FR2699539A1 - Protéine conférant une résistance de type inductible, à des glycopeptides, notamment chez des bactéries à gram-positif. Séquence de nucléotides codant pour cette protéine. - Google Patents

Protéine conférant une résistance de type inductible, à des glycopeptides, notamment chez des bactéries à gram-positif. Séquence de nucléotides codant pour cette protéine. Download PDF

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Abstract

L'invention concerne une protéine VanB caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés suivante 1, et en ce qu'elle est impliquée chez des bactéries à Gram-positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicaplanine. L'invention vise aussi l'utilisation de fragments de nucléotides du gène van B pour la détection de résistances à des glycopeptides.

Description

Protéine conférant une résistance de type
inductible, à des glycopeptides, notamment
chez des bactéries à Gram-positif. Séquence
de nucléotides codant pour cette protéine.
L'invention concerne les polypeptides associés à l'expression d'une résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine, notamment chez des bactéries à
Gram-positif, en particulier de la famille des cocci à
Gram-positif. L'invention vise également une séquence nucléotidique codant pour ces polypeptides. Elle concerne aussi l'utilisation de ces polypeptides et de leur séquence nucléotidique en tant que moyens de détection in vitro d'une résistance à des glycopeptides. Parmi les cocci à Gram-positif, l'invention vise tout particulièrement les entérocoques, les streptocoques et les staphylocoques.
Les glycopeptides, parmi lesquels la vancomycine et la teicoplanine, sont des antibiotiques inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne. Ces antibiotiques sont très utilisés pour le traitement des infections sévères dues à des cocci à Gram-positif (entérocoques, streptocoques et staphylocoques), en particulier dans les cas d'allergie et de résistance aux pénicillines.
Jusqu'en 1986, la vancomycine s'est avérée efficace contre la quasi-totalité des souches d'entérocoques.
L'activité des glycopeptides dépend de la formation d'un complexe entre l'antibiotique et les précurseurs du peptidoglycane, plus que de l'interaction directe avec des enzymes du métabolisme de la paroi cellulaire. En particulier on a constaté que les glycopeptides se fixent aux résidus terminaux
D-alanyl-D-alanine (D-ala-D-ala) des précurseurs du peptidoglycane.
Plusieurs phénotypes de résistance aux glycopeptides ont été mis en évidence ; on a notamment distingué des souches résistantes à un haut niveau de glycopeptides et les souches résistantes à un bas niveau de concentration.
Par souche résistante à un haut niveau, on entend une souche de bactérie en particulier une souche de cocci à Gram-positif pour laquelle les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de vancomycine et de teicoplanine sont respectivement supérieures à 32 et 8 Ag/ml. Les CMI de la vancomycine vis à vis des souches résistantes à bas niveau sont comprises entre 8 et 32 pg/ml. Le phénotype VanB est caractérisé par une résistance inductible par la vancomycine, mais non inductible par la teicoplanine. Une fois induite, cette résistance peut exister vis à vis de différents glycopeptides, en particulier vis à vis de la vancomycine et/ou de la teicoplanine, et ce à des niveaux variables.
Les souches d'entérocoques répondant au phénotype
VanB (classe B) sont notamment des souches de
E.faecalis et E.faecium.
Al-Obeid S. et al (FEMS Nicrobiology Letters 70 (1990) 101-106) ont ainsi comparé les protéines de résistance à des glycopeptides, inductibles par la vancomycine, chez quatre souches Enterococci, et ont déduit de leur comparaison, l'existence de trois types de protéines, l'un de ces types étant présent chez la souche E.faecium résistante à bas niveau de vancomycine. Selon les auteurs de cette publication, une protéine de poids moléculaire d'environ 39,5 kDa serait induite chez les souches à bas niveau de résistance et cette résistance serait liée à une induction par la vancomycine. Ces souches présenteraient aussi une résistance à la teicoplanine, également induite par la vancomycine.
D'après Al-Obeid et al, cette protéine de 39,5 kDa serait présente sous de multiples formes mais la nature de cette multiplicité n'a pas été étudiée. Selon ces auteurs, il pourrait exister une spécificité de structure en fonction des espèces concernées de bactéries et du niveau de résistance, ce qui demande à être confirmé.
Dans cette publication, Al-Obeid et al ont décrit 11 acides aminés de la séquence N-terminale de cette protéine de 39,5 kDa et ont observé que cette séquence comportait environ 70% d'homologie avec de nombreuses protéines de membrane d'origine procaryote ou eucaryote, ayant des fonctions diverses. Cette comparaison ne permettait pas selon les auteurs d'établir la fonction éventuelle de la protéine. Enfin
Al-Obeid et al ont remarqué que d'autres protéines sont induites, à un degré moindre cependant.
L'invention concerne des peptides, polypeptides ou protéines impliqués dans l'expression d'une résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides et notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ainsi que les séquences nucléotidiques codant pour de tels polypeptides. La résistance dont il est question ci-dessus est de type inductible par la vancomycine et non par la teicoplanine.
Les expressions "impliqué dans l'expression d'une résistance" ou "impliqué dans une résistance" signifient que la protéine de l'invention est nécessaire pour que se manifeste la résistance.
L'invention vise également des sondes nucléotidiques utilisables pour la détection d'une résistance aux glycopeptides, notamment par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ou par des tests faisant intervenir des anticorps.
L'invention a donc pour objet une protéine VanB caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés suivante I, et en ce qu'elle participe à la résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non par la teicoplanine, chez des bactéries à Gram-positif.

LFELSG IP YvGCD IQSSAAC
M D K S L A Y I L T K N A G I A V P E F
QM IEKGDKpEARTLTYpVFv
KP ARSGS SFGvTKVNSTEEL
NAAIEAAGQYDGKILIEQAI
S G C E V G C A V M G N E D D L I V G E
V D Q I R L S H G I F R I E Q E N E P E
K G S E N A M I I V P A D I P V E E R N
R V Q E- T A K K V Y R V L G C R G L A R VD LFLQEDGG IVLNEV
Par l'expression "résistance inductible" on entend la capacité pour une bactérie à Gram-positif déterminée, en particulier pour une souche Enterococcus déterminée, de produire une protéine VanB en présence d'une concentration 0,05 à 1 Al/ml de vancomycine.
La résistance à un ou plusieurs glycopeptides déterminés peut se traduire par la persistance d'une infection due à des germes habituellement sensibles aux glycopeptides, ou peut être détectée au moyen d'un antibiogramme (surtout pour les hauts niveaux de résistance), de la CMI, de l'hybridation avec des sondes (après amplification par exemple par PCR).
Selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine VanB est caractérisée en ce qu'elle est impliquée dans une résistance de type inductible à des glycopeptides et en particulier à la vancomycine, chez des entérocoques et par exemple chez des souches du genre E. faecium ou E. faecalis.
L'invention concerne également une protéine VanB caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés modifiée par rapport à la séquence I, par délétion, insertion, ou remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que la protéine VanB ainsi modifiée est impliquée chez des bactéries à
Gram-positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine, et non inductible par la teicoplanine.
Entre également dans le cadre de l'invention, tout fragment peptidique de la protéine VanB caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence d'acides aminés I ou à toute partie de cette séquence fonctionnellement associée à la résistance de type inductible à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, chez des bactéries à Gram-positif, par exemple des bactéries de la famille des enterocoques.
Avantageusement des fragments peptidiques de l'invention présentent en outre ou alternativement, des propriétés antigéniques et sont donc reconnus par des anticorps formés contre la protéine VanB.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ces antigènes sont spécifiques de la protéine VanB et ne sont donc pas reconnus par des anticorps reconnaissant les protéines VanA et VanC telles que décrites dans la demande de brevet EP 91920753.
L'invention concerne en outre une séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine VanB impliquée chez des bactéries à Grain- positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine, ladite protéine VanB comprenant la séquence d'acides aminés I, ou en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN complémentaire de cette séquence codante, ou d'une séquence d'ARN correspondante.
Par séquence complémentaire, on entend toute séquence d'ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la séquence I, et dont l'orientation est inversée.
Une séquence nucléotidique particulière répondant à cette définition est caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement de nucléotides II suivant ou un enchaînement nucléotidique modifié par rapport à II, dès lors qu'il code pour une protéine impliquée chez des bactéries à Gram-positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
TCTGTTTGAATTGTCTGGTATCCCCTATGTAGGCTGCGATATTCAkAGCTCCGCAGCTTG
CATGGACAAAtCACTGGCCTACATTCTTACAAAAAATGCGGGCATCGCCGTCCCCGAATT
TCAAATGATTGAAAAAGGTGACAAACCGGAGGCGAGGACGCTTACCTACCCTGTCTTTGT
GAAGCCGGCACGGTCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAACCAAAGTAAACAGTACGGAAGAACT
AAACGCTGCGATAGAAGCAGCAGGACAATATGATGGAAAAATCTTAATTGAGCAAGCGAT
TTCGGGCTGTGAGGTCGGCTGCGCGGTCATGGGAAACGAGGATGATTTGATTGTCGGCGA
AGTGGATCAAATCCGGTTGAGCCAAGGTATCTTCCGCATCCATCAGGAAAACGAGCCGGA
AAAAGGCTCAGAGAATGCGATGATTATCGTTCCAGCAGACATTCCGGTCGAGGAACGAAA
TCGGGTGCAAGAAACGGCAAAGAAAGTATATCGGGTGCTTGGATGCAGAGGGCTTGCTCG TGTTGATCTTTTTTTGCAGGAGGATGGCGGCATCGTTCTAAACGAGGTC
De manière générale l'invention a également pour objet un fragment nucléotidique caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider dans des conditions stringentes avec une séquence.
Les conditions stringentes sont les suivantes
* température de la réaction 65-C pendant une nuit
dans une solution contenant 0,1% de SDS, 0,7% de
lait en poudre écrémé, 6xSSC (lxSSC=0,15M NaCl et
0,015M de citrate de sodium à pH=7,0 >
* lavages à 65 C dans 2xSSC-0,1% SDS.
Avantageusement un fragment nucléotidique répondant à la définition précédente aura au moins 15 nucléotides, de préférence au moins 20.
Les peptides et polypeptides de l'invention permettent de définir une classe génotypique, caractérisée par la capacité des séquences nucléotidiques codant pour ces peptides, d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence II constituant une sonde.
Ces fragments peuvent être mis en oeuvre en tant qu'amorces pour la réalisation de réactions d'amplification, ou en tant que sondes.
Des sondes nucléotidiques selon l'invention peuvent être spécifiques pour détecter chez des bactéries à Gram-positif des séquences codant pour une protéine VanB impliquée dans la résistance à des glycopeptides notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, cette résistance étant inductible conformément à la définition précédente, ces sondes pouvant en outre être universelles parmi ces séquences.
Par les sondes spécifiques de VanB, on entend tout oligonucléotide hybridant avec une séquence nucléotidique codant pour une protéine VanB selon l'invention, telle que décrite dans les pages précédentes, et ne présentant pas de réaction d'hybridation croisée ou d'amplification (PCR) avec des séquences présentes chez l'ensemble des souches sensibles.
Un fragment nucléotidique particulier selon l'invention est caractérisé en ce qu'il n'hybride pas dans des conditions stringentes avec l'ADN de souches d'entérocoques sensibles à la vancomycine, en particulier avec l'ADN des souches E. faecalis JH2-2 et
E. faecium BM4107.
Ces souches de référence ont respectivement été décrites par Jacobs et Hobbs (J. Bacteriol. 117, 1974, 360-372) et Leclercq et al (Antimicrob. Agents
Chemother 33, 1989).
Un autre fragment nucléotidique intéressant dans le cadre de l'invention, est spécifique du gène vanB, dans la mesure où il n'hybride pas dans des conditions stringentes avec les gènes VanA et VanC tels que décrits dans la demande PCT 91920753.
Un fragment nucléotidique particulièrement intéressant dans le cadre de l'invention, est le fragment répondant à la séquence II.
Ce fragment est un fragment interne issu du gène impliqué dans la résistance à des souches d'entérocoques. La résistance peut exister à des niveaux variables de concentration en glycopeptides.
L'invention concerne aussi des fragments de nucléotides modifiés par rapport aux précédents, par mutation, addition ou délétion de nucléotides, dès lors que le fragment ainsi modifié soit code pour un fragment de la protéine VanB fonctionnel s'agissant de son association à la résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, dans les conditions décrites ci-dessus, soit hybride avec le gène vanB.
Dans l'hypothèse d'une utilisation des fragments nucléotidiques à titre de sondes, un marquage sera effectué, par les techniques classiques. A titre d'exemple, on utilisera des marqueurs radioactifs ou enzymatiques.
Des fragments de nucléotides selon l'invention peuvent être mis en oeuvre en tant qu'amorces, pour réaliser l'amplification, par exemple par PCR, d'acide nucléique contenu dans un échantillon biologique donné.
L'invention vise par ailleurs une séquence d'ADN recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides ci-dessus décrite, sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans le clonage ou l'expression, d'un gène impliqué dans une résistance de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine, à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine, chez un hôte déterminé.
Ce gène impliqué dans la résistance est par exemple le gène vanB qui comprend la séquence de nucléotides II ou toute partie fonctionnelle en terme de résistance inductible, issue d'une séquence hybridant avec la séquence II.
L'invention concerne aussi un vecteur recombinant pour le clonage ou l'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ci-dessus décrite en un site non essentiel pour sa réplication, le cas échéant sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression d'une résistance de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine, à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine, chez un hôte déterminé.
Des vecteurs particuliers sont par exemple des plasmides, des phages, des cosmides, des YAC.
Un vecteur préféré est le plasmide pAT201, déposé à la C.N.C.M. le 11 Décembre 1992 sous le numéro I-1277.
Ces vecteurs peuvent être utilisés pour transformer ou transfecter des hôtes cellulaires afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques de l'invention.
Un hôte cellulaire recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est modifié par une séquence nucléotidique ou un vecteur ci-dessus décrits.
De préférence l'hôte cellulaire est modifié par cette séquence dans des conditions permettant l'expression d'une protéine VanB fonctionnelle s'agissant de la résistance inductible à des glycopeptides.
L'invention a aussi pour objet une protéine VanB recombinante telle qu'obtenue à partir d'un hôte cellulaire recombinant selon la définition précédente, la protéine VanB obtenue étant caractérisée en ce que son ossature peptidique comprend la séquence d'acides aminés suivante I, et en ce qu'elle est impliquée chez des bactéries à Gram-positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
La protéine VanB selon l'invention permet de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement la protéine VanB ou un fragment peptidique décrit cidessus.
Ces anticorps peuvent être obtenus selon les méthodes classiques de production d'anticorps. En particulier pour la préparation des anticorps monoclonaux on aura recours à la méthode de Kohler et Milstein selon laquelle on prépare des anticorps monoclonaux par fusion cellulaire entre des cellules de myélome et des cellules spléniques de souris préalablement immunisées avec un polypeptide ou une composition selon l'invention, conformément au procédé classique.
Les anticorps de l'invention sont avantageusement utilisables pour la détection de la présence de protéines caractéristiques d'une résistance aux glycopeptides, en particulier à la vancomycine et à la teicoplanine, cette résistance étant du type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
Entre également dans le cadre de l'invention, un kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique, de la présence de souches résistantes à des glycopeptides après induction notamment par la vancomycine et non par la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier aux cocci à Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit des souches d'entérocoques, par exemple E. faecium, caractérisé en ce qu'il comprend - des anticorps ci-dessus décrits, le cas échéant
marqués, - un réactif pour la détection d'une réaction
immunologique du type anticorps-antigène, - le cas échéant des réactifs pour effectuer la lyse
des cellules de l'échantillon testé, - le cas échéant une concentration déterminée de
vancomycine, pour induire la résistance.
L'invention concerne aussi un kit tel que défini ci-dessus, qui comprend en outre des anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine VanA et/ou des anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine
VanC.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le kit permet indifféremment la détection d'une résistance correspondant à un phénotype VanA, VanB ou
VanC, et comprend des anticorps reconnaissant VanA,
VanB et VanC. Ces anticorps peuvent être sélectionnés par leur capacité à reconnaître un épitope commun aux trois protéines. Il peut également s'agir d'un mélange d'anticorps reconnaissant des épitopes différents, propres à chacune des protéines.
Selon une autre mode de réalisation de l'invention, un kit pour le diagnostic in vitro de la présence de souches résistantes à bas niveau, à des glycopeptides, en particulier résistantes à la vancomycine, est caractérisé en ce qu'il comprend - une sonde nucléotidique capable d'hybrider dans
des conditions stringentes avec une séquence
nucléotidique du gène vanB, et le cas échéant, - des nucléoside-triphosphates dATP, dCTP, dTTP,
dGTP, - un agent de polymérisation d'ADN.
Un autre kit de détection comprend en outre une sonde de nucléotides capable d'hybrider spécifiquement avec le gène vanA et une sonde capable d'hybrider spécifiquement avec le gène vanC.
Ce kit peut être avantageusement utilisé pour la détection d'une résistance chez des cocci à Grampositif notamment chez des entérocoques, par exemple chez E. faecium.
L'invention vise aussi un kit pour la détection in vitro d'une résistance à des glycoprotéines, notamment à la vancomycine, cette résistance correspondant à l'un des phénotypes VanA, VanB ou VanC, le kit comprenant
- une sonde nucléotidique hybridant avec les gènes
vanA, vanB et vanC,
- des nucléoside-triphosphates dATP, dCTP, dTTP et
dGTP,
- un agent de polymérisation d'ADN.
L'invention vise aussi un procédé de détection in vitro de la présence de souches résistantes à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier à la famille des cocci à Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E.
faecium ou E.faecalis, caractérisé en ce qu'il comprend a) la mise en contact d'un échantillon biologique
susceptible de contenir les souches résistantes,
avec une amorce constituée par un fragment
nucléotidique selon l'invention, tel que décrit
ci-dessus, capable d'hybrider avec une séquence
nucléotidique recherchée, impliquée dans
l'expression de la résistance, cette séquence
étant utilisée comme matrice, en présence des 4
différents nucléosides triphosphates, et d'un
agent de polymérisation, dans des conditions
d'hybridation telles que pour chaque séquence
nucléotidique ayant hybridé avec une amorce, un
produit d'élongation de chaque amorce
complémentaire de la matrice est synthétisé, b) la séparation de la matrice et du produit
d'élongation obtenu, ce dernier pouvant alors
également se comporter comme une matrice, c) la répétition de l'étape a) de façon à obtenir une
quantité détectable des séquences nucléotidiques
recherchées, d) la détection du produit d'amplification des
séquences nucléotidiques.
La sonde utilisée peut donc être spécifique de la séquence nucléotidique II ou d'une séquence hybridant dans des conditions stringentes avec la séquence II.
Dans ces conditions, le procédé selon l'invention permet la détection d'une résistance à des glycopeptides, cette résistance étant inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ce procédé comprend également la mise en contact de l'échantillon biologique avec un fragment nucléotidique spécifique du gène vanA et/ou un fragment nucléotidique spécifique du gène vanC. Dans ce cas le procédé selon l'invention permet avantageusement la détection de différents phénotypes de résistance.
Selon un autre mode de réalisation, on détectera indifféremment une résistance correspondant à un phénotype VanA, VanB ou VanC, en utilisant une sonde commune aux gènes vanA, vanB ou vanC. Une telle sonde peut être réalisée à partir des séquences polypeptidiques alignées de la figure 2.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants
FIGURES
Figure 1
Séquence de nucléotides et d'acides aminés du
fragment interne du gène vanB, obtenu par PCR. La
séquence de nucléotides des deux brins a été
déterminée à partir de l'insérat contenu dans
pUC18, par la méthode didéoxy de terminaison de
chaîne (Sanger et al, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA,74:5463-5467) en utilisant 1'ADN polymérase
T7.
Figure 2
Alignement de la séquence d'acides aminés
partielle déduite de la protéine VanB et des
régions correspondantes de VanA, VanC, DDLA et
DDLB (Dutka-Malen et al, 1992 Gene, 112:53-58).
Les acides aminés identiques (I) et les
substitutions conservatives (C) dans les 5
séquences ont été indiquées sous l'alignement.
Pour que la classification en tant que
substitution soit conservée, les acides aminés ont
été regroupés comme suit : RK, LFPMVI, STQNC, AGW,
H, ED et Y.
Figure 3
Oligonucléotides V1 et V2 utilisés pour amplifier l'ADN du gène vanB.
APPROCHE EXPERIMENTALE
Les antibiotiques de la famille des glycopeptides, tels que la vancomycine (Vm) et la teicoplanine (Te) se fixent aux résidus D-Ala C-terminaux des précurseurs du peptidoglycane, bloquant ainsi leur incorporation dans la paroi cellulaire bactérienne (Reynolds, P.E. 1989
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8:943-950). Les résidus D-Ala sont incorporés dans les précurseurs au niveau de la paroi cellulaire, sous forme de dipeptides synthétisés par des ligases D-Ala:D-Ala (DDL) (Walsh,
C.T. 1989 J. Biol. Chem. 264:2393-2396). La ligase VanA synthétise le depsipeptide D-Ala-D-lac qui se substitue à D-Ala-D-Ala conduisant à la synthèse de précurseurs qui lient la vancomycine avec une affinité réduite (Bugg et al, Biochemistry 30:10408-10415 (1991 > ,
Handwerger et al, J.Bacteriol. 174:5982-5984 (1992),
Messer et Reynolds, FEMS Microbiol. Letters 94:195-200 (1992)).
La résistance aux glycopeptides chez les entérocoques est hétérogène (Dutka-Malen et al, 1990
Antimicrobiol Agents Chemother 34:1875-1879).
Les protéines de résistance VanA et VanC (voir demande de brevet EP 91920753.0 du 29 octobre 1991) montrent une homologie de 28 à 33% en acides aminés avec les D-Ala:D-Ala ligases (Ala=Alanine) de E.coli (Dutka-Malen et al, 1992 Gene 112:53-58). Les gènes de structure pour les protéines VanA et VanC n'hybrident pas avec 1'ADN des souches de phénotype VanB (Dutka
Malen et al, 1990, Leclercq et al, Antimicrob. Agents
Chemother 36:2005-2008 (1992)).
Les inventeurs sont parvenus à identifier la séquence nucléotidique impliquée dans les propriétés de résistance à la vancomycine de souches d'entérocoques ayant le phénotype VanB et résistant, après induction avec la vancomycine.
Souches Bactériennes : 39 isolats de E.faecium (28 souches) et E.faecalis (11 souches) résistantes à de faibles ou de fortes concentrations de vancomycine et sensibles à la teicoplanine ont été étudiées (tableau
II). Parmi ces souches, 24 isolats y compris E.faecalis
V583 (Sahm D. et al, Antimicrob. Agents Chemother.
1989, 33:1588-91) et E.faecium D366 (Gutmann L. et al,
Antimicrob. Agents Chemother 1992, 36:77-80) étaient résistantes à de faibles concentrations de vancomycine sur la base d'un test de sensibilité sur disque. Ces souches appartiennent au phénotype de classe B. 15 isolats résistant à de fortes concentrations de vancomycine (CIM 2 128 pg/ml) y compris E.faecalis souche V583-2 (Zarlenga LJ. et al, Antimicrob. Agents
Chemother. 1992, 36:902-5), qui est un mutant spontané de V553, ainsi que UMH-1 (Schwalbe R. et al, Abstract
A-117, in Abstracts of the 91st General Meeting of the
American Society for Microbiology. Dallas, TX: American
Society for Microbiology, 1991) ont aussi été étudiés.
Les souches-contrôle étaient des souches d'enterocoque bien caractérisées appartenant aux phénotypes A et C et hybridant avec les sondes VanA et VanC respectivement.
I1 s'agit en particulier de 6 isolats cliniques de
E.faecium hautement résistants à la vancomycine et à la teicoplanine, incluant BM4147. Les souches de
E.gallinarum incluant BM4174 appartenant à la classe C ont également été utilisées comme contrôle. Font également partie les contrôles de souches de
E.casseliflavus, y compris la souche ATCC 25788, qui sont des isolats intrinsèquement résistants à de faibles niveaux de vancomycine et sensibles à la teicoplanine (Leclercq R. et al, Antimicrob. Agents
Chemother. 1992, 36:2005-8).
Les souches suivantes ont également été étudiées
Erysipelothrix rhusiopathiae A 124 (Institut Pasteur
Collection), Lactobacillus brevis ATCC 14869,
Lactobacillus casei ATCC 393, Lactobacillus confusus
ATCC 10881, Lactobacillus fermentum ATCC 9338,
Lactobacillus plantarum ATCC 8014, Lactobacillus reuteri ATCC 23272, Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469,
Lactobacillus salivarius ATCC 11741, Pediococcus acidilacti ATCC 8042, Pediococcus pentosaceus ATCC 33316, et Leuconostoc mesenteroides CIP 16407. Les enterocoques suivants sensibles à des antibiotiques de la famille des glycopeptides sont utilisés comme contrôles négatifs: E.durans ATCC 19432, E.faecium ATCC 19434, BM4107 (Leclercq R. et al, Antimicrob. Agents
Chemother. 1992, 36:2005-8), et MT1OR (GutmannL et al,
Antimicrob.Agents Chemother, 1992, 36:77-80), souche sensible à la vancomycine derivée de D366 ; E.faecalis
ATCC 29212, ATCC 33186,JH2-2 (Leclercq R. et al,
Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 36:2005-8), et
V583-C1, souche sensible à la vancomycine dérivée de
V583, (Tableau II), et un isolat clinique de E.faecium et E.faecalis. Des caractéristiques de souches de référence sont dépeintes au tableau I. E.faecium BM4107 et E.faecalis JH2-2, à la fois résistantes à la rifampine et à l'acide fusidique (Leclercq R. et al,
Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 36:2005-8), étaient utilisés comme souches réceptrices pour des expériences de conjugaison.
Identification des entérocoques
Les entérocoques ont été identifiés par la méthode de Facklam et Collins, J. Clin. Microbiol. 1989, 27:731-4). L'identification des espèces était fondée sur les tests de réduction du tellurite de potassium et de production d'acides à partir de carbohydrates sur des bandes de streptocoques API 20 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France). Le test de mobilité à 30 C et de fermentation des carbohydrates ont été utilisés pour distinguer E.gallinarum et E.casseliflavus de E.faecium et E.faecalis. Les souches de E.casseliflavus ont été distinguées des souches de E.gallinarum sur la base de la production d'un pigment jaune sur de l'agar.
Milieu
Un milieu coeur-cerveau et de l'agar (Difco
Laboratoires, Détroit, MI) ont été utilisés. Des tests de sensibilité ont été réalisés sur de l'agar Mueller
Hinton (Diagnostics Pasteur, Marne La Coquette, Francs). Toutes les incubations ont été réalisées à 37"C.
Détermination de la sensibilité in vitro aux antibiotiques.
Le test de diffusion sur disque avec des disques contenant 30 Ag de vancomycine ou 30 Ag de teicoplanine (Diagnostics Pasteur) a été utilisé pour le criblage initial. La méthode de Steers et al avec 104 CFU par tâche a été utilisée pour déterminer la CMI des antibiotiques (Steers E. et al, Antibiot. Chemother.
(Basel) 1959, 9:307-11).
Transfert du caractère de résistance d'un antibiotique
La conjugaison sur filtres a été réalisée selon la technique décrite par Dutka-Malen S. et al, Antimicrob.
Agents Chemother. 1990, 34:1875-9. Les concentrations en antibiotiques pour la sélection des transconjugués étaient les suivantes : rifampine : 20 yg/ml ; acide fusidique : 10pg/ml et vancomycine : 4 et 8 Zg/ml.
Enzymes et réactifs
La lisozyme a été obtenue chez Sigma Chemical Co.
(St Louis, MO). La RNase A (pancréas de bovin) et la protéinase K ont été obtenues chez Calbiochem. Co. (San
Diego, CA). L'[a-32P)dCTP et le sel de triethylammonium (activité spécifique 3000 CI/mmol) ont été obtenus de
Radiochemical Center, Amersham, Grande-Bretagne. La teicoplanine provient de Gruppo Lepetit (Milan, Italie) et la vancomycine provient de Eli Lilly & Co (Indianapolis, IN).
Les oligonucléotides V1 et V2 décrits dans la demande de brevet EP 91920753.0, ont permis l'amplification par la technique de PCR, de fragments internes aux gènes codant pour les protéines VanA, VanC et D-Ala:D-Ala ligases (Dutka-Malen et al, 1992 Gene 112:53-58).
L'amplification du gène vanB a été réalisée avec les oligonucléotides V1 et V2 et 1'ADN (20 ng) de
Enterococcus faecalis V583 (Sahm et al, 1989
Antimicrob. Agents Chemother 33:1588-1591)
Pour réaliser cette amplification, la technique décrite dans la publication de Dutka-Malen et al, 1992 a été utilisée.Les fragments obtenus ont été séparés sur gel d'agarose (1t) dans un tampon TAE, qui a permis de révéler une bande unique d'environ 600 pb, qui a été extraite du gel en utilisant un kit de purification de 1'ADN (GeneClean, BiolOl Inc., la Jolla, CA). En utilisant un kit permettant l'obtention d'extrémités franches au niveau de 1'ADN (Amersham, Amersham,
Grande-Bretagne), les fragments ont été traités avec 1'ADN T4 polymérase et ligaturés au niveau du site SmaI d'un plasmide pUC18 digéré et déphosphorilé (Norrander et al, 1983, Gene 26:101-106).
La séquence de 632 pb (sonde vanB) correspondant à l'insert du plasmide recombinant (figure 1) a été déterminée par la méthode didéoxy de terminaison de chaîne (Sanger et al, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) en utilisant 1'ADN T7 polymérase (Pharmacia, Uppsala, Suède) et le (a-35S]dATP (Amersham, Radiochemical Center, Amersham, Grande
Bretagne).
Etant donné que l'amplification avec 1'ADN Taq polymérase peut conduire à des incorporations erronées de nucléotides, la séquence a été confirmée comme suit : un oligonucléotide complémentaire des positions 513 à 530 de la séquence nucléotidique de la figure 1 a été synthétisé par la méthode au phosphoramidite (unité de Chimie Organique, Institut Pasteur, France) et utilisé avec l'amorce V1 pour réaliser une amplification par PCR d'un fragment de vanB. Le produit
PCR a été séquencé directement (Mabilat et al, 1990,
Plasmid 23:27-34) ou après le clonage dans un vecteur pUC18, afin de révéler l'identité des nucléotides avec le fragment cloné obtenu avec V1 et V2.
Une hybridation de type southern a été réalisée selon la méthode de Johnson et al, Gene Anal. Technol.
1:3-8 (1984 > . 1'ADN total des souches d'entérocoque (Tableau 1) a été préparé selon la technique décrite par Le Bouguénec et al, 1990, J. Bacteriol.
172:727-734, digéré avec les enzymes HindIII et KpnI (United States, Biochemical Corporation, Cleveland,
Ohio) et résolu sur des gels d'agarose 1% . L'ADN a été transféré sur des membranes de nylon (Nytran,
Schleicher & Schuell, Dassel, Allemagne) avec un appareil de transfert sous vide (Trans. Vac. TE80,
Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). La sonde a été obtenue en marquant le fragment PCR cloné avec un kit de translation de césure (Bethesda Research
Laboratories Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) et (a-32p) dCTP (Amersham, Radiochemical Center,
Amersham, Grande-Bretagne). L'hybridation a été réalisée dans des conditions stringentes à 68 C (Johnson et al, 1984, Gene Anal. Technol. 1:3-8).Les membranes ont été lavées à 65 C dans 0,1% SDS-2XSSC.
LA sonde vanA consistait en un fragment PstI de 265 pb interne au gène vanA (Dukta Malen S. et al, Mol.
Gen. Genet. 1990, 224:364-72). La sonde vanC consistait en un fragment EcoRI-HincII de 690 pb, interne au gène vanC (Leclercq R. et al, Antimicrob. Agents Chemother 1992, 36:2005-8. Dukta Malen S. et al Gene, 1992, 112:53-8). La sonde vanB correspond à la séquence II.
La séquence en acides aminés déduite de l'insérat contenu dans le plasmide pUC18 présente une similarité avec une partie des protéines VanA (77% d'identité des acides aminés), VanC (37%) et DDL de E.coli (30 et 32%) [figure 2]. Dans les conditions d'hybridation en southern, le fragment cloné hybridait avec le fragment de 3,3 kb HindIII-KpnI de E. faecalis V583. La sonde n'hybride pas avec 1'ADN d'un dérivé de V583 sensible à la vancomycine ou à 1'ADN des souches de E. faecalis et
E. faecium sensibles à la vancomycine utilisées comme référence. Le fragment d'ADN cloné obtenu par PCR correspond à un fragment interne du gène impliqué dans la résistance. Ce gène code pour une enzyme apparentée aux D-Ala:D-Ala ligases, appelée VanB, qui pourrait être impliquée dans la synthèse d'un produit se substituant à D-Ala-D-Ala.
Ces test ont permis de mettre en évidence un seul groupe de gènes apparentés à vanB, et responsable d'un bas et d'un haut niveau de résistance à la vancomycine chez les entérocoques (tableaux 1 et 2).
Aucune hybridation n'a été observée entre la sonde
VanB et 1'ADN de souches sensibles à la vancomycine sans induction ou portant les gènes vanA ou vanC ou intrinsèquement résistantes.
Le transfert du caractère de résistance à la vancomycine (chez 6 isolats d'entérocoques parmi 17) par conjugaison sur filtre, a été observé chez des souches E.faecium et E.faecalis résistantes à de faibles ou à de fortes concentrations d'antibiotiques. TABLEAU I: Souches bactériennes
CMI ( g/ml) Hybridisation avec
Souche Vm Te la sonde Référence
vanA vanB vanC
E.faecalis
V583 64 0,5 - + - Sahm et al (1989)
V583-Cl 2 0,5 - - - D.F.Sahm
V583-2 1024 1,0 - + - Zarlenga LJ (1992)
UMH-1 1024 1,0 - + - Schwalbe et al (1991)
ATCC 29212 2 0,5 - -
E.faecium
D366 32 0,5 - + - Gutmann et al (1992)
MT10R 2 0,25 - - - Gutmann et al (1992)
BM4147 1024 512 + - - Dutka-Malen et al (1990)
ATCC 19434 1 1 - -
E.gallinarum
BM4174 8 1 - - + Dutka-Malen et al (1992)
E.casseliflavus 8 1 - - - TABLEAU II: :
Classes de phénotypes et génotypes parmi les coccine à
Gram-positif, résistantes à la vancomycine
CLASSE DE CLASSE DE (A) ESPECE CMI ( g/ml)
PHENOTYPE GENOTYPE Vancomycina Teicoplanine
Susceptible Susceptible Enterococcus spp. (10) 0.5-2 0.25
A A E.faecium(6) 256#1.000 64#1.000
B B E.faecium(28) 4-256 0.5-1
B B E.faecalis(11) 4-1024 0.5-1
C C E.gallinarum (3) 8 1
C NC E.casseliflavus (2) 4-8 1
NC NC Lactobacillus spp.(8) > 1.000 > 1.000
NC NC Leuconostoc. sp. (1) > 1.000 > 1.000
NC NC Pediococcus spp.(2) > 1.000 > 1.000
NC NC E.rhusiopathise(1) > 1.000 > 1.000 (a)A: hybridation avec la sonde vanA; B: hybridation avec la sonde vanB;
C: hybridation avec la sonde vanC ; NC : non classé

Claims (24)

REVENDICATIONS
1. Protéine VanB caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés suivante I, et en ce qu'elle est impliquée chez des bactéries à Grampositif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
R V Q E T A K K V Y R V L G C R G L A R VD LFLQEDGG IVLNEV
K G S E N A M I I V P A D I P V E E R N
V D Q I R L S H G I F R I H Q E N E P E
S G C E V G C A V M G N E D D L I V G E
N A A I E A A G Q Y D G K I L X E Q A I
KpARSGSSFGvTKVb(STEEL
QMIEKGDKpEARTLTYPvFV
M D K S L A Y I L T K N A G I A V P E F
L F E L S G I P Y V G C D I Q S S A A C
2. Protéine VanB selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a la capacité de conférer une résistance de type inductible à des glycopeptides et en particulier à la vancomycine, chez des entérocoques et par exemple chez des souches du genre
E. faecium ou E. faecalis.
3. Protéine VanB selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés modifiée par rapport à la séquence I, par délétion, insertion, ou remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, dès lors que la protéine VanB ainsi modifiée est impliquée chez des bactéries à Gram-positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
4. Fragment peptidique de la protéine VanB caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence d'acides aminés I ou à toute partie de cette séquence fonctionnellement associée à la résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, chez des bactéries à Gram-positif, par exemple des bactéries de la famille des enterocoques, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
5. Fragment peptidique de la protéine VanB, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence d'acides aminés I ou à toute partie de cette séquence et en ce qu'il a des propriétés antigéniques.
6. Fragment peptidique de la protéine VanB selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est reconnu spécifiquement par des anticorps dirigés contre la protéine VanB, et qu'il est dépourvu de réaction immunologique avec des anticorps reconnaissant les protéines VanA et/ou VanC.
7. Séquence de nucléotides caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine VanB impliquée chez des bactéries à Gram-positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine, ladite protéine
VanB comprenant dans son ossature peptidique, la séquence d'acides aminés I, ou en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN complémentaire de cette séquence codante, ou d'une séquence d'ARN correspondante.
8. Séquence de nucléotides selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement de nucléotides II suivant ou un enchaînement nucléotidique modifié par rapport à II, dès lors qu'il code pour une protéine impliquée chez des bactéries à
Gram-positif, dans une résistance à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, cette résistance étant de type inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
TCGGGTGCAAGAAACGGCAAAGAAQAGTATATCGGGTGCTTGGATGCAGAGGGCTTGCTCG TGTTGATCTTTTTTTGCAGGAGGATGGCGGCATCGTTCTAAACGAGGTC
AAAAG GCT CAGAGAATGC GATGATTATCGTTCCAGCAGACATTCCGGTC GAGGAAC GAAA
AGTGGATCAAATCCGGTTGAGCCACGGTATCTTCCGCATCCATCAGGAAAACGAGCCGGA
TTCGGGCTGTGAGGTCGGCTGCGCGGTCATGGGAMCGAGGATGATTTGATTGTCGGCGA
AAAC GCTGC GATAGAAGCAG CAGGACAATATGATGGAAAAATCTAATTGAGCAAGCGAT
GAAGCCGGCACGGTCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAACCAAAGTAAACAGTACGGAAGAACT
TCAAATGATTGAAGGTGACABACCGGAGGCGAGGACGCTTACCTACCCTGTC=GT
CATGGACAAATCACTGGCCTACATTCTTAC;kLLTGCGGGCATCGCCGTCCCCGAATT
TCTGTTTGAATTGTCTGGTATCCCCTATGTAGGCTGCGATATTCAAAGCTCCGCAGCTTG
9. Fragment nucléotidique caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider dans des conditions stringentes avec une séquence selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8 ou fragment nucléotidique complémentaire.
10. Fragment nucléotidique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il n'hybride pas dans des conditions stringentes avec 1'ADN de souches d'enterocoques sensibles à la vancomycine, en particulier avec 1'ADN des souches E. faecalis JH2-2,
E. faecium BM4107.
11. Fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il répond à la séquence II.
12. Fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il est marqué
13. Séquence d'ADN recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression, d'une résistance de type inductible, à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine, chez un hôte déterminé, cette résistance étant inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
14. Vecteur recombinant pour le clonage ou l'expression dans un hôte déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, en un site non essentiel pour sa réplication, sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression, d'une résistance de type inductible à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine, cette résistance étant inductible par la vancomycine et non inductible par la teicoplanine.
15. Vecteur recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pAT201 déposé à la C.N.C.M. sous le numéro I-1277.
16. Hôte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 12 ou un vecteur selon la revendication 14 ou la revendication 15, cet hôte étant par exemple choisi parmi les bactéries, notamment les cocci à Gram-positif.
17. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement la protéine VanB selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6.
18. Kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique, de la présence de souches résistantes à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, ces souches appartenant en particulier aux cocci à Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit des souches d'entérocoques, par exemple E. faecium, caractérisé en ce qu'il comprend - des anticorps selon la revendication 17, le cas
échéant marqués, - un réactif pour la détection d'une réaction
immunologique du type anticorps-antigène, - le cas échéant des réactifs pour effectuer la lyse
des cellules de l'échantillon testé, - le cas échéant une concentration déterminée de
vancomycine pour induire la résistance.
19. Kit selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine VanA et/ou des anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine
VanC.
20. Kit pour le diagnostic in vitro de la présence de souches résistantes à des glycopeptides, en particulier résistantes à la vancomycine, ces souches appartenant en particulier aux cocci à Gram-positif notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E. faecium, caractérisé en ce qu'il comprend - une sonde nucléotidique selon la revendication 12,
et le cas échéant, - des nucléoside-triphosphates dATP, dCTP, dTTP,
dGTP, - un agent de polymérisation d'ADN.
21. Kit selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il comprend en outre des sondes nucléotidiques spécifiques des gènes vanA et/ou vanC.
22. Procédé de détection in vitro de la présence de souches résistantes à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier à la famille des cocci à Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E. faecium ou
E.faecalis, caractérisé en ce qu'il comprend a) la mise en contact d'un échantillon biologique
susceptible de contenir les souches résistantes,
avec une amorce constituée par un fragment
nucléotidique selon l'une quelconque des
revendications 9 ou 10, capable d'hybrider avec
une séquence nucléotidique recherchée, nécessaire
à l'expression de la résistance, cette séquence
étant utilisée comme matrice, en présence des 4
différents nucléosides triphosphates, et d'un
agent de polymérisation, dans des conditions
d'hybridation telles que pour chaque séquence
nucléotidique ayant hybridé avec une amorce, un
produit d'élongation de chaque amorce
complémentaire de la matrice est synthétisé, b) la séparation de la matrice et du produit
d'élongation obtenu, ce dernier pouvant alors
également se comporter comme une matrice, c) la répétition de l'étape a) de façon à obtenir une
quantité détectable des séquences nucléotidiques
recherchées, d) la détection du produit d'amplification des
séquences nucléotidiques.
23. Procédé de détection in vitro de souches résistantes à des glycopeptides, en particulier à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier à la famille des cocci à
Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E. faecium ou E.faecalis, caractérisé en ce qu'il comprend a) la mise en contact d'un échantillon biologique
susceptible de contenir les souches résistantes,
avec une amorce constituée par un fragment
nucléotidique selon l'une quelconque des
revendications 9 ou 10 et avec un fragment
nucléotidique du gène vanA et un fragment
nucléotidique spécifique du gène vanC, capable
d'hybrider avec une séquence nucléotidique
recherchée, nécessaire à l'expression de la
résistance, cette séquence étant utilisée comme
matrice, en présence des 4 différents nucléosides
triphosphates, et d'un agent de polymérisation,
dans des conditions d'hybridation telles que pour
chaque séquence nucléotidique ayant hybridé avec
une amorce, un produit d'élongation de chaque
amorce complémentaire de la matrice est
synthétisé, b) la séparation de la matrice et du produit
d'élongation obtenu, ce dernier pouvant alors
également se comporter comme une matrice, c) la répétition de l'étape a) de façon à obtenir une
quantité détectable des séquences nucléotidiques
recherchées, d) la détection du produit d'amplification des
séquences nucléotidiques.
24. Procédé de criblage de molécules en particulier d'antibiotiques actifs pour le traitement des infections dues à des cocci à Gram-positif, en particulier des entérocoques, caractérisé en ce que l'on détecte l'activité de ces molécules, sur des bactéries ayant un phénotype de résistance notamment à la vancomycine, de type VanB.
FR9215671A 1992-12-18 1992-12-18 Protéine conférant une résistance de type inductible, à des glycopeptides, notamment chez des bactéries à gram-positif. Séquence de nucléotides codant pour cette protéine. Expired - Lifetime FR2699539B1 (fr)

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