while the 5' end still carries the EcoRI site. The cDNAs are then separated according to their size on ULTROGEL AcA34 column (IBF
BIOTECHNICS). The larger fragments are then ligated in their 5'-3 'orientation in the XZapII expression vector digested with the enzymes EcoRI (5') and XhoI (3 ').
Les ADNc sont insérés dans le gène Lac Z, en aval d'un cadre de lecture ouvert codant pour la partie N-terminale de la ,8-galactosidase (4kDa). The cDNAs are inserted into the Lac Z gene, downstream of an open reading frame coding for the N-terminal portion of β-galactosidase (4kDa).
Après "empaquetage" de 1'ADN dans des protéines phagiques ("Gigapack II Gold packaging extract"), le titre de la banque est estimé en étalant différentes dilutions en présence de la souche E. coli
PLK-F'. La même souche est utilisée pour l'amplification de la banque.After "packaging" of the DNA into phage proteins ("Gigapack II Gold packaging extract"), the title of the library is estimated by plotting different dilutions in the presence of the E. coli strain.
PLK-F '. The same strain is used for the amplification of the bank.
b - Criblage:
- Criblage en expression
La banque est étalée en présence de la souche
E. coli XLl-Blue sur boîtes NZY. Les bactéries sont préalablement rendues compétentes par une incubation d'une heure en MgSO4 10mM. Après 2 h d'incubation à 42
C, un filtre imbibé dIPTG 10IrE et séché est déposé sur le tapis bactérien de façon à induire l'expression des protéines recombinantes, une nuit à 37- C. Les filtres sont saturés en TN1 contenant 5 % de lait en poudre (Gloria) puis incubés 2 h avec le sérum de rat anti-P21 dilué au 1/200e dans le même tampon. Après trois lavages de 15 min., en TN1, les filtres sont incubés 1 h avec des anticorps de chèvre anti-IgG de souris couplés à la
Peroxydase (Diagnostic Pasteur), au 1/500e en TN1, puis révélés après lavages.b - Screening:
- Screening in expression
The bank is spread in the presence of the strain
E. coli XLl-Blue on NZY plates. The bacteria are previously made competent by incubation for one hour in 10 mM MgSO4. After 2 hours of incubation at 42
C, a filter impregnated with IPI 10IrE and dried is deposited on the bacterial carpet so as to induce the expression of recombinant proteins overnight at 37 ° C. The filters are saturated with TN1 containing 5% milk powder (Gloria) then incubated for 2 h with anti-P21 rat serum diluted 1/200 in the same buffer. After three 15 min washes in TN1, the filters are incubated for 1 hour with goat anti-mouse IgG antibodies coupled to the
Peroxidase (Diagnostic Pasteur), at 1 / 500th in TN1, then revealed after washing.
Le criblage différentiel avec l'anticorps monoclonal Tg 17-179, dirigé contre l'antigène de sécrétion GP28,5 est effectué dans les mêmes conditions. The differential screening with the monoclonal antibody Tg 17-179, directed against the secretion antigen GP28.5 is carried out under the same conditions.
- Criblage en hybridation
La banque est étalée en présence des bactéries
E. coli XLl-Blue compétentes sur boîtes NZY, une nuit à 37 C. Une empreinte des plages de lyse est réalisée sur filtre de nitrocellulose. Ces filtres sont dénaturés par contact pendant 1 min. avec NaOH 0,5M, NaCl 1,5M puis neutralisés 8 à 10 min. par Tris-HCI pH 7,5 1M, NaCl 1,5M. Les filtres sont ensuite rincés 10 mn. en 2 x SSC, séchés puis l'ADN est fixé à 80 C pendant 2 h.Les filtres sont préhybridés en 6 xSSC, 0,25 96 lait en poudre puis hybridés dans le même milieu contenant la sonde marquée au 32P et dénaturée, une nuit à 65 C (T-H). Les lavages sont effectués en 2 x SSC, 0,1 % SDS, 0,25 96 lait en poudre, 2 x 30 min. à température ambiante puis 2 x 30 min., à (T-H-5 à 10 C) en 0,1 x SSC, 0,1 % SDS. Les filtres sont alors séchés puis autoradiographiés une nuit à -80- C (Hyperfilm MP, Amersham).- Hybridization Screening
The bank is spread in the presence of bacteria
E. coli XL1-Blue competent on NZY plates, overnight at 37 C. An imprint of the lysis plaques is carried out on a nitrocellulose filter. These filters are denatured by contact for 1 min. with 0.5M NaOH, 1.5M NaCl and then neutralized for 8-10 min. by Tris-HCl pH 7.5 1M, NaCl 1.5M. The filters are then rinsed for 10 minutes. in 2 x SSC, dried and the DNA is fixed at 80 ° C. for 2 h. The filters are prehybridized at 6 × SSC, 0.25 × 96 milk powder and then hybridized in the same medium containing the 32 P-labeled probe and denatured, night at 65 C (TH). The washes are carried out in 2 x SSC, 0.1% SDS, 0.25% milk powder, 2 x 30 min. at room temperature then 2 x 30 min at (TH-5 at 10 C) in 0.1 x SSC, 0.1% SDS. The filters are then dried and then autoradiographed overnight at -80 ° C. (Hyperfilm MP, Amersham).
Les clones positifs sont purifiés par un nouvel étalement sur boîte NZY. Les empreintes sont alors hybridées par la même sonde, marquée cette fois par la
Digoxigénine ("Non radioactive DNA labeling and detection kit", Boehringer Mannheim).The positive clones are purified by a new spread on NZY box. The fingerprints are then hybridized by the same probe, this time marked by the
Digoxigenin ("Non radioactive DNA labeling and detection kit", Boehringer Mannheim).
c - Excision : passage à la forme plasmidique des clones #Zap II
Les clones phagiques XZap II peuvent être obtenus sous forme plasmidique sans sous-clonage des inserts : cette étape est réalisée in vivo. Les clones XZap II positifs purifiés sont mis en contact avec des XLl-Bîue compétentes, en présence du phage "helper" R408 (Stratagène) pendant 15 min. à 37 C puis l'ensemble est mis en culture en milieu 2TY, 3 h à 37 C sous agitation.c - Excision: change to the plasmid form of clones #Zap II
The phage clones XZap II can be obtained in plasmid form without subcloning the inserts: this step is performed in vivo. Purified XZap II positive clones are contacted with competent XL1-B1e in the presence of helper phage R408 (Stratagene) for 15 min. at 37 C then the whole is cultured in 2TY medium, 3 h at 37 C with stirring.
Lors de cette étape, une partie de ce phage est répliquée sous forme de "phagemide" pBluescript, c'est-à-dire d'ADN double brin plasmidique. Les cellules sont ensuite lysées pendant 20 min. à 70 C et les débris sont éliminés par centrifugation. Le surnageant est mis en contact avec de nouvelles bactéries compétentes qui sont étalées cette fois sur boîtes LB-Ampicilline (l00g/ml), une nuit à 37 C. Une colonie Amp-résistante bien isolée des colonies satellites est alors réétalée sur une nouvelle boîte afin d'éliminer les éventuelles contaminations par le phage helper.During this step, part of this phage is replicated in the form of "phagemid" pBluescript, that is to say plasmid double-stranded DNA. The cells are then lysed for 20 minutes. at 70 C and the debris is removed by centrifugation. The supernatant is brought into contact with new competent bacteria which are spread this time on LB-Ampicillin plates (100 g / ml), overnight at 37 C. An Amp-resistant colony well isolated from the satellite colonies is then respread on a new box. to eliminate possible contamination by phage helper.
2- Banque d'ADN génomique
a - Purification d'ADN génomique de tachvzoites
1010 tachyzoites de la souche RH [JOHNSON et al., Arst. J. Exp. Biol. Med. Sci., n 64, p. 351-355 (1986)] sont rincés deux fois en PBS. Le culot est resuspendu dans 10 volumes de NaCl 0,1M, EDTA 0,1M, Tris HC1 pH7,5 10mM. Après addition de 1/10 de volume de SDS 10 %, les parasites sont incubés 30 min. à 37 C en présence de 10Rg/ml de RNase, puis 3 h à 50 C avec 100Rg/ml de Protéinase K. Après deux extractions des protéines au phénol/chloroforme, 1'ADN est dialysé une nuit à 4 C contre du TE (Tris-HCl pH 8,0 10mM, EDTA 1 mM).La séparation de 1'ADN de tachyzoites et de 1'ADN de souris contaminant, basée sur la différence du % (GC) entre les deux espèces, est effectuée sur gradient de CsCl.200Rg d'ADN sont mélangés à 7,6 ml de Tris-HCl pH 8,0 50mM, EDTA 25mM saturé en CsCl puis 2001g de colorant
Hoescht 33258 (Sigma) sont ajoutés. Un volume final de 10,57 ml est obtenu par addition d'eau, déposé dans un tube à ultracentrifugation "Quick Seal" (Beckman). Le volume est complété par de la paraffine et la centrifugation est effectuée 48 h à 45000rpm (rotor
Ti90). Trois bandes d'ADN sont alors repérées sous UV, 1'ADN de tachyzoltes correspondant à la plus basse. Cette bande est prélevée à la seringue puis le colorant est extrait au N-Butanol saturé en TE. Un second gradient peut être effectué dans les mêmes conditions, afin d'éliminer 1'ADN de souris résiduel. L'ADN est ensuite dialysé une nuit à 4 C contre du TE puis la concentration est estimée par mesure de la densité optique à 260 nm.2- Genomic DNA bank
a - Purification of genomic DNA of tachvozites
1010 tachyzoites of RH strain [JOHNSON et al., Arst. J. Exp. Biol. Med. Sci., 64, p. 351-355 (1986)] are rinsed twice in PBS. The pellet is resuspended in 10 volumes of 0.1M NaCl, 0.1M EDTA, 10mM Tris HCl pH7.5. After addition of 1/10 volume of 10% SDS, the parasites are incubated for 30 min. at 37 ° C. in the presence of 10 μg / ml of RNase and then 3 h at 50 ° C. with 100 μg / ml of Proteinase K. After two extractions of the proteins with phenol / chloroform, the DNA is dialyzed overnight at 4 ° C. against TE ( Tris-HCl pH 8.0 10mM, 1mM EDTA). The DNA separation from tachyzoites and contaminating mouse DNA, based on the% difference (GC) between the two species, is performed on a gradient of CsCl.200Rg of DNA are mixed with 7.6 ml of Tris-HCl pH 8.0 50mM, 25mM EDTA saturated with CsCl then 2001g of dye
Hoescht 33258 (Sigma) are added. A final volume of 10.57 ml is obtained by adding water, deposited in a "Quick Seal" ultracentrifuge tube (Beckman). The volume is supplemented with paraffin and the centrifugation is carried out 48 h at 45000rpm (rotor
Ti90). Three DNA bands are then labeled under UV, the tachyzole DNA corresponding to the lowest. This band is taken by syringe and then the dye is extracted with saturated N-butanol in TE. A second gradient may be performed under the same conditions to eliminate residual mouse DNA. The DNA is then dialyzed overnight at 4 C against TE then the concentration is estimated by measuring the optical density at 260 nm.
b - Banaue aénomiaue
Construction
L'ADN génomique de tachyzoite est partiellement digéré par l'enzyme de restriction MboII.b - Banaue aomiaue
Construction
Genomic tachyzoite DNA is partially digested with the restriction enzyme MboII.
Les fragments de 15 à 20kb sont alors sélectionnés, et ligués dans le site BamHI du vecteur EMBL 3.Fragments of 15 to 20 kb are then selected and ligated into the BamHI site of the EMBL 3 vector.
Criblage
La banque génomique est étalée en présence de la souche E. coli P2.392 rendue compétente par incubation en MgSO4 10mM, une nuit à 37 C sur boîtes NZY. Les empreintes en nitrocellulose sont dénaturées et fixées (voir "criblage de la banque d'ADNc") puis hybridées une nuit à 68 C avec un insert ADNc purifié et marqué par la
Digoxigénine. Les clones positifs sont réétalés et criblés dans les mêmes conditions.Screening
The genomic library is plated in the presence of the competent E. coli strain P2.392 by incubation in 10mM MgSO4 overnight at 37 C on NZY plates. The nitrocellulose fingerprints are denatured and fixed (see "screening of the cDNA library") and then hybridized overnight at 68 ° C. with a purified and labeled cDNA insert.
Digoxigenin. Positive clones are respread and screened under the same conditions.
c - Sous-clonape des fraaments csénomiaues en vecteur plasmidiaue
La souche E. coli P2.392 est utilisée pour amplifier en milieu NZY les clones génomiques. Les phages sont purifiés sur gradient de CsCl avant purification de 1'ADN phagique.c - Subclone of csomial fraises as a plasmid vector
E. coli strain P2.392 is used to amplify the genomic clones in NZY medium. The phages are purified on a CsCl gradient before purification of the phage DNA.
2 à 3g d'ADN phagique sont digérés par l'enzyme de restriction appropriée, pendant 3 h à 37 C. 2 to 3 g of phage DNA are digested with the appropriate restriction enzyme for 3 hours at 37 ° C.
Un aliquot est déposé sur gel d'agarose afin de vérifier que la digestion est complète. Le reste est alors ligué en totalité dans le vecteur pUC 18 ou pUC 19, préalablement digéré et déphosphorylé. La souche E. coli
JM109 rendue compétente pour la transformation par le TFB (Maniatis, Fritsch et al. 1990) est transformée, pendant 30 min. sur glace. Après 1,5 min. de choc thermique à 42
C, les bactéries sont mises en culture 1 h à 37 C en milieu LB, afin de permettre l'expression de la résistance à l'ampicilline. Les bactéries sont étalées sur boîtes LB-Ampicilline une nuit à 37 C.An aliquot is deposited on agarose gel to verify that digestion is complete. The remainder is then fully ligated into the vector pUC 18 or pUC 19, previously digested and dephosphorylated. The E. coli strain
JM109 made competent for transformation by TFB (Maniatis, Fritsch et al., 1990) is transformed for 30 min. on ice. After 1.5 min. of heat shock at 42
C, the bacteria are cultured 1 h at 37 C in LB medium, to allow the expression of ampicillin resistance. The bacteria are plated on LB-Ampicillin plates overnight at 37 C.
Les colonies sont alors repiquées en double sur boîtes quadrillées afin de permettre un criblage en hybridation. Une empreinte en nitrocellulose est réalisée sur la moitié de ces boîtes. Ces empreintes sont dénaturées pendant 5 à 10 min. avec NaOH 0,5M, NaCl 1,5M puis neutralisées 15 à 20 min. par Tris-HCl pH 7,5 1M,
NaCl 1,5M. Les filtres sont ensuite rincés 10 min. en 2 x
SSC, séchés puis 1'ADN est fixé à 80 C pendant 2 h.The colonies are then transplanted in duplicate on gridded boxes in order to allow hybridization screening. A nitrocellulose impression is made on half of these boxes. These prints are denatured for 5 to 10 min. with 0.5M NaOH, 1.5M NaCl and then neutralized for 15 to 20 min. with Tris-HCl pH 7.5 1M,
1.5M NaCl. The filters are then rinsed for 10 minutes. in 2 x
SSC, dried and then the DNA is fixed at 80 ° C. for 2 hours.
L'excès de matériel est éliminé par incubation des filtres en 3 x SSC, 0,1 96 SDS, 3 h à 50 C, puis par une digestion par la Protéinase K à 100Fg/ml en 2 x SSC, 0,1 % SDS, 1 h à 56 C. Les filtres sont ensuite préhybridés et hybridés dans les conditions standard avec un insert
ADNc marqué par la Digoxigénine.Excess material is removed by incubating the filters at 3 x SSC, 0.196 SDS, 3 h at 50 C, and then digestion with Proteinase K at 100 Fg / ml in 2 x SSC, 0.1% SDS. , 1 h to 56 C. The filters are then prehybridized and hybridized under standard conditions with an insert
CDNA labeled with Digoxigenin.
3 - Préparations de plasmides
Après transformation, les colonies sont testées en minipréparation de plasmide par la technique de lyse alcaline. Le matériel est digéré par les enzymes de restriction appropriées en présence de RNase.3 - Preparations of Plasmids
After transformation, the colonies are tested in plasmid minipreparation by the alkaline lysis technique. The material is digested with the appropriate restriction enzymes in the presence of RNase.
Les purifications de plasmide à grande échelle sont réalisées par la technique de "boiling" suivi d'un gradient sur CsCl-Bromure d'Ethidium. Après extraction du
BrEt au N-Butanol, 1'ADN est dialysé contre du TE et précipité si la concentration est insuffisante.Plasmid purifications on a large scale are carried out by the "boiling" technique followed by a gradient on CsCl-Ethidium bromide. After extraction from
When N-butanol is brominated, the DNA is dialyzed against TE and precipitated if the concentration is insufficient.
4 - Sondes nucléiques
Purification
Le plasmide recombinant purifié sur gradient de CsCl est digéré par des enzymes de restriction pendant 2 à 3 h à 37 C. L'insert ainsi libéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose. Après coloration du gel au Bromure d'Ethidium, la portion de gel contenant l'insert est découpée puis placée dans un tube de 1,5ml préalablement percé et contenant de la laine de verre siliconée tassée (Interchim). Ce tube est emboîté sur un seconde tube et l'insert est élué par centrifugation à 6.000rpm pendant 10 min.Les débris d'agarose sont éliminés par 2 extractions au phénol/chloroforme puis l'insert est précipité une nuit à -20 C par addition de 1/10e de volume d'Acétate de Sodium pH 5,2 3M et de 2 volumes d'Ethanol 100 96. Après 10 min. de centrifugation à 13.000rpm, l'insert est repris en TE
Marquage par le 32p
25ng d'insert sont dénaturés 5 min. à 100. C puis transférés rapidement sur glace. Le marquage est effectué par la polymérase Klenow selon la méthode des amorces aléatoires en présence de (a32P)-dCTP (AMERSHAM)
Marquage par la Digoxigénine
Le marquage est effecctué à l'aide du "Non radioactive DNA labeling and detection kit", (BOEHRINGER MANNHEIM). 4 - Nucleic probes
Purification
The recombinant plasmid purified on a CsCl gradient is digested with restriction enzymes for 2 to 3 hours at 37 ° C. The insert thus released is separated by agarose gel electrophoresis. After staining the gel with Ethidium Bromide, the gel portion containing the insert is cut and placed in a 1.5ml tube previously drilled and containing the packed silicone glass wool (Interchim). This tube is fitted on a second tube and the insert is eluted by centrifugation at 6,000 rpm for 10 minutes. The agarose debris is removed by 2 extractions with phenol / chloroform and the insert is then precipitated overnight at -20 ° C. addition of 1 / 10th volume of Sodium Acetate pH 5.2 3M and 2 volumes of Ethanol 100 96. After 10 min. centrifugation at 13,000rpm, the insert is taken up in TE
Marking by the 32p
25ng of insert are denatured 5 min. at 100. C then transferred quickly on ice. The labeling is carried out by the Klenow polymerase according to the random primer method in the presence of (a32P) -dCTP (AMERSHAM)
Digoxigenin labeling
The labeling is effecctué using the "Non radioactive DNA labeling and detection kit", (BOEHRINGER MANNHEIM).
Hybridation
Les Southern blots et Northern blots sont réalisés selon les techniques standard.Hybridization
Southern blots and Northern blots are made according to standard techniques.
5 - Purification d'anticorps sur protéines recombinantes
Les clones XZap II sont étalés de façon à obtenir l'expression des protéines de fusion (voir l-b "criblage en expression de la banque ADNc").5 - Purification of antibodies on recombinant proteins
The XZap II clones are plated to obtain expression of the fusion proteins (see "Expression screening of the cDNA library").
Sélection négative (épuisement de sérums) 10 ml de TN1 (Tris-HCl pH 7,5 10 mM, NaCl 0,15M) -lait 5 % contenant le sérum de rat anti-P21 native dilué au 1/200e sont passés successivement sur quatre filtres. Le sérum ainsi épuisé sur les protéines recombinantes est comparé au sérum non épuisé sur un Transfert immunoélectrophorétique d'extrait total de tachyzoites. Negative selection (depletion of sera) 10 ml of TN1 (10 mM pH 7.5 Tris-HCl, 0.15M NaCl) -5% milk containing the anti-native P21 rat serum diluted 1/200 filters. The serum thus exhausted on the recombinant proteins is compared with the serum not exhausted on an immunoelectrophoretic transfer of total extract of tachyzoites.
Sélection positive (élution)
Les filtres sont incubés 3 h avec le sérum de souris anti-P21 native au 1/100e en TN2 (pH 8,0) - lait 5%. Après lavages en TN2, les anticorps fixés sur les protéines recombinantes sont élués par 4ml de KSCN 3,5M, 10 min. sous agitation douce. Après addition de 15CL1 de
BSA 20 % et de 150CL1 de 10 x TBS (Tris-HCl pH 8,3 0,5M,
NaCl 1M), les anticorps sont dialysés une nuit à 4 C contre du 1 x TBS puis analysés sur Transfert immunoélectrophorétique d'extrait total de tachyzoites. Positive selection (elution)
The filters are incubated for 3 h with the anti-native P21 mouse serum at 1 / 100th in TN2 (pH 8.0) - 5% milk. After washing with TN2, the antibodies fixed on the recombinant proteins are eluted with 4 ml of 3.5M KSCN, 10 min. with gentle stirring. After addition of 15CL1 of
BSA 20% and 150CL1 of 10 x TBS (Tris-HCl pH 8.3 0.5M,
NaCl 1M), the antibodies are dialyzed overnight at 4 C against 1 x TBS and then analyzed on immunoelectrophoretic transfer of total extract of tachyzoites.
6 - Produits de traduction des clones
Le vecteur pBluescript permet de synthétiser 1'ARN sens ou antisens correspondant à l'insert ADNc cloné, grâce à des promoteurs de transcription des phages
T3 et T7 clonés de part et d'autre du polylinker. Chaque matrice est purifiée sur gradient de CsCl. lyg est linéarisé en 3' de l'insert ADNc par Xhol ou Kpnl, 1 h à 37 C puis traité par la Protéinase K à 50fg/ml 30 min. à 37 C. Après extraction par le phénol/chloroforme, 1'ADN est précépité à - 20'C et centrifugé. Le culot est repris en TE.La transciption in vitro est réalisée par 25U de
T3 ARN polymérase (Boehringer), 30 min à 37 C puis la matrice ADN est éliminée par digestion à la Dnase I, 15 min à 37 C. L'ARN est précipité 1 h à - 20'C après extraction au phénol/chloroforme. Après estimation à 260nm de la quantité d'ARN synthétisé, la traduction in vitro est réalisée sur l,5Rg en présence de 35S-
Méthionine (Amersham) et d'acides aminés froids, par un lysat de réticulocytes (Génofit), pendant 90 min. à 30
C. La quantité d'acide aminé radioactif incorporée est estimée par précipitation à l'acide trichloroacétique.6 - Translation products of clones
The pBluescript vector makes it possible to synthesize the sense or antisense RNA corresponding to the cloned cDNA insert, by means of phage transcription promoters.
T3 and T7 cloned on both sides of the polylinker. Each matrix is purified on a CsCl gradient. lyg is linearized in 3 'of the cDNA insert by XhoI or KpnI, 1 h at 37 ° C. and then treated with Proteinase K at 50 μg / ml for 30 min. at 37 ° C. After extraction with phenol / chloroform, the DNA is precipitated at -20 ° C. and centrifuged. The pellet is taken up in TE. The transciption in vitro is carried out by 25U of
T3 RNA polymerase (Boehringer), 30 min at 37 ° C., then the DNA template is removed by digestion with DNase I, 15 min at 37 ° C. The RNA is precipitated for 1 h at -20 ° C. after phenol / chloroform extraction. After estimation at 260 nm of the amount of RNA synthesized, the in vitro translation is carried out on 1.5 g in the presence of 35%.
Methionine (Amersham) and cold amino acids, by a reticulocyte lysate (Genofit), for 90 min. at 30
C. The amount of radioactive amino acid incorporated is estimated by precipitation with trichloroacetic acid.
Les produits de traduction sont analysés en SDS-PAGE 13 %. Après 30 min. d'incubation en liquide scintillant (Amplify, Amersham), le gel est séché et autoradiographié.The translation products are analyzed in SDS-PAGE 13%. After 30 min. Incubation in scintillant liquid (Amplify, Amersham), the gel is dried and autoradiographed.
La traduction in vitro de 911g d'ARN totaux de tachyzoites est réalisée en parallèle. The in vitro translation of 911 g of total tachyzoite RNA is performed in parallel.
L'ARNm correspondant aux inserts ADNc est synthétisé in vitro puis traduit en présence de 35S-Met. The mRNA corresponding to the cDNA inserts is synthesized in vitro and then translated in the presence of 35S-Met.
Les produits de traduction (Pt) sont analysées en SDS
PAGE.Translation products (Pt) are analyzed in SDS
PAGE.
B - CLONAGE DES GENES CODANT POUR POUR LES
ANTIGENES DE 21 ET 32 KDA
1 - Obtention des clones d'ADNc
Le criblage de la banque d'ADNc construite dans le vecteur d'expression XZap II à l'aide de sérum de rat anti-P21 (obtenu selon le protocole décrit à l'exemple 2), a conduit à l'isolement de 17 clones d'ADNc.B - CLONING GENES ENCODING FOR
ANTIGENS OF 21 AND 32 KDA
1 - Obtaining the cDNA Clones
Screening of the cDNA library constructed in the XZap II expression vector with anti-P21 rat serum (obtained according to the protocol described in Example 2), led to the isolation of 17 clones. cDNA.
La polyspécificité du sérum anti-P21 laissant à penser que certains des clones comprenaient des fragments d'ADN qui n'étaient pas dérivés du gène de P21, des criblages supplémentaires ont été effectués pour différencier ces clones. The polyspecificity of the anti-P21 serum suggesting that some of the clones included DNA fragments that were not derived from the P21 gene, additional screens were performed to differentiate these clones.
Un premier criblage différentiel avec l'anticorps monoclonal TG17-179 dirigé contre l'antigène
GP28.5 a permis l'élimination d'un seul clone.First Differential Screening with TG17-179 Monoclonal Antibody Against Antigen
GP28.5 allowed the elimination of a single clone.
Après passage in vivo à la forme plasmidique pBluescript les 16 clones restants ont classés par hybridations croisées chacun des inserts, purifié et marqué est hybridé en Southern Blot à tous les inserts des autres clones. After passage in vivo to the pBluescript plasmid form, the remaining 16 clones classified by cross hybridization each of the inserts, purified and labeled is hybridized in Southern Blot to all the inserts of the other clones.
Quatre familles d'hybridation ont ainsi été identifiées. Elles sont représentées par les inserts 1, 3, 13 et 33.2 et contiennent respectivement 6, 1, 6 et 3 clones d'ADNc. Four hybridization families have thus been identified. They are represented by inserts 1, 3, 13 and 33.2 and contain respectively 6, 1, 6 and 3 cDNA clones.
Dans un deuxième temps, les produits de traduction codés par les inserts d'ADNc ont été analysés. In a second step, the translation products encoded by the cDNA inserts were analyzed.
Le vecteur pBluescript permet de transcrire in vitro l'ARNm correspondant à l'insert. La traduction in vitro de ces ARNm a été réalisée en présence de 35S-méthionine.The pBluescript vector makes it possible to transcribe in vitro the mRNA corresponding to the insert. The in vitro translation of these mRNAs was carried out in the presence of 35 S-methionine.
L'analyse des produits de traduction en SDS
PAGE a permis d'écarter deux familles de clones la première représentée par le clone 33.2, la seconde, représentée par le clone 3.Analysis of translation products in SDS
PAGE allowed to separate two families of clones the first represented by clone 33.2, the second, represented by clone 3.
Un autre criblage a été effectué à l'aide d'anticorps purifiés par affinité sur les protéines recombinantes exprimées par les clones sous leur forme phagique (Zap II) (cf protocole décrit ci-dessus). Another screening was carried out using antibodies purified by affinity on the recombinant proteins expressed by the clones in their phage form (Zap II) (see protocol described above).
Le sérum de rat anti-P21 (préparé contre la protéine purifiée par RP-HPLC), épuisé sur les protéines recombinantes exprimées par le clone 13 ne reconnait plus la bande de 32 kDa. Les anticorps de rat fixés sur ces protéines recombinantes, trop fragiles, n'ont toutefois pas pu être récupérés par élution. Anti-P21 rat serum (prepared against purified protein by RP-HPLC), depleted on the recombinant proteins expressed by clone 13, no longer recognizes the 32 kDa band. The rat antibodies fixed on these recombinant proteins, too fragile, however, could not be recovered by elution.
Un sérum de souris dirigé contre l'antigène
P21 purifié par HPLC a été préparé selon le protocole décrit à l'exemple 2. En Transfert immunoélectrophorétique, ce sérum reconnaît trois bandes majeures à 21, 28 et 32 kDa ainsi que de nombreuses bandes mineures, dans un extrait total de tachyzoltes.A mouse serum directed against the antigen
P21 purified by HPLC was prepared according to the protocol described in Example 2. In immunoelectrophoretic transfer, this serum recognizes three major bands at 21, 28 and 32 kDa as well as many minor bands, in a total extract of tachyzoltes.
Ce sérum a été épuisé sur les protéines recombinantes exprimées par les clones 1 et 13 ; les anticorps fixés sur les protéines recombinantes ont été élués par le KSCN et leur spécificité a été analysée sur un extrait de tachyzoltes. Les anticorps élués à partir du clone 1 détectent une bande comigrant avec celle reconnue par le monoclonal TG17-113, ainsi qu'une bande plus faible à 32 kDa. Les anticorps élués du clone 13 révèlent une bande à 32 kDa (confirmant le résultat observé avec le sérum de rat) et une bande à 21 kDa, avec une intensité pratiquement identique. Cette observation confirme l'existence d'un antigène de 32 kDa présentant une réactivité croisée avec l'antigène de 21 kDa. This serum was exhausted on the recombinant proteins expressed by clones 1 and 13; antibodies bound to the recombinant proteins were eluted by KSCN and their specificity was analyzed on a tachyzole extract. Antibodies eluted from clone 1 detect a band comigrant with that recognized by the monoclonal TG17-113, as well as a lower band at 32 kDa. The antibodies eluted from clone 13 revealed a 32 kDa band (confirming the result observed with rat serum) and a 21 kDa band, with a substantially identical intensity. This observation confirms the existence of a 32 kDa antigen with cross-reactivity with the 21 kDa antigen.
La banque d'ADN génomique de tachyzoites a été criblée en hybridation, en utilisant des sondes obtenues à partir des inserts ADNc des clones 1 et 43, ce qui a permis de sélectionner les clones génomiques possédant des inserts codant respectivement pour les antigènes de 21 et 32 kDa. The genomic DNA library of tachyzoites was screened for hybridization, using probes obtained from the cDNA inserts of clones 1 and 43, which made it possible to select the genomic clones having inserts coding respectively for the antigens of 21 and 32 kDa.
C - DETERMINATION DE LA SEQUENCE DU GENE
CODANT POUR L'ANTIGèNE P21
La séquence du gène de la P21 a été établie parallèlement à partir des clones comprenant des inserts génomiques et des clones comprenant des inserts d'ADNc.C - DETERMINATION OF THE SEQUENCE OF THE GENE
ENCODING ANTIGEN P21
The P21 gene sequence was established in parallel from clones comprising genomic inserts and clones comprising cDNA inserts.
Cette séquence est représentée sur la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ.ID. NO 1. This sequence is represented on the list of sequences in annex under the number SEQ.ID. NO.
Ce gène ne contient pas d'intron, et est constitué de 861 pb. Le cadre de lecture ouvert code potentiellement pour 136 acides aminés. Le premier codon
ATG rencontré dans ce cadre se trouve dans un contexte favorable d'initiation (A-3 et G+4) et permet la traduction d'une protéine de 133 acides aminés. Cette région codante est encadrée de deux régions non traduites, de 102 pb en 5' et de 319 pb en 3'.This gene does not contain an intron, and consists of 861 bp. The open reading frame potentially encodes 136 amino acids. The first codon
ATG encountered in this context is in a favorable context of initiation (A-3 and G + 4) and allows the translation of a protein of 133 amino acids. This coding region is flanked by two untranslated regions, 102bp at 5 'and 319bp at 3'.
Dans la séquence SEQ. ID N 1 représentée sur la liste des séquences en annexe, les codons stop encadrant le cadre de lecture sont doublement soulignés. In the sequence SEQ. ID N 1 represented on the list of sequences in the appendix, the stop codons framing the reading frame are doubly underlined.
La flèche verticale indique le site de clivage potentiel du peptide signal. La seconde région hydrophobe est encadrée. La flèche horizontale indique le site majeur d'initiation de la transcription, les deux pointes de flèche montrant l'extrémité 5' des deux principaux inserts ADNc étudiés (1 et 22). Le site de polyadénylation, extrémité 3' de tous les inserts ADNc, est marqué d'une étoile.The vertical arrow indicates the potential cleavage site of the signal peptide. The second hydrophobic region is framed. The horizontal arrow indicates the major transcription initiation site, with the two arrowheads showing the 5 'end of the two major cDNA inserts studied (1 and 22). The polyadenylation site, 3 'end of all cDNA inserts, is labeled with a star.
Les séquences polyT et riches en G et C sont soulignées respectivement dans la région 5' non traduite du messager et dans la région potentiellement promotrice située en amont du départ de la transcription. PolyT sequences rich in G and C are underlined respectively in the 5 'untranslated region of the messenger and in the potentially promoter region located upstream of the start of transcription.
Les 5 séquences peptidiques soulignées dans la séquence polypeptidique déduite sont celles obtenues par le microséquençage d'une fraction HPLC enrichie en antigène P21. The peptide sequences underlined in the deduced polypeptide sequence are those obtained by microsequencing an HPLC fraction enriched with P21 antigen.
D - DETERMINATION DE LA SEQUENCE DU GENE
CODANT POUR L'ANTIGENE P32
La séquence nucléotidique codant pour la P32 a été obtenue par séquencage des inserts ADNc et génomique.D - DETERMINATION OF THE SEQUENCE OF THE GENE
ENCODING ANTIGEN P32
The nucleotide sequence coding for P32 was obtained by sequencing the cDNA and genomic inserts.
Cette séquence qui est représentée sur la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ.ID. NO 2 contient un cadre de lecture ouvert codant potentiellement pour 230 acides aminés. Les codons stop sont soulignés d'un trait double. Les deux codons ATG potentiellement initiateurs sont encadrés. Les têtes de flèches indiquent l'extrémité 5' des deux principaux inserts d'ADNc étudiés (43 et 1-3). Le site de polyadénylation est représenté par une étoile. Les deux régions hydrophobes sont encadrées. Un site potentiel de
N-glycosylation est marqué d'une étoile (résidu n 74).This sequence which is represented on the list of sequences in appendix under number SEQ.ID. NO 2 contains an open reading frame potentially encoding 230 amino acids. Stop codons are underlined by a double line. The two potentially initiating ATG codons are boxed. The arrowheads indicate the 5 'end of the two major cDNA inserts studied (43 and 1-3). The polyadenylation site is represented by a star. The two hydrophobic regions are framed. A potential site of
N-glycosylation is marked with a star (residue No. 74).
Les séquences polyT de la région 5' non traduite du messager et les régions riches en G et C de la région potentiellement promotrice sont soulignées. The polyT sequences of the 5 'untranslated region of the messenger and the G and C rich regions of the potentially promoter region are underlined.
Le peptide de synthèse 188-201 et le peptide 74-100 sont soulignés dans la séquence polypeptidique déduite. Synthetic peptide 188-201 and peptide 74-100 are underlined in the deduced polypeptide sequence.
EXEMPLE 4 : STRUCTURE MOLECULAIRE COMPAREE DES
DEUX ANTIGENES DE 21 ET 32 KDA
Analyse des séquences protéiques
L'analyse en séquence primaire est réalisée grâce au programme "PC gene".EXAMPLE 4 COMPACT MOLECULAR STRUCTURE
TWO ANTIGENS OF 21 AND 32 KDA
Protein sequence analysis
The analysis in primary sequence is carried out thanks to the program "PC gene".
Les profils en 2 dimensions sont obtenus grâce au programme "HCA plot" [GABORIAUD et al., FEBS Letter, n 224, p. 149-155, (1987) ; LEMESLE-VARLOOT et al.,
Bioch. n 72, p. 555-574, (1990)]. Les séquences protéiques ont été comparées aux banques de données NBRF / PIR (44900 entrées) et Genbank/EMBL (102947 entrées).The 2-dimensional profiles are obtained by means of the "HCA plot" program [GABORIAUD et al., FEBS Letter, No. 224, p. 149-155 (1987); LEMESLE-VARLOOT et al.,
Bioch. No. 72, p. 555-574, (1990)]. Protein sequences were compared to NBRF / PIR (44,900 entries) and Genbank / EMBL (10,297 entries).
A - STRUCTURE PRIMAIRE ET PROFIL D'HYDROPHO
BICITE
1 - L'antiaène P21
La présence d'une région N-terminale hydrophobe présentant toutes les caractéristiques d'un peptide signal indique que cette protéine rentre dans le réticulum endoplasmique pour être exportée. Le site de clivage le plus probable se situe entre les acides aminés 25 et 26 ; le peptide mature serait dès lors composé de 108 acides aminés.A - PRIMARY STRUCTURE AND PROFILE OF HYDROPHO
BICITE
1 - The P21 antiaene
The presence of a hydrophobic N-terminal region having all the characteristics of a signal peptide indicates that this protein enters the endoplasmic reticulum for export. The most likely cleavage site is between amino acids 25 and 26; the mature peptide would therefore be composed of 108 amino acids.
L'analyse de ce peptide révèle une seconde région hydrophobe au milieu de la molécule dont la taille (18 acides aminés) et l'environnement (5 Arg en position
C-terminale) sont compatibles avec une région transmembranaire. La région hydrophile N-terminale de 50 acides aminés est riche en acides aminés acides (34%) et en Glycine (16%). La région C-terminale de 40 acides aminés est riche en acides aminés acides (22%) et en résidus basiques (20%). Une seule Cystéine est présente, dans la région C-terminale (position 124). Le point isoélectrique du peptide mature est de 5,9. Analysis of this peptide reveals a second hydrophobic region in the middle of the molecule whose size (18 amino acids) and the environment (5 Arg in position
C-terminal) are compatible with a transmembrane region. The N-terminal hydrophilic region of 50 amino acids is rich in acidic amino acids (34%) and glycine (16%). The C-terminal region of 40 amino acids is rich in acidic amino acids (22%) and basic residues (20%). Only one Cysteine is present in the C-terminal region (position 124). The isoelectric point of the mature peptide is 5.9.
L'absence de reconnaissance de P21 recombinant par l'anticorps monoclonal TG17-113 suggère la présence d'épitopes généré par des modifications posttraductionnelles (glycosylation, phosphorylation) de l'antigène natif. La séquence de P21 ne contient pas de sites potentiels de N-glycosylation, mais les résidus
Sérine et Thréonine pourraient être O-glycosylés
2 - L'antigène P32
La séquence codant pour l'antigène de 32 kDa possède deux codons ATG distants de 30 acides aminés. Le codon le plus proche de l'extrémité 5' est dans un contexte plus favorable d'initiation, puisqu'il est encadré de G 3 et G+4 . De plus, seul ce premier résidu méthionine est suivi d'une séquence pouvant répondre aux critères de taille d'un peptide signal.The lack of recognition of recombinant P21 by the monoclonal antibody TG17-113 suggests the presence of epitopes generated by posttranslational modifications (glycosylation, phosphorylation) of the native antigen. The P21 sequence does not contain potential N-glycosylation sites, but the residues
Serine and Threonine could be O-glycosylated
2 - The P32 antigen
The coding sequence for the 32 kDa antigen has two ATG codons 30 amino acids apart. The codon closest to the 5 'end is in a more favorable context of initiation, since it is framed by G 3 and G + 4. In addition, only this first methionine residue is followed by a sequence that can meet the size criteria of a signal peptide.
Une région hydrophobe de 19 acides aminés et bordée de résidus basiques est située entre les acides aminés 153 et 171, ce qui suggère une région transmembranaire. A hydrophobic region of 19 amino acids and bordered with basic residues is located between amino acids 153 and 171, suggesting a transmembrane region.
Le résidu Asparagine 74 est un site potentiel de N-glycosylation. The Asparagine 74 residue is a potential N-glycosylation site.
La région C-terminale de 59 acides aminés est riche en Glycine (27%) et en résidus acides (29%). The C-terminal region of 59 amino acids is rich in Glycine (27%) and acid residues (29%).
B - REPRESENTATION DES MOLECULES EN 2
DIMENSIONS ("HCA plot")
La représentation en 2 dimensions sous forme théorique d'hélice permet l'étude des "clusters" hydrophobes, mais également le rapprochement d'acides aminés éloignés en séquence primaire.B - REPRESENTATION OF MOLECULES IN 2
DIMENSIONS ("HCA plot")
The representation in 2 dimensions in theoretical form of helix allows the study of hydrophobic "clusters", but also the approximation of distant amino acids in primary sequence.
Cette représentation des deux antigènes a permis d'observer la présence de 7 motifs semblables ou similaires dans les deux molécules (Figure 2). Ces motifs, constitués de 4 à 6 acides aminés éloignés les uns des autres en séquence primaire (Figure 3), sont situés dans les domaines hydrophiles des molécules et pourraient être à l'origine des réactivités croisées observées. This representation of the two antigens made it possible to observe the presence of 7 similar or similar motifs in the two molecules (FIG. 2). These motifs, consisting of 4 to 6 amino acids distant from each other in primary sequence (Figure 3), are located in the hydrophilic domains of the molecules and could be at the origin of the cross reactivities observed.
De nombreux doublets d'acides aminés sont observés, en particulier dans la séquence de l'antigène
P32 (Figure 3).Numerous amino acid doublets are observed, particularly in the antigen sequence
P32 (Figure 3).
Figure 2 : Représentation des deux antigènes en deux dimensions et détermination des motifs communs
La séquence des antigènes P21 (A) et P32 (B) est représentée sous forme d'hélice a. Les domaines hydrophobes sont indiqués par des doubles flèches audessus de chaque séquence et les acides aminés correspondants sont entourés d'un trait double. Les régions potentiellement a-hélicoldales sont indiquées par des doubles flèches en pointillés. Les motifs d'acides aminés communs aux deux antigènes sont entourés d'un trait épais. Les deux régions hydrophiles entourées d'un trait simple correspondent au fragment exprimé sous forme recombinante (R) et au peptide de synthèse (P) obtenus à partir de P32.Figure 2: Representation of two antigens in two dimensions and determination of common motifs
The sequence of the P21 (A) and P32 (B) antigens is represented as a helix a. The hydrophobic domains are indicated by double arrows above each sequence and the corresponding amino acids are surrounded by a double line. Potentially α-helicoidal regions are indicated by double dashed arrows. The amino acid motifs common to both antigens are surrounded by a thick line. The two hydrophilic regions surrounded by a single line correspond to the fragment expressed in recombinant form (R) and synthetic peptide (P) obtained from P32.
Les acides aminés sont représentés selon leur code à une lettre. Les acides aminés particuliers sont indiqués par les symboles suivants Thr O ; Ser m
Gly + ; Prou ; Cys Figure 3 : Séquence primaire des deux antigènes
Les acides aminés composant les motifs communs aux deux antigènes (A = P21 ; B = P32) sont encadrés
Les résidus appartenant à plusieurs motifs sont encadrés et surlignés. Les doublets ou triplets d'acides aminés sont soulignés.Amino acids are represented by their one-letter code. Particular amino acids are indicated by the following symbols Thr O; Ser m
Gly +; Prou; Cys Figure 3: Primary sequence of both antigens
The amino acids that make up the motifs common to both antigens (A = P21; B = P32) are boxed
The residues belonging to several motifs are framed and highlighted. The doublets or triplets of amino acids are underlined.
L'alignement des séquences en acides aminés des antigènes P32 et P21 ne révèle aucune homologie significative (24%). Par contre, la représentation de ces deux séquences sous forme théorique d'hélice a permet d'observer 7 regroupements d'acides aminés communs pouvant expliquer la réactivité croisée observée entre ces deux antigènes. Ces motifs sont constitués d'acides aminés éloignés les uns des autres en séquence primaire. The alignment of the amino acid sequences of the P32 and P21 antigens reveals no significant homology (24%). On the other hand, the representation of these two sequences in theoretical a helix form makes it possible to observe 7 groups of common amino acids which can explain the cross reactivity observed between these two antigens. These motifs consist of amino acids distant from each other in primary sequence.
EXEMPLE 5 : PURIFICATION DES PROTEINES P21 ET P32
RECOMBINANTES
Les polypeptides codés par les inserts 1 et 13 ont été produits sous forme recombinante dans E. coli afin d'obtenir des sérums anti-P21 et anti-P32. Les inserts ont été sous-clonés dans le vecteur plasmidique d'expression pGEX 2T [SMITH and JOHNSON, Gene, n 67, p.EXAMPLE 5 PURIFICATION OF PROTEINS P21 AND P32
Recombinant
The polypeptides encoded by inserts 1 and 13 were produced in recombinant form in E. coli to obtain anti-P21 and anti-P32 sera. The inserts were subcloned into the pGEX 2T expression plasmid vector [SMITH and JOHNSON, Gene, No. 67, p.
31-40, (1988)], de façon à produire une protéine de fusion avec la protéine Sj 26. Cette protéine de 26 kDa, une Glutathion S-transférase de Schistosoma japonicum, possède une très haute affinité pour le glutathion. Le couplage du glutathion à des billes d'agarose permet une purification très rapide des protéines de fusion comprenant la Sj 26.31-40, (1988)], to produce a fusion protein with Sj 26 protein. This 26 kDa protein, a Glutathione S-transferase from Schistosoma japonicum, has a very high affinity for glutathione. The coupling of glutathione to agarose beads allows a very rapid purification of fusion proteins including Sj 26.
Les inserts ADNc sont ligués dans le vecteur pGEX. La souche E. coli JM109 rendue compétente par le traitement au TFB est transformée par le vecteur chargé. The cDNA inserts are ligated into the pGEX vector. The E. coli JM109 strain made competent by the TFB treatment is transformed by the loaded vector.
Les colonies sont testées en minipréparation de plasmides par lyse alcaline de façon à vérifier la présence de l'insert et sa bonne orientation. The colonies are tested in minipreparation of plasmids by alkaline lysis so as to verify the presence of the insert and its good orientation.
L'expression de la protéine de fusion est recherchée dans un lysat de chacun des clones sélectionnés.Expression of the fusion protein is sought in a lysate of each of the selected clones.
Une colonie exprimant la protéine de fusion est cultivée une nuit à 37 C dans 200ml de LBampicilline. Cette culture est diluée dans 2 litres pendant une heure à 37 C puis l'expression est induite pendant 1 h par addition d'IPTG 0,lmM. La culture est centrifugée 10 min. à 4- C, 3000rpm. Chaque culot correspondant à 500 ml de culture est repris dans 10 ml de PBS-TEP froid puis les bactéries sont soniquées 4 x 20 sec.. Le soniquat est centrifugé en tubes Corex à 4- C 10 min. à 10.000rpm puis le surnageant est mis en contact avec 2 ml de billes agarose-Glutathion préalablement équilibrées en PBS, environ 5 min. sur un agitateur rotatif à 4- C.Les billes sont centrifugées 2 min. à 4 C à 2000rpm puis lavées trois fois dans un grand volume de
PBS-TEP.A colony expressing the fusion protein is cultured overnight at 37 ° C. in 200 ml of LBampicillin. This culture is diluted in 2 liters for one hour at 37 [deg.] C. and then the expression is induced for 1 h by addition of 0.1M IPTG. The culture is centrifuged for 10 min. at 4- C, 3000rpm. Each pellet corresponding to 500 ml of culture is taken up in 10 ml of cold PBS-TEP, then the bacteria are sonicated 4 × 20 sec. The soniquat is centrifuged in Corex tubes at 4 ° C. for 10 min. at 10,000 rpm then the supernatant is brought into contact with 2 ml of agarose-Glutathione beads previously equilibrated in PBS, approximately 5 min. on a rotary shaker at 4- C. The beads are centrifuged for 2 min. at 4 C at 2000rpm and then washed three times in a large volume of
PBS-PET.
L'élution de la protéine de fusion est ensuite réalisée par compétition avec du glutathion libre ajouté à la concentration de 5mM en Tris-HCl pH 8,0 5 ohm. Ce "décrochage" est effectué deux fois de suite par 5 ml de cette solution, quelques minutes à 4 C. La protéine de fusion est conservée à -20- C, un aliquot étant prélevé de façon à effectuer les analyses qualitatives et quantitatives sur minigel de polyacrylamide. Elution of the fusion protein is then performed by competition with free glutathione added at the concentration of 5 mM Tris-HCl pH 8.0 5 ohm. This "stall" is carried out twice in succession by 5 ml of this solution, a few minutes at 4 ° C. The fusion protein is stored at -20 ° C., an aliquot being taken in order to carry out the qualitative and quantitative analyzes on minigel. of polyacrylamide.
La protéine de fusion est dialysée 2 x 1 h à 4 C contre du PBS pH 7,5 EDTA lmM, PMSF 0,5mM, puis concentrée sur AQUACID (CALBIOCHEM). The fusion protein is dialyzed 2 x 1 h at 4 C against PBS pH 7.5 1mM EDTA, 0.5mM PMSF, then concentrated on AQUACID (CALBIOCHEM).
EXEMPLE 6 : PRODUCTION D'ANTICORPS CONTRE LES PROTEINES
RECOMBINANTES P21 ET P32
Les protéines recombinantes sont injectées en fusion avec la protéine Sj26. Les souris Swiss OF1 reçoivent à deux semaines d'intervalle quatre injections de 10 à 15reg de chaque construction dans 100R1 de PBS, additionnés de 100,U1 d'adjuvant complet de Freund.EXAMPLE 6 PRODUCTION OF ANTIBODIES AGAINST PROTEINS
RECOMBINANT P21 AND P32
The recombinant proteins are injected in fusion with the Sj26 protein. The OF1 Swiss mice receive two injections of 10 to 15 g of each construct in 100 μl of PBS at intervals of two weeks, supplemented with 100 μl of Freund's complete adjuvant.
L'analyse par Westen blot sur un extrait de tachyzoltes de la réponse anticorps dirigée contre chacune des protéines de fusion a confirmé la réactivité croisée entre les deux antigènes. Westen blot analysis on a tachyzole extract of the antibody response directed against each of the fusion proteins confirmed cross-reactivity between the two antigens.
Le sérum anti-P21 recombinante reconnaît comme prévu l'antigène de 21 kDa. The recombinant anti-P21 serum recognizes as expected the 21 kDa antigen.
Les deux sérums anti-P21 et anti-P32 recombinantes révèlent en commun une bande à 32 kDa et un doublet à environ 28 kDa. The two recombinant anti-P21 and anti-P32 sera together reveal a 32 kDa band and a doublet at about 28 kDa.
Le sérum anti-P32 recombinante détecte en outre une bande à 24 kDa. The recombinant anti-P32 serum further detects a 24 kDa band.
Les antigènes de 32 et 21 kDa reconnus par les sérums anti-protéines recombinantes comigrent avec ceux détectés par le sérum de souris dirigé contre la fraction
HPLC . Par contre, ce dernier révèle une simple bande à 28 kDa, et non pas un doublet et ne détecte aucune bande à 24 kDa.The 32 and 21 kDa antigens recognized by the recombinant anti-protein sera comigrate with those detected by the mouse serum directed against the fraction.
HPLC. On the other hand, the latter reveals a simple band at 28 kDa, and not a doublet and detects no band at 24 kDa.
La réactivité croisée entre les antigènes P21 et P32 semble donc s'étendre à d'autres molécules, en particulier à un doublet migrant à environ 28 kDa et à un antigène de 24 kDa, définissant ainsi une famille de protéines. The cross-reactivity between the P21 and P32 antigens thus seems to extend to other molecules, in particular to a doublet migrating at about 28 kDa and a 24 kDa antigen, thus defining a family of proteins.
EXEMPLE 7 : OBTENTION D'ANTISERUMS SPECIFIQUES CONTRE DES
FRAGMENTS PEPTIDIQUES DE L'ANTIGèNE DE 32 KDA
Afin d'obtenir un anticorps spécifique contre l'antigène de 32 kDa, deux régions hydrophiles ne comportant apparemment pas de motifs communs complets avec l'antigène P21 ont été choisies de part et d'autre de la seconde zone hydrophobe
- La région N-terminale 74-100 a été sous clonée dans le vecteur d'expression pGEX 3X (fragment Hindil obtenu à partir de l'insert ADNc 13 Fragment 13HII) et produite sous forme recombinante chez
E. coli selon le protocole décrit à l'exemple 5 cidessus;
- Un peptide de synthèse a été choisi dans la région C-terminale (188-201). Ce peptide a été couplé à liovalbumine. EXAMPLE 7: OBTAINING SPECIFIC ANTISERUMS AGAINST
PEPTIDE FRAGMENTS OF ANTIGEN OF 32 KDA
In order to obtain a specific antibody against the 32 kDa antigen, two hydrophilic regions apparently lacking complete common motifs with the P21 antigen were chosen on both sides of the second hydrophobic zone.
The N-terminal region 74-100 was subcloned into the pGEX 3X expression vector (Hindil fragment obtained from the 13 Fragment 13HII cDNA insert) and produced in recombinant form at
E. coli according to the protocol described in Example 5 above;
A synthetic peptide was chosen in the C-terminal region (188-201). This peptide was coupled to liovalbumin.
Les souris Swiss OF1 sont immunisées avec ces deux peptides, selon le protocole décrit à l'exemple 6 ci-dessus. Swiss OF1 mice are immunized with these two peptides, according to the protocol described in Example 6 above.
Les sérums de souris dirigés contre ces deux fragments ont été dans un premier temps analysés sur un
Transfert immuno-électrophorétique d'extrait de tachyzoites et en immunofluorescence sur parasites fixés.The mouse sera directed against these two fragments were first analyzed on a
Immunoelectrophoretic transfer of tachyzoite extract and immunofluorescence on fixed parasites.
Le sérum anti-13HII révèle sur un Transfert immuno-électrophorétique une simple bande à 32 kDa, alors que le sérum anti-peptide 188-201 ne détecte aucun antigène. The anti-13HII serum reveals a single 32 kDa band on an immunoelectrophoretic transfer, whereas the anti-peptide 188-201 serum detects no antigen.
En revanche, les deux immunsérums permettent de détecter en immunofluorescence un marquage d'aspect granulaire sur les tachyzoltes fixés ou en coupes. Les bradyzoites présentent le même marquage, et il est également possible d'observer un faible marquage au niveau de la paroi des kystes. La présence dans la séquence en acides aminés de cette molécule de deux régions hydrophobes possédant les caractéristiques d'un peptide signal et d'une région transmembranaire conforte ces résultats. il apparaît donc que l'antigène de 32kDa représente une molécule des granules denses non décrite jusqu'à présent. On the other hand, the two immune sera make it possible to detect in immunofluorescence a marking of granular aspect on the fixed tachyzoltes or in sections. The bradyzoites have the same marking, and it is also possible to observe a weak marking at the wall of the cysts. The presence in the amino acid sequence of this molecule of two hydrophobic regions possessing the characteristics of a signal peptide and a transmembrane region confirms these results. it therefore appears that the 32kDa antigen represents a molecule of dense granules not described so far.
EXEMPLE 8 : tlNISATION DES SOURIS PAR L'ANTIGENE P21
NATIF ET RECOMBINANT
Des souris femelles OF1 âgées de 8 à 10 semaines ont été immunisées de la façon suivante quarante-deux, trente-cinq, vingt-sept et sept jours avant l'infection, l'antigène suivant
- 15 g de P21 native purifiée par HPLC a été mis en suspension dans 100 Rl de PBS, émulsifié avec 100 ,ul d'adjuvant incomplet de Freund et administrés par injection sous-cutanée. EXAMPLE 8: USE OF MOUSE BY ANTIGEN P21
NATIVE AND RECOMBINANT
Female OF1 mice 8 to 10 weeks old were immunized as follows forty-two, thirty-five, twenty-seven and seven days before infection, the next antigen
15 g of purified native P21 by HPLC was suspended in 100 μl of PBS, emulsified with 100 μl of incomplete Freund's adjuvant and administered by subcutaneous injection.
Des souris témoin ont été traitées selon le même protocole par du PBS additionné de 100 pil d'adjuvant incomplet de FREUND. Control mice were treated according to the same protocol with PBS supplemented with 100 pb of incomplete FREUND adjuvant.
Le jour de l'infection, les sérums ont été collectés, puis une suspension de 1200 kystes dans 0,3 ml de PBS, pH7,2 a été administrée oralement. On the day of infection, the sera were collected and then a suspension of 1200 cysts in 0.3 ml of PBS, pH 7.2 was administered orally.
Les sérums des souris immunisées avec la P21 purifiée par HPLC ont été testés par transfert immunoélectrophorétique, contre un extrait NP.40 de tachyzoites, afin de déterminer s'ils reconnnaissent l'antigène P21. Sera from mice immunized with HPLC-purified P21 were immunoelectrophoretically transferred against an NP.40 extract of tachyzoites to determine if they recognize P21 antigen.
La figure 4 représente le pourcentage de souris survivantes après l'infection dans le cas d'une expérience d'immunisation par l'antigène P21 natif. Figure 4 shows the percentage of surviving mice after infection in the case of an immunization experiment with native P21 antigen.
Dans une première expérience (figure 4a), alors que seulement 15% des souris témoin immunisées uniquement avec l'adjuvant incomplet de FREUND (+) survivent 15 jours après l'infection, 40% des souris immunisées avec l'antigène P21 purifié par HPLC (Ck) sont encore vivantes. 50 jours après l'infection, le pourcentage de survie n'a pas diminué, alors qu'il est inférieur à 10% chez les animaux témoin. In a first experiment (FIG. 4a), whereas only 15% of the control mice immunized solely with the incomplete FREUND (+) adjuvant survive 15 days after infection, 40% of the mice immunized with HPLC purified antigen P21 (Ck) are still alive. At 50 days after infection, the survival percentage did not decrease, while it was less than 10% in the control animals.
Une deuxième expérience (figure 4b) a abouti à des résultats similaires. A second experiment (Figure 4b) yielded similar results.
Ces résultats montrent que l'immunisation avec l'antigène P21 purifié par HPLC conduit à une protection significative. These results show that immunization with purified P21 antigen by HPLC leads to significant protection.
Dans une autre expérience de protection, il a été constaté que à Jll, l'immunisation de souris par l'antigène P21 natif purifié, et l'antigène P21 recombinant confèraient respectivement 31 %, et 15% de survie, et qu'à J85, les taux de survie sont respectivement de 15 et 8% chez les animaux immunisés par
P21 natif et P21 recombinant.In another protection experiment, it was found that at J11, immunization of mice with purified native P21 antigen, and recombinant P21 antigen conferred respectively 31%, and 15% survival, and that at J85 , the survival rates are respectively 15 and 8% in animals immunized with
Native P21 and recombinant P21.
Les résultats d'immunisation de cette dernière expérience sont plus faibles que ceux des premières ceci s'explique par une charge parasitaire initiale particulièrement importante. The results of immunization of this last experiment are weaker than those of the first this is explained by a particularly important initial parasite load.
EXEMPLE 9 : REACTIVITE DES SERUMS HUMAINS AVEC L'ANTIGENE
P32 RECOMBINANT
Les sérums humains ont été obtenus à partir de patients porteurs d'une infection aigue ou chronique par
Toxoplasma gondii (TG positif). Des sérums de patients sains ont été utilisés comme témoin (TG négatif). Le test a été réalisé par ELISA, et la révélation faite en utilisant des anticorps anti-IgG humaines biotinylées la fixation de ces anticorps a été décelée en utilisant des complexes streptavidine-biotine marqués à la peroxydase. Le substrat de peroxydase utilisé est l'OPD et la densité optique a été mesurée à 492 nm
Les résultats obtenus montrent que l'antigène
P32 recombinant est reconnu par tous les sérums de patients infectés par T. gondii .Au contraire, dans les conditions expérimentales utilisées, l'antigène P21 recombinant n'est reconnu par aucun d'entre eux. I1 apparaît donc que, malgré la présence de motifs communs, le ou les épitopes de P32 immunogènes chez l'homme sont soit absents soit non antigéniques dans P21. il semble d'ailleurs en être de même chez la souris, puisque le sérum anti-P32 recombinant ne reconnaît pas P21. EXAMPLE 9 REACTIVITY OF HUMAN SERUM WITH ANTIGEN
P32 RECOMBINANT
Human sera were obtained from patients with acute or chronic infection
Toxoplasma gondii (TG positive). Sera from healthy patients were used as control (TG negative). The assay was performed by ELISA, and the revelation made using biotinylated anti-human IgG antibodies binding of these antibodies was detected using streptavidin-biotin complexes labeled with peroxidase. The peroxidase substrate used is OPD and the optical density was measured at 492 nm
The results obtained show that the antigen
Recombinant p32 is recognized by all the sera of patients infected with T. gondii. On the contrary, under the experimental conditions used, the recombinant P21 antigen is not recognized by any of them. It thus appears that, despite the presence of common motifs, the epitope or epitopes of immunogenic P32 in humans are either absent or non-antigenic in P21. it seems to be the same in the mouse, since the anti-P32 recombinant serum does not recognize P21.
SEQ. ID. 1
GGTCGCATG ACTCCCTCAG GTGGTTAGCG GAGAAACCTC AGATCCCTCG GCGCGCGACG CGTGCCAGAG -144
CGCGGGACGG GGTGGCAACG AGACACGTTT GGATAAAGGT CCTGCCAGGT TGTGGAATCA GACGTGTGGG -74
GGTCGCATG ACTCCCTCAG GTGGTTAGCG GAGAAACCTC AGATCCCTCG GCGCGCGACG CGTGCCAGAG -144
CGCGGGACGG GGTGGCAACG AGACACGTTT GGATAAAGGT CCTGCCAGGT TGTGGAATCA GACGTGTGGG -74
<tb> CTGTTCZGCG <SEP> TCGGTTTGGT <SEP> TTGTGCAGAG <SEP> ACGCACTGAC <SEP> GGTTGACGTC <SEP> GATCGGCACT <SEP> CGATCCTACC <SEP> -4
<tb> <SEP> 22
<tb> GTCAGTCAAT <SEP> TTTATTTTGG <SEP> TTTTTGCAGA <SEP> TATCATCGCG <SEP> CGTGTGTTCA <SEP> CTCTAACTGT <SEP> GTGTATGGTT <SEP> 87
<tb> <SEP> +1
<tb>
CACTGTTTTT TATTGCGATT TTCGTGAAGT AACAAA ATGGCGTCTGTAAAACGCGTCGTTGTGGCGGTAATG 139
M A S V K R V V V A V M 12
ATCGTGAACGTGCTGGCTTTAATTTTTGTGGGCGTTGCCGGTTCAACGCGTGACGTAGGGTCAGGCGGGGATGAC 214
<tb><SEP> 22
<tb> GTCAGTCAAT <SEP> TTTATTTTGG <SEP> TTTTTGCAGA <SEP> TATCATCGCG <SEP> CGTGTGTTCA <SEP> CTCTAACTGT <SEP> GTGTATGGTT <SEP> 87
<tb><SEP> +1
<Tb>
CACTGTTTTT TATTGCGATT TTCGTGAAGT AACAAA ATGGCGTCTGTAAAACGCGTCGTTGTGGCGGTAATG 139
MASVKRVVVAVM 12
ATCGTGAACGTGCTGGCTTTAATTTTTGTGGGCGTTGCCGGTTCAACGCGTGACGTAGGGTCAGGCGGGGATGAC 214
<tb> t <SEP> V <SEP> N <SEP> V <SEP> t <SEP> A <SEP> L <SEP> I <SEP> F <SEP> V <SEP> G <SEP> V <SEP> A <SEP> G <SEP> S <SEP> T <SEP> R <SEP> D <SEP> 7 <SEP> G <SEP> S <SEP> G <SEP> G <SEP> D <SEP> 3 <SEP> 37
<tb> <SEP> p
<tb> TCCGAAGGTGCTAGGGGGCGTGAACAACAACAGGTACAACAACACGAACAAAATGAAGACCGATCGTTATTCGAA <SEP> 289
<tb>
S E G A R G R E Q Q Q V Q Q R E Q N E D R S t F E 62
2 3
AGGGGAAGAGCAGCGGTGACTGGACATCCAGTGAGGACTGCAGTGGGACTTGCTGCAGCTGTGGTGGCCGTTGTG 364
R G R A A V T G H P V R T
4
<tb><SEP> p
<tb> TCCGAAGGTGCTAGGGGGCGTGAACAACAACAGGTACAACAACACGAACAAAATGAAGACCGATCGTTATTCGAA <SEP> 289
<Tb>
SEGARGREQQQVQQREQNEDR S t FE 62
2 3
AGGGGAAGAGCAGCGGTGACTGGACATCCAGTGAGGACTGCAGTGGGACTTGCTGCAGCTGTGGTGGCCGTTGTG 364
RGRAAVTGHPVRT
4
<tb> A <SEP> V <SEP> G <SEP> L <SEP> A <SEP> A <SEP> A <SEP> V <SEP> V <SEP> A <SEP> V <SEP> V <SEP> 87
<tb> TCACTACTGCGATTGTTGAAAAGGAGGAGAAGACGCGCGATTCAAGAAGAGAGCAAGGAGTCTGCAACCGCGGAA 439
<tb> TCACTACTGCGATTGTTGAAAAGGAGGAGAAGACGCGCGATTCAAGAAGAGAGCAAGGAGTCTGCAACCGCGGAA 439
<tb> s
<tb> <SEP> I
<tb> K R R R R R A r Q E E S X E S A T X E 112
GAGGAAGAAGTTGCCGAGGAAGATAAGGGGCACTGTGTTGCTCGGCTCTTTGTTGTCTCAGCG TGAGGATTTA 512
E E E V A E E D K G H C V A R L F V V S A 133
GTGCGTGTAG CGCAGCATGT ATCGATCGAT ACAGGCACGG TTGGACGTGT CGTCTGTATC CCTTGTGGCA 582
GACGGCAGAC GCCATTGTCA GAGCGTGTTG CACGTTGGAA GAAAATGTGT TGGTGTAATC CCTCGTCGGA 652
CAGATACCAG GAGGTTGCGT GGTGATGATC GTGTGTGCGT AGAGGTGTGC CTCGTGATAA CATGAAGGGC 722
AAGGACCTTT TTTGTCGAGC ACATACTCAA ACCAGTGATT GTGCGAGGCG GGTTGCXCGC GACTTTGATC 792
CATTACAGTT AAATATGCCG AACGCGTGGC CTGATTCSCA CACAAGGCGC ACAGACGTAC CGTTGATGAG 862
SEQ.ID. 2
GAATACGTCG GACTGGTCTA GGTGAACGTG GTGCGACGAG CTGATCACCA TCGGAGGGCT TTGGCTTTCG 70
TCGCTGAGGA TGCTTCTCAT CTTGTTCCAC CGGCTGCCAC GCGGAGCAGG AACGGCCGAC CTGTACGAAA 140
CACGAGTCTC GCGCGTCTCA TGCAAATGCC CACTGGCTGA CTCTTCCCCA TTAGTAGAAT ATTTGCGTCG 210
TGCAATGCTG ACGGCAAACA AAACGAAGTG CTATCAGCGT GTTTTGCTGT GCATTGCAGG CTGTTTTATT 280
TAGACATTTT GGCCGCAAAA GATTTGTGTT TCCGAGCAGG TGACCTGGGT CGCTTTTTTG AAACAGCAGG 360
AAAACAGCTT CGTGGTGCCA CGTAGCGTGC TTGTTGGCGA CTACCTTTTT TTCTTGGGAG TGTCGGCGAA 420
<tb><SEP> I
<tb> KRRRRRA r QEESXESATXE 112
GAGGAAGAAGTTGCCGAGGAAGATAAGGGGCACTGTGTTGCTCGGCTCTTTGTTGTCTCAGCG TGAGGATTTA 512
EEEVAEEDKGHCVARLFVVSA 133
GTGCGTGTAG CGCAGCATGT ATCGATCGAT ACAGGCACGG TTGGACGTGT CGTCTGTATC CCTTGTGGCA 582
GACGGCAGAC GCCATTGTCA GAGCGTGTTG CACGTTGGAA GAAAATGTGT TGGTGTAATC CCTCGTCGGA 652
CAGATACCAG GAGGTTGCGT GGTGATGATC GTGTGTGCGT AGAGGTGTGC CTCGTGATAA CATGAAGGGC 722
AAGGACCTTT TTTGTCGAGC ACATACTCAA ACCAGTGATT GTGCGAGGCG GGTTGCXCGC GACTTTGATC 792
CATTACAGTT AAATATGCCG AACGCGTGGC CTGATTCSCA CACAAGGCGC ACAGACGTAC CGTTGATGAG 862
SEQ.ID. 2
GAATACGTCG GACTGGTCTA GGTGAACGTG GTGCGACGAG CTGATCACCA TCGGAGGGCT TTGGCTTTCG 70
TCGCTGAGGA TGCTTCTCAT CTTGTTCCAC CGGCTGCCAC GCGGAGCAGG AACGGCCGAC CTGTACGAAA 140
CACGAGTCTC GCGCGTCTCA TGCAAATGCC CACTGGCTGA CTCTTCCCCA TTAGTAGAAT ATTTGCGTCG 210
TGCAATGCTG ACGGCAAACA AAACGAAGTG CTATCAGCGT GTTTTGCTGT GCATTGCAGG CTGTTTTATT 280
TAGACATTTT GGCCGCAAAA GATTTGTGTT TCCGAGCAGG TGACCTGGGT CGCTTTTTTG AAACAGCAGG 360
AAAACAGCTT CGTGGTGCCA CGTAGCGTGC TTGTTGGCGA CTACCTTTTT TTCTTGGGAG TGTCGGCGAA 420
<tb> ATGGCACACGGTGGCATCCATCTGAGGCAGAAGCGTAACTTCTGTCCTGTAACTGTCTCCACAGTTGCTGTGGTC <SEP> 496
<tb> <SEP> M <SEP> A <SEP> H <SEP> G <SEP> G <SEP> I <SEP> H <SEP> L <SEP> R <SEP> Q <SEP> K <SEP> R <SEP> N <SEP> F <SEP> C <SEP> P <SEP> V <SEP> T <SEP> V <SEP> S <SEP> T <SEP> V <SEP> A <SEP> V <SEP> V <SEP> 26
<tb> TTTGTAGTCTTCATGGGTGTACTCGTCAATTCGTTGGGTGGAGTCCGTGTCGCAGCAGACAGCGGTGGTGTTAAG <SEP> 570
<tb> F <SEP> V <SEP> V <SEP> F <SEP> M <SEP> E <SEP> V <SEP> L <SEP> V <SEP> N <SEP> S <SEP> L <SEP> G <SEP> G <SEP> V <SEP> R <SEP> V <SEP> A <SEP> A <SEP> A <SEP> D <SEP> S <SEP> G <SEP> G <SEP> v <SEP> K <SEP> 50
<tb>
CAGACCCCTTCGGAAACCGGTTCGAGCGGTGGACAGCAAGAAGCAGTGGGGACCACTGAAGACTATGTCAACTCT 645
Q T P S ET G S S GGQQ K A V G T T E O Y Y
*
TCGGCGATGGGCGGTGGCCAAGGCGACTCGTTAGCTGAAGATGATACAACCTCCGAAGCGGCGGAGGGCGACGTT 720
S A M G G G Q G D S L A E D D T T S Z A A E G D F 100
GACCCTTTTCCCGTGCTGGCGAATGAGGGGAAGTCGGAGGCGCGTGGCCCGTCGCTCGAGGAAAGAATCGAAGAA 795
D P F P V L A N E G K S E A R G P S L E E R I E E 125
CAGGGCACAAGACGACGTTACTCCTCTGTTCAAGAACCACAAGCGAAGGTGCCATGCAAACGAACACAGAAACGC 378
Q G T R R R Y S S V Q E p Q A K V p C K R T Q K R 150
CACAGACTCATTGGTGCTGTGGTGTTGGCAGTATCTGTGGCAATGCTTACCGCTTTCTTTCTTCGAAGGACTGGA 940
## EQU1 ## R <SEP> N <SEP> F <SEP> C <SEP> P <SEP> V <SEP> T <SEP> V <SEP> S <SEP> T <SEP> V <SEP> A <SEP> V <SEP> V <SEP> 26
<tb> TTTGTAGTCTTCATGGGTGTACTCGTCAATTCGTTGGGTGGAGTCCGTGTCGCAGCAGACAGCGGTGGTGTTAAG <SEP> 570
<tb> F <SEP> V <SEP> V <SEP> F <SEP> M <SEP> E <SEP> V <SEP> L <SEP> V <SEP> N <SEP> S <SEP> L <SEP > G <SEP> G <SEP> V <SEP> A <SEP> A <SEP> A <SEP><SEP> K <SEP> 50
<Tb>
CAGACCCCTTCGGAAACCGGTTCGAGCGGTGGACAGCAAGAAGCAGTGGGGACCACTGAAGACTATGTCAACTCT 645
QTPS AND GSS GGQQ KAVGTTEOYY
*
TCGGCGATGGGCGGTGGCCAAGGCGACTCGTTAGCTGAAGATGATACAACCTCCGAAGCGGCGGAGGGCGACGTT 720
SAMGGGQGDSLAEDDTTSZAA EGDF 100
GACCCTTTTCCCGTGCTGGCGAATGAGGGGAAGTCGGAGGCGCGTGGCCCGTCGCTCGAGGAAAGAATCGAAGAA 795
DPFPVLANEGKSEARGPSLEE RIEE 125
CAGGGCACAAGACGACGTTACTCCTCTGTTCAAGAACCACAAGCGAAGGTGCCATGCAAACGAACACAGAAACGC 378
QGTRRRYSSVQE p QAKV p CKRTQKR 150
CACAGACTCATTGGTGCTGTGGTGTTGGCAGTATCTGTGGCAATGCTTACCGCTTTCTTTCTTCGAAGGACTGGA 940
<tb> K <SEP> K <SEP> JL <SEP> t <SEP> I <SEP> G <SEP> G <SEP> A <SEP> 'r <SEP> v <SEP> t <SEP> A <SEP> V <SEP> S <SEP> V <SEP> A <SEP> M <SEP> L <SEP> T <SEP> A <SEP> r <SEP> A <SEP> LIR <SEP> R <SEP> T <SEP> G <SEP> 175
<tb>
CGACGCTCTCCCCAAGAACCATCTGGGGATGGTGGTGGAAATGATGCAGGCAATAATGCTGGGAACGGTGGGAAT 1020
R R S P Q E P S G D G G G N D A G N N A G N G G N 200
GAAGGCAGAGGTTACGGAGGCAGAGGTGAAGGAGGAGCCGAGGATGACAGGCGCCCGTTGCACCCGGAACGTGTG 1095
E G R G Y G G R G E G G A E D D R R P L H P E R V 226
AATGTGTTTGATTAT TAAAGATGAA AACAGGGGGT CTATGCGCCA CTGGGGCACT CTATGTCTTG 1160
N V F D Y 230
TAGTCGATGC CATGCAACGA CCCGGAGAGC GGCACTGTCC GACGTGGAGA AGAACGTAGG AATCTGTACG 1230
AACTGCGCTC CTTCCAGACT TGGGACGTGG ACAGGTCGAC ATGTGTGGAC GGGTCGCGAT GAATGGTTTG 1300
CGTCTTTTAC ACCTGAGGTA GTGTACGTCG GCGATCGCAG GGCTGTAACG CTCAGGAGAA TCTTCCAAAG 1370
AACGGTGAAG CCGAATCTGT CGAGTTACCA TCTGGCAGTT GTGACGTGGT ACTACCGGAC TGAAATAAAA 1440
AGCAAAGTTT TCGTGAAAGT CTGTGGCAGC GATTCCAGTG AAAAGTCGAA GAGATGAAAC ATAAGTAGGA 1510
ATACGATAAT GCCTCCGACA CCGCCGGCAT CACCTGCAAG CTGTACGTTT CAGTCGTGGA AGATGCTTTA 1580
AGTGTGAAGC GAAAAGAGTC GCACACACGA GAACGAATGA GTGTAAAACA GGGGCCGGAT CATACACCGA 1660
CCCGTCGATG AGGCAGAGCC GCTGCGCCGA AGCTGCCGCG ATTTGTCATA AAGTTTTCAC GTGTTTTGTG 1720
TTTTGCGTCG TGTGTATGCC GTGTCGCGAT TTCGTCTTTC AAAACTCCAC ACAAGCGCGA AAAATTATGG 1790
AAACGTATCA TGCGTGGGCT TAATACGATG TTGAAGAATT GCACGTGCAC ATGCCAGCGA AACTAGCAGG 1800 <tb> K <SEP> K <SEP> JL <SEP> t <SEP> I <SEP> G <SEP> G <SEP> A <SEP>'r<SEP> v <SEP> t <SEP> A <SEP> V <SEP> S <SEP> V <SEP> A <SEP> M <SEP> L <SEP> T <SEP> A <SEP> r <SEP> A <SEP> LUR <SEP> R <SEP> T <SEP> G <SEP> 175
<Tb>
CGACGCTCTCCCCAAGAACCATCTGGGGATGGTGGTGGAAATGATGCAGGCAATAATGCTGGGAACGGTGGGAAT 1020
RRSPQEPSGDGGGNDAGNNAG NGGN 200
GAAGGCAGAGGTTACGGAGGCAGAGGTGAAGGAGGAGCCGAGGATGACAGGCGCCCGTTGCACCCGGAACGTGTG 1095
EGRGYGGRGEGGAEDDRRPLH PERV 226
AATGTGTTTGATTAT TAAAGATGAA AACAGGGGGG CTATGCGCCA CTGGGGCACT CTATGTCTTG 1160
NVFDY 230
TAGTCGATGC CATGCAACGA CCCGGAGAGC GGCACTGTCC GACGTGGAGA AGAACGTAGG AATCTGTACG 1230
AACTGCGCTC CTTCCAGACT TGGGACGTGG ACAGGTCGAC ATGTGTGGAC GGGTCGCGAT GAATGGTTTG 1300
CGTCTTTTAC ACCTGAGGTA GTGTACGTCG GCGATCGCAG GGCTGTAACG CTCAGGAGAA TCTTCCAAAG 1370
AACGGTGAAG CCGAATCTGT CGAGTTACCA TCTGGCAGTT GTGACGTGGT ACTACCGGAC TGAAATAAAA 1440
AGCAAAGTTT TCGTGAAAGT CTGTGGCAGC GATTCCAGTG AAAAGTCGAA GAGATGAAAC ATAAGTAGGA 1510
ATACGATAAT GCCTCCGACA CCGCCGGCAT CACCTGCAAG CTGTACGTTT CAGTCGTGGA AGATGCTTTA 1580
AGTGTGAAGC GAAAAGAGTC GCACACACGA GAACGAATGA GTGTAAAACA GGGGCCGGAT CATACACCGA 1660
CCCGTCGATG AGGCAGAGCC GCTGCGCCGA AGCTGCCGCG ATTTGTCATA AAGTTTTCAC GTGTTTTGTG 1720
TTTTGCGTCG TGTGTATGCC GTGTCGCGAT TTCGTCTTTC AAAACTCCAC ACAAGCGCGA AAAATTATGG 1790
AAACGTATCA TGCGTGGGCT TAATACGATG TTGAAGAATT GCACGTGCAC ATGCCAGCGA AACTAGCAGG 1800
Claims (17)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9302891A FR2702491B1 (en) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | Cloning of genes coding for toxoplasm P21 and P32 excretion-secretion antigens, preparations of such antigens, fragments thereof and their applications. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9302891A FR2702491B1 (en) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | Cloning of genes coding for toxoplasm P21 and P32 excretion-secretion antigens, preparations of such antigens, fragments thereof and their applications. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2702491A1 true FR2702491A1 (en) | 1994-09-16 |
| FR2702491B1 FR2702491B1 (en) | 1995-04-28 |
Family
ID=9444914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9302891A Expired - Fee Related FR2702491B1 (en) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | Cloning of genes coding for toxoplasm P21 and P32 excretion-secretion antigens, preparations of such antigens, fragments thereof and their applications. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2702491B1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5874526A (en) * | 1994-06-10 | 1999-02-23 | Akzo Nobel N.V. | Toxoplasma gondii antigens |
| US7790187B2 (en) | 2005-03-08 | 2010-09-07 | Kenton S.R.L. | Chimeric recombinant antigens of Toxoplasma gondii |
| FR2996918A1 (en) * | 2012-10-16 | 2014-04-18 | Univ Grenoble 1 | ANTIGENES GRA RECOMBINANTS AND THEIR APPLICATION FOR THE EARLY DIAGNOSIS OF TOXOPLASMOSIS |
-
1993
- 1993-03-12 FR FR9302891A patent/FR2702491B1/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| A. ACHBAROU ET AL: "Differential targeting of dense granule proteins in the parasitophorous vacuole of Toxoplasma gondii", PARASITOLOGY, vol. 103, no. 3, 1991, pages 321 - 329 * |
| F. DARCY ET AL: "Induction of a protective antibody-dependent response against toxoplasmosis by in vitro excreted/secreted antigens from tachyzoites of Toxoplasma gondii", PARASITE IMMUNOLOGY, vol. 10, no. 5, September 1988 (1988-09-01), pages 553 - 567 * |
| H. CHARIF ET AL: "Toxoplasma gondii : Characterization and localization of Antigens secreted from Tachyzoites", EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, vol. 71, no. 1, July 1990 (1990-07-01), pages 114 - 124 * |
| L. D. SIBLEY ET AL: "Modification of host cell phagosomes by Toxoplasma gondii involves redistribution of surface proteins and secretion of a 32 KDa protein", EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 47, no. 1, October 1988 (1988-10-01), pages 81 - 87 * |
| L. LECORDIER ET AL: "Molecular structure of a Toxoplasma gondii dense granule antigen (GRA 5) associated with the parasitophorous vacuole membrane", MOLECULAR AND BIOCHEMICAL PARASITOLOGY, vol. 59, no. 1, 1993, pages 143 - 153 * |
| M.F. CESBRON-DELAUW ET AL: "Molecular charactrization of a 23-kilodalton major antigen secreted by Toxoplasma gondii", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 86, October 1989 (1989-10-01), WASHINGTON US, pages 7537 - 7541 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5874526A (en) * | 1994-06-10 | 1999-02-23 | Akzo Nobel N.V. | Toxoplasma gondii antigens |
| US6420540B1 (en) | 1994-10-06 | 2002-07-16 | Akzo Nobel N.V. | Toxoplasma gondii antigens |
| US7790187B2 (en) | 2005-03-08 | 2010-09-07 | Kenton S.R.L. | Chimeric recombinant antigens of Toxoplasma gondii |
| US7867503B2 (en) | 2005-03-08 | 2011-01-11 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Chimeric recombinant antigens of Toxoplasma gondii |
| FR2996918A1 (en) * | 2012-10-16 | 2014-04-18 | Univ Grenoble 1 | ANTIGENES GRA RECOMBINANTS AND THEIR APPLICATION FOR THE EARLY DIAGNOSIS OF TOXOPLASMOSIS |
| WO2014060448A1 (en) * | 2012-10-16 | 2014-04-24 | Universite Joseph Fourier - Grenoble 1 | Recombinant gra antigens and the use of same for early diagnosis of toxoplasmosis |
| US9658227B2 (en) | 2012-10-16 | 2017-05-23 | Universite Joseph Fourier—Grenoble 1 | Recombinant GRA antigens and the use of same for early diagnosis of toxoplasmosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2702491B1 (en) | 1995-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lecordier et al. | Molecular structure of a Toxoplasma gondii dense granule antigen (GRA 5) associated with the parasitophorous vacuole membrane | |
| FR2692592A1 (en) | DNA fragments encoding the Neisseria meningitidis transferrin receptor subunits and methods of expressing them. | |
| JPH11502923A (en) | T. Compounds and methods for detecting CRUZI infection | |
| EP0712414A1 (en) | Recombinant vector containing a lipoprotein gene sequence for expressing nucleotide sequences | |
| EA001789B1 (en) | Isolated, substantially pure surface antigen of protein neisseria meningitidis and neisseria gonorrhoeae, fragments thereof and dna sequences | |
| WO1996017936A2 (en) | Cloned porphyromonas gingivalis genes and probes for the detection of periodontal disease | |
| KR100331358B1 (en) | Rib protein, a cell surface protein that provides immunity against many strains of Group B Streptococcus, methods of purification of the protein, reagent kits, and pharmaceutical compositions | |
| CA2301374A1 (en) | Polypeptide nucleic sequences exported from mycobacteria, vectors comprising same and uses for diagnosing and preventing tuberculosis | |
| EP0648270B1 (en) | Cloning of gene encoding the gp28.5 protein of toxoplasma gondii; peptide fragments of said protein and their applications | |
| US5130417A (en) | Entamoeba histolytical immunogenic protein and cdna clone | |
| Singh et al. | Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium | |
| KR19990087436A (en) | Porphyromonas gingivalis antigen for diagnosis and treatment of periodontitis | |
| EP0796332A1 (en) | Neisseria meningitidis subunit tbp2 | |
| JPH11504206A (en) | Helicobacter antigen for defense | |
| Tosini et al. | Identification and characterisation of three antigenic proteins from Cryptosporidium parvum sporozoites using a DNA library expressing poly-histidine tagged peptides | |
| FR2702491A1 (en) | Cloning of genes encoding excretion-secretion antigens P21 and P32 of toxoplasma, preparations of such antigens, fragments thereof and their applications | |
| JP2001517091A (en) | Antigenic compositions and methods for detecting HELICOBACTER PYLORI | |
| EP0787796B1 (en) | Protective epitopes from adenylate cyclase-hemolysin(AC-Hly) and their use for treatment or prevention of Bordetella infections | |
| Nockemann et al. | Expression, characterization and serological reactivity of a 41 kDa excreted–secreted antigen (ESA) from Toxoplasma gondii | |
| Cryz Jr et al. | Construction and characterization of a Vi-positive variant of the Salmonella typhi live oral vaccine strain Ty21a | |
| Marin et al. | Screening molluscan cDNA expression libraries with anti-shell matrix antibodies | |
| JPH11503609A (en) | Novel proteins from canine filamentous worms and immunodiagnostic methods for canine filamentous worms in mammals | |
| EP1343814B1 (en) | Immunogenic glycopeptides, screening, preparation and uses | |
| EP0283829B1 (en) | Plasmodium falciparum merozoite antigen peptides | |
| CZ291013B6 (en) | Modified polypeptides exhibiting greater immune response |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |